Efek Ekstrak Kulit Buah Kakao (Theobroma cacao L) terhadap Ekspresi Matrix Metalloproteinase-9 (MMP-9) pada sel kondrosit dan Luasnya Pannus pada jaringan

periartikular Tikus Putih Adjuvant Arthritis

Karyono Mintaroem.*, Nurdiana**, Eko Aprilianto H.***

ABSTRAK

Penyakit muskuloskelatal yang sering dijumpai adalah Rheumatoid Arhtritis (RA). Upaya untuk menagani masalah tersebut digunakan obat-obatan antiinflamasi maupun tindakan operatif. Namun, penatalaksanaan ini relatif mahal dan menimbulkan banyak efek samping. Untuk itu, obat yang mampu menurunkan inflamasi dan perbaikan sendi pada RA sangat diperlukan. Tujuan penelitian ini yaitu untuk membuktikan efek dari ekstrak kulit buah kakao dengan melihat penurunan derajat Pembengkakan, penurunan luas pannus , dan ekspresi MMP-9 pada jaringan periartikuler tikus dengan Adjuvant Arthritis. Penelitian ini merupakan penelitian murni dengan metode Randomized Posttest Only Controlloed Group Design. Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih (Rattus Norvegicus). Untuk mengevaluasi efek anti-artritis ekstrak kulit buah kakao, model tikus artritis ajuvan diberikan induksi Complete Freunds Adjuvant pada bagian ekor dan sela jari kaki. Kulit buah kakao diekstraksi dengan pelarut etanol dan diberikan secara peroral selama 14 hari. Pada penelitian ini hewan coba di bagi menjadi 5 kelompok (n=5), yaitu kontrol negatif, kontrol positif, 3 kelompok mendapat terapi ekstrak kulit buah kakao dengan dosis 20, 30 dan 40 mg/kgBB. Berdasarkan analisis statistik One Way didapatkan perbedaan yang signifikan antara masing-masing kelompok Perlakuan, yang menunjukkan bahwa pemberian ekstrak kulit buah kakao mampu menurunkan derajat pembengkakan kaki tikus. Sedangkan dari analisis Statistik menggunakan Kruskal-Willis juga menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah kakao mampu menurunkan Luas pannus dan ekspresi MMP-9. Dari uji korelasi Pearson,. Kesimpulan dari penelitian ini adalah pemberian Esktrak kulit buah kakao mampu menurunkan progresivitas penyakit berdasarkan derajat pembengkakan kaki tikus, luas pannus pada jaringan periartikuler, serta secara eskpresi MMP-9 pada sel kondrosit.

Kata kunci: Rheumatoid Arthritis, Kulit Buah Kakao, Derajat Pembengkakan, Luas Pannus, Matrix Metalloproteinase-9.

ABSTRACT

The most often musculosceletal disease found in indonesia is Rheumatoid Arthritis (RA). Operative and antiinflammation are used for treatment of this disease but they are costly en Ough and also have the side effects. Another drug which can reduce inflammation and improve joint quality is needed. The objective of this research was to prove the effect of cocoas rind extract by analyzing decreasing of swelling and MMP-9 expression. On the periarticular tissue of white rat with adjuvant arthritis. This research is true experimental by Randomized Posttest Only Controlled Group Design. This sample is white rat (Ratttus Norvegicus). To evaluate the effect of cacaos rind extract, this white rat induced by complete freunds adjuvant in tail and between fingers. Cocoas rind was made using ethanol solvent and administered for 14 days. Samples divided into five groups (n=5), negative control, positive control, three groups administered with cocoas rind extract in a range 20, 30 dan 40 mg/kgBB. Based on statistic analyzing One Way ANOVA continued by Post hoc tukey, show that administration of cocoas rind extract can reduce swellings degree of white rats feet. While statistic analyzing with Mann-Whitney, this extract can also reduce the width of pannus and expression of MMP-9. From Pearson correlation test, it is found that there is strong correlation between these parameters. The conclusions of this research is cocoas rind extract can reduce disease progresivity based on swellings degree, widht of pannus and MMP-9 expression.

Key Word: Rheumatoid Arthritis, Cocoas rind, Swellings degree, Widht of Pannus , Matrix Metalloproteinase-9.

* Laboratorium Patologi Anatomi FKUB ** Laboratorium Farmakologi FKUB *** Program Studi Pendidikan Dokter FKUB

PENDAHULUAN

Gold standard Untuk terapi RA saat ini adalah DMARD, akan tetapi meskipun demikian penggunaan DMARD dalam mengurangi degradasi tulang rawan masih belum cukup adekuat (Daud, 2006). Karena banyak faktor yang menghambat penggunaan DMARD, salah satunya adalah faktor Harga. Pengobatan dengan DMARD membutuhkan biaya yang tidak sedikit. oleh karena itu dalam penelitian ini, kami mencoba menggunakan kulit buah kakao. Beberapa Sumber menyebutkan bahwa kandungan aktif Kulit buah kakao memiliki kemampuan sebagai antioksidan , dimana potensi tersebut mampu digunakan sebagai terapi RA.

