evaluación de la efectividad de la proteína ompg
TRANSCRIPT
Evaluación de la efectividad de la proteína OmpG proveniente de Escherichia coli K12
W3110/pCA24N OmpG como biosurfactante y agente viscorreductor en el transporte de
crudo.
JUAN NICOLÁS GUERRA GONZÁLEZ
Proyecto de grado para optar al título de Ingeniero Químico
Asesor,
ANDRES GONZALEZ BARRIOS
Ingeniero químico, M. Sc., Ph. D
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
FACULTAD DE INGENIERÍA
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA
BOGOTA D.C.
JUNIO 2018
Objetivo general:
• Evaluar el efecto viscorreductor de la proteína OmpG de Escherichia Coli K12
W3110/pCA24N OmpG como biosurfactante en las emulsiones crudo-agua/proteína
Objetivos específicos:
• Producir OmpG de Escherichia Coli en escala de laboratorio mediante Erlenmeyers.
• Establecer un protocolo para extracción de OmpG de Escherichia Coli a través de
centrifugación y un proceso de sonicado.
• Realizar emulsiones crudo-agua/proteína con OmpG de Escherichia Coli como
biosurfactante.
• Evaluar la reología de la emulsión variando la concentración de la proteína y la tasa
de cizalla comparando con una emulsión blanco.
Evaluación de la efectividad de la proteína OmpG proveniente de
Escherichia coli K12 W3110/pCA24N OmpG como biosurfactante
y agente viscorreductor en el transporte de crudo.
1. Introducción
En la industria petrolera, existen dos tipos
de crudos que pueden ser obtenidos en los
pozos: ligeros y pesados. En estos últimos
América Latina encabeza el ranking con
las mayores reservas de crudos pesados del
mundo con el 48% mundial. Colombia está
ubicada quinta con el 0,6% del crudo
dentro de este rango [1]. Ahora bien, a la
hora de la extracción del crudo se cuenta
con la presencia de surfactantes
provenientes del mismo donde se forman
emulsiones petróleo-agua que permiten de
cierta forma su extracción y su transporte.
Sin embargo, estas emulsiones debido a
los grados API del petróleo colombiano
(Inferior a 20 y superior a 10) son
demasiado pesadas, lo que está asociado
también a cierto valor de viscosidad [2]
(dentro de 100 a 10000 cP) y esto dificulta
de forma drástica su transporte por los
oleoductos para que llegue a las refinerías
costando tiempo, dinero y daño de las
tuberías.
Generalmente para reducir la viscosidad
del crudo y de la emulsión se cuenta con
diferentes opciones, una de ellas es un
proceso industrial que involucra un
craqueo térmico suave del residuo
atmosférico o de vacío donde se obtiene
productos mejorados y ligeros dentro de
una torre de destilación de petróleo [3].
Otras alternativas, son el aumento de la
temperatura del crudo, la dilución del
crudo con hidrocarburos de bajo peso
molecular, y el uso de los surfactantes
mencionado anteriormente [4]. Esta
última, es generalmente usada ya que se
realiza mediante la estabilización del agua
y del petróleo en una emulsión directa lo
que de cierta forma ayuda al transporte del
crudo. Además, se entiende que los
surfactantes que provienen del petróleo, en
la mayoría de los casos tienden a
contaminar los suelos y a dificultar su
remoción en caso de tener crudo regado
sobre estos. Se observa entonces, como los
surfactantes no son bio-amigables lo que a
futuro representa una gran contaminación
para los suelos y aguas en caso de un
derrame de crudo [5]. Como algunos
ejemplos a mencionar, se encuentra
surfactantes tales como las aminas, los
óxidos de aminas, esteres de ácidos grasos,
jabones, betaínas, opacificantes, etc. [6]
Como alternativa, en los últimos años el
avance de las tecnologías sostenibles ha
logrado impulsar el uso de compuestos
naturales y biodegradables para la
remediación de sitios contaminados por
hidrocarburos, y más importante aún son
usados en la cadena de producción de
petróleo, como la extracción, el transporte
y el almacenamiento [7]. Estos
biosurfactantes en su mayoría son
producidos por organismos vivos como
saponinas producidas por plantas,
glucolípidos producidos por
microorganismos y sales biliares
producidas por animales y son llamados
biotensoactivos debido a sus propiedades
surfactantes producidas por los
especímenes mencionados [7]. Estos
compuestos tienen moléculas anfipáticas
con porciones hidrofílicas e hidrófilas que
actúan en fluidos de diferente polaridad
como lo son el aceite y el agua,
permitiendo una disminución en la tensión
superficial debido al acceso de sustratos
hidrofóbicos, un aumento en el área de
contacto de compuestos insolubles como
lo son los hidrocarburos, y una mejor
biodegradación de estos [8].
Además, los biosurfactantes cuentan con
muchas ventajas sobre los surfactantes
como lo son la biodegradabilidad gracias a
una estructura simple, compatibilidad
ambiental, baja toxicidad, entre otras [9].
