Original Papers

EinfluB von Diclofop-methyl auf die Protein-, Nukleinsaure­und Lipidbiosynthese der Keimwurzeispitzen von Zea mays L.::-

Effect of Diclofop-Methyl on Protein Nucleic Acid and Lipid Biosynthesis in Tips of Radicles from Zea mays 1.

H. H. HOPPE

Institut fUr Pflanzenpathologie und Pflanzenschutz der Georg-August-Universitat Gottingen, 3400 Gottingen, G.F.R.

Eingegangen am 3. Oktober 1980 . Angenommen am 14. Januar 1981

Summary

Maize seedlings were treated with 5 . 10-7 M, 5· 10-6 M and 5· 10-5 M diclofop-methyl to determine the effect of this herbicide on the lipid, protein, and nucleic acid biosynthesis of root tips isolated from the radicles 24 hr after herbicide treatment. Diclofop-methyl caused a strong inhibition of the incorporation of 14C-acetate into the lipids. The uptake of 14C-acetate by the root tips was inhibited to a lower extent. Under the same conditions the herbicide had no effect on the incorporation of 14C-leucine into proteins and only a weak effect on the incorporation of 14C-adenine into nucleic acids, which could be explained by reduced uptake of 14C-adenine.

These effects of diclofop-methyl on precursor uptake and incorporation were also visible in the percentage distribution of radioactivity between soluble and insoluble components of untreated and herbicide treated root tips. In the protein biosynthesis experiments distribution of 14C-activity between TCA soluble and insoluble fractions was not affected. In the experiments on nucleic acid biosynthesis herbicide treated root tips contained - probably due to reduced precursor uptake - a lower percentage of radioactivity in the ethanol soluble fraction than the controls. The major difference in the percentage 14C-distribution was observed in the experiments on lipid synthesis. Dic1ofop-methyl caused a reduction of 14C-activity in the lipids and an accumulation in water soluble compounds. These results are in agreement with the reduction of acyl lipid content in herbicide treated root tips observed in earlier experiments. They suggest that the mode of action of diclofop-methyl is inhibition of fatty acid synthesis.

Key words: Zea mays, diclofop-methyl; protein, nucleic acid and lipid biosynthesis; root tips.

':. Diese Arbeit ist em Teil der bei der Landwirtschaftlichen Fakultat der Georg-August-U niversita t zu Gottingen vorgelegten Habilitationsschrift « Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus herbizider Phenoxy-Phenoxy-Propionsaurederivate».

Abkurzungen: FGW Frischgewicht; TGW Trockengewicht; PPO 2,5-Diphenyloxazol; POPOP = 1,4-Bis-2-(5-phenyloxazolyl)benzol.

Z. Pflanzenphysiol. Ed. 102. S.189-197. 1981.

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Einleitung

Diclofop-methyl (2-[4-(2',4' -Dichlorphenoxy)-phenoxy ]-propionsauremethylester, Handelspraparat: IlIoxan®), ein herbizider Wirkstoff aus der von der Hoechst AG entwickelten Gruppe der Diphenoxypropionsaurederivate, fuhrt zu einer Hemmung des Keimwurzelwachstums von Zea mays, die 12 Std. nach der Behandlung der Keimlinge sichtbar wird. Fruhere Versuche zeigten, daB die Wachstumshemmung nicht mit einem Eingriff in die Respiration, einer Zerstorung biologischer Membranen oder einer nicht ausreichenden Versorgung der Wurzelspitzen mit Kohlenhydraten erklart werden kann (Hoppe, 1980 a und b). Das Herbizid reduziert in den Keimwurzelspitzen den Gehalt einiger Acyllipide und fuhrt zu einer Anrei­cherung von Glykolipiden, die keine Fettsaurereste enthalten (Hoppe, 1980 b). Diese Veranderungen im Lipidgehalt konnten auf eine Hemmung der Biosynthese der Acyllipide durch das Herbizid hindeuten. In der vorliegenden Arbeit wird da­her die Wirkung von Diclofop-methyl auf den Einbau von He-Acetat in die Lipide der Keimwurzelspitzen von Zea mays uberpruft und mit dem EinfluE auf die Pro­tein- und Nukleinsaurebiosynthese der Wurzelspitzen verglichen.

