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EVALUACIÓN DEL YM976 COMO ALTERNATIVO A LAS HORMONAS GONADOTRÓPICAS
EN LA MADURACIÓN IN VITRO DE OOCITOS BOVINOS Y SU COMPETENCIA PARA EL
DESARROLLO EMBRIONARIO.
Diego Fernando Carrillo González
Universidad Nacional de Colombia
Sede Medellín
Facultad De Ciencias
2011
1
EVALUACIÓN DEL YM976 COMO ALTERNATIVO A LAS HORMONAS GONADOTRÓPICAS
EN LA MADURACIÓN IN VITRO DE OOCITOS BOVINOS Y SU COMPETENCIA PARA EL
DESARROLLO EMBRIONARIO.
Diego Fernando Carrillo González
Tesis de grado presentada para optar al título de
Magíster en Ciencias - Biotecnología
Director
Neil Vásquez Araque Biol., MSc., (c)Dr.
Línea de investigación en Biotecnología Animal
Producción in vitro de embriones
Grupo de Investigación Biotecnología Animal
Universidad Nacional de Colombia
Sede Medellín
Facultad De Ciencias
2011
2
AGRADECIMIENTOS
A mi familia, en especial a mis padres Beatriz González y Héctor Carrillo quienes con su
colaboración y apoyo incondicional, permitieron el poder desarrollar todas las actividades
propuestas para este estudio.
A mi profesor Neil Vásquez por su colaboración como asesor, tutor y amigo, al contribuir
en mi proceso de formación académica y en la ejecución del presente trabajo.
A la Universidad Nacional de Colombia sede Medellín y al grupo de Biotecnología Animal
por proporcionarme la infraestructura necesaria para la realización de este trabajo.
A mis compañeros de trabajo en laboratorio y amigos por todo el apoyo incondicional
recibido durante este proceso de formación, especialmente a Yasser Lénis Sanín, Ana
María Mesa y Juan Camilo Zuluaga, quienes en cada uno de los logros alcanzados, siempre
han estado presentes.
A la Central Ganadera de Medellín y especialmente al Dr. Francisco Valencia, por su
colaboración en el aporte del material biológico.
3
RESUMEN
El AMPc juega un papel importante en la maduración del oocito. Los inhibidores
fosfodiesterasa tipo 4 como el YM976 inducen un aumento en la concentración
intracelular de AMPc, que conduce a la activación de la maduración del oocito. Objetivo.
Evaluar el efecto del YM976 sobre la maduración in vitro de oocitos y su competencia para
el desarrollo embrionario.
Materiales y Métodos. Los Complejos Cúmulo-Oocito se obtuvieron por aspiración
folicular y madurados in vitro por 24h en medio TCM-199 suplementado con el inhibidor
YM976 (1nM, 10nM, 100nM y 1000nM) o gonadotropinas (LH y FSH). La expansión se
evaluó bajo los criterios de Calder y col., 2003 y la metafase II por tinción con Hoechst.
Posteriormente fueron fertilizados y cultivados en medio KSOM Evolve por 7 días, bajo
condiciones de 5% CO2, 38,5°C y 95% de humedad. Resultados. Los resultados muestran
un mayor porcentaje de expansión grado 3 (p<0,05) con gonadotropinas (81%) que con
YM976 1nM y 10nM (24,83% y 23,21%). El porcentaje de metafase II no presento
diferencias entre gonadotropinas (79,62%) y YM976 10nM (88,33%), pero fueron mayores
(p <0.05) que YM976 1nM (60,39%). Sin embargo, no hubo diferencia entre
gonadotropinas, YM976 1nM y 10nM en la tasa de clivage (72,74%, 73,55% y 62,73%) y de
blastocistos (21,03%, 26,18% y 22,96%). Conclusiones. El inihibidor de PDE4 YM976
disminuye la expansión de las células del cúmulo, pero los oocitos madurados con YM976
1nm y 10nM tienen una competencia para el desarrollo embrionario similar a los oocitos
madurados con gonadotropinas.
Palabras clave: Clivaje, embriones, expansión, fosfodiesterasas tipo 4, maduración in vitro,
oocito.