Es gracias a estas ventajas que la economía
de los biosurfactantes ha ido creciendo
considerablemente, y se ve claramente en
las proyecciones económicas realizadas en
los últimos años: en 2011 alcanzo US
$1735.5 millones; en 2013 la producción
de biosurfactantes fue de
aproximadamente 344 kilo toneladas; se
estimó que para 2018 esta cuota de
mercado alcanzara los US $2110,5
millones y en 2020 sea de US $2308,8
millones con una producción mundial de
biosurfactantes de alrededor de 462 kilo
toneladas. Finalmente, se espera que la
tasa de crecimiento promedio anual llegue
al 4,3% durante 2014-2020 [10].
Consecuentemente, se utilizará la proteína
OmpG como biosurfactante en este
proyecto, que es una formadora de poros
de las membranas externas de E. Coli.
OmpG es un barril 𝛽 monomérico formado
por 14 cadenas 𝛽antiparalelas con giros
periplásmicos cortos y bucles
extracelulares más largos [11]. La
orientación de OmpG en la membrana está
indicada por la ubicación de los extremos
N y C uno al lado del otro, que están en el
lado periplásmico en todas las porinas de
la membrana externa. Las cadenas β están
conectadas por seis vueltas cortas (T1-T6)
de tres a cinco residuos en el lado
periplásmico, y por 7 bucles más largos
(L1-L7) en el lado extracelular [12]. Esta
proteína cuenta con una zona superior
hidrofóbica y una zona inferior hidrofílica
que le permite tener ese efecto de
surfactante previamente mencionado y se
puede observar en la Figura 1.
Figura 1. Modelo de la proteína OmpG de donde se observa su estructura polar [13].
También se cuenta con un plásmido dentro
de la proteína (Figura 2) que cuenta con
resistencia al cloranfenicol en el gen
cat,que permite que la cepa pCA24N sea
la dominante en los cultivos y se usa
Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido
(IPTG), o en este caso lactosa, como
inductor para el gen promotor que brinde
el gen de interés, en este caso la proteína
OmpG por medio del promotor 𝑃𝑇5−𝑙𝑎𝑐.
Figura 2. Plásmido de E. Coli con sus respectivos genes [14].
Ahora bien, en este proyecto se pretende
evaluar la efectividad de la proteína
transmembranal OmpG proveniente de
Escherichia Coli K12 W3110/ pCA24N
OmpG como agente viscorreductor en el
transporte de petróleo divida en 3 partes
importantes: realizar una curva de
crecimiento de Escherichia Coli K12
W3110/ pCA24N OmpG para saber el
momento exacto de inducción de lactosa,
obtención de la proteína y su
cuantificación en la solución para preparar
emulsiones petróleo/agua y realizar
pruebas reológicas a cada una de las
emulsiones propuestas para observar su
comportamiento de viscosidad a distintas
tazas de cizalla.
2. Metodología
2.1. Curva de crecimiento en
Erlenmeyer
En primera instancia, se preparó Agar LB
(2 g de Triptona, 2 g de NaCl, 1 g de
Extracto de levadura y 3 g de Agar) en
solución de 200 ml en un Erlenmeyer de
500 ml el cual fue autoclavado
posteriormente. Cuando este estuviera a
una temperatura media, se agregaron 200
𝜇L de cloranfenicol a una concentración
de 25 mg/ml (0,25 g de cloranfenicol y 10
ml de Etanol) y se vertieron 25 ml en 7
cajas de Petri para realizar luego el cultivo
de la bacteria Escherichia Coli K12
W3110/ pCA24N OmpG. Este cultivo se
hizo mediante una siembra por
agotamiento, con el fin de generar colonias
aisladas en las distintas cajas de Petri.
Después de realizar la siembra, se
introducen las cajas a la incubadora y se
dejan por 17 horas a 37 °C (condiciones
overnigth).
Posteriormente, se prepara el medio LB
liquido (10 g de Triptona, 10 g de NaCl y
5 g de extracto de levadura) en Erlenmeyer
de 1 L para solución de 1 L en un frasco
Shott. Se preparan 50 ml de medio en 3
Erlenmeyer de 250 ml y se realiza la
inoculación de la bacteria de medio solido
a liquido con ayuda de las puntas de la
micropipeta y se deja el cultivo en la
incubadora-shaker por 16 horas a 37 °C y
250 rpm.
Consecuentemente, se realizan pruebas de
absorbancia de los 3 Erlenmeyers con
cultivos de 50 ml para saber cuánto
volumen del cultivo se deben agregar a las
3 soluciones con volumen total de 200 ml.
Finalmente, se realiza la inoculación de los
medios líquidos de 50 ml a los medios
líquidos de 200 ml y se toman medidas de
absorbancia en el tiempo 0, cada 30
minutos durante 4 horas, y luego cada hora
hasta un tiempo total de 8 horas.
2.2. Inducción con lactosa
Para lograr la sobreexpresión de la
proteína se hace uso de lactosa, que se
introduce en el inoculo a una
concentración de 30 g/L, de esta forma
para un Erlenmeyer de 400 ml le
corresponden 3 gramos de lactosa.
