Arch. Zootec. 47: 299-304. 1998.

FECUNDACIÓN IN VITRO CON SEMEN CONGELADOEN LA ESPECIE PORCINA*

IN VITRO FERTILIZATION WITH FROZEN BOAR SEMEN*

Gadea, J.1, S. Ruiz1, P. Coy1, A. Poto2, B. Peinado2, R. Romar1, I. Campos1 y O. Zubillaga3

1Departamento de Biología Animal (Fisiología Animal). Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia.

30071 Murcia. España.2Centro de Investigación y Desarrollo Agroalimentario. La Alberca. 30150 Murcia. España.3Asociación de Defensa Sanitaria Cordillera-Sur. 30071 Murcia. España.

*Este trabajo ha sido financiado por la ComisiónInterministerial de Ciencia y Tecnología(CICYT). Proyecto AGF96-1069.

RESUMEN

Se ha estudiado el efecto de la concentra-ción espermática (1, 5 y 10 x 106 espermatozoides/ml) y de la presencia de las células epiteliales deloviducto porcino (POEC) en un sistema de fecun-dación in vitro (FIV) utilizando semen congelado.Los resultados muestran que la presencia decélulas epiteliales tiene un efecto positivo en lapenetración de los ovocitos (22,64 vs 11,02;70,09 vs 47,41 y 89,68 vs 56,88) y que laconcentración espermática está directamenterelacionada con las tasas de penetración y elnúmero de espermatozoides que penetran cadaovocito (1,54 vs 2,56 vs 3,05; 1,31 vs 1,82 vs1,92).

Los resultados obtenidos son alentadorespues, por una parte, se consiguen niveles eleva-dos de penetración lo que permite utilizar la FIVcomo una técnica válida para asegurar y compa-rar la capacidad fecundante del semen congela-do y permiten, por otra parte, conseguir embrio-

PALABRAS CLAVE ADICIONALES

Ovocito

ADDITIONAL KEYWORDS

Oocyte

COMUNICACIÓN

nes viables a partir de semen congelado en unas

proporciones muy interesantes y que varían

entre el 10 y el 20 p.100 del total de ovocitos

maduros.

SUMMARY

Effect of sperm concentration (1, 5 and 10 x

106 cells/ml) and the presence of porcine oviductal

epithelial cells (POEC) have been studied by invitro fertilization (IVF) with frozen boar semen.

In this work, the presence of epithelial cells in the

culture has a positive effect on the percentage

of oocyte penetrated (22.64 vs 11.02; 70.09 vs47.41 y 89.68 vs 56.88) and the sperm

concentration has an effect on the penetration

rate and on the number of sperm per oocyte

penetrated (1.54 vs 2.56 vs 3.05; 1.31 vs 1.82 vs1.92).

These are encouraging results because IVF

would be a good tool for evaluating the fertilizing

capacity of frozen boar semen and on the other

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hand, an interesting rate of embryos was obtainedfrom frozen semen (ranged 10-20 p.100 ofmadured oocytes).

INTRODUCCIÓN

La fecundación in vitro (FIV) esuna técnica que permite el estudio delos procesos que conducen a la pene-tración del ovocito por un espermato-zoide y la formación de un zigoto via-ble. Del mismo modo puede ser utiliza-da en la valoración de la capacidadfecundante de los gametos masculinosy es una herramienta que permite laobtención de embriones a partir degametos de alto valor genético.

La producción de embriones me-diante la FIV puede ofrecer una granayuda a los programas de mejora yconservación del patrimonio genético,al permitir la utilización de gametosque, de modo natural, serían inviables.Por otro lado, la aplicación de la técni-ca de criopreservación espermáticapuede ayudar a la conservación delmaterial genético durante largos perio-dos de tiempo. En relación con la FIV,la congelación de semen se determinacomo un instrumento de gran utilidadpara el desarrollo de esta técnica yaque permite aprovechar el semen deun determinado animal en repetidasocasiones para valorar los diferentesfactores que afectan al proceso (Rathy Niemann, 1997), y al mismo tiempo laFIV es una herramienta útil para valo-rar la capacidad fecundante de losespermatozoides (Xu et al., 1996;Gadea, 1997).

