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LC基礎講座

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いまさら聞けないLC分析のノウハウ〜基礎からトラブルシューティングまで〜

日本ウォーターズ株式会社

©2014 Waters Corporation 1

JASIS 2014 新技術説明会9月5日（⾦） 15:50〜16:15

LC各装置の注意事項

ポンプ– 送液が安定でないと再現性やノイズの原因になる

タインジェクター– メンテナンスが悪いと再現性やピーク形状に影響– クロスコンタミの対策が必要

検出器– 各検出器に応じた注意事項を守る– 環境影響を受けやすい検出器に注意


環境影響を受けやすい検出器に注意

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ポンプ－一般的なポンプの構造（ヘッド）

出口のチェックバルブ

フィルターウォッシュホール

2つのヘッドを並列に配置

入り口のチクバルブ

ボール＆シール

プランジャー

プランジャーシール

2つのヘッドを並列に配置•交互に送液

エアーは脈流の原因（溶媒を取り入れるときヘッド内の圧は大気圧になる）


チェックバルブ溶媒の流れ

⼀定流量が保てる脈流がない送液（圧⼒変動のない送液）

ポンプ－注意点十分な脱気

– 移動相の気泡がポンプヘッド内に残らないように、移動相は脱気（デガス）しておく

– 送液の始めには十分溶媒置換をしてヘッドの空気を追いだしておく構造上注意すべき点

– チェックバルブ（逆流防⽌弁）のつまりo ポンプヘッドの入⼝や出⼝には、ヘッドから押し出された液が逆流して移動相のリザーバーに戻らないようにチェックバルブが取り付けられている

o チェックバルブはシールの上にボールが乗っていて下からの流れではボールが浮き上がり液が流れる上からの流れはボールが抑えつけられて流れない仕組み


り液が流れる。上からの流れはボールが抑えつけられて流れない仕組みo 移動相中のごみがバルブに付くと逆流してしまい、カラムに液を送れなくなるo ろ過したバッファーを使用し、使用後はバッファーの塩類が残らないように十分に水洗する

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オートインジェクター

注入の精密度と正確度は固定ループに近似精密度はオペレタの違に影響されな精密度はオペレーターの違いに影響されない

インジェクターのパージ–注入正確さの確保

ニードルの洗浄液– クロスコンタミの防⽌

注入方式


注入方式– ピーク形状に影響

オートインジェクター－注意点

再現性の確保– サンプル計量用のシリンジに気泡があるとサンプルの吸入が不正確になる

シリンジ内の溶媒を置換する⼿順を⾏い気泡も追い出しておくo シリンジ内の溶媒を置換する⼿順を⾏い、気泡も追い出しておくo 気泡が目で確認できるほど入っている場合は、溶媒置換・エア抜きを2〜3回繰り返し⾏う

クロスコンタミの防⽌直前の分析の汚れを持ち越すこと– オートサンプラーにはニードルや試料注入ポートの洗浄機構があり、サンプルを溶解する適切な洗浄液を設置するo ただし塩類はニードルなどをいためるので使用しない


– ウォーターズ2695では緑のチューブが洗浄液の取り入れ⼝

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LCで仕事をする－操作の流れ

装置に電源投入溶液の調製

– 移動相– ニードル洗浄液– その他

溶液の置換カラム取り付け/送液開始サンプル調製


サンプル調製 LCへサンプル注入

溶液の調製

移動相– 水– 有機溶媒– バッファー

シールウォッシュ液– シールウォッシュはポンプシールに塩が析出するのを防⽌– バッファー系で分析する場合は必須– バクテリア発生を防ぐため数％有機溶媒を含む水溶液を用いる

ニードルウォッシュ液– クロスコンタミ（キャリーオーバ）を防⽌

プ塩液


– サンプルをよく溶かし塩を含まない溶液を選択パージ液

– オートサンプラーの種類によって注入補助溶媒が必要

*メーカーによって各種溶液の呼び名は異なる

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移動相調製の注意点

バッファー調製– 秤量は正確にフレシな水を使用する– フレッシュな水を使用する

o LCグレードの水または超純水装置で製造した水を使用– pH調整前に必ず校正を⾏うo 水系である緩衝液ないしは水溶液の段階での調製が望ましいo 使用カラムのpH許容範囲もあらかじめチェックしておく