2.3. Centrifugación previa a proceso
de sonicado
Para lograr obtener un pellet donde se
encuentren las bacterias con la proteína es
necesario realizar un proceso de
separación. Para esto, se decide hacer uso
de la centrifugadora refrigerada a
condiciones de 4500 rpm durante 1 hora y
4°C. Se remueve el pellet de los envases
usados en el equipo y se almacenan en
tubos falcon de 50 mL estériles.
2.4. Proceso de sonicado
Una vez obtenido el pellet en los falcons,
es necesario hacer uso del buffer de lisis o
de sonicación pH 8.0 (6,89 g de fosfato de
sodio monobásico, 17,55 g de NaCl, 100
𝜇L de Tween 20, 10 mL de Triton, se lleva
a volumen con agua desionizada) en una
relación de 1:6. Se hace uso del sonicador
de punta para romper las bacterias y liberar
las proteínas que se encuentran en la
membrana con una amplitud de 37% en 40
ciclos de 20sX40s con baño de hielo.
2.5. Centrifugación final
Después de haber sonicado, se introducen
los falcons en la centrifugadora refrigerada
a una velocidad de 4500 rpm durante 1
hora y 4°C. De esta forma, se logra separar
la proteína que queda en el sobrenadante
del producto del proceso de separación.
2.6. Cuantificación de proteínas
Para lograr cuantificar la proteína se hace
uso del Nanodrop a una longitud de onda
de 280 nm, donde se usa el buffer de lisis
como blanco, donde se entiende que es la
cantidad total de proteína incluyendo
OmpG obteniendo los siguientes
resultados:
Tabla 1. Resultados para la cuantificación de proteínas en Nanodrop
Blanco (Sin inducción) 0,18
mg/mL
Inoculo con Lactosa 0,64
mg/mL
2.7. Caracterización del crudo
En este apartado, se quiere hallar la
densidad del crudo con el que se va a
trabajar por medio de un picnómetro
metálico, y a su vez hallar la viscosidad y
el esfuerzo cortante del crudo a diferentes
tasas de cizalla en el reómetro AR-G2.
2.8. Desarrollo de emulsiones
Para las emulsiones se hará uso de crudo
en 70 %w/w y se variará la concentración
de proteína para 0,0075 %w/w, 0,01
%w/w, 0,015 %w/w y 0,02 %w/w. Se
prepararán usando el sonicador de punta
en 40 ciclos de 20sX40s a una amplitud de
37% y se realizarán pruebas reológicas en
el reómetro AR-G2 variando la tasa de
cizalla desde 1 hasta 750 𝑠−1.
2.9. Preparación de la emulsión
blanco con cultivo sin inducción
Para esta emulsión, se debe cuantificar la
cantidad de proteína diferente a OmpG
dentro de la solución blanco. Se hace uso
entonces del HPLC con el método de fase
inversa para péptidos y purificación de
proteínas, que hace uso de Acetonitrilo
(ACN) y Ácido Trifluoroacético (TFA) al
0,1% v/v que ayuda al emparejamiento de
los iones en las proteínas y ayuda en el
ensanchamiento de los picos arrojados por
el equipo para mejorar su lectura [15]. Se
hacen 3 barridos a 210, 260 (expresión de
acidos nucleicos) y 280 nm (expresión de
proteinas) y se cambian las composiciones
en la fase móvil de los compuestos
anteriores a lo largo de la prueba para
cambiar su polaridad y mejorar la lectura
de los picos. Dichos porcentajes se
presentan en la tabla 2.
Tabla 2. Porcentajes de ACN y TFA durante la prueba en el HPLC
Minuto %ACN %TFA 0,1
0 5 95
10 5 95
25 30 70
45 60 40
50 5 95
Este método se aplicó para una solución de
OmpA purificada, OmpN purificada,
OmpG con inducción de lactosa y OmpG
sin inducción para poder saber en qué
tiempo se empiezan a presentar las
proteínas de interés y lograr cuantificar la
producción de OmpG en la solución sin
inducir.
3. Resultados
3.1. Curva de crecimiento en
Erlenmeyer
En primera instancia, se plantean 3
inóculos como replicas biológicas, y al
momento de hacer la toma de datos en cada
tiempo se realizaron 3 mediciones de
forma que se cuente con replicas técnicas.
Como fue mencionado en el apartado 2.1
se obtuvieron resultados de absorbancia de
los preinóculos de 50 ml para saber que
volumen debe agregarse del cultivo a los
inóculos de 200 ml y así también saber
cuánto medio agregar. Los resultados se
pueden observar en la tabla 3.
Tabla 3. Resultados de absorbancia para los preinóculos de 50 ml después de 16 horas a 37 °C y 250 rpm
Inóculo 1 1,623 A
Inóculo 2 1,616 A
Inóculo 3 1,641 A
Ahora bien, a partir de la ecuación 1 se
pudo encontrar los volúmenes de cultivo
que se deben agregar a los inóculos de 200
ml para obtener una absorbancia en el
tiempo 0 de 0,15 A.
