estandarización de la técnica de ensayo cometa
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Ensayo cometaTRANSCRIPT
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UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL
FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES Y MATEMÁTICA
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA
Informe de Prácticas Pre Profesionales I
ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE ENSAYO COMETA
EMPLEANDO GENOTOXICIDAD DE CICLOFOSFAMIDA EN
ERITROCITOS DE SANGRE PERIFÉRICA DE TILAPIA,
Oreochromis sp. EN CONDICIONES DE LABORATORIO
ALUMNA: Marlene Gabriela Espinoza Goyas
TUTORA INTERNA: Blga. Gloria María Sáez Flores
TUTOR EXTERNO: Mg. Carlos Scotto Espinoza
LUGAR DE PRÁCTICAS: Laboratorio de Mejora Genética y Reproducción
Animal
Lima – Perú
2013
2
ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE ENSAYO COMETA EMPLEANDO
GENOTOXICIDAD DE CICLOFOSFAMIDA EN ERITROCITOS DE SANGRE
PERIFÉRICA DE TILAPIA, Oreochromis sp. EN CONDICIONES DE
LABORATORIO
STANDARDIZED TEST TECHNIQUE USING COMET CYCLOPHOSPHAMIDE
GENOTOXICITY OF PERIPHERAL BLOOD ERYTHROCYTE TILAPIA,
Oreochromis sp UNDER LABORATORY CONDITIONS
RESUMEN
El ensayo de cometa, o electroforesis en gel de una sola célula, es un método
genotoxicológico sensible para la evaluación de daños en el ADN en las células
individuales, lo que permite la cuantificación de las roturas del ADN y sitios
lábiles alcalinos. Actualmente, varios grupos de investigación internacionales
han publicado recomendaciones que describen los protocolos y criterios para el
ensayo cometa, cuyo objetivo es establecer altos estándares para obtener
datos válidos, reproducibles y precisos. En el presente estudio, se tuvo como
objetivo estandarizar el ensayo cometa en condiciones de laboratorio con
ciclofosfamida a diferentes concentraciones y periodos de exposición en
eritrocitos de Oreochromis sp., con el fin de ajustar el método con materiales y
equipos con los que se cuentan en el laboratorio de Mejora genética y
reproducción animal. Para la tinción se utilizó una solución de 0.25 % de Nitrato
de plata, 40 µL/100mL de formaldehído al 37% y agua destilada. Se observó
que el uso de las sustancias utilizadas en la metodología fue óptimo para el
desarrollo de la técnica. Se logró observar cometas, éstos, fueron clasificados
visualmente empleando una escala arbitraria de cinco categorías según la
formación de ADN en la cola, asignando a cada cometa un valor.
Palabras clave: Ensayo cometa, estandarización, Oreochromis sp., tilapia,
ciclofosfamida.
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ABSTRACT
The test of comet, or gel electrophoresis of a single cell, is a sensitive
genotoxicologico method for the assessment of DNA damage in individual cells,
which allows the quantification of DNA breaks in the labile alkali and sites.
Currently, several international research groups have published recommendations
describing the protocols and criteria for the comet assay, which aims to set high
standards for valid, reproducible and accurate. In the present study, we aimed to
standardize the comet assay laboratory conditions with cyclophosphamide at
different concentrations and exposure periods in erythrocytes of Oreochromis sp.,
In order to adjust the method and equipment with materials that are counted in
breeding laboratory and animal reproduction. For staining, a solution of 0.25%
silver nitrate, 40 μL/100mL of 37% formaldehyde and distilled water. Observed that
the use of the substances used in the methodology was optimal for the
development of the technique. It was possible to observe comets; they were
classified visually using an arbitrary scale of five categories according to the
formation of DNA in the tail, assigning a value to each kite.
Key words: comet assay, standardization, Oreochromis sp., Tilapia,
cyclophosphamide.
