elisa & ria.docx

7/27/2019 ELISA & RIA.docx

1/6

ELISA & RIA = tehnici de analiza imunochimica (metode care se bazeaza pe reactii ag-ac, utilizeaza ac

pt a detecta si doza ag)

Definitii

Antigene

Definitia antigenului I :

Ag este orice substanta de origine exo/endogena capabila:

a) sa activeze limfocitele Ag specifice

b) sa interactioneze specific cu receptorii Ag solubili (anticorpii) si/sau Ag membranari

(limfocitele)

Ag pot avea 1 din 4 proprietati posibile:

1. toate Ag interactioneaza cu receptori Ag SPECIFICITATE

2. unele Ag pot interactiona cu receptorii antigenici limfocitari, dar ele NU sunt capabile sa

activeze limfocitele Ag specifice ( haptenele)

3. Ag pot interactiona cu receptorii limfocitari, pot activa limfocitele Ag specifice, dar NU

declanseaza rapunsuri imune (tolerogene)

4. exista Ag care interactioneaza cu receptorii limfocitari, activeaza limfocitele Ag-specifice si au

si proprietati de a declansa raspunsuri imune (imunogene) IMUNOGENITATE

Ag au 2 proprietati importante: - specificitate

- imunogenitate

Ag alcatuit din

1. structura elementara (determinant antigenic, epitop) fata de care se formeaza

ac; este un fragment restrans din ag

2. Restul moleculei de Ag care NU e receptor direct de receptorii Ag, insa are rol de

sustinere a determinantului Ag. acesta = purtator sau carrier

Imunoglobulinele (anticorpii)

Ig sunt glicoproteine (la electroforeza apar in fractiunea -globulinelor) prezente n plasm, lichidele

extracelulare, i secreii i sunt molecule dotate cu proprieti de Ac, adic au capacitatea de a se

combina specific i sunt responsabile de recunoaterea Ag inductor (declanator) al RI. Sunt secretate

de limfocitele B.

Structura de principiu a Ac

- indiferent de clas, Ac sunt constituii din asocierea a 2 perechi de lanuri


2/6

- forma monomeric e format din asocierea unei perechi de lanuri grele (DH) i una de

lanuri uoare (DL)

1. DH

- lungi, constituite din numr mare de aa => au greutate molecular foarte mare

- se asociaz ntre ele prin puni disulfurice

2. DL

- scurte, constituite din numr mic de aa => au greutate molecular mic

- ele sunt asociate la lanurile DH prin puni disulfurice

In alctuirea acestor lanuri intr 2 categorii de secvene:

a.)secvenele variabile ale lanurilor grele i uoare, constituite din primii 110 aa, la

capetele N-terminale .

b.)secvenele constante sunt poziionate ctre captul C-terminale al lanurilor. Ele

sunt responsabile de unele efecte biologice ale Ac

5 clase de Ig(IgG, M, A, E, D).

Ac recunosc si fixeaza specific ag corespunzatoare. Fixarea ag se realizeaza la nivelul zonelor variabile

ale lanturilor grele. Interactiile Ag-Ac se realizeaza prin legaturi de tip dipol-dipol, hidrofob,electrostatic, legaturi de hidrogen.

RIA =Radio Immuno Assay (1950)

In 1977 Rosalyn Sussman Yalowa primi Premiul Nobel pentru medicina pt dezvoltarea RIA pt

determinarea cant de insulina din sange.

Masoara concentratia de ag (ex. hormon) folosind ac specifici. Este f sensibila ,f specifica si ieftina,

dar se folosesc substante radioactive. In prezent inlocuita de tehnica ELISA.

Pe un suport solid se adsoarbe (ataseaza) ac specific pentru proteina (antigenul) de determinat. Seadauga proba (ser) ce contine ag. Se formeaza complexe ag-ac, se spala placa (se indeparteaza ag in

exces care a ramas nelegat). Se adauga un ac marcat izotopic ( cu125

I,131

I)specific proteinei. Se

asteapta formarea complexelor, se spala, se masoara radioactivitatea. Radioactivitatea este

proportionala cu cant de proteina din serul de studiat.

