黒毛和種牛における生体内卵子の効率的採取および体外受精成績の向上に関する検討

誌名誌名島根県立畜産技術センター研究報告 = Bulletin of the Shimane PrefecturalLivestock Technology Center

ISSNISSN 18821030

巻/号巻/号 40

掲載ページ掲載ページ p. 1-5

発行年月発行年月 2008年1月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat

〔島根畜技セ研報40:1 ~ 5 (2008))

黒毛和種午における生体内卵子の効率的採取および

体外受精成績の向上に関する検討

長谷川清寿 津 香代子 佐々木恵美 1) 高仁敏光 2) 岡崎尚之

要約 経睦採卵 (OPU)におけるウシ生体内卵子の効率的採取および体外受精 (IVF)成績の向上を目的に、

大卵胞の存在がOPU-IVF成績に及ぼす影響を調査するとともに、卵胞波をコントロールした黒毛和種経産

牛を用いてOPUを実施する時期を検討した。OPU時の長径 8mm以上の卵胞(大卵胞)の有無と卵丘細胞一

卵子複合体 (coc)採取成績およびIVF成績について調査した結果、大卵胞の観察されない個体群(大卵胞

無、 n= 6)でOPU1回あたりの平均採取coc数お よび平均発生旺盤胞数は29.2個および6.8個であったの

に対し、大卵胞を有する個体群(大卵胞有、 n=32)では20.9個および3.9個であった。さらに、プロスタグ

ランジンF2α および性腺刺激ホルモン放出ホルモン製剤 (Gn-RH)を用いた発情排卵誘起処理により新た

な卵胞波を生じさせた供卵牛 (n= 9)を供試して、 OPU時期の検討を試みた。Gn-RH処理 (DayO)後3

日目 (Day3区)および5日目 (Day5区)にOPUを実施した結果、 OPU1回あた りの平均採取coc数お よ

び平均発生脹盤胞数は、 Day3区が17.9個および2.0個、 Day5区が17.0個および2.3個、無処理の対照区が15.7

個および2.6個で、各区の間で差は認められなかった。以上のことから、 OPU時の大卵胞の存在はOPU-IVF

成績にマイナスの影響を与えている可能性が推察されたが、発情排卵誘起処理を用いた卵胞波コントロール

後の 2つのOPU時期 (Day3および、Day5)では、いずれもcoc採取やIVFによる匹盤胞発生への明らかな向

上効果は認められなかった。

キーワード:ウシ 黒毛和種 OPU IVF 発情排卵誘起

近年、生体卵巣から直接卵子を吸引採取する経睦

採卵 (ovumpick up : OPU)技術によって、ウシの

生体内卵子は体外受精 (invitro fertilization : IVF) 技術との組み合わせ (OPU-IVF)で遺伝資源とし

て活用することが可能となっている。元来、 OPU-lVFは人医領域における不妊治療の一手法1)として

開発され、ウシへの応用が図られた 2)。その後、特

定個体からの産子生産の新たな手法としてク ローズ

アップされ、これまでに国内外で様々な知見が蓄積

されてきた 3，4)OOPUの利点のーっとしては妊生産

が継続的に行えることであり 、ま た、育種改良の観

点からみれば優良雌牛の種畜利用としての可能性を

拡大できることである。 OPU-IVF技術については、

連続したOPUでの採取卵子数の減少、発生率のバ

ラツキ、流産や過大子、 ijfの超低温保存法の改善な

どのいくつかの課題が指摘されており へ 体内妊移

植や食肉処理場卵巣由来卵子のlVFijf移植と比べて、

フィールドでの実用例がそれほど多くないのが現状

である 6)。

OPU-IVF技術の フィールドでの実用化に向けて