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ÍNDICE
Páginas
I. INTRODUCCIÓN 6
II. MARCO TEÓRICO 7
2.1 Genotoxicidad 7
2.2 Agentes alquilantes 7
2.3 Ciclofosfamida 8
2.4 “Tilapia” Oreochromis sp 9
2.5 Ensayo cometa 9
III. OBJETIVOS 11
3.1 Objetivo general 11
3.2 Objetivos específicos 11
IV. MATERIALES Y MÉTODOS 11
4.1. Animales 11
4.2. Suntancia 12
4.3. Concentración y Tiempo 12
4.4. Materiales 13
4.5. Métodos 13
5.5.1. Ensayo Cometa 13
4.5.1.1. Preparación de la lámina 13
5
4.5.1.1.1. Primera capa de agarosa 14
4.5.1.1.2. Segunda capa de agarosa 14
4.5.1.1.3. Tercera capa de agarosa 15
4.5.1.2. Fase de Lisis 15
4.5.1.3. Fase de denaturación 16
4.5.1.4. Fases de electroforesis 16
4.5.1.5. Fase de neutralización 17
4.5.1.6. Fijación 17
4.5.1.7. Tinción 18
4.5.1.8. Observación de cometas 19
V. RESULTADOS 19
VI. DISCUSIÓN 22
VII. CONCLUSIONES 24
VIII. REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA 25
ANEXOS 29
6
I. INTRODUCCIÓN
El ensayo de cometa, o electroforesis en gel de una sola célula, es un método
genotoxicológico sensible para la evaluación de daños en el ADN en las células
individuales, lo que permite la cuantificación de las roturas del ADN y sitios lábiles
alcalinos. En comparación con otras pruebas de genotoxicidad, las ventajas del
ensayo cometa son la detección de ligero daño en el ADN, el bajo número de
células requerido, de bajo costo, precisión, facilidad de aplicación,
reproducibilidad, y corto período de tiempo para llevar a cabo el experimento.
(Belpaeme et al, 1998;. Tice et al, 2000;. Bücker et al, 2006).
Esta técnica es el resultado de los estudios realizados por Östling y Johanson, que
desarrolló la metodología de electroforesis de ADN en micro-gel, y aquellos por
Singh et al. (1988), que mejoró la técnica. Actualmente, varios grupos de
investigación internacionales han publicado recomendaciones que describen los
protocolos y criterios para el ensayo cometa, cuyo objetivo es establecer altos
estándares para obtener datos válidos, reproducibles y precisos. (Klaude et al,
1996;. Brendler-Schwaab et al, 2005;. Di -Paolo, 2006).
Los peces son considerados como buenos bioindicadores porque dependen de
varios eslabones de la cadena trófica y son capaces de acumular sustancias
tóxicas y responden fácilmente a bajas concentraciones de agentes mutagénicos.
(Gustavino 2001).
En los últimos años, la formación de las alteraciones morfológicas nucleares en
eritrocitos ha sido utilizado por diversos autores como posibles indicadores de
genotoxicidad (Cavas y Ergene-GÖZÜKARA, 2005a, b; Da Silva Souza y
Fontanetti, 2006;. Ergene et al, 2007a ).
El ensayo cometa se ha aplicado con éxito en los eritrocitos de varias especies de
peces, mostrando así la sensibilidad de las células de la sangre de estos animales
a los efectos genotóxicos. (Padrangi et al, 1995;. Belpaeme et al, 1998;.. Gontijo et
al, 2003).
7
Por otra parte es conocido que en los estudios de genotoxicidad in vivo se utilizan
sustancias mutagénicas, dentro de las más utilizadas se encuentra la
ciclofosfamida, la cual es un agente alquilante que causa alcalinación en el anillo
de purina, y esto resulta en una mala codificación y replicación de ADN.
En el presente estudio, se tuvo como objetivo estandarizar el ensayo cometa en
condiciones de laboratorio con ciclofosfamida a diferentes concentraciones y
periodos de exposición en eritrocitos de Oreochromis sp., con el fin de ajustar el
método con materiales y equipos con los que se cuentan en el laboratorio de
Mejora genética y reproducción animal.
II. MARCO TEÓRICO
2.1. Genotoxicidad:
La genotoxicidad es el resultado nocivo de la interacción de agentes químicos o
físicos con el aparato hereditario de la célula, y se manifiesta como alteraciones
genéticas y/o cambios en el número o estructura de los cromosomas, que
pueden incorporarse en generaciones celulares subsecuentes llamadas
mutaciones (Clayson, y Grant, 1992).
2.2. Agentes alquilantes
Los agentes alquilantes comprenden un númeroso grupo de compuestos
químicos que contienen grupos alquílicos, muy reactivos, capaces de formar
uniones covalentes con los puntos nucleófilos (ricos en electrones) de los
compuestos orgánicos (Flores, 2006).