Rheumatoid arthritis (RA) merupakan suatu penyakit autoimun kronis dengan gejala nyeri, kekakuan, gangguan pergerakan, erosi sendi dan berbagai gejala inflamasi lainnya (Zacky, 2009). Penyebab RA selama ini masih belum jelas. Namun dicurigai karena faktor kerentanan genetik yang terekspose oleh antigen asing yang kemudian mengalami respon autoiminitas (Baratawidjaja, 2004). Penyakit pada hewan coba standar yang digunakan untuk menjelaskan RA pada manusia dinamakan dengan adjuvant arthritis (Ronaghy, et al., 2002). adjuvant arthritis dapat terjadi melalui induksi Complete Freunds Adjuvant (CFA) pada tikus putih.

Interleukin-1 dan TNF- menstimulasi kondrosit, sinoviosit dan fibroblas untuk mensekresikan matrix metalloproteinase melalui produksi radikal bebas dan NO (Nitrit oxide) pada sel-sel kondrosit, sinoviosit dan fibroblas. Matrix metalloproteinase merupakan kelompok enzim yang berperan dalam erosi tulang dan kartilage (Zacky, 2009). Proses Inflamasi akibat produksi NO serta degradasi kartilage akibat pembentukan protease merupakan patogenesis utama terjadinya penyakit Rheumatoid arthritis.

Diketahui bahwa hambatan pada pembentukan radikal bebas atau produksi NO (Nitrit oxide), dapat menurunkan derajat inflamasi Rheumatoid arthritis, karena dapat menghambat aktivitas matrix metalloproteinase serta menghindari meluasnya Pannus melalui penghambatan proses inflamasi. Matrix

metalloprteinase merupakan enzim yang berperan dalam degradasi pada matrix extracellular, termasuk collagen (Bredveld, 2004). Metalloproteinase-9 (MMP-9) merupakan salah satu dari jenis metalloproteinase yang kadarnya ditemukan cukup tinggi pada penderita rheumatoid arthritis, dan memiliki peran yang cukup besar pada degradasi matrix extracellular (Ryumachi, 1995).

Kulit buah kakao merupakan limbah utama dari dari pengolahan biji kakao yaitu mencapai sekitar 70 % dari keseluruhan buah atau ada juga yang menyebutkan bahwa setiap ton biji kakao kering menghasilkan hasil ikutan 10 ton kulit buah kakao segar (Purnama, 2004; Figueira, dkk., 1993). Padahal, beberapa penilitian menyebutkan bahwa di dalam kulit buah kakao terdapat banyak zat aktif yang bermanfaat bagi kesehatan. Salah satunya adalah cathecin, yang merupakan salah satu polifenol (subclass flavonoid) yang terdapat pada kulit buah kakao (Arlorio et al, 2005; Figuera et al, 1993).

Cathecin merupakan melanosit antioksidan tumbuhan yang bersifat. poliphenolik. Istilah cathecin secara umum digunakan untuk menggantikan family dari flavonoid dan subgroup flavan-3-ols (atau flavanol sederhana) (Ruidavets, 2000).

Tang, et al. (2007) membuktikan bahwa cathecin dapat berperan sebagai antioksidan dengan menetralkan radikal bebas pada tikus putih dengan adjuvant arthritis. Kulit buah kakao (Theobroma cacao L) yang didalamnya terdapat kandungan cathecin diharapkan dapat digunakan sebagai salah satu alternative obat pada penyakit rheumatoid arthritis.

Berdasarkan fakta diatas maka perlu penyelidikan lebih lanjut bagaimanakah Efek cathecin yang terkandung dalam ekstrak kulit buah kakao (Theobroma cacao L) dapat menurunkan ekspresi matrix metalloproteinase-9 dan Luasnya Pannus pada jaringan periartikular tikus putih adjuvant arthritis.

METODOLOGI PENELITIAN

Desain Penelitian Penelitian ini menggunakan desain true experimental in vivo dengan metode Randomized Posttest Only Controlloed Group Design dimana setiap hewan coba memiliki

probabilitas yang sama untuk mendapatkan perlakuan, sehingga dapat menjaga validitas generalisasi ke populasi. Pada penelitian ini akan dilakukan Pemberian ekstrak kulit buah kakao pada model tikus putih artritis adjuvant. Tikus

putih yang telah diinduksi CFA, akan diberi 3 dosis ekstrak kulit buah kakao yang berbeda (P1=20mg/KgBB, P2= 30mg/KgBB, P3=40mg/KgBB), 1 kelompok kontrol positif, dan 1 kelompok kontrol negatif

Populasi dan Sampel Penelitian Penelitian ini akan dilakukan dan Laboratorium Farmako Universitas Brawijaya.