Fur die Versuche wurden 3 Konzentrationen von Diclofop-methyl verwendet: 5· 10-5 M, 5.10-6 M und 5.10-7 M. Die niedrige Herbizidkonzentration (5.10-7 M) war unter unseren Bedingungen subletal und lieE noch ein gegenuber der Kontrolle verlangsamtes Keimwurzelwachstum zu. Die beiden hohen Herbizid­konzentrationen (5 ·10-6 M und 5 ·10-5 M) hemmten nach einer 12stundigen Ein­wirkungsdauer das Wurzelwachstum vi:illig und fuhrlten zu einer Nekrose, die etwa 2 Tage nach der Herbizidbehandlung zunachst im Bereich der Teilungs- und Strek­kungszone sichtbar wurde, sich mit langer andauernder Herbizidbehandlung uber die gesamte Keimwurzel ausbreitete und sie so zum Absterben brachte (Hoppe, 1980 a).

Material und Methoden

Anzucht und H erbizidbehandlung

Die Anzucht und Herbizidbehandlung der Maiskeimlinge wurden bereits beschrieben (Hoppe, 1980 a).

lnkubation mit 14C-markierten Vorstufen

Fur die Einbauversuche wurden foIgende radioaktiv markierte Vorstufen von der Fa. Amersham-BuchIer bezogen: L-U-' 4C-Leuein (330 mCilmmoI), 8-'4C-Adenin (58 mCil mmoI) und 1-l4C-Acetat (Na-Salz, 59,5 mCi / mmoI). Fur die Inkubation mit den markier­ten Vorstufen wurden bei den Versuchen zur Protein- und Nukleinsaurebiosynthese 20 und bei den Lipidbiosyntheseversuehen 40 Keimwurzelspitzen verwendet. Die Wurzelspitzen wur­den nach einer 24-stundigen Herbizidvorbehandlung der Keimlinge auf 1,5 em abgetrennt und anschlieflend 1 Std. mit 20 ml Herbizidlosung bei 27 DC geschiittelt. Danach wurden die Herbizidlosungen durch 10 ml Isotopenlosung ersetzt, die 0,1.10-3 mCi / mI l4C-Leucin, 0,1.10-3 mCi / ml l4C-Adenin oder 0,3.10-3 mCi/ml 14C-Aeetat sowie die bei den Ergeb­nissen angegebenen Herbizidkonzentrationen enthielt. Die Aufnahme der markierten Ver-

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bindungen durch die Wurzelspitzen wurde durch die Abnahme der Radioaktivitat in der Applikationslosung ermittelt. Nach Beendigung der Inkubation mit den Vorstufen wurden die Wurzelspitzen abfiltriert, mit 10-4 M CaCl2 nachgespult, gewogen und sofort weirer aufgearbeitet.

Nachweis der Radioaktivitat in Proteinen

Zur Bestimmung der Radioaktivitat in den pufferloslichen Proteinen wurden die Wurzel­spitzen mit 5 ml Tris-Puffer (0,1 M, pH 7,5) extrahiert. In 0,5 ml-Portionen des Extraktes wurde nach einer TCA-Fallung der Proteingehalt bestimmt (Lowry,-1951) und in 0,2 ml­Anteilen die Radioaktivitat des Oberstandes mit den nicht TCA-fallbaren Verbindungen er­mittelt. Der TCA-fallbare Ruckstand wurde in 2 ml 0,1 N NaOH uber Nacht bei Raum­temperatur gelost und danach die Radioaktivitat in 0,2 ml der Losung gemessen.

Nachweis der Radioaktivitat in Nukleinsauren

Zur Bestimmung der Radioaktivitiit in den Nukleinsauren wurden die Nukleinsauren nach Wilcockson und Hull (1974) extrahiert und nach Peacock und Dingman (1967) quan­titativ bestimmt. Die Bestimmung der Radioaktivitat erfolgte in 0,2 ml der Nukleinsaure­Losung.

Nachweis der Radioaktivitat in Lipiden

Fur die Ermittlung der Radioaktivitat in den Lipiden wurden die Wurze1spitzen nach dem Zermorsern mehrfach mit insgesamt 16 ml Extraktionsgemisch (CHCla : CHaOH : H 20 = 1: 2 : 0,8) extrahiert. AnschlieGend wurde die Losung mit 4,2 ml CHCIs und 4,2 ml H 20 versetzt und uber Nacht bei 4°C belassen, urn die Trennung in di,e wasserige Phase und in die CHCla-Phase zu beschleunigen. Die Messung der Radioaktivitat der CHaOH­H 20-Phase erfolgte direkt, die der Chloroformphase nach dem Verfluchtigen des Chloro­forms aus dem MeGglaschen.