Desde los primeros trabajos deNagai et al. (1988), con resultadosnegativos al utilizar semen congelado,

se ha dado un gran paso hasta nuestrosdías donde con técnicas de fecunda-ción in vitro con semen congelado sepuede obtener un número considerablede embriones viables (Wang et al.,1997; Abeydeera et al., 1997). Sinembargo, hasta el momento en la espe-cie porcina, la fecundación in vitrosigue limitada por la presentación dealtas tasas de polispermia. In vivo, lapolispermia está controlada en partepor la acción reguladora del oviducto,demostrándose en muchas especiesque el istmo actúa como un reservoriode espermatozoides, al adherirse éstosa su epitelio. La unión con estas célu-las ayuda a mantener la viabilidad ycapacidad fertilizante y regula el nú-mero de espermatozoides que alcan-zan el ovocito. Diversos autores hanpreincubado los espermatozoides concélulas epiteliales del oviducto en unpaso previo a la fecundación in vitrocomo un método que ha permitido re-ducir las tasas de polispermia (Nagai yMoor, 1990; Dubuc y Sirard, 1995).Sin embargo, no está totalmente acla-rado el efecto de las células epitelialescuando éstas están presentes en elmomento de la fecundación.

El objetivo del presente estudio hasido evaluar el efecto de las condicio-nes de cultivo en un sistema de FIV enel ganado porcino empleando diferen-tes concentraciones de semen conge-lado y la presencia de células epitelialesdel oviducto en el sistema de fecunda-ción.

MATERIAL Y MÉTODOS

MADURACIÓN IN VITROLos ovocitos fueron obtenidos a

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FECUNDACIÓN IN VITRO CON SEMEN CONGELADO EN PORCINO

partir de ovarios procedentes del sa-crificio de cerdas híbridas comercialesde unos 90-100 kg de peso vivo, en elmatadero Industrias Fuertes S.A. Unavez obtenidos los ovarios fueron trans-portados al laboratorio en una soluciónsalina (0,9 p.100 w/v NaCl) con 100mg/l de kanamicina y 50 mg/l de sulfatode polimixina B atemperada a 37°C enun periodo de tiempo inferior a unahora. Los ovarios seleccionados pre-sentaban folículos de tamaño compren-dido entre 3 y 5 mm de diámetro; éstosfueron seccionados con un bisturí pararecoger el contenido folicular que sedispuso en placas de petri con PBSDmsuplementado con 4 mg/ml de alcoholde polivinilo.

El método de maduración utilizadoes el descrito por Yoshida et al. (1992)basado en la utilización del medioWaymouth MB 725/1, suplementadocon un 10 p.100 de fluido folicularporcino, 10 p.100 de suero fetal bovino(FCS), 10 UI/ml de PMSG, 10 UI/mlde HCG, 1 µg/ml de 17ß-estradiol y100 µg/ml de kanamicina. El cultivo serealizó en condiciones estáticas en 3microgotas de 100 ml por placa cubier-tas con aceite de parafina. En cadamicrogota se dispusieron 20 ovocitosque fueron mantenidos durante 44 ho-ras en un incubador a 38,5ºC, saturadode humedad y con un 5 p.100 de CO

2en aire.

CULTIVO DE LAS CÉLULAS EPITELIALES DELOVIDUCTO PORCINO (POEC)

Los oviductos fueron obtenidos enel matadero a part ir de cerdasprepúberes de razas comerciales. Es-tos fueron trasladados al laboratorio ensolución salina con polimixina B ykanamicina a 37ºC, donde fueron di-

secados y sometidos a una solución detripsina al 0,25 p.100 en solucióntamponada de Hepes (Sigma) a 37°durante 45 min. Tras este tiempo seprocedió a la obtención de las célulasmediante la compresión del oviductopara recoger el contenido de la luzoviductal en medio M199 con un 15 p.100 de suero fetal bovino (FCS), peni-cilina y estreptomicina.