は、供卵牛として農家繋養牛を想定した場合に必ず

しも連続的な OPUができる状況にはならないこと、

現所属 1)東部農林振興センター出雲家畜衛生部

2 )西部農林振興センター益田家畜衛生部

そして、仮にOPUを連続して行うことができても、

採取卵子数や採取卵子の品質が低い場合には、移植

可能匹が十分確保されず子牛が効率的に生産できな

いといった問題点が生じ、これらは実用化の障壁に

なるー。OPU1回当たりの採取卵子数については、

供卵牛のコンデイション、採取間隔、技術レベルな

どの要因で大きく変動することが知られている 3，71。

最近、 Mertonら8)がOPUの間隔と匪発生成績を詳

細に検討 して、 OPU時に存在する主席卵胞が卵子

の佐発育能にマイナス効果を及ぼすことを示唆した。

そこで、我々は、供卵牛をOPU時の大卵胞の有

無で区分してOPU-IVF成績に違いがあるかどうか

を比較検討した。そしてさ らに、プロスタグランジ

ンF2α(PG) と性腺刺激ホルモン放出ホルモン製

剤 (Gn-RH)を用いた発情排卵誘起処理9)によっ

て生じさせた新たな卵胞波に応じた OPUを行い、

大卵胞の存在がOPU-IVF成績に影響を及ぼすかど

うかを調べた。

材料および方法

実験 1

供試牛は、同一飼養環境下で飼育中で正常発情周

島根県畜産技術センター研究報告第40号 (2008)

期が確認された 2から 16歳の黒毛和種経産牛

(n =38) を用いた。発情周期の任意の時期に、超

音波画像 (Aloka; SSD-1200) で長径 2mm以上の

卵胞数を算定し、同時に長径 8mm以上の卵胞を大

卵胞として計数後、大卵胞の有無で供試牛を 2区分

してOPUを行い、 COC採取およびIVF成績を比較

した。OPUは既報10)に従って行い、超音波画像で

観察可能な卵胞は全て吸引対象とした。採取した卵丘

細胞一卵子複合体 (cumulusoocyte complex : COC)

は、 Haslerらの評価l川こ基づいて明らかに変性した

COCを除き、個体別に成熟培養を行った。成熟培

養は、 5%C02、95%空気の気相条件下の 5%子

牛非働化血清を添加したTCM199培地 (GIBCO) 内

で22から23時間行った。成熟培養後の COCは、 5

X 1Q6/mlに濃度調整した凍結融解精子ドロップ内で

6時間の媒精処理を行った後、卵子周囲に付着して

いる卵丘細胞を除去し、 5%C02、 5%02、90%

N2の気相条件下の改変TCM199培地 (IVD101;機

能性ペプチド研究所)ゆで7日間体外培養して脹発

生を観察した。

実験2

供試牛は、同一飼養環境下で飼育中で正常発情周

期が確認された 3から 14歳の黒毛和種経産牛 (n= 9 )を用いた。 OPU前の卵胞波のコン トロールを

目的とした発情排卵誘起処理は、発情周期 5から15

日目に PG (ジノプロス トとして15mg)、その48時

間後に Gn-RH(酢酸フェルチレ リンとして100μg)

を投与 (DayO) した。試験区は、Gn-RH投与後 3

日目 (Day3区)お よび5日目 (Day5区)に OPUを

行った。対照区では、発情周期の任意の時期に OPU

を行った。供試牛は任意に 3頭ずつの 3グループに

分別し、 1か月間隔で 2試験区および対照区の適用

順序をグループごとに入れ替えて OPUを行った。

OPU、成熟培養、媒精および発生培養は、実験 l

と同じ方法を用いた。ただし、媒精には同一種雄牛

由来かつ同一採取ロッ トの凍結精液を用いた。調査

項目は、 OPU時の計測卵胞数(小卵胞 2mm以上

5mm未‘満、中卵胞 5mm以上8mm未・満、大卵胞:

長径 8mm以上)、採取COCの数と品質およびIVF

後の匪発生成績とした。

統訴処理

各区分間の成績比較にかかる統計処理は、 t検定

(student' s t-test) またはf検定を用いた。

成 績

実験 1

供試牛は、 OPU時に大卵胞が観察されない個体

群 (n= 6) および観察された個体群 (n=32) に

区分した(表 1)。供試牛 1頭あたりの総卵胞数、

採取COC数、 IVF供試数、体外培養後の卵割数お

よび匪盤胞数は、両群聞に明らかな差は認められな

かったが、大卵胞が観察されない個体群でいずれも

多い傾向であった。また、 COC採取率および匪盤

胞発生率についても、両群聞に明らかな差は認めら

れなかったが、大卵胞が観察されない個体群で高率

傾向であった。

実厳2

OPU時に卵胞数 UOPU、mean:l:::SD) を計測した

結果(図 1)、総卵胞数は Day3区が26.3:l:::10.0個、

Day5区が22.4:l:::7.8個、対照区が24.2:l:::9.7個であり 、

有意差は認められなかった。サイズ別の卵胞数は、

中卵胞数についてDay3区 (6.7:l:::3.4個)がDay5区

(3.2:l::: 2.8個)と比べて有意に多かった (P=0.02)。

小卵胞数および大卵胞数については各区間で差は認

められなかったが、 Day3区の大卵胞数 (0.4:l:::0.5個)

はDay5区(1.9:l:::1.5個)と比べて少ない傾向であっ

表 1 OPU時の大卵胞の有無区分別のOPUおよびIVF成績

(mean::tSD)

大卵胞の有無 OPU

による区分 総卵胞数 採取coc数 供試卵数

IVF

卵割卵数 旺盤胞数

無(n=9) 32.3:t17.3 29.2:t18.6 20.0:t12.3 13.0:t13.4 6.8:t11.0

(90.2) 1) (65.0) 2) (34.2) 2)

27.4:t9.3 20.9:t12.3 13.8:t8.5 9.3:t7.6 3.9:t4.7

(76.1) 1) (67.0) 2) (28.2) 2)

有(n=32)

表中の()内の数値は 1)総卵胞数に占める割合(%)，ならびに 2)供試卵数に占める割合(%)

を示す.

円

L

長谷川清寿.i事香代子・佐々 木恵美・高仁敏光・岡崎尚之:黒毛和種牛における生体内卵子の効率的採取および体外受精成績の向上に関する検討

た。OPUによるCOC採取成績(図 2)について、

採取 COC数(jOPU、mean::!::SO) は、 Oay3区が

17.9::!::12.9個、 Oay5区が17.0::!::11.6個で、対照区が

15.7::!:: 13.5個であった。採取 COCに対する変性

COCの割合は、Oay3区が22.4% (34/161)、 Oay5

区が19.6% (30/153) であり、対照区は 17.0%

(24/141)であった。これらの COC採取に関する調

査項目において、各区の数値聞に有意差は認められ

なかった。 IVF後の匪発生を調べた結果(表 2)、

卵割率および妊盤胞発生率、さらに OPU1回あた

りの卵割数および匪盤胞数についても、差は認めら

れなかった。

40

35

30

25

20

15

10

5

0 総卵胞数 小卵胞数 中卵胞数 大卵胞数

図 1 OPU時期別の推定卵胞数OPU時期区分別に， OPU時の卵胞数を示す.卵胞数の区

分は，小卵胞が長径2mm以上5mm未満，中卵胞が長径5mm以上 8mm未満，大卵胞が8mm以上.

考 察

現在、島根県内では、ウシ脹移植技術の普及定着

に伴い、高い経済形質を有する種畜の高度利用に取

り組む産地の増加、 酪農経営の収入源としての和牛

匪移植の要望の急増などに よって、移植に用いる匪

の不足が生じている。これまで20年余りにわたって

普及定着化を進めてきた SOVによる体内匹の採取 ・

利用に加えて、OPU-IVFによって生産される体外

匹の移植が高位安定的な生産技術として普及できれ

ば、技術の選択肢が増え、生産現場の要望に応えて

いくことができる。そして、広域的な活用が可能と

なれば、優良な経済形質を有する雌牛の活用が加速

されるとともに、地域や農場における改良進度が増

(mean:tSD)

80唱

60首

40%

20%

0% 楳取coc数 成熟培養coc数変性coc教 対照区 Day3区 Day5区

図 2 OTu時期別の COC採取成績左図はOPU時期区分別にOPU1回あたりのCOC数を示し，

右図は，採取COC数に占める成熟培養可能COCおよび変性

COCの割合を示す.