Radioaktivitatsmessungen

Die Radioaktivitatsmessungen wurden in einem Szintillationszahler der Firma Tricarb­Packard (Modell 2003) mit einem Szintillator auf Toluol-Basis (8 g PPO, 0,5 g POPOP, 700 ml Toluol, 300 ml Athanol) durchgefuhrt. Zu vergleichende Messungen erfolgten unter identischen Bedingungen, so daG sich in der Regel fur einen Vergleich der Kontrollen mit den herbizidbehandelten Varianten eine Quenchkorrektur erubrigte. Bei Beginn neuer Ver­suchsserien wurden Kontrollmessungen im Zentralen Isotopenlabor der Universitat Gottin­gen durchgefiihrt, um den Wirkungsgrad der Messungen zu ermitteln und Quencheffekte auszuschlieGen.

Ergebnisse und Diskussion

Einfluft von Diclofop-methyl und Actidion auf den Einbau von 14C-Leucin m

die Proteine der Keimwurzelspitzen von Zea mays

In die Versuche zur Proteinsynthese wurde als Vergleichssuhstanz Actidion auf­genommen, ein Hemmstoff der Proteinbiosynthese, der selektiv die Funktion der 80 S-Ribosomen hemmt und auch in Pflanzen wirksam ist (Yang und Scandalios, 1977). Die Leucinaufnahme durch die Wurzelspitzen verlief sehr rasch. Bereits nach

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1 Std. war unter unseren Bedingungen der groihe Teil der Radioaktivitat aus der Applikationslosung aufgenommen (Abb. 1). Der Einbau des 14C-Leucins in die Pro­teine war gegeniiber der Aufnahme zeitlich verzogert. Er verlief in den ersten 60 Minuten annahernd linear, zeigre danach nur noch eine geringe Zunahme, wei! die Verfiigbarkeit an Vorstufen begrenzend wirkte (Abb. 1 B). Khnliche Aufnahme­und Einbaukinetiken des Leucins durch Pflanzenmaterial wurden von anderen Autoren beschrieben (Oaks, 1965).

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hr after application of 14C-leucine

Fig. 1: Uptake of 14C-leucine (A) and incorporation into proteins (B) by untreated, herbicide or actidion treated root tips of Zea mays. The root tips were isolated from the radicles 24 hr after pretreatment of the seedlings and used for incorporation studies. x-x Control; 0- - -05 . 10-7 M diclofop-methyl; .- . -. 5 . to ,6 M diclofop-methyl;

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Nach einer 24stiindigen Vorbehandlung fiihrte Diclofop-methyl mit steigender Konzentration zu einer zunehmenden Verminderung der 14C-Leucinaufnahme durch die Wurzelspitzen (Abb. 1 A), die sich jedoch nicht auf den Einbau des Leucins in die Proteine auswirkte (Abb. 1 B). Bezogen auf die gleiche Anzahl von Wurzelspit­zen wurden durch die Kontrollen und herbizidbehandelten Wurzelspitzen gleich viel Proteine wahrend der Inkubation mit 14C-Leucin synthetisiert (B), lediglich bei Bezug auf 1 mg Protein und die Proteine von 1 g FGW zeigten die mit 5 . 10-5 M oder 5· 10-6 M Diclofop-methyl behandelten Wurzeln wegen ihres hoheren Protein­gehaltes und Frischgewichtes einen geringfiigig verminderten Einbau von 14C-Leucin in die Proteine.

Actidion hemmte den Leucineinbau in die Proteine fast vollig (Abb. 1). Der nicht hemmbare Anteil der Proteinbiosynthese diirfte auf die Aktivitat der plasti­daren und mitochondrial en 70 S-Ribosomen zuriickzufiihren sein, deren Protein­synthese nicht durch Actidion unterbunden werden kann (Yang und Scandalios, 1977). Die Leucinaufnahme wurde durch die Substanz weniger stark gehemmt als

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der Einbau in die Proteine. Offenbar flillte sich nach der Blockierung der Protein­biosynthese der «pool» des freien, nicht in Proteine eingebauten Leucins noch auf und erst nachdem er aufgeflilh war, wurde die Aufnahme des Leucins vermindert. Dieser Ablauf wird durch die prozentuale Verteilung der Radioaktividit zwischen den TCA-fallbaren und nicht fallbaren Fraktionen actidionbehandelter Wurzelspit­zen bestatigt. In den actidionbehande1ten Wurzelspitzen lag die Radioaktivita:t zu ca. 90 Ofo in nicht TCA-fallbarer, also nicht proteingebundener Form vor, wahrend in den unbehandelten Wurzeln dieser Anteil nur ca. 60 Ofo ausmachte (Abb. 2). Nach einer Vorbehandlung mit Diclofop-methyl war bei der prozentualen Vertei­lung der Radioaktivitat zwischen TCA-fallbarer und nicht fallbarer Fraktion kein Unterschied zwischen den Kontrollen und herbizidbehandelten Varianten zu erken­nen (Abb. 2).