Esta unión se realiza sustituyendo los átomos de hidrógeno por los grupos
alquílicos. A nivel celular, los lugares que se alquilan con mayor frecuencia son,
por este orden, los ácidos nucleicos, las proteínas y los fosfolípidos; las
macromoléculas alquiladas sufren profundos cambios estructurales que se
8
manifiestan en la célula por mutaciones, pérdida de las funciones y muerte
(Flores, 2006).
El DNA es la macromolécula preferentemente afectada. La unión del alquilante
y el DNA se efectúa habitualmente a nivel del nitrógeno 7 de la guanina,
formándose una 7-alquilguanina; a partir de esta unión puede ocurrir que la
base se destruya como tal o que se una a otra base no complementaria (por
ejemplo, tímina, en vez de unirse a la citosina), dando lugar a mutaciones
celulares. La alquilación de dos bases puede provocar la destrucción de ambas,
con la consiguiente pérdida de información genética. La acción citocida parece
estar ligada a la formación de uniones estables guanina-guanina, que
impedirían la separación de las cadenas en el momento de la replicación del
DNA (Llopis, 2009).
2.3. Ciclofosfamida
La ciclofosfamida es un fármaco antineoplásico que también tiene propiedades
inmunosupresoras. Pertenece a la familia de los fármacos alquilantes entre los
que se encuentran el busulfan, clorambucil y melfalan. La ciclofosfamida es
activa en la enfermedad de Hodgkin, el linfoma no de Hodgkin, la leucemia
linfocítica aguda, el carcinoma de mama, el cáncer de ovario, los cánceres
pulmonares, la micosis fungoide, el mieloma múltiple, el neuroblastoma y el
retinoblastoma. También se ha utilizado para tratar enfermedades
inmunológicas como el síndrome nefrótico, la granulomatosis de Wegener, la
artritis reumatoide, la enfermedad injerto contra huésped y el rechazo después
de los trasplantes de órganos.
La ciclofosfamida necesita ser activado por el sistema de enzimas
microsomales hepáticas para ser citotóxico. Esta enzimas hepáticas convierten
la ciclofosfamida en primer lugar a aldofosfamida y 4-hidroxiciclofosfamida, y
luego a acroleína y fosforamida, dos potentes sustancias alquilantes del ADN.
Al reaccionar con el ADN, los agentes alquilantes forman unos puentes que
9
impiden la duplicación del mismo y provocan la muerte de la célula (Enns Et. al.,
1999).
2.4. “Tilapia” Oreochromis sp
Los peces cíclidos Oreochromis (Linnaeus) son uno de los taxones más
importantes en la acuicultura global de hoy (FAO, 1980). El género se
encuentra de forma natural en África oriental y occidental, aunque su
distribución no es continua. Es probablemente el género más extendido y el
más abundante de todas los que han sido introducidos ampliamente en muchas
áreas del mundo (Welcomme, 1981). Estas poblaciones introducidas de
Oreochromis se han creado a partir de una variedad de fuentes naturales y
cultivadas (Trewavas, 1983).
Dentro de las características que tiene paras ser una especie modelo
bioindicadora tenemos la tolerancia a condiciones extremas: resistencia a
concentraciones bajas de oxígeno, niveles altos de amonio, valores bajos de
pH. Fácil manejo: resistencia al manipuleo en siembra, transferencias,
cosechas, manejo de reproductores.
2.5. Ensayo cometa:
Existen una gran variedad de bioensayos útiles para evaluar genotoxicidad,
entre ellos se encuentra el de electroforesis unicelular en gel, llamado
comúnmente ensayo cometa, El cual es un método genotoxicológico sensible
para la evaluación de daños en el ADN en las células individuales, lo que
permite la cuantificación de las roturas del ADN y de sitios lábiles alcalinos. En
comparación con otras pruebas de genotoxicidad, las ventajas del ensayo de
cometa son la detección de ligero daño en el ADN, el bajo número de células
requerido, de bajo costo, precisión, facilidad de aplicación, reproducibilidad, y
corto período de tiempo para llevar a cabo el experimento (Belpaeme et al,
1998;. Tice et al, 2000;. Bücker et al, 2006).