清浄な溶媒瓶を使用する—移動相の継ぎ足しはカラムの詰まりやゴーストピークの原因となる


溶媒のろ過—移動相中のごみなどをあらかじめ取り除きカラム及び配管の詰まりを防ぎます

ろ過の⼿順—バッファ類は必ずろ過する— メンブレンフィルターの材質とポアサイズ

o フィルターの材質はろ過する移動相によって選択有機溶媒耐性または有機溶媒及び水溶液耐性などを


o 有機溶媒耐性または有機溶媒及び水溶液耐性などを購入前に確認

o 0.45μmまたはそれ以下のポアサイズのフィルターでろ過o UPLCカラムで分析をする場合は、0.20μmのフィルタでろ過

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混合溶媒の調製—混合方法


MeOH

o メスシリンダーを使用し、正確に混合

—混合の順番o 水／有機溶媒

• 混合する順番は常に同じ順番o バッファー／有機溶媒

• 塩の析出に注意しながら

400 mL H2O

400 mL H2O

600 mL MeOH

H2O0.4 mL/min


塩の析出に注意しながらバッファーに有機溶媒を加えていく

—混合が先か、ろ過が先か？o 先にバッファーのろ過をする

MeOH 0.6ml/min

H2O

600 mLMeOH

溶媒の脱気—脈流の原因となる気泡を取り除く


⼿順—装置にセットする前に脱気

o 減圧o 超音波o 減圧＋超音波（最も効果的）

—装置内での脱気


装置内での脱気o ヘリウムスパージo インラインデガッサー

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溶液の置換-装置中の溶媒の確認

装置内の溶媒状態の把握– これから使用する移動相と相溶性の無い溶媒でないか？逆相の場合o 逆相の場合• 装置内が100%塩溶液や有機溶媒で満たされている場合は水を送液してから移動相に置換

o 順相の場合• 装置内が水系溶媒の場合は水を取り除き、中間溶媒を流してから移動相に置換例）装置内が水系バッファーからヘキサンに置換する場合


水で塩を洗い流す→メタノール→中間溶媒（THF・IPA etc.）→ヘキサン

溶液の置換

ポンプ– プライム/パージ（機種によって呼び名が異なる）プライムシルウシ– プライムシールウォッシュ

オートサンプラー– パージインジェクター/シリンジプライム（機種によって呼び名が異なる）

– ニードルウォッシュ検出器


– RI（示差屈折計）のリファレンスセル

*メーカーによって各種操作の呼び名は異なる

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カラムの取り付け

エンドフィッティング（接続部分）に注意– LCメーカー、カラムメーカー間の違いメカ、カラムメカ間の違o デッドボリウムは測定データに悪影響

0.090" Parker Style

0.130" WatersStyle

ウォーターズ Columns（ Spherisorb 以外）

ウォーターズUPLC＆Spherisorb＆他社メーカーカラム


– フェラルの消耗状態の確認カラムの充塡溶媒の確認

Style

送液開始

事前にカラムの耐圧性能は確認する事– 耐圧の低いカラム流速の変更o 流速の変更

o カラム温度

送液開始後の液漏れ確認– 圧⼒変動を確認する– 変動が大きい場合は、カラム接続部で漏れがないかをまずは確認する


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サンプル調製

必要に応じて除タンパクする– アセトニトリル、アルコールなどモノクル酢酸スルホサリチル酸– モノクロル酢酸、スルホサリチル酸

– 限外濾過– タンパクは変性し強⼒に詰まってしまう

注入前に必ず濾過– メンブレンフィルター 0.45μm以下のフィルターを使用


メンブレンフィルタ 0.45μm以下のフィルタを使用– UPLCカラムで分析する場合は0.20μmのフィルターを使用

サンプル調製-注入溶媒なるべく移動相又はそれに近い組成である事

– 100％有機溶媒 →ピークの割れなどの原因– pHの極端な溶媒 →強塩基はカラムをいためる（ODS）

5 1510 Min.