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40

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Fig. 2: Distribution of radioactivity between TeA soluble (~) and TeA insoluble (.) fractions after the incubation of untreated (C), herbicide treated (5' 10-7, 5· 10-6, 5· 10-5 M diclofop-methyl) or actidion treated (5,ug/ml) root tips of Zea mays with 14e-Ieucine (for experimental conditions see Fig. 1).

Einflup von Diclofop-methyl auf den Einbau von 14C-Adenin in die Nukleinsau­Ten deT Keimwurzelspitzen von Zea mays L.

Bei den Versuchen Zur Neusynthese von Nukleinsauren wurde das als Vorstufe verwendete 14C-Adenin langsamer aus der Applikationslosung aufgenommen als das 14C-Leucin bei den Proteinbiosyntheseversuchen (Abb. 3 A). Die 14C-Adeninaufnah­me vedief wahrend der vierstlindigen Inkubationszeit annahernd linear. Steigende Konzentrationen von Diclofop-methyl flihrten zu einer zunehmenden Hemmnung der 14C-Adeninaufnahme durch die Wurzelspitzen von Zea mays, wahrend der Ein­bau der Vorstufe in die Nukleinsauren in geringerem Ausma~ gehemmt wurde (Abb. 3). Die deutlichere Wirkung des Herbizids auf die Aufnahme flihrte dazu, da~ im Vergleich zu den Kontrollen in den herbizidbehandelten Wurzelspitzen ein

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Fig. 3: Uptake of 14C-adenine (A) and incorporation into nucleic acids (B) by untreated or herbicide treated root tips of lea mays (for symbols and experimental conditions see Fig. 1).

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100

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Dlclofop-methyl

Fig. 4: Distribution of radioactivity between ethanol soluble (~) and ethanol insoluble (.) fractions after the incubation of untreated or herbicide treated root tips of lea mays with 14C-adenine (for symbols and experimental conditions see Fig. 2).

geringerer prozentualer Anteil der Radioaktivitat in den athanolloslichen Fraktio­nen und ein hoherer Anteil in den fallbaren Nukleinsauren vorlag (Abb. 4). Die prozentuale Abnahme der Radioaktivitat in der athanolloslichen Fraktion deutet darauf hin, da~ der durch Diclofop-methyl verminderte Einbau von 14C-Adenin in die Nukleinsauren durch eine Hemmung der 14C-Adeninaufnahme in die Wurzel­spitzen verursacht wurde und nicht durch eine direkte Hemmung des 14C-Adenin­einbaues in die Nukleinsauren. Die hier dargestellten Ergebnisse ergaben somit kei­nen Hinweis fUr einen direkten Eingriff des Herbizids in die Nukleinsaurebiosyn­these.

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Einfluft von Diclofp-methyl auf den Einbau von 14C-Acetat in die Lipide der Keimwurzelspitzen von Zea mays

Die 14C-Acetataufnahme durch die Wurzelspitzen erfolgte mit ahnlicher Ge­schwindigkeit wie die Aufnahme des 14C-Adenins. Nach 3 Std. war unter unseren Bedingungen ca. die Halfte des Acetats aus der Applikationslosung aufgenommen (Abb. 5). Nach einer 24stiindigen Vorbehandlung der Keimlinge fiihrte Diclofop­methyl mit den Konzentrationen 5.10-6 und 5' 10-5 M zu einer zunehmenden Verringerung der Acetataufnahme durch die Wurzelspitzen, wahrend 5· 10-7 M ohne eindeutigen EinfluB war (Abb. 5 A). Wesentlich starker als die Aufnahme des 14C-Acetat wurde der Einbau der Vorstufe in die Lipide der Wurzelspitzen ge­hemmt. Die drei verwendeten Herbizidkonzentrationen reduzierten die 14C-Aktivi­ta,t in der Lipidphase (Abb. 5 B). Nach einer Behandlung mit 5.10-5 M Diclofop­methyl war die Lipidbiosynthese vollig unterbunden.