𝐷0 ∗ 𝑉0 = 𝐷𝐹 ∗ 𝑉𝐹 (1)
Donde D es la densidad óptica o
absorbancia inicial (absorbancia del
preinóculo) y final (absorbancia deseada
en el tiempo 0), y V es el volumen del
inoculo donde el inicial es la cantidad por
agregar del preinóculo de 50 ml al
siguiente inoculo y el volumen final son
los 200 ml que se desean como solución.
Inóculo 1
𝑉0 =200 𝑚𝑙 ∗ 0,15 𝐴
1,623 𝐴= 18,48 𝑚𝑙 (2)
Inóculo 2
𝑉0 =200 𝑚𝑙 ∗ 0,15 𝐴
1,616 𝐴= 18,56 𝑚𝑙 (3)
Inóculo 3
𝑉0 =200 𝑚𝑙 ∗ 0,15 𝐴
1,641 𝐴= 18,28 𝑚𝑙 (4)
De esta forma, se realizaron entonces las
mediciones de absorbancia en los tiempos
mencionados en el apartado 2.1 y los
resultados de las mediciones se pueden
observar en el Anexo 1. A continuación se
muestra la figura 3 que describe el
crecimiento de inóculos Escherichia Coli
K12 W3110/ pCA24N OmpG en 8 horas.
Figura 3. Curva de crecimiento de Escherichia Coli K12 W3110/ pCA24N para un tiempo total de 8 horas.
Como se puede ver en la figura 3 se tiene
un comportamiento muy similar para los 3
inóculos, de donde se pueden distinguir 3
fases claves: lag, exponencial y
estacionaria. Según la 3 grafica, la fase lag
se da desde el tiempo 0 hasta los primeros
30 minutos, con un rango de absorbancia
de 0,253 a 0,302 en promedio. La fase
exponencial ocurre desde los 30 minutos
hasta alrededor de las 3 horas en un rango
de absorbancia de 0,302 hasta 0,930.
Finalmente, la fase estacionaria ocurre
desde las 3 horas hasta las 8 horas, donde
se empieza a observar el comportamiento
estacionario donde no ocurre más
crecimiento de bacterias en el inóculo.
De esta forma, se puede observar que en 2
horas se puede realizar la adicción del
agente inductor (lactosa) al cultivo para
lograr obtener la proteína de interés.
3.2. Caracterización de crudo
El crudo usado para el desarrollo de los
experimentos cuenta con una densidad de
0,86 g/ml, y se le desarrollaron pruebas
reológicas para saber su viscosidad y
esfuerzo cortante a diferentes tazas de
cizalla en el reómetro AR-G2. En cuanto a
los grados API, se hace uso de la siguiente
ecuación:
°𝐴𝑃𝐼 =141.5
𝐺𝐸− 131.5 (5)
Donde GE es la gravedad especifica del
crudo, que al ser el agua el fluido de
referencia se puede aproximar a la misma
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Ab
sorb
anci
a [A
] a
60
0 n
m
Tíempo [h]
Replicas Biológicas (Absorbancia vs Tiempo)
Inóculo 1
Inóculo 2
Inóculo 3
densidad del crudo, dando como resultado
que se trabaja con un crudo de 33° API.
Respecto al esfuerzo cortante contra la tasa
de cizalla se obtuvieron los siguientes
resultados:
Figura 4. Tasa de cizalla v esfuerzo cortante para prueba reológica de crudo
Como se puede observar en la figura 4, se
ve como al aumentar la tasa de cizalla, el
esfuerzo cortante va aumentando de forma
lineal al principio de la prueba de
cizallamiento. Sin embargo, después de los
200 𝑠−1 existe una disminución en la
viscosidad que posteriormente aumenta.
Si, se observa este comportamiento con
mas detenimiento, se puede ver que se
trata de un fluido de tipo no newtoniano
pseudoplastico ya que comienza con un
incremento en la viscosidad y
posteriormente intenta mantenerse
constante [16].
Ahora bien, en cuanto a la viscosidad
contra la tasa de cizalla se obtuvieron los
siguientes resultados:
Figura 5. Tasa de cizalla vs viscosidad para prueba reológica de crudo
Se puede ver en la figura 5 como el crudo
comienza con una viscosidad de 6,96 Pa*s
y comienza a disminuir gradualmente con
el aumento de la tasa de cizalla, donde
después de los 200 𝑠−1 se ve un cambio
significativo en la viscosidad llegando a
alcanzar valores de hasta 1,49 Pa*s
teniendo una reducción bastante amplia.
Esto permite confirmar que se trata de un
fluido no newtoniano pseudoplastico.