ELISA- Enzyme Linked Immunosorbent Assay (1971)
http://en.wikipedia.org/wiki/Rosalyn_Sussman_Yalowhttp://en.wikipedia.org/wiki/Rosalyn_Sussman_Yalowhttp://en.wikipedia.org/wiki/Rosalyn_Sussman_Yalow


3/6

Placa de microtitrare

Reprezinta la ora actuala una dintre cele mai des folosite metode de identificare si apreciare

cantitativa pt ac, ag, hormoni, citokine si multe alte molecule.

Principiul metodei se bazeaza pe reactia ag-ac. Ag sau ac este fixat pe un suport solid dupa care este

pus in contact cu o imunoglobulina, un antigen sau respectiv orice molecula pentru care are

specificitate. O enzima cuplata fie direct de imunoglobulina sau de un alt ac anti-Ig degradeaza un

substrat cromogen incolor producand un compus colorat ce poate fi detectat spectrofotometric la o

lungime de unda corespunzatoare. Enzima folosita este de obicei fosfataza alcalina sau peroxidaza

din hrean.

Tipuri de ELISA

ELISA Sandwich

1. Se pipeteaza proba (cu Ag) in godeurile cu Ac1 fixat

2. Se incubeaza complexe Ag-Ac1

3. Se spala excesul de Ag (Ag liber)

4. Se pipeteaza Ac2 (marcat enzimatic)

5. Se incubeaza complexe Ac1-Ag-Ac2


4/6

6. Se spala excesul de Ac2 (Ac2 liber)

7. Se adauga substratul colorarea mediului de reactie proportionala cu cantitatea de Ag din

proba

8. Se citeste la spectrofotometru

ELISA Competitiva

1. Se amesteca proba (cu Ag) cu o cantitate cunoscuta de Ac1, in solutie

2. Se pipeteaza amestecul in godeurile cu Ag fixat

3. 2 situatii:

Exces de Ag

Exces de Ac1

Exces de Ag:

Solutie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ag libere

Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat) nu se formeaza complexe Ag-Ac1

fixe

Se spala Ag-Ac1 libere si Ag libere

Se pipeteaza Ac2 in godeuri nu se formeaza complexe Ag-Ac1 - Ac2 fixe

Se spala Ac2 liber (tot Ac2, de fapt)

Se adauga substratul nu apare nicio reactie incolor

Exces de Ac1 :

Solutie (cu Ag) + Ac1 Ag-Ac1 + Ac1 liberi

Se pipeteaza amestecul in godeuri (cu Ag fixat) complexe Ag-Ac1 fixe


5/6

Se spala Ag-Ac1 libere

Se pipeteaza Ac2 in godeuri complexe Ag-Ac1-Ac2 fixe

Se spala Ac2 liber

Se adauga substratul colorarea mediului de reactie i.p. cantitatea de Ag din proba

Se citeste la spectrofotometru

ELISA Indirecta

Dozarea Ac

Ag fixat in godeuri, specific Ac de determinat

Ac primar (Ac1):

=Ac de determinat

Nemarcat enzimatic

Ac secundar (Ac2):

Specific pentru Fc al Ac1

Marcat enzimatic

1.Se pipeteaza proba (cu Ac1) in godeurile cu Ag fixat

2.Se incubeaza complexe Ag-Ac1 fixe

3.Se spala Ac1 liber

4.Se pipeteaza Ac2

5.Se incubeaza complexe Ag-Ac1-Ac2 fixe

6.Se spala Ac2 liber


6/6

7.Se adauga substratul colorarea mediului de reactie proportionala cu cantitatea de Ac1

din proba

Se citeste la spectrofotometru

Avantaje ELISA:

Sensibila, Reproductibila, Cantitati mici de reactivi (ieftina), Determina si Ag, si Ac, Automata (rapida),Noniradianta

elisa & ria.docx

Documents