4
ABSTRACT
The cAMP plays an important role on the oocyte maturation. The Phosphodiesterase type
4 inhibitors such as YM976 induce an increase in the intracellular concentration of cAMP
which leads to the activation of the oocyte maturation. Objective. To evaluate the effect
of the YM976 on oocytes in vitro maturation and its embryonic developmental
competence. Materials and Methods. The cumulus-oocyte complexes were obtained by
follicular aspiration and matured in vitro for 24 h in medium TCM-199 supplemented with
YM976 inhibitor (1nM, 10nM, 100nM and 1000nM) or gonadotropins (LH and FSH). The
expansion was evaluated by the criteria of Calder et al., 2003 and metaphase II by staining
with Hoechst. They were then fertilized and cultured in KSOM Evolve media for seven days
under 5% CO2, 38.5°C and 95% humidity conditions. Results. The results showed a higher
expansion grade 3 percentage (p <0.05) with gonadotropins (81%) than Ym976 1nM and
10nm (24.83% and 23.21%). The metaphase II percentage did not differ between
gonadotropins (79,62%) and YM976 10nM (88,33%), but they were higher (p <0.05) than
YM976 1nM (60,39%). However, there was no difference between gonadotropins, YM976
1nM and 10nM in cleavage rate (72,74%, 73,55% and 62,73%) and blastocysts rate
(21,03%, 26,18% and 22,96%). Conclusions. YM976 PDE4 Inihibidor decreases in the
expansion of cumulus cells, but oocytes matured with YM976 1nM and 10nM have
embryonic developmental competence similar to oocytes matured with gonadotropins.
Keywords: Cleavage, embryos, expansion, in vitro maturation, oocyte, phosphodiesterase
type 4.
5
CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS 2
RESUMEN 3
INDICE DE TABLAS 8
LISTA DE FIGURAS 11
1. INTRODUCCION 12
2. MARCO TEÓRICO 14
2.1 Maduración del oocito 14
2.2 Maduración Citoplasmática 14
2.3 Maduración nuclear del oocito 15
2.3.1 Regulación y modulación de la maduración in vitro del oocito 16
2.3.2 Regulación del AMPc 16
2.4 Inhibidores de Fosfodiesterasas del AMPc 17
3 OBJETIVOS 20
3.1 Objetivo general 20
3.2 Objetivos específicos 20
4 METODOLOGÍA 21
4.1 Localización 21
4.2 Procesamiento del material de estudio 21
4.2.1 Aspiración y Maduración in vitro 21
6
4.2.2 Grupos Experimentales 22
4.2.3 Evaluación del efecto del inhibidor de PDE tipo 4, YM976, sobre el
grado de mucificación del Complejo Cúmulo Oocito y el
porcentaje de maduración nuclear de oocitos bovinos in vitro
23
4.2.4 Fertilización y desarrollo in vitro 23
4.2.5 Evaluación del porcentaje de clivaje obtenido de oocitos
madurados in vitro en presencia de gonadotropinas ó en
presencia del inhibidor de PDE tipo 4 YM976
24
4.3 Análisis Estadístico 25
5 RESULTADOS 27
5.1 Objetivo específico número uno: Determinación del grado de
expansión de las células del cúmulo en presencia del inhibidor de
PDE4 YM976
27
5.2 Objetivo específico número uno: Determinación del porcentaje de
maduración nuclear in vitro de oocitos bovinos
32
5.3 Objetivo específico número dos: Determinación del porcentaje de
embriones bovinos producidos in vitro en etapa de clivaje, a partir
de oocitos madurados con gonadotropinas o diferentes
concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976
34
5.4 Objetivo específico número dos: Determinación del porcentaje de
embriones bovinos de cuatro o más células, producidos in vitro, a
partir de oocitos madurados con gonadotropinas o diferentes
concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976
36
5.5 Objetivo específico número dos: Determinación del porcentaje de
embriones bovinos producidos in vitro, en etapa de blastocisto, a
7
partir de oocitos madurados con gonadotropinas o diferentes
concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976
38
6 DISCUSIÓN 43
7 CONCLUSIONES 47
BIBLIOGRAFÍA 49
8
INDICE DE TABLAS
Tabla 1 Grupos Experimentales de estudio para los inhibidores de
fosfodiesterasa y controles
23
Tabla 2 Análisis descriptivo de la expansión grado 3 de las células
del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro con un
p<0,05
27
Tabla 3 Comparación de medias mediante el test de Tukey para
pruebas con N desigual para la expansión grado 3 de las
células del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro
con un p<0,05
28
Tabla 4 Análisis descriptivo de la expansión grado 2 de las células
del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro con un
p<0,05
29
Tabla 5 Comparación de medias mediante el test de Tukey para
pruebas con N desigual para la expansión grado 2 de las
células del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro
con un p<0,05.
29
Tabla 6 Análisis descriptivo de la expansión grado 1 de las células
del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro con un
p<0,05
31
Tabla 7 Comparación entre medias mediante el test de Tukey para
pruebas con N desigual para la expansión grado 1 de las
células del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro
9
con un p<0,05 31
Tabla 8 Análisis descriptivo de la continuación de la Metafase II de
oocitos madurados in vitro.
33
Tabla 9 Comparación de medias mediante el test de Tukey para
pruebas con N desigual para la Metafase de oocitos bovinos
madurados in vitro con un p<0,05
33
Tabla 10 Análisis Descriptivo para las diferentes concentraciones del
inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas el clivaje de
oocitos madurados y fertilizados in vitro con un p<0,05.