3.3. Resultados del HPLC
De acuerdo con los resultados obtenidos
para OmpA y OmpN a 280 nm que se
encuentran en el Anexo 2, se encuentra
que alrededor de los 40 minutos de prueba
se encuentra un pico que significa la
expresión de la proteína transmembranal,
lo que sirve de comparación para encontrar
la expresión de OmpG en su respectiva
prueba ya que los pesos de las proteínas
0
200
400
600
800
1000
1200
0 200 400 600 800
Esfu
erzo
co
rtan
te [
Pa]
Tasa de cizalla [1/s]
Tasa de cizalla vs Esfuerzo cortante
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 200 400 600 800
Vis
cosi
dad
[P
a.s]
Tasa de cizalla [1/s]
Tasa de cizalla vs Viscosidad
involucradas en las pruebas son similares
y deben absorber la luz en un tiempo
similar (OmpN: 39 kDa; OmpA: 32 kDa;
OmpG: 31 kDa) [17].
Ahora bien, en la figura 6, se observa el
resultado obtenido para OmpG inducido
en contraste con OmpG sin inducir a 280
nm. Se puede ver como evidentemente se
encuentra un pico en los 40 minutos de
prueba que confirma la existencia de
OmpG en ambas soluciones y la
sobreexpresión de la proteína. De acuerdo
con los resultados obtenidos para OmpG a
280 nm (figura 6) y 260 nm (Anexo 3), se
puede cuantificar la concentración de
OmpG total dentro de la solución sin
inducir por medio de la ecuación 7 que es
la misma que utiliza el nanodrop para
hacer su cuantificación [18].
𝑃𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 (𝑚𝑔
𝑚𝑙) = 1,55 ∗ 𝐴280𝑛𝑚 − 0,76 ∗ 𝐴260𝑛𝑚 (7)
Se toma entonces el pico que se encuentra
en los 40 minutos de prueba para el blanco
y se encuentra que la absorbancia a 260 nm
es de 0,0058 UA y a 280 nm es de 0,015
UA.
Haciendo uso de la ecuación 7 se obtiene
una concentración total de OmpG en la
solución de proteínas sin inducción de
lactosa de 0,017 mg/ml. Si se realiza la
diferencia entre la cuantificación total de
proteínas arrojada por el Nanodrop para el
blanco (Tabla 1) se obtiene la
concentración de proteínas que no son
OmpG, concentración necesaria para
elaborar la emulsión que será el blanco en
el experimento y que servirá como punto
de comparación y su valor es de 0,16
mg/ml.
3.4. Cálculo de volúmenes
Para realizar las emulsiones, primero se
debió definir un peso esperado de la
emulsión, el cual fue establecido en 12 g
debido al uso de la punta del sonicador.
Posteriormente se hicieron los cálculos
para el volumen de crudo, proteína y agua
en la emulsión vistos en el Anexo 4.
Figura 6. Resultados HPLC para OmpG sin inducir (superior) y OmpG inducido (inferior) a 280 nm. Encerrado en rojo se evidencia la sobreexpresion de la proteina transmembranal correspondiente.
3.5. Efecto para la concentración de
proteína
Como se puede ver en la figura 7, las
emulsiones presentan un comportamiento
de fluido no newtoniano pseudoplastico ya
que se observa una disminución drástica
de viscosidad en los primeros 100 𝑠−1 y
se reduce con menor efectividad hasta los
750 𝑠−1 [19]. Ahora bien, los valores de
viscosidad bajos pueden ser explicados
gracias a dos factores importantes: que se
está trabajando con un tipo de crudo de
peso liviano y el efecto viscorreductor que
posee la proteína. En primera instancia, las
emulsiones con 30% w/w de agua con este
tipo de crudo tienen viscosidades desde
0,04 Pa*s hasta 0,01 Pa*s [20] por lo que
es de esperarse que se tengan valores bajos
de viscosidad. Segundo, se ve claramente
como a medida que la cantidad de proteína
va aumentando, se va disminuyendo la
viscosidad donde la efectividad se ve
claramente reflejada en los valores
proporcionados en el Anexo 5. Entonces,
para el primer nivel de proteína que actúa
como el mínimo en el experimento a 100
𝑠−1 se tiene un valor de viscosidad de 0,10
Pa*s, mientras que, para el cuarto nivel
que actúa como el máximo a 100 𝑠−1 se
tiene un valor de viscosidad de 0,0036
Pa*s. Consecuentemente, se puede
observar una efectividad entre el primer y
cuarto nivel del experimento del 96,5%.
Tomando en cuenta lo mencionado en el
anterior párrafo, se puede entender como
la proteína OmpG cuenta con ese efecto
viscorreductor gracias a que la mayoría de
los biosurfactantes residen
predominantemente en la interfaz
hidrocarburo/agua, cubriendo la superficie
de las gotas de hidrocarburos,
protegiéndolos de la coalescencia y
manteniendo la viscosidad reducida a lo
largo del tiempo [21]. Además, gracias a
su parte hidrofílica e hidrofóbica dentro de
la proteína, se logra una reducción de la
tensión superficial que resulta en una
disminución efectiva de viscosidad que
ayuda perfectamente al transporte de crudo
por los oleoductos.
0
1
2
3
4
5
6
7
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Vis
cosi
dad
[P
a*s]
Tasa de cizalla [1/s]
Tasa de cizalla vs Viscosidad
70% N1
70% N2
70% N3
70% N4
Figura 7. Resultados del reómetro AR-G2 para las emulsiones a distintos niveles de proteína.