Populasi yang menjadi target penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus). Sampel penelitian yang digunakan adalah tikus putih strain wistar, berbadan sehat, jenis kelamin betina, berat badan 120-200 gram, dan usia 3-4 bulan (dewasa).

Sampel dipilih dengan menggunakan teknik Simple Random Sampling (Sastroasmoro, 1995) Cara Kerja dan Pengumpulan Data

1. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Kakao Pembuatan ekstrak Kulit Buah

Kakao dilakukan dengan memilih Kulit buah yang sudah matang, berwarna Kecoklatan dan segar. Kemudian dihaluskan menggunakan mortar dan pestle, dan diambil sarinya dengan kassa.

2. Pemberian Ekstrak Kulit Buah Kakao

Pemberian ekstrak kulit buah kakao diberikan setiap pagi hari (07.00) pada kelompok perlakuan I (dosis dibawah optimal), II (dosis sesuai optimal), dan III (dosis diatas optimal) secara per oral (p.o) selama, 14 hari dengan menggunakan spuit yang ujungnya dipasang sonde sehingga dapat masuk ke mulut tikus hingga ke lambung.

3. Pengambilan Sampel

Tikus dibuat tidak sadar dengar, cara didislokasi pada bagian leher. Potong kaki kiri bagian belakang lalu cuci dengan larutan PBS untuk bahan analisis. Dimasukkan dalam botol sampel yang telah berisi larutan PBS dan disimpan dalam refrigator. Digunakan kaki tikus bagian kanan belakang dan kaki tikus bagian kanan depan (hanya pada satu tikus untuk setiap kelompok tikus) untuk pembuatan preparat wright. Dicuci dengan larutan PBS dan disimpan pada larutan PFA 4%

4. Metode Pengamatan Luas Pannus Pengamatan sediaan histopatologis

dari pannus dilakukan dengan

menggunakan mikroskop cahaya, binokuler. Pengamatan ini difokuskan pada sinovial, kartilago, dan daerah sekitar kartilago yang mengalami kerusakan. Pembentukan pannus pada permukaan kartilago ditandai dengan sinovial yang menginvasi ke dalam kartilago dan dapat disertai infiltrat mononuklear juga diamati dengan fokus pada pengukuran diameternya sebagai data untuk mencari luas pannus. Pada pengukuran luas area pannus diperlukan alat pengukur mikroskopis yaitu mkrometer. Sebelum pengukuran luas area pannus dilakukan kalibarasi kedua mikrometer tersebut dengan cara : 1. Mikrometer objektif diletakkan diatas

meja objektif dan dicari bayangan skalanya pada perbesaran 100x dan 400x.

2. Mikrometer objektif diambil, sedangkan mikrometer okuler diletakkan di dalam perangkat lensa okuler dan dicari bayangan skalanya pada perbesaran 100x dan 400x.

3. Mikrometer objektif kembali dipasang pada meja objektif. Dengan perbesaran 100x, sekarang pada bidang pandang nampak, baik skala mikrometer objektif maupun okuler.

4. Skala pada ujung kiri dari kedua mikrometer diusahakan saling berhimpitan, kemudian dicari skala terdekat lainnya, dimana skala pada kedua mikrometer itu saling berhimpitan untuk pertama kalinya.

5. Dihitung banyaknya anak skala pada mikrometer objektif (dinyatakan sebagai A) yang terdapat diantara dua skala mikrometer okuler yang berhimpitan (dinyatakan sebagai B). Maka nilai kalibrasi mikrometer okuler ditentukan dengan menggunakan rumus berikut : Kalibrasi mikrometer okuler =( A/B) x 0,01 mm Setelah dilakukan kalibrasi terhadap

kedua mikrometer tersebut, tahap selanjutnya adalah mengukur luas area pannus melalui pengukuran diameter area pannus dan dikonversi menggunakan rumus untuk mennetukan luasnya.

Untuk mengukur luas area pannus dapat dilakukan dengan mengukur diameter dari area yang mengandung sel-sel pembentuk pannus. Pengukuran luas pannus dilakukan sesuai prosedur sebagai berikut :

1. Pasang mikrometer objektif pada mikroskop dan amati pada pembesaran 400x.

2. Temapatkan grasi skala mikrometer objektif tepat ditengah bidang pandang.

3. Hitung jumlah skala mikrometer objektif yang menempati diameter bidang pandang dan lakukan dengan 0,01 mm untuk memperoleh panjang diamteter bidang pandang.

