enzimas de restricciÓn y otras enzimas utilizadas en...
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ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Y OTRAS ENZIMAS
UTILIZADAS EN
INGENIERÍA GENÉTICA
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Importancia en el desarrollo de la ingeniería genética
EcoRI GAATTC
CTTAAG
Restricción-modificación
m
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
m
Metilasa
EcoRI
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
m
mG-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
m
Nucleasa
EcoRI
G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
Nucleasa
EcoRI
G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-G
G A-A-T-T-CC-T-T-A-A G
Sistemas de modificación- restricción:
mecanismo de defensa de las bacterias
contra DNA invasor
Par
endonucleasa + metilasa
misma especificidad
(reconocen la misma
secuencia)
Tipos de enzimas de restricción
Tipo IIs: Reconocen secuencias no palindrómicas, 4-7 pb. Sitio de
corte en la secuencia y hasta 20 pb de distancia
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
- Desoxirribonucleasas, con actividad endonucleolítica, que
reconocen secuncias específicas en el DNA
- Estas secuencias tienen a menudo estructura palindrómica
(simetría), y una longitud de 4, 6, 8 nucleótidos
GTCGAC
CAGCTG
GTAC
CATG
GTCCGGAC
CAGGCCTG
44 46 48
256 4096 65536
Sitios de corte de las endonucleasas de restricción del tipo II
Tipo IIs: MboII
Extremos protuberantes o cohesivos
GAATTC
CTTAAG
G-3’
CTTAA-5’
5’-AATTC
3’-G
EcoRI
5’ protuberantes
Extremos protuberantes o cohesivos
CTGCAG
GACGTC
CTGCA-3’
G-5’
5’-G
3’-ACGTC
PstI
3’ protuberantes
Extremos romos
CCCGGG
GGGCCC
CCC-3’
GGG-5’
5’-GGG
3’-CCC
SmaI
Extremos compatibles (I)
GAATTC
CTTAAG
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
Extremos compatibles (II)
GTCGAG
CAGCTC
GTCGAC
CAGCTG
SalI
CTCGAG
GAGCTC
XhoI
Extremos romos
(siempre compatibles)
CCCATC
GGGTAG
CCCGGG
GGGCCC
SmaI
GATATC
CTATAG
EcoRV
Extremos 5’ protuberantes no compatibles. Rellenados, se transforman en romos
(siempre compatibles)
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
CTCGAG
GAGCTC
XhoI
G-3’
CTTAA-5’
AA T-3’T
5’-TCGAG
3’-CTCG3’-A
GAATT
CTTAA
TCGAG
AGCTC
Klenow + dNTPs
Extremos 3’ protuberantes no compatibles. Degradado de cadena sencilla para
convertirlos en extremos romos
CTGCAG
GACGTC
PstI
C
G-5’
• Nucleasa S1: endonucleasa específica de cadena sencilla
• Mung Bean: endonucleasa específica de cadena sencilla
• T4 DNA polimerasa: Carece de la actividad exonucleasa 5’→3’, pero retiene la
actividad exonucleasa 3’→5’
• Klenow: Carece de la actividad exonucleasa 5’→3’, pero retiene la actividad
exonucleasa 3’→5’
TGCA-3’-3’-3’-3’-3’
Plantas: metilación m5CG y m5CNG.
Uso de endonucleasas con diferente sensibilidad a metilación:
McClelland M. 1983. The frequency and distribution of methylatable DNA
sequences in leguminous plant protein coding genes. J. Mol. Biol. 19: 346-354
Vertebrados: metilación de la C en secuencias CG en el C5, generando 5-
metilcitosina: m5CG. Secuencias (islas) CpG, implicadas en regulación de la
transcripción.
HpaII, MspI: isosquizómeros, reconocen C/CGG
La metilación del ADN en eucariotas superiores está relacionada con la
regulación de la transcripción. El uso de algunas enzimas de restricción
específicas permite distinguir entre ADN metilado y no metilado,
obteniéndose de esta manera información sobre la posible regulación
de la expresión de un gen por metilación del ADN
Aspectos prácticos
Unidad: Cantidad de enzima que digiere 1 mg de ADN en 1 hora a la
temperatura y condiciones óptimas.
Inhibición: Adición de 20 mM EDTA
Inactivación: Por calor o tratamiento con fenol-CIA
Dos enzimas de restricción pueden utilizarse simultáneamente siempre
que compartan las mismas condiciones de digestión (temperatura, pH,
concentración de sales)
POLIMERASAS Y ENZIMAS
MODIFICADORAS DEL ADN
DNA polimerasas: actividades y propiedades
DNA polimerasas: actividades y propiedades
5’ 3’OH
5’3’DNA molde con primer
dsDNA con huecos
Extremos 5’ protuberantes
dsDNA con “nicks” (nick translation)
5’P3’OH 5’P3’OH
Hairpin5’
3’OH
Nick Translation
DNasa I
DNA polimerasa I
DNA polimerasas: utilidades
DNA Polimerasa I
- Marcaje por “nick translation”
Klenow
- Rellenado de extremos 5’ protuberantes
- Síntesis de la segunda hebra de cDNA
T4 polimerasa
- Eliminación de extremos 3’ protuberantes
Taq DNA polimerasa (Vent, Pfu)
- PCR
Transcriptasa reversa (AMV: avian myeloblastosis virus) (MMLV: Moloney murine leukemia virus) (Tth: Thermus thermophylus)
- Síntesis de cDNA a partir de RNA
Enzimas modificadoras: actividades y utilidades
DNA ligasa (del bacteriófago T4)
- Forma enlaces fosfodiester entre un extremo 5’ P y otro 3’OH. Requiere ATP
- Usos: Unir dos moléculas de DNA: vector - inserto
Fosfatasa alcalina (BAP: bacterial alcaline phosphatase) (CIP: calf intestinal alkaline phosphatase) (SAP: shrimp alkaline phosphatase)
- Eliminan el grupo fosfato del extremo 5’ de DNA, RNA y dNTPs
- Usos: desfosforilación de extremos en experimentos de ligación vector-inserto
5’P3’OH 5’P3’OHNNG GATCCNNNNCCTAG GNN
NNGGATCCNNNNCCTAGGNN
Ligasa
NNGGA TCCNNNNCCT AGGNN
LigasaNNGGATCCNNNNCCTAGGNN5’P3’OH
5’P 3’OH
Acción de la DNA ligasa
Enzimas modificadoras: actividades y utilidades
Fosfatasa alcalina
Enzimas modificadoras: actividades y utilidades
Polinucleótido kinasa
- Transfiere el grupo fosfato g desde una molécula de ATP a un extremo 5’ de DNA o RNA
- Usos: Marcaje 5’ terminal de una molécula de DNA
Fosforilación de fragmentos de DNA que carecen de P en 5’ para ligación
Ribonucleasa H (RNasa H)
- Degradación endonucleolítica del RNA en híbridos DNA-RNA
Nucleasas
DNasa I (de páncreas bovino)
- Corta ambas hebras del DNA en presencia de Mn2+. En presencia de Mg2+
corta una sóla hebra (nick)
- Usos: Eliminación de DNA en muestras de RNA (Mn2+)DNA footprinting (Mn2+)Nick translation: generación de nicks para acción de DNA pol. I (Mg2+)