35
Tabla 11 Comparación de medias mediante el test de Duncan para las
diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y
gonadotropinas, en el clivaje de oocitos bovinos madurados
y fertilizados in vitro; con un p<0,05
35
Tabla 12 Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del
inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas de embriones
en estado de cuatro o más células, producidos in vitro a
partir del total de oocitos madurados y fertilizados in vitro
37
Tabla 13 Comparación de medias mediante el test de Duncan para las
diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y
gonadotropinas, en embriones de cuatro o más células; con
un p<0,05
37
Tabla 14 Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del
inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas de blastocistos
producidos in vitro a partir del total de oocitos madurados y
fertilizados in vitro
39
10
Tabla 15 Comparación de medias utilizando el test de Duncan para
las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976
y gonadotropinas, en tasa de blastocistos a partir de oocitos
bovinos madurados y fertilizados in vitro; con un p<0,05
39
Tabla 16 Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del
inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas de blastocistos
producidos in vitro a partir de oocitos clivados in vitro con
un p<0,05
41
Tabla 17 Comparación de medias utilizando el test de Duncan para
las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976
y gonadotropinas, en tasa de blastocistos a partir de oocitos
bovinos clivados in vitro; con un p <0,05
41
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Expansión grado 3 de las células del cúmulo de oocitos
bovinos a las 24 horas
28
Figura 2 Expansión grado 2 de las células del cúmulo de oocitos
bovinos a las 24 horas de maduración in vitro
30
Figura 3 Expansión grado 1 de las células del cúmulo de oocitos
bovinos a las 24 horas de maduración in vitro
32
Figura 4 Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la maduración
nuclear in vitro de oocitos bovinos a las 24 horas de cultivo
34
Figura 5 Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de clivaje
de oocitos bovinos fertilizados a las 24 horas de maduración
in vitro
36
Figura 6 Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de
embriones en estado de 4 o más células a las 72 hpi
38
Figura 7 Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de
embriones a partir de oocitos bovinos fertilizados a las 24
horas de maduración in vitro
40
Figura 8 Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de
embriones a partir de oocitos bovinos clivados in vitro
42
12
INTRODUCCIÓN
El inventario ganadero en nuestro país has sido similar a través de los últimos años con un
valor aproximado de 23.500.000 de cabezas de ganado, del cual se producen para el
consumo en promedio 4.054.485 cabezas (fedegan 2008). Algunas tecnologías
reproductivas tales como la superovulación y la transferencia de embriones han sido
usadas como herramientas en la búsqueda de mejorar estas tazas de producción. Es en
esta misma búsqueda donde aparecen en nuestro país nuevas herramientas tales como la
producción de embriones in vitro (PIVE) la cual ha tomado mucho auge por su aplicación
en programas de mejoramiento genético y porque los costos de producción son más bajos
en comparación a otros procesos.
Adicionalmente, esta biotecnología ha permitido la investigación básica en los
mecanismos de la maduración de oocitos, fertilización y desarrollo embrionario,
generando grandes aportes sobre las condiciones de cultivo y factores hacia la búsqueda
de una eficiente producción de embriones in vitro de buena calidad. Las técnicas de
producción in vitro de embriones (PIVE) son atractivas debido a las posibilidades de
disminuir los costos de producción de embriones para la transferencia, el diagnóstico
molecular preimplantatorio, la clonación de células somáticas o de embriones y para la
producción de bovinos transgénicas.
La obtención de un embrión de buena calidad depende en gran parte de la competencia
del oocito para reanudar la meiosis y la capacidad para el desarrollo después de la
fertilización. Esta competencia la adquiere el oocito durante su crecimiento en la dinámica
13
folicular, sin embargo, en los procesos de maduración in vitro, el oocito es aspirado de un
folículo que no ha alcanzado su máximo tamaño para ovular y es cultivado por 24 horas en
presencia de las gonadotropinas FSH y LH, sin embargo la eficiencia y calidad de los
embriones producidos bajo estas condiciones es baja (Rizos et. al. 2002).
Lo anterior ha conducido a la búsqueda de modificaciones en los protocolos de
producción in vitro de embriones, siendo una alternativa el uso de inhibidores de las
enzimas fosfodiesterasa del AMPc (Thomas et al., 2004). Resultados previos obtenidos en
nuestro grupo, demostraron que el Rolipram, (un inhibidor de fosfodiesterasas tipo 4
PDE4), puede reemplazar la acción de las hormonas gonadotrópicas FSH y LH durante el
proceso de maduración in vitro de oocitos bovinos (López et al., 2008). Sin embargo la
especificidad de este inhibidor (Rolipram) por las fosfodiesterasas es del orden
micromolar e inhibe otras fosfodiesterasas en otros tejidos, presentando efecto
colaterales. De esta manera se ha desarrollado modificaciones desarrollando nuevas
generaciones de inhibidores con constantes de inhibición mucho más bajas (Huang et al.,
2001), que podrían generar una maduración de oocitos igual o mejor al obtenido con las
gonadotropinas y una óptima competencia para el desarrollo de embriones bovinos
producidos in vitro.