4. Catat anka yang diperoleh. 5. Luas Bidang Pandang dihitung

dengan dihitung dengan rumus : x 3,14 x d2.

Hasil pengukuran luas pannus dicatat kemudian diolah menggunakan analisa data yang telah ditentukan.

5. Penghitungan Ekspresi MMP-9 Setelah dilakukan Pengecatan

Immunohistokimia pada preparat, dilakukan penghitungan ekspresi MMP-9. Penghitungan jumlah MMP-9 dilakukan di bawah mikroskop Olympus, yaitu dengan menghitung rata-rata jumlah sel kondrosit yang mengekspresikan MMP-9 (Berwarna coklat) per lapang pandang sebanyak 20 lapang pandang pada pembesaran 1000x. Sel yang Mengekspresikan MMP-9 akan ditandai dengan warna coklat pada sitoplasma.

HASIL PENELITIAN DAN ANALISA DATA

Hasil Pengamatan derajat pembengkakan Tikus Putih dengan Adjuvant Arthritis

Hasil pengamatan dari penelitian ini didapatkan data kualitatif dari gambaran Pembengkakan Kaki Tikus Dibawah Ini :

Gambar 1. Perbedaan antara kaki tikus

Hasil Pengamatan Makroskopis Derajat Pembengkakan Secara Grafik dapat digambarkan pada Gambar 5.2 :

PRLAKUAN

5.004.003.002.001.00

Mea

n of

BEN

GKA

K

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

Gambar 2. Grafik pengaruh pemberian

ekstrak kulit buah kakao terhadap Derajat Pembengkakan

Dari grafik dan tabel, secara rata-rata Derajat Pembengkakan kaki tikus yang paling besar tampak pada kelompok penelitian kontrol (+) yaitu sebesar 7,16+0,3, berturut-turut semakin kecil yaitu pada kelompok penelitian : P1 (5,920,59) , P2 (5,30,46), P3( 4,680,19) dan Kelompok penilitian yang memiliki rata-rata derajat Pembengkakan paling kecil tampak terlihat pada kelompok kontrol (-) (4,32 0,15) , Untuk Mengetahui Signifikansi dan Korelasi Pengaruh Pemberian Ekstrak Kulit buah kakao terhadap derajat Pembengkakan kaki tikus pada masing-masing kelompok Penelitian, diperlukan analisis Data Menggunakan metode statistik.

Hasil Pengamatan Secara Mikroskopis

Tikus Putih Adjuvant Arthritis Setelah dilakukan pembedahan dan

dibuat sediaan histopatologi dari persendian untuk kemudian dilakukan pengukuran diameter Pannus dengan menggunakan mikrometer. Pengukuran luas Pannus hewan coba dilakukan dengan menggunakan mikrometer yang okular yang telah dikalibrasi dengan mikrometer objektif dengan menggunakan rumus skala mikrometer objektive dibandingkan skala mikrometer okular dikalikan faktor skala yaitu sebesar 0,01 mm. Diameter Pannus dapat diketahui dengan mengukur jarak antara sel-sel pembentuk Pannus sebelah lateral paling kiri dan paling kanan. Sel pembentuk Pannus yang nampak jelas dan dapat dijadikan patokan ukuran adaah sinoviosit yang menginfiltrasi ke dalam kartilago.

Pada proses selanjutnya, dilakukan pengukuran luas Pannus dengan menggunakan rumus x x d2 . Pengunaan rumus ini berdasarkan angapan bahwa luas Pannus yang menutupi kartilago sebanding dengan luas lingkaran (Caprette, 2004). Hasil pengukuran

A B

Luas Pannus pada Jaringan periartikuler tampak pada tabel 5.4 :

Tabel 5.4. Hasil pengukuran Luas Pannus Pada persendian kaki (mm2)

No Kelompok (n=5) Luas Pannus

( SD)

1 Kontrol negatif 0

2 Kontrol positif 39.64+13.27

3 P1 (20 mg/kgBB) 16.68+4.81

4 P2 (30 mg/kgBB) 6.36 +4.19

5 P3 (40 mg/kgBB) 0.88+1.26

Dari data diatas, Luas rata-rata paling

kecil terdapat pada kelompok kontrol (-) dan Luas Pannus rata-rata terbesar terdapat pada kelompok kontrol (+). Sedangkan hasil pengukuran luas Pannus rata-rata dari kelompok P1 sampai dengan kelompok P3 berangsur-angsur mengalami penurunan.

Signifikansi dan Korelasi dari pengaruh Ekstrak kulit buah kakao terhadap Luasnya Pannus pada kelompok penelitian dapat diketahui pada analisis data menggunakan metode statistik.

Hasil Pengamatan Secara

Biomolekuler (MMP-9) Tikus Putih Adjuvant Arthritis .