10
Rydberg y Johanson (1978) fueron los primeros en cuantificar directamente el
daño del ADN en las células individuales mediante la lisis de células embebidas
en agarosa en portaobjetos bajo condiciones alcalinas suaves para permitir el
desenrollado parcial del ADN. Después de la neutralización, las células se tiñían
con naranja de acridina y el grado de daño en el ADN se cuantificaba midiendo
la proporción de verde (indicando ADN de doble hebra) a rojo (indicando ADN
de una sola hebra) de fluorescencia utilizando un fotómetro.
Para mejorar la sensibilidad para la detección de daño en el ADN en las células
aisladas, el mismo laboratorio (Ostling, O., and Johanson, K. J., 1984)
desarrolló una técnica de electroforesis en microgel. En esta técnica, las células
estaban incrustadas en gel de agarosa en portaobjetos, se lisaron por los
detergentes y la alta concentración de sal, y luego a electroforesis durante un
corto período de tiempo en condiciones neutras. Las células con aumento de la
pantalla de daño en el ADN aumentó la migración de ADN desde el núcleo
hacia el ánodo. El ADN migración se cuantificó por tinción con bromuro de etidio
y por la medición de la intensidad de fluorescencia a dos posiciones fijas dentro
del patrón de migración con un fotómetro microscopio.
Actualmente, varios grupos de investigación internacionales han publicado
recomendaciones que describen los protocolos y criterios para el ensayo
cometa, cuyo objetivo es establecer altos estándares para obtener datos
válidos, reproducibles y precisos (Klaude et al, 1996;. Brendler-Schwaab et al,
2005;. Di -Paolo, 2006).
El fundamento de este ensayo para detectar daños al ADN producidos por un
rompimiento simple o doble en la cadena, daño oxidativo inducido y
entrecruzamiento de ADN-ADN/ADN-proteína, se basa en la fragilidad que
poseen los sitios dañados; al ser sometidos a un pH superior a trece y su
comportamiento en una electroforesis. Los fragmentos de ADN, producto de la
acción de la sustancia a probar, afectados por el pH alcalino, migran a una
velocidad diferente del resto del material nuclear formando la cola del “cometa”,
entre más larga sea esta porción mayor será el daño ocasionado al ADN.
11
Es una técnica electroforética sensible, reproducible, simple y de gran utilidad
en monitoreo en poblaciones humanas expuestas a radiaciones y a diversas
sustancias mutagénicas.
III. OBJETIVOS
3.1. Objetivo general
Estandarizar el ensayo cometa para evaluar genotoxicidad de ciclofosfamida en
eritrocitos de sangre periférica de tilapia, Oreochromis sp. en condiciones de
laboratorio.
3.2. Objetivos específicos
3.2.1. Estandarizar las sustancias y concentraciones a utilizar en las
diferentes fases del ensayo cometa.
3.2.2. Estandarizar los tiempos de cada fase del proceso.
3.2.3. Ajustar la técnica con los equipos y materiales del laboratorio.
3.2.4. Estandarizar la tinción con nitrato de plata para observarse por
microscopia simple.
IV. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Animales: se trabajó con 112 peces adquiridos en la Facultad de
Pesquería de la Universidad Nacional Agraria La molina. Las medidas de éstos
fueron de 2,5 cm de longitud (juveniles). Se mantuvieron en una piscina de 2,5 x
2,0 x 0.7 m. llena de agua hasta sus tres cuartas partes. Fueron alimentados
con comida peletizada dos veces por día.
12
4.2. Sustancia: la ciclofosfamida se obtuvo del laboratorio NEOPHOS S.A.
presentación en polvo para solución inyectable.
Fig.1 Ciclofosfamida usada para el trabajo
4.3. Concentración y Tiempo: Las concentraciones ensayadas fueron: 2, 4, 6
y 8 mg/L con tres individuos por cada una. Las concentraciones fueron
seleccionadas sobre la base de los resultados de experimentos inmersión por
otros autores para las especies de peces tales como Anguilla anguilla (Pacheco
y Santos, 1996).
Los periodos de sometimiento de los peces a la sustancia fueron de 12, 24, 48,
72 horas. Se hizo dos repeticiones por cada concentración. Y se trabajó con un
control de agua destilada.
Fig. 2 Envases de plástico de 1 litro que contienen los peces a la solución indicada de
ciclofosfamida en agua destilada.