14
1. MARCO TEÓRICO.
La habilidad de un oocito para generar un individuo no es un proceso simple, por lo tanto,
el hecho que se realicen los primeros eventos no garantiza los eventos subsecuentes. Se
ha demostrado que estos eventos están asociados con el proceso de maduración del
oocito, durante la cual el oocito adquiere diferentes competencias o habilidades, que se
pueden describir en cinco niveles, cada uno dependiente del anterior: la habilidad del
oocito para continuar la meiosis, para clivar después de la fertilización, el desarrollo hasta
la etapa de blastocisto, la habilidad de implantarse y generar una gestación, y por último
generar un individuo a término. (Sirard et al., 2006)
1.1. Maduración del oocito.
En el ovario, el oocito se encuentra en un bloqueo meiótico (profase I, etapa de vesícula
germinal-GV) por muchos meses o años hasta que son ovulados o degenerados. La
maduración del oocito es iniciada durante el crecimiento folicular y es completada por el
pico preovulatorio de LH el cual induce la ovulación. Esta maduración del oocito involucra
cambios a nivel citoplásmico y nuclear, que capacitan al oocito para los posteriores
eventos como la fertilización y el desarrollo embrionario (Mayes, 2002).
1.2. Maduración Citoplasmática
La maduración citoplasmática involucra transformaciones que preparan al oocito para la
fertilización y el desarrollo embrionario preimplantatorio (Eppig, 1996; Sirard et al., 1989),
y comprende los cambios ultraestructurales que ocurren en el oocito durante el
15
crecimiento folicular desde el estadio de vesícula germinal hasta metafase II (Ducibella et
al., 1994; Duranthon y Renard, 2001; Hyttel et al., 1986a; Hyttel et al., 1986b; Shamsuddin
et al., 1993). Estos cambios ultraestructurales incluyen la migración de la vesícula germinal
cerca de la zona pelúcida, la síntesis y acumulación de los diferentes tipos de RNA,
ribosomas y polipéptidos (Whitaker, 1996), la localización de las mitocondrias en la
periferia del oocito, el aumento en el número de vesículas en el aparato de golgi y en los
niveles de glutation, la translocación de los gránulos corticales desde el centro del oocito
hacia la periferia y su posterior unión a la membrana plasmática (Fair et al, 1997).
1.3. Maduración nuclear del oocito
Durante el crecimiento folicular el oocito adquiere la competencia meiótica, la cual se
refiere a la capacidad del oocito para completar el ciclo meiótico o maduración nuclear.
Ésta es adquirida progresivamente durante el crecimiento folicular y está estrechamente
relacionada con el tamaño del oocito y éste a su vez con el tamaño del folículo (2 a 3 mm)
(Fair et al., 1997; Fair et al, 2001). El oocito se encuentra detenido en profase de la meiosis
I, desde la vida embrionaria hasta que se da el pico preovulatorio de LH; en respuesta a
éste, la meiosis continúa hasta metafase II, estadío en el que ocurre el segundo freno
meiótico. Como consecuencia el folículo expulsa un oocito completamente maduro
(ovulación) y apto para ser fecundado (Tsafriri y Channing, 1975; Whitaker, 1996). Este
proceso de continuación de la meiosis involucra la desintegración de la envoltura nuclear
(GVBD, Germinal Vesicle Break Down), la condensación de cromosomas, la formación del
huso en metafase I, la separación de cromosomas homólogos con expulsión del primer
cuerpo polar y el freno en metafase II (Kubelka, et al., 1988; Salomone et al, 2001). El
oocito de bovino requiere un periodo de 24 horas para completar únicamente la
maduración nuclear in vitro (Sirard, 1989; Sirard et al., 1989).
16
2.3.1 Regulación y modulación de la maduración in vitro del oocito
En los procesos de maduración in vitro (MIV), los complejos cúmulo oocito (CCO)
aspirados de folículos con un diámetro entre 3 y 8 mm (Thomas et al., 2002), completan
su maduración en 24 horas, mediante el uso de gonadotropinas, reflejada en la expansión
o mucificación del cúmulo, la continuación de la meiosis y la expulsión del primer cuerpo
polar (Wassarman y Albertini, 1994; Eckert y Niemann, 1995).