Hasil pengamatan secara biomolekuler

menggunakan parameter MMP-9 yang ada di sel kondrosit didapatkan dengan pengecatan immunohistokimia pada preparat Jaringan kartilago. Kemudian Hasil pengecatan Immunohistokimia dilihat menggunakan Mikroskop dengan pembesaran 1000x

Preparat positif mengekspresikan MMP-9 apabila terdapat warna coklat pada sel kondrosit periartikuler. Ekspresi MMP-9 dilihat dengan menggunakan mikroskop cahaya pada perbesaran 1000x, kemudian dihitung ekspresinya dengan 2 orang penghitung dalam 20 lapangan pandang dan hasilnya dirata-rata. Data pengihitungan rata-rata jumlah sel kondrosit yang mengekspresikan MMP-9 adalah sebagai berikut :

Tabel 5.5 jumlah sel kondrosit yang

mengekspresikan MMP-9 (Lapang pandang)

No Kelompok (n=5) Ekspresi MMP-9 ( SD)

1 Kontrol negatif 1,44 + 0,14

2 Kontrol positif 6,26 + 0,52

3 P1 (20 mg/kgBB) 4,68 + 0,15

4 P2 (30 mg/kgBB) 2,63 + 0,28

5 P3 (40 mg/kgBB) 2,22 + 0,21

Dari data diatas, Ekspresi MMP-9 pada

sitoplasma sel kondrosit paling sedikit terdapat pada kelompok kontrol (-) dan Ekspresi MMP-9 pada sel kondrosit rata-rata terbanyak terdapat pada kelompok kontrol (+). Sedangkan hasil pengukuran Ekspresi MMP-9 pada sitoplasma sel kondrosit rata-rata dari kelompok P1 sampai dengan kelompok P3 berangsur-angsur mengalami penurunan. Signifikansi dan Korelasi dari pengaruh Ekstrak kulit buah kakao secara makroskopis terhadap Ekspresi MMP-9 pada sitoplasmasel kondrosit pada kelompok penelitian dapat diketahui pada analisis data menggunakan metode statistik.

ANALISA DATA

Untuk Parameter Derajat Pembengkakan kaki tikus, Setelah syarat homogenitas dan Uji Normalitas data terpenuhi, dilakukan uji One Way Anova. Berdasarkan uji tersebut didapatkan nilai signifikansi 0,000; artinya paling tidak terdapat perbedaan Besarnya Derajat Pembengkakan secara bermakna pada dua kelompok. Selanjutnya data hasil penelitian dianalisis dengan menggunakan uji Post hoc untuk mengetahui antara perlakuan mana yang berbeda secara bermakna. Didapatkan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol Positif dengan semua kelompok yang

diberi perlakuan. Perbedaan Bermakna tidak didapatkan Antara kelompok Kontrol negatif dan kelompok perlakuan 3, Selain itu Perbedaan bermakna juga tidak didapatkan antara kelompok perlakuan 2 dan kelompok perlakuan 3 serta 1

Berdasarkan hasil uji Kruskal-Wallis, menunjukkan bahwa Pada Parameter Luas Pannus Jaringan Periartikuler dan Ekspresi MMP-9 di Sel Kondrosit menunjukkan Nilai Signifikansi sebesar 0,000 (p

Buah kakao antara tiap perlakuan terhadap Parameter Luas Pannus dan Ekspresi MMP-9.

Selanjutnya adalah mengolah data yang ada dengan metode post hoc test sebagai uji pembandingan berganda (multiple comparisons) dengan uji Mann-Whitney. Dengan metode ini akan dilakukan pembandingan yang berganda terhadap Luas Pannus dan Ekspresi MMP-9 antara setiap perlakuan.

Untuk mengetahui besarnya hubungan dari Perubahan antara Tiap Parameter pada setiap Perlakuan, maka dilakukan Uji Korelasi,

- Derajat Pembengkakan Kaki Tikus dan Luasnya Pannus pada jaringan Periartikuler memiliki hubungan yang kuat signifikan(p

untuk derajat pembengkakan antara P1, P2 dan P3 dengan kontrol positif. Sedangkan pada uji juga didapatkan bahwa tidak ada perbedaan yang bermakna antara P3 dengan kontrol negatif, ini berarti pemberian terapi ekstrak kulit buah kakao dengan dosis 40 mg/kgBB pada tikus Adjuvant Arthritissecara makroskopis dapat mengembalikan pada keadaan normal. Pengaruh terhadap gambaran Histopatologi Pannus pada jaringan periartikuler.