Urn Hinweise auf die Verteilung der 14C-Aktivitat in den Wurzelspitzen zu be­kommen, wurden bei den Versuchen auch die 14C-Aktivitat def wasserloslichen Verbindungen ermittelt. Diese Bestimmungen waren leicht durchzufiihren, da bei der Lipidextraktion nach Bligh und Dyer mit CHCla-CHaOH-H20-Gemischen auch der groBte Teil der wasserloslichen Verbindungen mit extrahiert wird und nach der Verdiinnung des Extraktes mit CHCla und H 20 in der H 20-CHaOH­Phase vorliegt. Bei der prozentualen Verteilung der 14C-Aktivitat zwischen CHCla-und H 20-CHaOH-Phase ergab sich ein sehr einheitliches Bild: Mit zunehmender Herbizidkonzentration nahm der Anteil der 14C-Aktivitat in der CHCla-Phase ab und in def H 20-CHaOH-Phase zu (Abb. 6). Dieser Effekt erinnert an die Wirkung des Actidions auf die Proteinbiosynthese (Abb. 2) und ist ein Hinweis darauf, daB die Wirkung des Diclofop-methyl auf die Lipidbiosynthese beim Einbau des Acetat in die Lipidfraktion einsetzt und nicht bei der Aufnahme der Vorstufe in die Zelle.

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Fig. 5: Uptake of 14C-acetate (A) and incorporation into lipids (B) by untreated or herbicide treated root tips of Zea mays (for symbols and experimental conditions see Fig. 1).

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Dlelotop-methyl

Fig. 6 : Distr ibution of radioactivity between CHCla- (.) and H20-CH30H-phases (~) after the incubation of untreated or herbicide treated root tips of Zea mays with 14C-acetate (for symbols and experimental conditions see Fig. 2).

SchluBfolgerungen

Von den drei untersuchten Biosynthesebereichen wurde die Lipidbiosynthese am starksten durch Diclofop-methyl beeinflufk Nach den vorliegenden Ergebnissen ist Diclofop-methyl den Verbindungen zuzurechnen, die liber eine Hemmung der Li­pidbiosynthese die Neusynthese, Zus,ammensetzung und Funktion biologischer Mem­branen verandern und so zur Wachstumshemmung und schlieBlich zum Tod der Pflanze flihren (Corbett, 1974). Ein derartiger Wirkungsmechanismus wlirde auch mit der pharmakologischen Wirkung der Di(phenoxy)propionsaurederivate bei Warmbliitern in Einklang stehen. Die freie Saure von Hoe 22870, einem weiteren herbiziden Wirkstoff aus dieser Gruppe, fuhrt bei Warmblutern zu einer Erniedrigung des Triglycerid- und Cholesterinspiegels im Blut (Granzer und Nahm, 1973). Die verglichen mit einer CHCls-Behandlung geringe aber signifikante Erho­hung der Membranpermeabilitat (Hoppe, 1980 b; Crowley und Prendeville, 1979), sowie der deutliche EinfluB auf Aufnahmeprozesse unterstreichen die Wirkung von Diclofop-methyl auf die Funktion biologischer Membranen.

Eine Wirkung des Diclofop-methyl als Biosynthesehemmstoff wurde auch mit der Symptomentwicklung in Einklang stehen: Diclofop-methyl fuhrt nach einer Wachs­tumshemmung an Wurzeln und Sprossen vor aHem im Bereich der Vegetations­punkte zu einer Nekrose (Kocher und Lotzsch, 1975; Shimabukuro et aI., 1978; Hoppe, 1980 a). Rasch wachsende Gewebe mit hoher Biosyntheseaktivitiit reagier­ten besonders empfindlich auf das Herbizid.

Die selektive Wirkung von Diclofop-methyl auf die Lipidbiosynthese deutet auf einen spezifischen Eingriff des Herbizids in diesen Stoffwechselbereich hin. Durch weitere Einbauversuche 5011 daher versucht werden, den Eingriff von Diclofop-me­thyl in die Lipidbiosynthese genauer zu charakterisieren.

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Herrn Prof. Dr. R. HeitefuG danke ich fiir die kritische Durchsicht des Manuskriptes und Frau S. Gorlt fur die Mitarbeit bei den Versuchen und die sorgfaItige Durchfuhrung der Zeichen- und Photoarbeiten. Der Hoechst AG danke ich fiir die Bereitstellung des Wirkstoffes Diclofop-methyl sowie fur die Unterstutzung dieser Arbeiten und den Mitar­beitern des Zentralen Isotopenlaboratoriums der Universitat Gottingen fur die Durchfuh­rung der Radioaktivitatsmessungen.

Literatur

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