表 2 OPU時期別の IVF成績

対照区 Day3区 Day5区

n/OPU n/OPU n/OPU

調査項目n

(mean:tSD) n

(mean:tSD) n

(mean:tSD)

供試卵子 108 12.0:t10.7 113 12.6:t9.3 113 12.6:t8.1

2cell豆 47 5.2:t5.6 48 5.3:t4.1 35 3.9:t2.8

(%) (43.5) (42.5) (31.0)

8cell豆 26 2.9:t3.8 22 2.4:t3.2 21 2.3:t1.9

(%) (24.1 ) (19.5) (18.6)

匪盤胞 23 2.6:t3.2 18 2.0:t2.5 21 2.3:t1.9

(%) (21.3) (15.9) (18.6)

OPU時期区分別にIVF後の発生成績を示す.表中()内の数値は，供試卵子数に対する割合.

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島根県畜産技術センター研究報告第40号 (2008)

し、結果的に農場経営に寄与できると考えられるへ

我々はまず、 OPU1回あたりの採取卵子数およ

び移植可能な IVF匹の発生数を増加させるため、

OPU時の大卵胞の有無が卵子採取成績や発生成績

に影響を及ぼしているかどうかを調査した(実験 1)。

その結果、明らかな差は認められなかったものの、

OPU時に大卵胞が存在しない場合に採取卵子数お

よび発生匹数が多い傾向であり、 Gibbonsら14)ある

いは Mertonら8)の指摘と同様な結果となった。 た

だし、 OPU時に存在した大卵胞が主席卵胞として

機能していたかどうかについては、卵胞波の観察を

行っていないため不明で、あった。 しかしながら、今

回の成績から、 OPU時に大卵胞が存在しない供卵

牛を用いれば、COCが比較的多く採取され、移植

可能な匪盤胞も多く得られる可能性があると推察し

た。 この調査結果を踏まえ、我々は、仮に OPUの

ターゲットとする卵胞内卵子の品質が卵巣に存在す

る主席卵胞と考えられる大卵胞の影響を受けるとす

るなら、発情誘起と排卵処理で卵胞波をリセ ケトし

て新たな卵胞波を生じさせた上で、 OPUのタイミ

ングを設定して検討する必要があると考えた。つま

り、主席卵胞を含む大卵胞が存在する可能性の高い

時期の OPU-IVF成績が、存在する可能性の低い時

期と比べて良好であった場合、大卵胞の有無を想定

した OPU時期の最適化が図れることになると推測

した。

そして今回、 OPUの実施時期について、主席卵

胞が選択されていない時期としてGn-RH投与後 3

日目 (Day3)、そして主席卵胞がすでに選択されて

いる時期としてGn-RH投与後 5日目 (Day5) を設

定して、無処理の対照区との比較を試みた(実験2)。

実際に、 Day5と比べて Day3で、は、明らかにOPU時

に中卵胞数が有意に多く、大卵胞が少ない傾向であっ

たことから、主席卵胞の選択前で大卵胞の出現頻度

が低い時期と考えられた。結果的に、卵胞波コント

ロールを行った供卵牛に対して Day3および、Day5で、

のOPUを行ったが、 COC採取およびIVF匹発生に

関してはいずれも対照区との差は認められず、特定

のOPU時期によるポジテイブな効果は確認されな

かった。そして、発情排卵処理におけるGn-RHの

投与量 9)が影響し、その投与量を減じた場合に有意

な効果が確認できた可能性も考えられたが、明らか

な根拠は見いだせなかった。ただし、Gibbonsら14)、

Mertonら8)およびlmaiら5)はいずれも共存する主席

卵胞の影響を示唆していることから、実験例数を増

やすか、あるいはクローンのような相似性の高い個

体15，16)を用いて検討すれば、明らかな成績差が認め

られた可能性も否定できない。よって、今回と同様

の検討を行う場合では、 COCの外見的評価や IVF

発生成績に加えて、 COCの比重17)、卵丘細胞のア

ポトーシスの出現18)などの評価法も追加する必要が

あるかもしれない。

これまでに他の研究者も、 OPU-IVF成績の向上

につなげるための OPU前処理プログラムを種々検

討している。それらの主体となるのは、前処理プロ

グラムを考案、改良して、体外妊の効率的な確保に

つなげる試み19-23)である。その中で、早坂ら24)は

OPU 6日前のエストラジオール (EB)製剤投与で

発育型の卵胞群を誘起でき 、その結果として採取

COCの品質と匪発生成績を向上させることが可能

であると述べている 。我々も、黒毛和種牛にOPU