Las gonadotropinas FSH y LH se unen a receptores en las células de la granulosa del CCO,
la vía de señalización es la mediada por proteína G, la cual a su vez activa la adenilato
ciclasa, enzima que induce la producción de 3´, 5´- adenosín monofosfato cíclico (AMPc) a
partir del adenosín trifosfato (ATP). Los altos niveles de AMPc en las células de la
granulosa inducen la mucificación caracterizada por el desacoplamiento de las uniones
gap (Calder et al., 2003) y la secreción de ácido hialurónico (Salustri et al., 1992; Fulop et
al., 1997), disminuyendo los niveles de AMPc intraoocitario, el cual es el principal factor
involucrado en el freno meiótico, permitiendo la continuación de la meiosis y por tanto la
maduración nuclear (Tsafriri et al, 1996). Esta acción inhibitoria de la meiosis es mediada
por la proteína quinasa dependiente de AMPc (PKA), la cual inactiva por fosforilación a la
proteína fosfatasa cdc25, responsable de la activación del factor promotor de la
maduración (MFP), que induce la continuación de la meiosis (Jones, 2004; Josefsberg y
Dekel, 2002)
2.3.2 Regulación del AMPc
Durante la continuación de la meiosis estimulada por el pico preovulatorio de FSH y LH,
los niveles de AMPc intraoocitario descienden debido a la disminución de la expresión de
conexinas formadoras de las uniones gap (Calder et al., 2003) y por la hidrólisis del AMPc a
su forma inactiva 5´-AMP (Conti et al., 2002), reacción catalizada por fosfodiesterasas
(PDE). En los mamíferos, estas enzimas son codificadas por al menos 15 genes, agrupados
en 12 familias funcional y estructuralmente relacionadas (Spaulding, 1993; Muller et al.,
17
1996; Conti, 2000). Cada familia de enzimas es bloqueada por inhibidores específicos
(Soderling y Beavo, 2000; Tsafriri et al., 1996) y no específicos (Wagner et al., 1996;
Jackson et al., 1997; Nichols, 2000). La expresión de estas enzimas es específica de tejido
en la unidad folicular, el oocito bovino expresa la PDE tipo 3, mientras que en las células
de la granulosa se expresa la PDE tipo 4 (Tsafriri et al, 1996), sin embargo aún no se
conoce cuales genes (PDE3 A-B; PDE4 A-B-C-D) se expresan o qué variantes generadas por
splicing alternativo de PDEs se presentan en la unidad folicular bovina.
2.4 Inhibidores de Fosfodiesterasas del AMPc
Las fosfodiesterasas (PDE) son las enzimas responsables de la hidrólisis del AMPc, y el
aumento de éste, puede lograrse por la inhibición específica de estas enzimas. La alta
heterogeneidad en las familias de PDE y su distribución específica de tejido, hace de estas
enzimas puntos estratégicos para el diseño de medicamentos y su evaluación en
diferentes áreas de investigación. (Piaz y Giovannoni, 2000).
En el área de la reproducción, se han evaluado diversos tipos de inhibidores de
fosfodiesterasas específicos e inespecíficos. Entre los inhibidores inespecíficos están la
teofilina (inhibidor reversible) con un 41% de oocitos madurados in vitro (datos no
publicados del laboratorio de Biotecnología Animal de la Universidad Nacional de
Colombia-Sede Medellín) y 41% para el IBMX (inhibidor irreversible) (Sirard y First, 1988),
estos porcentajes de maduración son bajos comparados con los obtenidos con
gonadotropinas (Thomas et al., 2002). Los inhibidores específicos de PDE tipo 3 (localizada
en el oocito), como la Cilostamida y la Milrinona tienen un efecto bloqueador reversible
de la maduración del oocito de mamíferos, sin afectar la viabilidad del oocito, ni el
proceso ovulatorio (Jensen et al., 2002; Mayes y Sirard 2002). Mientras que los inhibidores
de PDE tipo 4, como el Rolipram (ciclopentiloxi-metoxifenil-pirrolidona), es un compuesto
con una actividad biológica variada, destacándose por sus efectos antiinflamatorio,
18
inmunosupresor, antidepresivo, antiparkinsoniano y neuroprotector (Demnitz et al.,
1998). Además se ha encontrado que disminuye la producción del factor de necrosis
tumoral (TNF); aumenta la producción de interleuquina 10 (IL-10) (Soares et al., 2003) y
promueve la regeneración de axones neuronales (Nikulina et al., 2004). Sin embargo, el
Rolipram presenta efectos adversos como náuseas y vómito (Lugnier, 2006).