Tras la centrifugación, las célulasepiteliales obtenidas fueron sembra-das a una concentración de 750.000células en placas de petri de 35 mm dediámetro en 2 ml de medio M199 y sepusieron en cultivo en un incubador deCO

2 al 5 p.100 y a 39°C. El medio fue

renovado cada 48 horas, comprobandoel crecimiento normal de la monocapade células.

FECUNDACIÓN IN VITROSe utilizó como medio de fecunda-

ción el M199 suplementado (Mattioli etal., 1989). La pajuela de semen, con unvolumen de 5 ml y con un total de 5 x109 espermatozoides, fue descongela-da por inmersión en baño a 42°C du-rante 45 segundos y seguidamente dilui-da en medio BTS en una proporción1:20. Tras el equilibrado, las muestrasseminales fueron sometidas a una pri-mera centrifugación (50 g x 3 minu-tos), de la cual se recogió el sobre-nadante, de manera que se eliminó elsedimento para desechar partículasextrañas y espermatozoides muertos.Seguidamente se procedió a una se-gunda centrifugación (1200 g x 3 minu-tos) de donde se recogió el pellet. Éstese diluyó en el medio de cultivo y seajustó a una concentración final de 1, 5y 10 x 106 espermatozoides/ml, aña-diendo volúmenes de 100 ml a las

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GADEA ET AL.

placas de petri que contenían 2 ml delmedio de fecundación y 20 ovocitosmaduros.

Después de 18 h de cultivo enincubador de CO

2 al 5 p.100 y a 38,5°C,

los ovocitos fueron fijados y teñidoscon una solución de lacmoid al 1 p.100(w/v) y examinados bajo microscopíade contraste de fases a 400x.

DISEÑO EXPERIMENTALEn este estudio se analizó el efecto

de la concentración espermática (1, 5y 10x106 espermatozoides/ml) y la pre-sencia o ausencia de las células POECsobre los resultados de la fecundaciónin vitro. Para ello se evaluaron lossiguientes parámetros: porcentaje depenetración y número de esperma-tozoides por ovocito penetrado. El es-tudio se realizó en 3 replicados en díasdiferentes, siendo posteriormente agru-pados.

ANÁLISIS ESTADÍSTICOLos resultados se expresaron como

la media ± sem. Éstos fueron analiza-dos mediante un ANOVA de doblevía, considerando como efectos princi-pales la concentración espermática yla presencia o ausencia de célulasPOEC. Los valores porcentuales fue-ron previamente transformados. Cuan-do el ANOVA mostró diferencias sig-nificativas, los valores obtenidos fue-ron comparados con un test de Tukey.Se consideraron diferencias estadísti-camente significativas cuando p<0,05.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados se resumen en latabla I . El método de maduración in

vitro de ovocitos utilizado, basado enel medio Waymouth (Yoshida et al,1992), permite obtener unos buenosporcentajes de éxito, como se reflejaen los resultados obtenidos en el pre-sente estudio. Las tasas de madura-ción (núcleos en metafase II) obteni-das en este estudio varían para losdiferentes grupos experimentales en-tre el 92,2 y el 100 p.100, con un valormedio de 96,88 p.100. Del mismo modo,la formación del pronúcleo masculinoen los ovocitos penetrados alcanza unasbuenas proporciones que oscilan entodos los grupos experimentales entreel 62 y el 79 p.100. Este valor dependefundamentalmente del grado de madu-ración alcanzado por el ovocito y de lascaracterísticas del macho utilizado (Coyet al., en prensa) y no tanto de otrascondiciones del cultivo como puedeser el medio utilizado (Wang et al.,1997), la concentración espermática ola presencia de células epiteliales.