Sample in Water

0.04 AU

1

23 移動相：0.1%TFA/メタノール

（60/40）


下段のクロマトグラムは移動相よりも溶出⼒の強い溶媒を注入溶媒として用いている

Sample in 80% MeOH 0.02 AU

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サンプル注入

ベースラインが安定しているか？グラジエントの場合ブランクランを必ず測定グラジエントの場合ブランクランを必ず測定

– 移動相由来のゴーストピークがしばしば発生するため

AU

Peak 10n=10

AU

Waters Alliance n=10


33.5Minutes

32.9 33.1 33.3Minutes

0 5 10 15 20 25 30 35 40

トラブルシューティング

正常時/異常時のクロマトグラムの⽐較分析条件の⽐較

分析条件由来の問題カラムガドカラム

ポンプインジェクタ

分析条件の⽐較問題の原因を確認

簡単に対処できる原因から対処する

装置由来の問題


ガードカラム移動相添加剤サンプル、バイアル

インジェクター検出器データ取り込み配管接続配管カラムバイアル

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よくあるトラブル

ゴーストピーク圧⼒が⾼い/低い/不安定ベースラインノイズ保持時間が不安定ピーク形状が異常


ゴーストピーク

ゴーストピークの原因を突き⽌める– 装置、分析条件いずれが原因かを確認する

E 使用時の診断⼿順– Empower使用時の診断⼿順


①プレップ注入の実⾏：インジェクションの動作を⾏わず、データを取り込む②0ul注入の実⾏：インジェクションの動作を⾏い、ブランク液は注入せずにデータを取り込む③④ブランク注入：注入量を変化させてブランクのデータを取り込む

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ゴーストピーク-原因と対策

動作原因対策

移動相の汚染*移動相の再調整 *移動相容器の汚染*市販の水を購入し試す（移動相は継ぎ足しは汚染の原因となりま

①プレップ注入でピーク検出

移動相の汚染す。）*別ブランドの溶媒で試す

カラムの汚染 *カラム洗浄を実施する、新品カラムを使用する。*分析毎にカラム洗浄の工程を追加する

②0μL注入でピーク検出

ニードル洗浄液が流れていない

*パージの実施*洗浄液が流れているかを確認

ニードル洗浄液が不適切

*よりサンプルが溶ける溶液に最適化0.1%ギ酸：アセトニトリル：メタノール：イソプロパノｰル=１：１：１：１の溶液で試す


③④ブランク注入でピーク検出

ブランクの汚染 *注入量に⽐例して強度が変化する場合はブランク溶液を新しくしてみる。溶媒のブランドを変更する、水を変更する。

バイアルの汚染 *強度が注入量に⽐例しない場合は、バイアルのブランドをかえてみる。*セプタムを使用せずに注入してみる

圧⼒異常－圧⼒が⾼い

⾼圧の箇所を探す– フィッティングをゆるめて、圧が下がるかどうか調べてみる– ⾼圧個所がフィルターやカラムであれば交換する

原因– 徐々に上昇する場合

• サンプル、移動相中の粒⼦が徐々に蓄積


サンプル、移動相中粒⼦が徐蓄積インラインフィルターまたはカラム

– 急激に上昇する場合• サンプル中の多量の粒⼦がカラムやチューブに詰まった

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圧⼒異常-⾼圧箇所の確認

流路の末端から⾼圧箇所を確認する①移動相

②ポンプ

③インジェクター

④カラム ⑤検出器

⑥廃液

確認箇所原因対策検出器を外して圧⼒低下セルの詰まりセル洗浄


検出器を外して圧⼒低下セルの詰まりセル洗浄カラムを外して圧⼒低下カラムの詰まりカラム交換/カラム洗浄インジェクターを外して圧⼒低下インジェクターの詰まり⾼圧箇所の部品交換

メーカーに問い合わせポンプ部分だけで圧⼒が⾼いソルベントフィルターの詰まりソルベントフィルター交換

インラインフィルターの詰まりインラインフィルターの洗浄または交換

分離条件により圧⼒が違う－溶媒による圧⼒の差

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各有機溶媒によって粘度が異なります。粘度が⾼いとカラム圧は⾼くなるアセトニトリル50%をメタノール50%に変更した場合のカラム圧は

12345

1

3

4

51.85

0 9

アセトニトリルメタノール

エタノールアセトンTHF

1.85/0.9=2.1倍アップする(20℃)