En estudios realizados por nuestro grupo, se demostró que la maduración del oocito
inducida por gonadotropinas puede ser igualada aumentando los niveles de AMPc en las
células de la granulosa, utilizando como único estímulo Rolipram, confirmando la
compartimentalización de fosfodiesterasas (Tsafriri et al, 1996) y de AMPc en la unidad
folicular (Conti et al., 2002; Mayes y Sirard, 2002). Además se encontró que la maduración
de los oocitos en presencia de inhibidores de PDE4 produce oocitos competentes para los
procesos de fertilización y clivaje, sin embargo se debe buscar inhibidores que no generen
estos efectos colaterales y evaluar su eficiencia en la maduración in vitro de oocitos, para
su implementación en protocolos de producción de embriones. Las herramientas
computacionales y bioquímicas han generado recientes investigaciones que permiten
comprender las interacciones moleculares entre las enzimas PDE4 y sus inhibidores, la
expresión y función específica de las isoenzimas de PDE4, ha permitido el diseño de una
nueva generación de moléculas inhibidoras de PDE4 más específicas, tales como el
YM976, entre otros, con un gran potencial terapéutico en la clínica, disminuyendo o en
algunos casos anulando sus efectos colaterales observados con otros inhibidores
(Rolipram) (Huang et al., 2001).
Debido a su alta especificidad es un medicamento candidato para evaluar en los
protocolos de producción in vitro de embriones, sin embargo no se han realizado estudios
sobre maduración in vitro de oocitos de bovino, utilizándolo como único estímulo, en
19
ausencia de gonadotropinas, y la posterior producción de embriones in vitro, conociendo
que la constante de inhibición es mucho menor que la del Rolipram (Huang et. al 2001).
Medicamento IC50
PDE 4 B PDE 4 D
Ym976 2,2nM
Rolipram 570nM 1,1µM
Tomado de Huang et. al 2001
20
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Evaluar el efecto del inhibidor de PDE4, YM976 sobre la maduración in vitro de oocitos
bovinos y la capacidad para formar embriones después de la fertilización.
3.2 Objetivos específicos
Evaluar el efecto del inhibidor de PDE tipo 4, YM976, sobre el grado de mucificación del
Complejo Cúmulo Oocito y el porcentaje de maduración nuclear de oocitos bovinos in
vitro.
Comparar el porcentaje de clivaje y de desarrollo embrionario obtenido de oocitos
madurados in vitro en presencia de gonadotropinas con el obtenido en presencia del
inhibidor de PDE tipo 4 YM976
21
4 METODOLOGÍA
4.1 Localización
El trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología Animal de la Universidad
Nacional de Colombia sede Medellín, ubicado en la Calle 59A No. 63-020, Bloque 19A -
113, a 1538 metros sobre el nivel del mar, con una precipitación promedio de 1571 mm
de agua y una temperatura promedio de 24° Centígrados.
4.2 Procesamiento del material de estudio
Los ovarios de bovino fueron obtenidos de hembras en ciclo reproductivo sacrificadas en
la Central Ganadera de Medellín. Los ovarios disectados a partir del tracto reproductivos
de las hembras poseían en al menos uno de ellos, una unidad de cuerpo lúteo; una vez
retirados del tracto, fueron depositados en solución tampón de fosfato salino (PBS) estéril
a 37°C para luego ser transportados (30 minutos aproximadamente) hacia el Laboratorio
de Biotecnología Animal de la Universidad Nacional Sede Medellín para su
procesamiento.
4.2.1 Aspiración y Maduración in vitro:
En el laboratorio, bajo condiciones asépticas fueron lavados los ovarios tres veces con PBS
a 37ºC para retirar material contaminante, sangre y detritus tisular. Luego con aguja
N°18 en jeringa de 5 mL, se procedió a la aspiración de los folículos con un diámetro de 3
a 8mm y el líquido fue recolectado en tubos cónicos de 15 mL a 37ºC. Una vez se
terminó este proceso, se descartó el sobrenadante y, el precipitado se resuspendió en
22
5mL de medio TCM-199 HEPES modificado con sales de Earle (Sigma M2520)
suplementado con 0,275 mg/mL de ácido pirúvico (Sigma P2506), 0,029 mg/mL de
glutamina (Sigma G9003), 100 UI/mL de penicilina, 0,1 mg/mL de estreptomicina, 0.25
mm. Bajo visión con estereomicroscopio Nikon SMZ-645 se seleccionaron los Complejos
Cúmulo Oocito (CCO) de buena calidad, los cuales poseen varias capas compactas de
células de la granulosa. Los CCO seleccionados son lavados tres veces en medio TCM 199
y en grupos de diez CCO cultivados a 38.5°C en gotas de 50L de medio de maduración
suplementado con 10% de suero fetal bovino SFB (Sigma N4887), rhLH 5 µg/ml (Luveris,
Estradiol (Sigma E2758), 5% de suero fetal bovino, penicilina, estreptomicina, anfotericina
B (Sigma A5955). Las gotas fueron cubiertas con aceite mineral (Sigma M8410), en plato
de cultivo de 4 pozos. Las condiciones de cultivo fueron de 38.5°C, 5% de CO2 y 90% de
humedad relativa.