Ahora bien, por otro lado, podemos
realizar una comparación que existe entre
realizar emulsiones con un crudo de peso
liviano y con un crudo de peso mediano
diluido con n-dodecano. Para el segundo,
las emulsiones también presentan un
comportamiento de fluido no newtoniano
pseudoplastico, pero a altas tasas de cizalla
como 750 𝑠−1 llegan a valores máximos de
viscosidad de 0,165 Pa*s con
concentraciones de proteína de 0,1 %w/w
en la emulsión con OmpA como
biosurfactante [22]. En contraste, las
emulsiones preparadas con crudo liviano y
utilizando OmpG como biosurfactante, a
concentraciones de proteína de 0,02 %w/w
cuenta con un valor máximo de viscosidad
a una tasa de cizalla de 750 𝑠−1 de 0,0040
Pa*s. Esto hace pensar que la proteína
OmpG es mucho mas efectiva que la
proteína OmpA a la hora de reducir
viscosidad y, además, que hacer uso del
biosurfactante OmpG es más efectivo que
diluir crudo con n-dodecano en términos
de viscosidad si se comparan las dos
alternativas de reducción de viscosidad.
También, en comparación con otros
biosurfactantes como lo son los
rhamnolípidos producidos por P.
aeruginosa muestran que se pueden
formar emulsiones estables durante 14 días
y con viscosidades menores a 0,5 Pa*s
[23]. Esto permite realizar una
comparación donde aparentemente
OmpG es más efectivo que los
rhamnolípidos a la hora de reducir la
viscosidad.
Finalmente, para mejorar el experimento y
los resultados obtenidos se propone
realizar la emulsión blanco propuesta y
realizar experimentos con niveles de
proteínas mayores, realizar purificación de
proteínas por medio de la columna de
purificación y una posterior liofilización
para obtenerla en estado sólido. Además,
se propone realizar las emulsiones con
distintos métodos de agitación, hacer la
prueba de cizallamiento realizada de 1 a
750 𝑠−1 y de 750 a 1 𝑠−1 para que se
confirme que la emulsión no se corta
debido al esfuerzo al que se ve sometida y
hacer uso del Mastersizer para observar la
homogeneidad de la emulsión y confirmar
sus diámetros de partícula.
4. Conclusiones
Se puede concluir que, al haberse evaluado
la viscosidad de las emulsiones a
diferentes tasas de cizalla, la proteína
OmpG sirve como biosurfactante para
realizar emulsiones crudo-agua, en donde
a tasas de cizalla menores a 100 𝑠−1 se ve
una gran diferencia entre los niveles de
proteína con una relación directa donde a
mayor cantidad de esta, mayor reducción
de viscosidad. Sin embargo, después de los
100 𝑠−1 se observa que todos los niveles,
aunque siguen disminuyendo en términos
de viscosidad, sus valores son bastante
similares lo que da a entender que después
de esta tasa de cizalla, se podría utilizar
cualquiera de los niveles especificados en
el experimento para el transporte del
crudo.
Por otra parte, se puede ver que se logra
obtener OmpG a escala de laboratorio en
Erlenmeyers y con un método apropiado
para su separación de la membrana de la
enterobacteria, se logra obtener una
solución de proteínas donde prima OmpG.
Esta solución, finalmente logra realizar las
emulsiones a los distintos niveles de
proteína propuestos por medio del
sonicador, lo que permite concluir que su
poder como biosurfactante existe, y es una
alternativa mucho más económica que
obtener la proteína pura, en términos de
tiempo y dinero.
Referencias
[1] L. E. G. L., «Crudos pesados en
Colombia,» EL ESPECTADOR, 1
05 2011. [En línea]. Available:
http://www.elespectador.com/opini
on/crudos-pesados-en-colombia-
columna-266587. [Último acceso:
22 04 2016].
[2] J. L. Sanger, «Crudos pesados: El
reto para Colombia,» Campetrol,
18 06 2015. [En línea]. Available:
http://campetrol.org/crudos-
pesados-el-reto-para-colombia/.
[Último acceso: 22 04 2016].
[3] H. H. R. González, «Efectos de los
surfactantes en la biorremediación
de suelos,» QuímicaViva, nº 3, p.
26, 2010.
[4] J. Wauquier, El Refino Del
Petróleo: Petróleo Crudo,
Productos Petrolíferos, Esquemas
de Fabricacion, Madrid, España:
Diaz de Santos, 2004.
[5] S. W. Hasan, «Heavy crude oil
viscosity reduction and rheology
for pipeline transportation,»
Elsevier, Quebec, Canada, 2010.
[6] Tri-Tex, «Tri-Tex co Inc,»
Origine2.com, 2015. [En línea].
Available:
http://www.tritex.com/esp/surfacta
ntes_y_especialidades.php.
[Último acceso: 12 Mayo 2017].
[7] D. G. A. R. D. R. J. M. L. Rita de
Cássia F. S. Silva, «Applications of
Biosurfactants in the Petroleum
Industry and the Remediation of
Oil Spills,» 15 Julio 2014. [En
línea]. Available:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc
/articles/PMC4139858/. [Último
acceso: 2 Febrero 2018].