13
4.4. Materiales
Láminas portaobjeto
Láminas cubreobjeto
Probetas
Matraces
Baguetas
Espátulas
Balanza analítica
Fiolas
Erlenmeyer
Beackers
Agua destilada
Cámara electroforética
Microscopio
Estuche de disección
Agarosa bajo punto de
fusión
Agarosa normal punto de
fusión
NaCl
NaOH
Tris
Tritón X-100
Nitrato de plata
EDTA
DMSO
Formaldehído 37%
Ciclofosfamida
PBS 1X
Bencina
Peces Oreochromis sp.
4.5. Métodos:
4.5.1. Ensayo Cometa
4.5.1.1. Preparación de la lámina:
Previamente se limpian las láminas en bencina para retirar la capa de
grasa que contiene, secar con papel tisú para no dejar pelusas.
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4.5.1.1.1. Primera capa de agarosa: en un portaobjetos limpio formar
una capa delgada de agarosa de normal punto de fusión al 1.5%
(Christofoletti et.al, 2009). en un beacker colocar la agarosa líquida y
sumergir el portaobjetos unas 25 – 30 veces dejando un espacio de
30 segundos en cada una. Dejar secar a temperatura ambiente por 1
½ - 2 horas.
Fig. 3 A) Preparación de primera capa de agarosa. B) observación de la
fina lámina formada.
4.5.1.1.2. Segunda capa de agarosa: aplicar sobre la primera capa la
mezcla de 5 µL de sangre periférica de Oreochromis sp. con 85 µL
de agarosa de bajo punto de fusión al 0.5% (Christofoletti et.al,
2009). Colocar un cubreobjetos sobre ella y llevar a 4 °C por 10
minutos.
A B
15
Fig. 4 Formación de la segunda capa de agarosa con la muestra de sangre.
4.5.1.1.3. Tercera capa de agarosa: retirar la laminilla cubreobjetos y
agregar 85 µL de agarosa de bajo punto de fusión 0.5%
(Christofoletti et.al, 2009), colocar una laminilla cubreobjetos y llevar
a 4 °C por 10 minutos.
Fig. 5 Observación de la forma de retiro del cubreobjetos.
4.5.1.2. Fase de Lisis:
Colocar las láminas en una solución de lisis (volumen suficiente como
para cubrirlas) constituida por 2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM Tris
pH10, 20 mL DMSO y 1 mL Triton X-100. Por una hora y media a 4°C en
oscuridad.
A B
16
Fig. 6 A) sustancias químicas utilizadas para la solución de lisis. B) solución de
lisis en láminas con muestra.
Al cabo del tiempo sacar las láminas y lavar con solución de
electroforesis. Dejar secar
4.5.1.3. Fase de denaturación:
Las láminas se colocan en una placa Petri con solución de denaturación
(volumen suficiente como para cubrirlas) compuesta por NaOH 300mM y
EDTA 1mM, pH 12, durante 20 minutos en oscuridad y a 4°C.
Fig.7 Sustancias químicas para la preparación de la solución de denaturación.
4.5.1.4. Fase de electroforesis:
Colocar las láminas en la camára electroforética oscura con solución de
electroforesis (NaOH 300mM y EDTA 1mM) por 20 minutos, 21 V. y 270
mA.
A B
17
Fig. 8 A) fuente de poder y cámara electroforética oscura. B) muestras en
cámara electroforética
4.5.1.5. Fase de Neutralización:
La lámina pasa por tres baños de 5 minutos cada uno con 3 mL de
solución de neutralización: 0.4M Tris-HCl, pH 7.5.
Fig. 9 Sustancias utilizadas para la solución de Neutralización
Dejar secar la lámina.
Fig. 10 Imagen de láminas secando a temperatura ambiente en un lugar tenue
para no alterar la muestra.
4.5.1.6. Fijación
Se sumergieron las láminas en etanol absoluto por 10 minutos. Luego se
dejaron secar.
18
Fig.11 Láminas en fijación con alcohol absoluto
4.5.1.7. Tinción
Se utilizó una solución de 0.25 % de Nitrato de plata, 40 µL/100mL de
formaldehído 37% y agua destilada. Las láminas fueron cubiertas de la
solución por 15 minutos o hasta observar un oscurecimiento de la lámina,
luego enjuagarlas con agua destilada y dejar secar.
Fig 12. A) Nitrato de Plata. B) Solución de nitrato de plata 0.25 %. C) Láminas
en proceso de tinción.
A B
C
19
4.5.1.7. Observación de cometas:
Las láminas se observaron a aumento de 400x.
V. RESULTADOS
Se observó que el uso de las sustancias utilizadas en la metodología fue óptimo
para el desarrollo de la técnica.