の48時間前に卵胞刺激ホルモンあるいはGn-RHを

投与して、非投与群との成績比較を行い、形態的な

COC品質と匹盤胞発生率の向上の可能性を示唆し

た初。 しかし、いずれも再現性の高い確実な手法と

して提案されるまでには至っていない。別の角度か

ら、供卵牛の栄養状態を改善すべきと指摘する研究

者26)もいる。最近、 Leroyら18) はパルミチン酸、ス

テアリン酸などの血中脂肪酸がウシのストレス状態

を反映し、パルミチン酸を成熟培地に添加した場合

での卵子成熟やIVF後の匹発生の低下を報告した。

このような脂肪酸の動向に加え、他の検査可能なパ

ラメータも組み合わせて分析し、農場全体の飼養管

理の改善を誘導することによって、供卵牛からの採

取 COC数や IVFでの脹盤胞の発生数を向上させる

ようなことが可能になるかもしれない。それはまた、

IVF匪のフィールドでの受胎率の高位安定化に向け

たヒントにもなる可能性がある。

参考文献

1) Gleicher N.， et al. Lancet. 27: 508-509， 1983.、

2) Pieterse M.C.， et al. Theriogenology. 27: 751-

762， 1988.

3 )今井 敬・田川真人.日本匪移植学雑誌， 28:

29-35， 2006.

4) Leeuw A.M.W.， et al. Theriogenolog)人 65:914-

925， 2006.

5) Imai K.， et al. Journal 01 Reproduction and

Development. 52: S19-29， 2006.

6 )今井敬.畜産技術， 2: 14-18， 2008.

7)今井敬.ETニュースレター， 29: 1-7， 2005.

8) Merton ].S.， et al. Theriogenology. 59: 651-674，

-4-

長谷川清寿.i率香代子・佐々 木恵美・高仁敏光・岡崎尚之 :黒毛和種牛における生体内卵子の効率的採取および体外受精成績の向上に関する検討

2003.

9) Sato T.， et al. Journal of Reproduction and

Development. 51: 573-578， 2005.

10)長谷川清寿ら.島根県立畜産試験場研究報告，

35: 1-4， 2002.

11) Hasler ].F.， et al. Theriogenology. 43: 141-152，

1995.

12) Abe H. and Hoshi H. Journal of Reproduction

and Development. 49: 193-202， 2003.

13)轟木淳一.日本佐移植学雑誌， 28: 44-47， 2006.

J4) Gibbons ].R.， et al. Theriogenology. 42: 405-

419， 1994.

15)長谷川清寿ら.島根県立畜産試験場研究報告，

36: 33-37， 2003.

16) Yonai M.， et al. Journal of Dauア Science.88:

4097-4110， 2005.

17) Yotsushima K.， et al. Journal of Reproduction

and Development. 53 :971-976， 2007.

18) Leroy ].L.M.R.， et al. Reproduction. 130: 485-

495， 2005.

19) Blondin P.， et al. Biology of R々production. 66:

38-43， 2002.

20) AIgriany 0.， et al. Theriogenology. 62: 1483-

1497， 2004.

21) Berlinguer F.， et al. Theriogenolog)人 65:1099-

1109， 2006.

22) Chaubal S.A.， et al. Theriogenology. 65: 1631-

1648， 2006.

23) Chaubal S.A.， et al. Theriogenology. 67: 719-

728， 2007.

24)早坂駿哉.日本匹移植学雑誌， 28: 94-101，

2008.

25)岡崎尚之ら.島根県立畜産試験場研究報告， 36:

12-15， 2003.

26) Fouladi-Nashta A.A.， et al. Biology of

R々production.77: 9-17， 2007.

-5-