[8] S. G. H. S. Aparna A., «Efecto de
la adición de biosurfactante
producido por Pseudomonas ssp.
en la biodegradación del petróleo
crudo,» 2011. [En línea].
Available:
http://www.ipcbee.com/vol6/no1/1
5-F00028.pdf. [Último acceso: 2
Febrero 2018].
[9] B. Y. S.G. Kapadia, «Current trend
and potential for microbial
biosurfactants,» Enero 2013. [En
línea]. Available:
https://www.researchgate.net/publi
cation/281536756_Current_trend_
and_potential_for_microbial_biosu
rfactants. [Último acceso: 2
Febrero 2018].
[10] R. d. C. F. S. D. S. J. M. L. R. D.
R. V. A. S. I. M. B. L. A. S. Darne
G. De Almeida, «Biosurfactants:
Promising Molecules,» 31 Octubre
2016. [En línea]. Available:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc
/articles/PMC5087163/pdf/fmicb-
07-01718.pdf. [Último acceso: 2
Febrero 2018].
[11] v. P. K. Y. Ö. Köster S,
«Purification, Refolding, and
Crystallization of the Outer
Membrane Protein OmpG from
Escherichia coli.,» 24 Marzo 2015.
[En línea]. Available:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pub
med/25950964. [Último acceso: 16
Febrero 2018].
[12] K. R. V. P. G. a. W. K. Özkan
Yildiz, «Structure of the
monomeric outer-membrane porin
OmpG in the open and closed
conformation,» 3 Agosto 2006. [En
línea]. Available:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc
/articles/PMC1538548/. [Último
acceso: 16 Febrero 2018].
[13] U. o. Michigan, «Orientations of
proteins in membrane,» University
of Michigan, [En línea]. Available:
http://opm.phar.umich.edu/protein.
php?pdbid=2x9k. [Último acceso:
16 Febrero 2018].
[14] T. A. M. A. T. I.-N. E. I. H. T. M.
Masanari Kitagawa, «Complete set
of ORF clones of Escherichia coli
ASKA library ( A Complete S et of
E. coli K -12 ORF A rchive):
Unique Resources for Biological
Research,» 1 Enero 2005. [En
línea]. Available:
https://academic.oup.com/dnaresea
rch/article/12/5/291/350187.
[Último acceso: 16 Febrero 2018].
[15] J. G. C. I. C. LTD, «Aplicacion de
ácido trifluoroacético en HPLC,»
22 Junio 2017. [En línea].
Available:
http://es.chemicalgreat.com/info/th
e-application-of-trifluoroacetic-
acid-in-hpl-19841069.html.
[Último acceso: 2 Mayo 2018].
[16] L. S. J. Elizabeth, «Escuela
Politécnica Nacional,» Enero 2012.
[En línea]. Available:
https://docplayer.es/60785195-
Escuela-politecnica-nacional.html.
[Último acceso: 30 Junio 2018].
[17] B. d. B. Gowtham V.Subbarao,
«Crystal Structure of the
Monomeric Porin OmpG,» 21 Julio
2006. [En línea]. Available:
https://www.sciencedirect.com/scie
nce/article/pii/S002228360600645
0. [Último acceso: 13 Junio 2018].
[18] L. Cologne, «Technical Reference
Guide, Determination of Protein
Concentration,» Marzo 2009. [En
línea]. Available: www.lonza.com.
[Último acceso: 2 Mayo 2018].
[19] E. J. Llambías, «Reflexiones sobre
reologia de fluidos,» [En línea].
Available:
http://www.geologica.org.ar/archiv
os_usuarios/Manuscrito-Reologia-
completo1.pdf. [Último acceso: 13
Junio 2018].
[20] E. Y. H. H. Tajnor Suriya Taju
Ariffina, «The Rheology of Light
Crude Oil and Water-In-Oil-
Emulsion,» 14 Junio 2016. [En
línea]. Available:
https://www.sciencedirect.com/scie
nce/article/pii/S187770581631084
0. [Último acceso: 13 Junio 2018].
[21] M. d. L. M. B. Z.-R. E. M.-J. C.
B.-H. J. d. l. C. C.-L. J. A. Rafael
Martínez-Palou, «Transportation of
heavy and extra-heavy crude oil by
pipeline: A review,» 26 Noviembre
2010. [En línea]. Available:
https://www.sciencedirect.com/scie
nce/article/pii/S092041051000264
0. [Último acceso: 13 Junio 2018].
[22] N. A. C. Santos, «Evaluación de la
efectividad de la proteína OmpA
de Escherichia coli K12
W3110/pCA24N ompA+,» Mayo
2016. [En línea]. Available:
file:///C:/Users/DESK/Downloads/
Documento%20proyecto%20de%2
0grado%20Nestor%20Cardozo%2
0(5).pdf. [Último acceso: 30 Junio
2018].