4.2.2. Grupos Experimentales
En este proceso se evaluaron diferentes concentraciones de medicamento YM976, desde
1nM, 10nM, 100nM y 1000nM, adicionados como suplemento en el medio base de
maduración y comparados con medios suplementados con gonadotropinas, también se
hizo una gota control, la cual no recibió algún estímulo en el medio base de maduración.
23
Tabla 1. Grupos Experimentales de estudio para los inhibidores de fosfodiesterasa tipo
4 y controles:
4.2.3 Evaluación del efecto del inhibidor de PDE tipo 4, YM976, sobre el grado de
mucificación del Complejo Cúmulo Oocito y el porcentaje de maduración nuclear de
oocitos bovinos in vitro.
Pasadas 24 horas de maduración in vitro, se realizó una evaluación de la expansión del
complejo cúmulo-oocito, basándose en los criterios de Calder et al.2003, (Grado 1, poco o
nada de expansión, Grado 2, expansión moderada de las capas externas del cúmulo,
Grado 3, expansión de todas las capas), mediante el uso del esteremicroscopio.
Posteriormente, los oocitos fueron desnudados y teñidos con DAPI y con el uso de un
microscopio de fluorescencia se evaluó la expulsión del primer cuerpo polar en cada uno
de ellos, en los diferentes tratamientos, para determinar el porcentaje de maduración.
4.2.4 Fertilización y desarrollo in vitro
Cumplidas las 24 horas de maduración in vitro con los diferentes estímulos
(gonadotropinas y las concentraciones del inhibidor YM976 1nM, 10nM, 100nM y
1000nM), los oocitos fueron lavados en medio de fertilización y transferidos a gotas de
24
50µl de medio de fertilización. Se utilizó semen proveniente del mismo ejemplar (Prosefo
Arafat 14190) de la planta de procesamiento San Pablo de la Universidad Nacional,
descongelado a 37°C por 1 minuto, y luego se seleccionaron los espermatozoides viables
y móviles mediante gradiente de swim up durante 45 minutos, se utilizó una
concentración final de 2 X 106/mL de espermatozoides y fueron incubados durante 18-20
horas. Las condiciones de fertilización fueron de 38.5°C, 5% de CO2 y 90% de humedad
relativa. Al finalizar el tiempo de fertilización, los presuntos cigotos fueron transferidos a
medio de cultivo KSOM Evolve por 72 horas.
4.2.5 Evaluación del porcentaje de clivaje y de desarrollo embrionario obtenido de
oocitos madurados in vitro en presencia de gonadotropinas ó en presencia del inhibidor
de PDE tipo 4 YM976.
Pasadas 72 horas por inseminación, se evaluaron los diferentes estadios de desarrollo
mediante la visualización con un microscopio invertido de contraste de fase y se
determinó el porcentaje de clivaje y de cigotos de cuatro o más células.
En el día siete de desarrollo se determinaron los porcentajes de embriones en estado de
blastocisto, mediante la visualización con un microscopio invertido de contraste de fase.
Para comprobar la presencia de embriones de cuatro o más células o de blastocistos, se
realizó tinción nuclear con Hoechst 33342, de la siguiente manera: Se retiraron los
embriones del medio de cultivo y se les realizaron dos lavados en gotas de 100 µl de PBS
que contenía 1 mg/ml polivinylpirrolidona (PVP). Los embriones fueron fijados en gotas de
100 µl de solución de paraformaldehido [4%(w/v) in PBS, pH 7.4] por 1 h a temperatura
ambiente, luego fueron lavados tres veces en gotas de 100 µl de PBS/PVP pasándolos gota
a gota. Los embriones se transfirieron a gotas de 50 µl de solución de trabajo tiñendo por
10 minutos. Posteriormente fueron lavados dos veces en gotas de PBS-PVP pasándolos
gota a gota. En un portaobjetos limpio se colocó una gota de solución a 1:10 poly-L-lysine
(Sigma P8920) por 2 minutos donde se transfirieron los embriones dejándolos allí durante
25
15 minutos a temperatura ambiente. Se añadió el mínimo volumen posible (2-16 Pl) de
solución descolorante (ProLong Antifade Kit; (Molecular Probes P-7481) sobre el área en la
que los embriones fueron fijados. Luego se colocó el cubreobjetos y se llevaron al
microscopio para observar la fluorescencia con filtro UV. Allí se observaron los núcleos de
las células de color azul.
4.3 Análisis estadístico
Se realizó un modelo de bloques incompletos al azar, donde se tomaron los diferentes
niveles de inhibidor YM976, el tratamiento con gonadotropinas y el control negativo. Se
realizaron mínimo 10 repeticiones donde cada una de las gotas de cultivo se tomó como
una repetición.