Pannus adalah suatu eksudat inflammatorik di luar lapisan sel sinovial pada bagian dalam sendi biasanya timbul pada pasien rheumatoid arthritis atau arthritis peradangan lainnya dan kadang menyebabkan ankilosing fibrosa pada persendian (Dordland, 2002). Pannus merupakan jaringan granulasi vaskular yang terbentuk dari sinovium yang meradang. Jaringan ini dapat bertambah luas sampai ke sendi (Price dan Wilson, 2002). Pannus terdiri dari kumpulan sel yang tumbuh kedalam kartilago. Sel-sel itu antara lain makrofag, sinoviosit, fibroblas, dan sel-sel inflamasi (koopman, 1997; Hopkins, 2005). Luas area pannus sangat mempengaruhi kejadian destruksi dari tulang yang terkena. Disekitar area pannus sering kali terlihat degradasi sel kondrosit (Koopman, 1997).

Pada pengamatan sediaan histopatologi, tampak tipe pannus yang terjadi pada hewan coba adalah tipe fibroblastik yang berasal dari sinoviosit dan kondrosit. Hal ini sesuai dengan teori bahwa tipe pannus yang sering dijumpai pada persendian dengan kartilago terdegradasi dan invasi pannus ke dalam kartilago adalah tipe fibroblastik (Zvaifler dan Firestein, 1994).

Pada Kontrol positif didapatkan kerusakan kerusakan kartilago pada hampir semua permukaan sendinya, hal ini kemungkinan disebabkan karena terjadinya ketidakseimbangan antar condroprotektive yang diperankan oleh enzim antioksidan dan makromolekul pelindung kartilago dengan faktor perusak seperti radikal bebas dalam sinovial, matriks yang dikeluarkan oleh sinoviosit dan kondrosit, serta infiltrasi leukosit sehingga proses perluasan dan invasi Pannus lebih cepat terjadi dibandingkan dengan kelompok perlakuan lain.

Efek pemberian ekstrak kulit buah kakao pada tikus Adjuvant Arthritis memberikan gambaran perbaikan histopatologi jaringan periartikuler kaki tikus yang ditandai dengan menurunnya luas pannus yang terbentuk dibandingkan kontrol positif hingga mendekati normal, membran sinovial juga tampak seperti gambaran normal, yaitu tidak mengalami hiperplasia sel fibroblast. Luas Pannus semakin berkurang walaupun masih dijumpai tonjolan-tonjolan halus pada permukaan superfisial

kartilago. Hal ini menunjukkan bahwa pemberian ekstrak kulit buah kakao berpengaruh terhadap penurunan luas Pannus dengan mekanisme yang akan dijelaskan kemudian.

Dari hasil pengamatan uji statistik pada luas pannus dengan menggunakan metode Kruskal-Wallis menunjukkan nilai signifikansi 0,000 yang berarti terdapat perbedaan signifikan antara kelompok perlakuan. Pada uji Mann-Whitney untuk mengetahui secara spesifik kelompok yang mana yang memiliki perbedaan yang signifikan terhadap kelompok pembanding, Hal ini ditandai dengan adanya perbedaan notasi pada masing-masing perlakuan.

Pengaruh terhadap Ekspresi MMP-9

Sitokin proinflamasi (IL-1 dan TNF-) yang dihasilkan selama terjadi RA mampu menstimulasi terjadinya degradasi IB dari kompleks NF-B, sehingga terjadi translokasi sub unit p50/p65 dari sitoplasma ke dalam nukleus. Akibatnya, terjadi proses transkripsi dan translasi dari gen yang disandi seperti inducible nitric oxide synthase (iNOS). Stimulasi produksi NO akibat aktifasi inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS). Reaksi antara NO dengan oksigen radikal pada RA memicu pembentukan peroksinitrit yang merupakan kelompok dari Reactive Nitrogen Species (RNS). Terjadinya peningkatan produksi peroksinitrit akan memperparah kerusakan sendi pada RA (Hitchon and El-Gabalawy, 2004). Hal ini dibuktikan pula bahwa terjadinya korelasi yang kuat antara peningkatan ekspresi iNOS di dalam sel kondrosit RA dengan tingkat kerusakan jaringan sendi. Peningkatan produksi NO di dalam celah sendi juga mempengaruhi peningkatan aktivitas dari enzim cycloxygenase-2 (COX-2) dan matrix metalloproteinase (MMP) yang akan menginduksi terjadinya proses inflamasi dan peningkatan kerusakan kartilago sendi (Hitchon and El-Gabalawy, 2004).