En cuanto a la técnica para la formación de la primera capa de agarosa de
normal punto de fusión y el tiempo de secado, se tuvo una fina capa casi
uniforme y una adherencia positiva del gel en el 90% de las láminas que
permitió el óptimo desarrollo de los siguientes pasos.
La rapidez al obtener la muestra de sangre periférica cumple un proceso
importante para evitar la coagulación de una muestra tan pequeña (5 µL). El
éxito de la toma de muestra sin coagulación fue del 95 % del total. Aún así las
muestras que se llegaron a semi coagular se aplicaron en el gel. Al final del
ensayo se observó una sola diferencia entre ellas, la aglomeración de los
cometas en el caso de las láminas con sangre semi coagulada.
El tiempo de 10 minutos para el secado de la segunda y tercera capa de
agarosa fue también importante para no perder muestra mientras se retiraba el
cubreobjetos, pues al dejarlo menos o más tiempo se corría el riesgo de retirar
parte de la muestra por no haberse gelificado bien o por haberse adherido
fuertemente el cubreobjetos al agar impidiendo de las dos formas asegurar que
la muestra se hubiese mantenido allí.
En las fases de lisis, denaturación, electroforesis y neutralización, las
concentraciones de las sustancias se siguieron según lo propuesto en la
metodología de Christofoletti et.al, 2009. En todo momento se minimizó la
exposición a la luz, usando una luz muy tenue o en todo caso muy alejada, lo
20
suficiente como para permitir trabajar. Para la fase de electroforesis la cámara
usada fue negra.
La concentración de nitrato de plata usada en el trabajo mostró una tinción
buena en los cometas observados. El tiempo de tinción fue relativo, en la
mayoría de los casos se esperó 15 minutos para observar el oscurecimiento de
las láminas y un máximo de 25 minutos.
Hubo muerte de algunos de los individuos durante la exposición en las
concentraciones de 8 mg/L en 24 horas, 4mg/L en 48h y 8mg/L en 72 horas.
Aparentemente la muerte de éstos habría sido por condiciones de alimentación
o por la poca concentración de oxígeno disuelto porque en los frascos de
repeticiones de esas mismas concentraciones los peces sí se mantuvieron
vivos.
Para cada lámina, 100 núcleos fueron analizados. Todas las pruebas realizadas
con las diferentes concentraciones de Ciclofosfamida utilizando el ensayo
cometa indican daño en el ADN.
Los cometas fueron clasificados visualmente empleando una escala arbitraria
de cinco categorías según la formación de ADN en la cola, asignando a cada
cometa un valor de 1, sin daño; 2, bajo nivel de daño; 3, daño moderado; 4,
daño elevado ó 5, daño extremo (Kobayashi et al. 1995).
A B
C
21
Fig.13 Cometas observados a 400X A) tipo 3, B y C) tipo 1, D) E) nivel 2, F) tipo 4, G)
tipo 3, H) tipo2, I y J) nivel 4.
D
J
I H
F G
E
22
VI. DISCUSIÓN
La electroforesis en gel de una sola célula se ha usado por los investigadores en
una amplia variedad de organismos y tejidos, mejorando de este modo su utilidad.
Por lo tanto, para entender mejor los efectos de los diferentes valores de pH en los
eritrocitos de las tilapias, se hicieron ciertos cambios, sobre la base de estudios de
Tice et al. (2000), Gontijo et al. (2003) y David (2007), el uso de pH 12,1, el tiempo
de desenrrollamiento equivalente a 20 min y el tiempo de electroforesis de 20 min,
21 V y 270 mA., la variación de pH durante las etapas de lisis y electroforesis
influyen en el tipo de rupturas de ADN que pueden ser detectadas, como se
desnaturaliza ADN y desenrolla en valores de pH de alrededor de 12, debido a las
interrupciones en puentes de hidrógeno entre las cadenas de ADN (Kohn, 1991).
La sensibilidad y la reproducibilidad son puntos críticos para cualquier
biomarcador de daño en el ADN, e incluso cuando es un método estandarizado a
fondo es necesario para poner a prueba la capacidad de los laboratorios para
producir resultados reproducibles.
En el ensayo de cometa, la sensibilidad depende en primer lugar de cómo se llevó
a cabo el ensayo. El uso del tinte, intensidad de éste, cambios en las condiciones
de electroforesis, etc, juegan un papel importante en la sensibilidad (Singh, 2000).