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0.9

Vol% Water

THF

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トラブル対策－圧⼒が低い・不安定

現象確認事項と対策

圧⼒が低いまたはゼロ溶媒が出⼝から流れているか溶媒がリザーバーにあるか圧⼒が低いまたはゼロ

ポンプが原因溶媒がリザバあるかポンプをプライムし、気泡を追い出すチェックバルブの洗浄または交換

圧⼒が低いまたはゼロポンプ以外が原因

カラム温度が⾼すぎないか？溶媒の種類・流量・カラムが正しいかを確認


圧⼒が不安定

気泡が原因液漏れがないか確認ポンププライム･移動相脱気チェックバルブの洗浄または交換

トラブル対策－ベースラインノイズ

原因が流路系か電気系か特定する– 送液を停⽌し数分間ベースをモニターする

ベースラインノイズが改善– 流路系（ポンプ・移動相・流路・カラム）が原因

ノイズが改善されない– 検出器やデータ処理機の電気的な故障


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短い周期(数秒から数分）

ポンプの圧⼒が⼀定であるか確認する不安定な場合はポンプのパージを実施をかん

トラブル対策-ベースラインノイズ流路系

(数秒から数分）エアをかんでいるミキシング不良→大容量ミキサーの追加

周期的でない不安定なノイズ(スパイクノイズ）

検出器のセル内の気泡が原因セル内のエア抜きを実施するセルのパージ(UV検出器では0.009インチのチューブを30cm程度つなげ背圧をかける,他の検出器は耐圧に注意して0.04インチのチューブを接続)


⼤容量ミキサーエアをかんでいる

ミキシング不良

ベースラインノイズ


⻑い周期（十数分から数時

室温が不安定な場合が多い・カラムヒーターの使用

間）・エアコンの吹出し⼝近くや直射日光が当たる場所は避ける

ベースラインドリフト

平衡化不足移動相の汚れセルの汚れ/カラムの汚れセル・カラムの汚れの場合は、溶出⼒の強い溶媒で洗浄


長い周期のノイズ

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ベースラインドリフト移動相・波⻑によって異なる

10mM Phosphate - Methanol gradient 5-80% in 10 min.

10mM Phosphate - THF gradient 5-80% in 10 min.


25mM Amm. acetate - Methanol gradient 5-80% in 40 min.

50mM Amm. bicarbonate - Methanol gradient 5-60% in 10 min.

トラブル対策－保持時間


保持時間が不安定送液流量の変動や溶媒の混合に問題がある保持時間が不安定圧⼒変動あり

送液流量の変動や溶媒の混合に問題がある不安定な場合はポンプのパージを実施チェックバルブ・ミキサーの確認

保持時間が不安定圧⼒変動なし

カラム平衡化不足イオンペア試薬は特に十分な平衡化が必要グラジエント分の場合平衡化時間は十分に取るともに、平衡化時間を⼀定にする1回目のグラジエント分析は再現が得られない事が多い


保持時間が正しくない

日間で再現性がない場合・カラム、カラム温度、移動相の組成、pHが正しいか確認・流量が正しいか確認装置間で再現性がない場合・グラジエントの場合はシステム容量に相違がないかを確認

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トラブル対策－ピーク形状が異常


カラム劣化によるカラム効率の低下

全てのピークが異常

*ガードカラムの交換*分析カラムの洗浄、交換インジェクターの異常による試料の拡散*溶出の早いピークほど影響されるチューブ内径が大きい、フェラルの取り付けが正しくないカラム・システムの汚れ

溶出の早いピークの異常*インジェクターからカラムまでの間で拡散


特定のピークが異常

インジェクタからカラムまでの間で拡散サンプル溶解溶媒が正しくない*溶出⼒の強い溶媒にサンプルを溶かしている(逆相の場合有機溶媒100％)

*移動相に近い溶液で溶解

トラブル対策－ピーク形状が異常

デッドボリューム

フェラルの取り付けチューブの内径の影響


⻑いチューブもバンドの広がりの原因となる

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トラブル対策－ピーク形状が異常カラム・システムの汚染が原因の場合

カラム汚染– カラムの取扱説明書に沿って洗浄ガドカラムカラムの交換– ガードカラム・カラムの交換

システム汚染– 配管の汚れによりピーク形状が悪くなる場合もある– システム洗浄液例）4液混合液水/メタノール/アセトニトリル/イソプロパノール = 1:1:1:1 (0.2%ギ酸含有)


システム洗浄前/異常時システム洗浄後/正常時

LCの主な消耗部品

ポンプ– プランジャーシールソルベントフィルタ– ソルベントフィルター

– チェックバルブインジェクター

– インジェクターシール– シリンジ– ニードル

カラム


カラム– ガードカラム

検出器– ランプ

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まとめ

LC各装置の注意事項– ポンプ– インジェクター検出器– 検出器

LC操作の流れと注意事項– 溶液の調製– 溶液の置換– カラム取り付け/送液開始– サンプル調整– サンプル注入

トラブルシューティング/よくあるトラブル


– ゴーストピーク– 圧⼒– ベースラインノイズ– 保持時間– ピーク形状– 消耗品

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