Pada Rheumatoid Arthritis (RA), kerusakan permukaan artikuler adalah akibat dari kombinasi efek radikal bebas dan proteinase yang dilepaskan oleh leukosit polimorfonuklear. Radikal bebas yang dilepaskan oleh sel-sel tersebut dapat mengaktifkan kolagenase laten (Burkhardt,1986). Kerusakan kolagen tipe II pada matriks di zona yang dalam dekat tulang subkondral juga terjadi seperti daerah dekat Pannus. Proses tersebut terjadi berkaitan dengan ekspresi sitokin proinflamasi (IL-1, TNF-) oleh sekitarnya (Lethwaite,1995). Kerusakan kartilago yang terjadi di sekitar sel (pericelluler pattern) pada daerah dekat Pannus maupun dekat tulang menunjukkan degradasi oleh MMP yang dihasilkan oleh kondrosit aktif dan sel-sel sinovial. Sitokin mengaktifkan kondrosit untuk menghancurkan matriks. Sebagian besar

kolagen tipe II pada seluruh kartilago mengalami kerusakan pada RA, seperti pada OA. Perbedaan kerusakan kartilago pada kedua penyakit tersebut adalah pada terbentuknya sitokin prodegradatif yang masif pada RA oleh sel sinovial, makrofag dan tulang subkondral, sehingga kartilago pada RA diserang dari semua sisi (Dodge,1993). Enzim matriks metalloproteinase disekresi oleh sinoviosit dan kondroblas saat merespon pelepasan sitokin. Pada penelitian ini, parameter matriks metalloproteinase yang digunakan adalah dari kelompok protease gelatinase, yaitu matriks metalloproteinase-9. Metalloproteinase-9 (MMP-9) akan mendenaturasi fragmen Collagen, dan secara signifikan akan meningkat pada late stage dalam perkembangan penyakit RA (Sudhakaran,2009)

Analisis statistik menggunakan Metode Kruskal Willis menunjukkan perbedaan bermakna antar perlakuan pada ekspresi MMP-9 (p

KESIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian mengenai pengaruh ekstrak Kulit buah Kakao terhadapa Progesivitas penyakit pada Tikus Putih yang diinduksi Arthritis Adjuvant dapat diambil kesimpulan bahwa:

1. Pemberian Ekstrak Kulit Buah Kakao mampu menurunkan derajat inflamasi, menurunkan Luas Pannus pada jaringan

periartikuler, dan menurunkan ekspresi MMP-9 pada sitoplasma sel kondrosit tikus putih Adjuvant Arthritis.

2. Kulit buah kakao berpotensi sebagai kandidat obat untuk penatalaksanaan RA melalui aktivitas antioksidan yang dimiliki.

.

DAFTAR PUSTAKA

Allard, 1993. Kroncke. 1998. Inducible Nitric Oxide Synthase in Human Disease. (http://www.pubmed.com). Diakses tanggal 07 Oktober 2009 pukul 16.00 WIB.

Arlorio,M; Travaglia, F. Varsaldi,B. 2004. Antioxidant and biological activity of phenolic pigments from Theobroma cacao hulls extracted with supercritical CO2. Universita` degli Studi del Piemonte Orientale..

Baratawidjaja, 2004. Atasi Rheumatoid Athritis Sejak Dini. Yogyakarta : Sejahtera.

Barret, AJ, 1978. The Cystatin : a new class of peptidase inhibitors. TIPS. 12 :193-196.

Bredveld, 2004. The possible role of neuthropil proteinase in damage to articular cartilage. Agents Actions. 8 : 11-18

Buch, Cines, D.B., Pollak, E.S., Buck, C.A., Loscalzo, J., Zimmerman, G.A., McEver, R.P., Pober, J.S., 2003. Treating rheumatoid arthritis with tumour necrosis factor blockade. Page 56-58.

Burkhardt, H., Schwingel, M., Menninger, H., Macarmey, H.W., Tschesche H. 1986. Oxygen radicals as effecters of cartilage destruction. Arth Rheum;29(3):379-387.

Carol V. and Richard M. 2008. The Immune Respons System and Its Regulation. Pniladelpla: Lippincott William & Wilkins. Page 72.

Carter M, 2006. Arthritis Rheumat. Patofisiologi :Konsep Klinis Proses-proses Penyakit/Cetakan I. Jakarta: EGC.

Daud, R. 2006. Artritis Reumatoid. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Cetakan 11. Jakarta: Pusat Penerbitan Departemen 11mu Penyakit Dalam FKUI.

Depperin, 2007. Gambaran Sekilas Industri Kakao. (http:/www.depperin.go.id/PaketInformasi/Kakao/kakao.pdf,2007). Diakses pada tanggal 08 Oktober 2009 pukul 18.00 WIB.

Dogde, 1989. Immunohistochemical detection and analysis of tipe II collagen degradation in human normal, rheumatoid and osteoarthritic articular cartilage and in explants of bovine articular cartilage culture with interleukin. 83;647-661.

Dorland, 2002. Kamus Kedokteran Dorland. Cetakan 29. Jakarta: EGC.