De acuerdo con Padrangi et al. (1995) y Lemos et al. (2005), los diferentes tejidos
de organismos acuáticos se pueden utilizar para el ensayo cometa. Sin embargo,
en la mayoría de los casos, los eritrocitos se han utilizado como células diana, ya
que requieren pequeños volúmenes que se pueden obtener a través de una
técnica no perjudicial y la disociación celular no es necesario (Belpaeme et al.,
1998). Para nuestro caso, al trabajar con animales tan pequeños, la muestra se
obtuvo matando a éstos.
La agarosa forma una matriz de fibras de hidratos de carbono que encapsulan las
células, de anclaje en su lugar. La agarosa se considera que es osmótica-neutro,
por lo tanto, las concentraciones usadas permitieron que las soluciones puedan
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penetrar en el gel y afectar a las células. Aunque otras revisiones nos sugieren
otras concentraciones (Singh, 1988, Wclcomme, 1981, Di-Paolo, 2006) se tomó
las de Christofoletti 2009 por ser empleada específicamente en Oreochromis sp.
En la solución de lisis el papel de cada sustancia es importante; la sal acuosa
altera los patrones de unión dentro de la célula, así como interrumpe el contenido
de ARN de la célula. El detergente se disuelve las membranas celulares. A través
de la acción de la solución de lisis de las células se destruyen. Todas las
proteínas, ARN, membranas y componentes citoplasmáticos y nucleoplasmáticos
se interrumpen y se difunden en la matriz de agarosa. Sólo el ADN de la célula se
mantiene, y se desenreda para llenar la cavidad en la agarosa que toda la célula
anteriormente llena.
En la tinción con nitrato de plata, García et. al., 2004, Wclcomme, 1981, Di-Paolo,
2006 y muchos más usan un método de nitrato de plata con otros componentes.
Algunos de ellos son restringidos en su obtención. Es por eso que se opta por
emplear sólo formaldehído y nitrato de plata en una solución con agua destilada
sacada de un protocolo de tinción en geles de poliacrilamida (Duina Posso Duque
y Thaura Ghneim) modificándolo. El protocolo para la tinción de plata aplicada en
este ejercicio permitió observar los cometas, éste era el principal objetivo de
estandarización. Se podría jugar un poco con la concentración del nitrato de plata,
en este caso, se logró observar bien los cometas.
El laboratorio se acondicionó con respecto a la luz, las ventanas oscuras y la luz
indirecta. El uso de guantes, la rapidez de la toma de muestra, el tiempo de
secado, de exposición a las diferentes soluciones fueron importantes para obtener
resultados confiables y un protocolo que pueda reproducirse.
Se observó que el uso de las sustancias utilizadas en la metodología fue óptimo
para el desarrollo de la técnica.
24
VII. CONCLUSIONES
- Se logró acondicionar la técnica del ensayo cometa a las condiciones del
laboratorio.
- La modificación en la tinción con nitrato de plata, dio resultados objetivos en la
observación de cometas bajo microscopía simple.
- Esta estandarización de la técnica de ensayo cometa es reproducible en
Oreocrhomis sp. bajo diferentes sustancias tóxicas.
25
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Belpaeme K, Cooreman Kand, Kirsch-Volders M (1998) Development
and validation of the in vivo alkaline comet assay for detecting genomic
damage in marine flatfish. Mutat Res Genet Toxicol Environ Mutagen
415:167-184.
2. Brendler-Schwaab S, Hartmann A, Pfuhler S and Speit G (2005) The in
vivo comet assay: Use and status in genotoxicity testing. Mutagenesis
20:245-254.
3. Bücker A, CarvalhoWand Alves-Gomes JA (2006) Avaliação da
mutagênese e genotoxicidade em Eigenmannia virescens (Teleostei,
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29
ANEXOS
Anexo I. Esquema de la formación del cometa propuesta por Shaposhnikov,
et al. 2009. Tomado de http://ddd.uab.cat/record/64777
30
Anexo II. Esquema típico de un portaobjetos con las capas de agarosa
dispuestas tipo sándwich. Tomado de http://ddd.uab.cat/record/64777
Anexo III. Clasificación visual esquemática usada por Kobayashi et al. 1995
Clasificación de 5 clases de cometas. Tomada de
http://ddd.uab.cat/record/64777