Anexos 1: Resultados de absorbancia para la curva de crecimiento de E. Coli
Tabla 4. Resultados de absorbancia para la curva de crecimiento para los 3 inóculos
t (h) Inoculo 1 Promedio 1 Inoculo 2 Promedio 2 Inoculo 3 Promedio 3 Varianza
0,253 0,250 0,271
0,251 0,249 0,269
0,250 0,249 0,269
0,302 0,288 0,319
0,301 0,287 0,318
0,301 0,287 0,318
0,450 0,446 0,496
0,447 0,443 0,494
0,448 0,443 0,495
0,658 0,648 0,694
0,651 0,645 0,689
0,649 0,646 0,690
0,775 0,769 0,811
0,769 0,769 0,808
0,770 0,770 0,809
0,865 0,853 0,883
0,862 0,851 0,881
0,863 0,851 0,880
0,934 0,928 0,964
0,930 0,926 0,962
0,930 0,926 0,962
0,980 0,977 1,008
0,975 0,977 1,007
0,976 0,978 1,006
1,021 1,026 1,048
1,020 1,025 1,046
1,019 1,024 1,046
1,100 1,101 1,123
1,098 1,099 1,122
1,100 1,100 1,122
1,180 1,168 1,181
1,179 1,168 1,180
1,180 1,169 1,179
1,228 1,227 1,225
1,226 1,226 1,225
1,227 1,226 1,224
1,268 1,274 1,266
1,267 1,273 1,264
1,269 1,272 1,263
0,013
0,007
8 1,268 1,273 1,264 0,004
0,0017 1,227 1,226 1,225
0,011
0,016
0,028
0,024
0,023
0,0150,881
0,963
1,007
1,047
0,020
0,017
0,014
1,122
1,180
0,927
0,977
1,025
1,100
1,168
0,270
0,318
0,495
0,691
0,809
0,249
0,287
0,444
0,646
0,769
0,8520,863
0,931
0,977
1,020
1,099
1,180
3
4
4
5
6
0,251
0,301
0,448
0,653
0,771
3
0
1
1
2
2
Anexos 2: Resultados del HPLC para OmpA y OmpN a 280 nm
Anexos 3: Resultados del HPLC para OmpG inducido y sin inducir a 260 nm
Figura 8. Resultados del HPLC para OmpA (Superior) y OmpN (inferior) a 280 nm. Encerrado en rojo se encuentra el pico que evidencia la presencia de la proteína transmembranal correspondiente.
Figura 9. Resultados del HPLC para OmpG sin inducir (Superior) y OmpG inducido (inferior) a 260 nm. Encerrado en rojo se encuentra el pico que evidencia la presencia de la proteína transmembranal correspondiente.
Anexos 4: Volúmenes de crudo, proteína y agua para realizar las emulsiones
Tabla 5. Volúmenes de crudo, proteína y agua para realizar las emulsiones en los niveles propuestos
Anexos 5: Valores de viscosidad para los distintos niveles de proteína a varias tasas de
cizalla
Tubos Falcon 50 ml %m/m Tubos Falcon 50 ml %m/m
Petroleo 9,76744186 70% 9,76744186 70%
Sobrenadante 1,451612903 0,0075% 1,935483871 0,010%
Agua 3,5991 29,993% 3,5988 29,990%
Total 14,81815476 1 15,30172573 1
Tubos Falcon 50 ml %m/m Tubos Falcon 50 ml %m/m
Petroleo 9,76744186 70% 9,76744186 70%
Sobrenadante 2,903225806 0,015% 3,870967742 0,020%
Agua 3,5982 29,985% 3,5976 29,980%
Total 16,26886767 1 17,2360096 1
Emulsion N4
Emulsion N2
Emulsion N3
Emulsion N1
Tasa de cizalla 70% N1 Viscosidad 70% N2 Viscosidad 70% N3 Viscosidad 70% N4 Viscosidad
1 6,755 2,567 1,396 0,02003
2,154 6,075 1,364 0,8517 0,01657
4,642 4,415 1,367 0,4834 0,0084
10 3,114 0,9447 0,3632 0,00444
21,54 1,657 0,5196 0,1908 0,003908
46,42 0,7885 0,1573 0,07039 0,005716
100 0,1066 0,06036 0,04283 0,003683
215,4 0,02876 0,03947 0,03181 0,003482
464,2 0,09742 0,0226 0,01368 0,003614
750 0,0516 0,02595 0,01245 0,004035
Tabla 6. Valores de viscosidad arrojados por el reómetro AR-G2 para los distintos niveles de proteína
Anexos 6: Registro fotográfico del experimento
Figura 10. Cultivos líquidos de E. Coli K12 W3110/pCA24N OmpG después de 8 horas.
Figura 11. Pellets obtenidos después de la centrifugación para cada uno de los cultivos
Figura 13. Solución de proteínas, obtenida después de sonicar y de centrifugar. A la izquierda, el sobrenadante donde se encuentra la proteína de interés y a la derecha el residuo obtenido en el Falcon.
Figura 12. A la izquierda, preparación de la emulsión crudo-agua por medio del sindicador y a la derecha prueba reológica de cizallamiento en reómetro AR-G2