Figueira, A., J. Janick, and J.N. BeMiller. 1993. New products from Theobroma cacao: Seed pulp and pod gum. (http://www.hort.purdue.edu/newcrop/proceedings1993/v2-475.html, diakses 08 Oktober 2009 pukul 16.00 WIB)

Hasan, Wahyu. 2006. Teknologi Pembuatan Pakan Ternak dari Limbah Kulit Kakao. Malang : Bayumedia Publishing.

Hellman DB and Stone JH. 2004. In Arthritis and musculoskletal disorders. Patology 2th.

Hitchon , Carol A and El-Gabalawy ,Hani S. 2004. Arthritis Centre and Rheumatic Diseases Research. Laboratory University of Manitoba, Winnipeg, Manitoba, Canada

Kontinen, 2002. Acidic endoproteinase cathepsin K in the degradation of the superficial articular hyaline cartilage in osteoarthritis. 46:953-960.

Koopman, William, 1997. Hopkins, 2005. Rheumatoid Arthritis. Arthritis and Allied Conditions A Text Book of Rheumatology. 13`h ed. Philadelpia. Williams and Wilkins.

Loekito, 1998. Studi Ekstraksi Pewarna Alami (Antosianin) Ekstrak Kulit Buah Kakao (Theobroma cacao L.) terhadap Stabilitas (Kajian : Konsentrasi NaOH dan Dekstrin) serta analisis Break Event Point dan Payback Periods. Skripsi. Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya.

Mcdonald, 1980. Degradation of fibronectin by human leucocyte elastase. 255 : 8848 8858.

Mitchell R and Vinay K. 2007. Buku Ajar Patologi : Inflamasi Akut dan Kronik. Jakarta: EGC

Noyori, 2004. Rheumatoid Arthritis. Arthritis and Allied Conditions A Text Book of Rheumatology. 13`h ed. Philadelpia. Williams and Wilkins.

Price S and M. Wilson. 2002. Arthritis Rheumatoid. PatofiFiologi :Konsep Minis Proses-proses Penyakit. Cetakan I. Jakarta. EISC.

Shiel, William C. 2005. Rheumatoid Arthritis. (http://www.medicinenel.com). Diakses tanggal 07 Oktober 2009 pukul 16.00 WIB.

Silman, 2002. Epidemiolog and Genetics of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Research. Page 265-272.

SitusHijau, 2006. Manfaat Cathecin untuk Atherosklerosis. (http:/www.situshijau.com/cathecin/). Diakses tanggal 08 Oktober 2009 pukul 18.00 WIB.

Sorsa T, Konttinen YT, 1992. Collagenase in Synovitis of Rheumatoid Arthritis. Finland Department of Anatomy, Helsinki University.

Spencer, Jeremy P. E. 2007. The interactions of flavonoids within neuronal signalling pathways. Genes Nutr 2:257273

Suara karya, 2008 Suara Karya. 2008. Atasi Nyeri Sendi dengan Senam Rematik (http://www.suara-karya-online.com). Diakses tanggal 08 Oktober 2009 pukul 18.00 WIB.

Sunanto, Hatta. 1992. Cokelat : Budidaya, Pengolahan Hasil dan Aspek Ekonominya. Yogyakarta : Kanisius.

Surabaya Post, 2008. Rematik, Amerman Semua Usia. (http://www.surabayapost.co.id) Diakses tanggal 20 September 2008 pukul 16.00 WIB.

Tang, Silman, Racic M, Stadler 2007. Epidemiology and Genetics of Rheumatoid Arthritis. Arthritis Research. 265-272.

Tuminah, S. 2004. Teh Camellia sinensis O.K. var. Assamica (Mast) sebagai Salah Satu Sumber Antioksidan. Cermin Dunia Kedokteran No. 144.

Weigbert BJ, Lang T, Wilkinson WD, Pisetsky DS and Clair EWST. 2006.Serum, Complexities of interpreting nitric oxide measure urinary and salivery nitric oxide in rheumatoid arthritis. Am J. Toxcl.

Wijaya dan suyatna, 2005. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Belimbing Wuluh (Averrhoa bilimbi, l.) terhadap 1,1-diphenyl-2-Picrylhidrazyl (dpph). Jakarta : Fakulktas Farmasi Universitas Setia Budi.

Yerra, Koteswara Raoa, Shih-Hua Fangb, Yew-Min Tzenga. 2004. Institute of Biotechnology, Chaoyang University of Technology. Taiwan : Taichung.

Zacky, 2009. Nitric oxide and arthritis. 36-44.

Zeng QY, Price S., M. Wilson, 2008. Arthritis Rheumatoid. PatofiFiologi :Konsep Minis Proses-proses Penyakit. Cetakan I. Jakarta. EISC.

Zvaifler N.J., Firestein G. 1994. Immunostimulatory RNA Sequences Influence The Course of Adjuvant Arthritis. The Journal of Immunollogy. 168: 51-36.