En cuanto a las tasas de penetra-ción y al número de espermatozoidespor ovocito, ambos parámetros se venclaramente favorecidos por la presen-cia de las células POEC y por la con-centración creciente de espermatozoi-des, sin embargo la relación no eslineal para la tasa de penetración comolo indica la interacción significativa delos efectos principales.

Otros autores han estudiado la rela-ción entre la concentración espermáticay los resultados de la FIV en variascondiciones de trabajo (Coy et al., 1993;Martínez et al., 1993; Xu et al., 1996),de manera que, para cada macho ysistema de fecundación, puede ajus-tarse la concentración más adecuadaal objetivo propuesto (Test de penetra-ción o producción de embriones).

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FECUNDACIÓN IN VITRO CON SEMEN CONGELADO EN PORCINO

Tabla I. Efecto de la concentración espermática (C) y la presencia de células epiteliales deloviducto porcino (POEC) sobre los resultados de la fecundación in vitro (media ± sem). (Effect

of sperm concentration (C) and the presence of porcine oviductal epithelial cells on the in vitro

fertilization results (mean ±sem)).

C POEC N TP E/Op FPM PFM Rendimiento1

1 x 106 + 106 22,64±4,08a 1,54±0,22a 79,17 50±10,43a 11,32±3,09ab

- 118 11,02±2,89a 1,31±0,17a 76,92 53,85±14,39a 5,93±2,18a

5 x 106 + 107 70,09±4,45c 2,56±0,19ab 62,67 20±4,65ab 14,02±3,37ab

- 116 47,41±4,66b 1,82±0,16a 69,09 29,09±6,18ab 13,79±3,22ab

10 x 106 + 126 89,68±2,72d 3,05±0,19b 75,22 16,81±3,53b 15,08±3,2ab

- 109 56,88±4,77bc 1,92±0,15a 70,97 33,87±6,06b 19,27±3,8b

Fuentes de variaciónPOEC 0,000 0,002 0,99 0,096 0,854concentración 0,000 0,002 0,25 0,003 0,029POEC*concentración 0,027 0,287 0,60 0,610 0,317

TP: Tasa de Penetración (p.100). E/Op: Esperm/ Ovocito penetrado. FMP: Formación del pronúcleomasculino del total de ovocitos penetrados ( p.100). PFM: Pronúcleo femenino y masculino ( p.100).Ovocitos que presentan un pronúcleo femenino y uno masculino del total de penetrados.1Zigotos viables/ovocitos totales.a,b,cDiferentes superíndices en la misma columna indican diferencias significativas (p<0,05).

por una parte, se consiguen nivelesmuy considerables de penetración loque permite utilizar la FIV como unatécnica válida para asegurar y compa-rar la capacidad fecundante del semencongelado y por otra parte, permiteobtener embriones viables a partir desemen congelado en unas proporcio-nes interesantes. Los resultados va-rían entre el 10 y el 20 p.100 de losovocitos utilizados siendo comparablescon los obtenidos por Wang et al.,1997 y Abeydeera et al., 1997. Ade-más es posible modificar otros facto-res del sistema que permitan reducir lapolispermia para poder mejorar la tasade embriones viables, como son el tiem-po de cocultivo y los aditivos.

Las células POEC ejercen un efec-to favorecedor de la penetración puesprobablemente permitan unas condi-ciones mas fisiológicas, permitiendo laliberación al medio de cultivo de hor-monas y factores de crecimiento (Kanoet al., 1994). La utilización de estascélulas en precultivos para la prepara-ción de los espermatozoides ha sidouna técnica utilizada para conseguirmayores tasas de monospermia (Nagaiy Moor, 1990; Dubuc y Sirard, 1995).Sin embargo, bajo las condiciones ex-perimentales utilizadas en este estudiocon elevadas concentraciones deespermatozoides y un largo periodo decocultivo no se detecta este efecto.

Los resultados son alentadores pues,

Archivos de zootecnia vol. 47, núm. 178-179, p. 304.

GADEA ET AL.

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