Para determinar el efecto del inhibidor de PDE tipo 4, YM976, sobre el grado de
mucificación del Complejo Cúmulo Oocito se halló el porcentaje de expansión en cada
una de las gotas de cada grupo de estudio, clasificando a los oocitos en las diferentes
categorías de expansión. Los datos fueron sometidos a un análisis de varianza (p<0,05)
donde se tomó cada uno de los grados de expansión como variable de respuesta y se
compararon todos los tratamientos de forma independiente en cada una de estas
variables (1, 10, 100, 1000nm, gonadotropinas y sin hormonas). Luego se realizó una
comparación de medias mediante el test de Tukey para pruebas con N desigual para cada
uno de los grados de expansión de las células del cúmulo en oocitos bovinos madurados
in vitro siendo significativo entre tratamientos si p<0,05.
Como parámetro indicativo de maduración nuclear in vitro se determinó el porcentaje de
expulsión del primer cuerpo polar en oocitos bovinos, este porcentaje se determinó en
cada una de las gotas de cada uno de los niveles de los grupos de estudio. Los datos
fueron sometidos a un análisis de varianza (p<0,05) donde el efecto variable fue la
26
expulsión del primer cuerpo polar en cualquiera de los bloques de tratamiento 1, 10, 100,
1000nM del inhibidor de PDE4 YM976, gonadotropinas y sin hormonas. Posteriormente
se procedió a hacer una comparación entre medias con el Test de Tukey para N desigual
para determinar se existía una diferencia significativa (p<0,05) entre los tratamientos.
Los porcentajes de clivaje fueron determinados a las 72 horas pos inseminación (hpi); la
variable dependiente fue el número de clivajes a partir del total de oocitos bovinos
fertilizados, previamente madurados in vitro en presencia de los tratamientos con el
inhibidor de PDE4 YM976 1, 10, 100, 1000nM y gonadotropinas. Posteriormente se
determinó del porcentaje de embriones bovinos de cuatro o más células, producidos in
vitro, a partir de oocitos madurados con gonadotropinas o diferentes concentraciones del
inhibidor de PDE4 YM976, a las 72 hpi, mediante el conteo de las blastómeras de cada uno
de ellos, sobre el total de los oocitos inseminados.
En la búsqueda de encontrar una mejor concentración del inhibidor de PDE4 YM976 que
permita la producción in vitro de embriones bovinos, se determinó del porcentaje de
embriones, en etapa de blastocisto, a partir de oocitos madurados con gonadotropinas o
diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976.
Para establecer la competencia de los embriones clivados para alcanzar la etapa de
blastocisto, se determinó el porcentaje de blastocistos a partir de embriones clivados.
Todos los datos fueron sometidos a un análisis de varianza (p<0,05) para evaluar los
efectos entre tratamientos. En esta parte del proceso, se buscó una diferencia mínima que
reflejara significancia, por lo que se realizó una comparación de medias mediante el test
de Duncan para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y
gonadotropinas
27
5 RESULTADOS
5.1 Objetivo específico número uno: Determinación del grado de expansión de las
células del cúmulo en presencia del inhibidor de PDE4 YM976.
Se encontró que el 81,12% de los oocitos madurados in vitro con gonadotropinas
presentan el mayor grado de expansión (grado 3), siendo mayor, estadísticamente
significativo (p<0,05) entre los grupos madurados con el inhibidor de PDE4 YM976 1nM
(24,83%), 10nM (23,21%), 100nM (20,41%) y 1000nM (12,42%) al igual que con el
tratamiento sin gonadotropinas (13,36%). No se presentó diferencia con respecto a la
expansión grado 3 entre los diferentes grupo madurados con el inhibidor de PDE4 (ver
tabla 3)
Tabla 2: Análisis descriptivo de la expansión grado 3 de las células del cúmulo en oocitos
bovinos madurados in vitro con un p<0,05.
Tratamientos Medias N Desviación Estándar
GON 81,125 11 15,069
1nM 24,832 9 25,188
10nM 23,219 5 24,537
100nM 20,419 7 15,785
1000nM 12,427 8 14,909
SH 13,364 11 14,614
28
Tabla 3: Comparación de medias mediante el test de Tukey para pruebas con N desigual
para la expansión grado 3 de las células del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro
con un p<0,05.
Tratamiento GON 1nM 10nM 100nM 1000nM SH
µ=81,125 µ=24,832 µ=23,219 µ=20,420 µ=12,428 µ=13,365
GON 0,000143 0,000251 0,000144 0,000143 0,000143
1nM 0,000143 0,999993 0,997482 0,749217 0,764247
10nM 0,000251 0,999993 0,999886 0,934881 0,955104
100nM 0,000144 0,997482 0,999886 0,962238 0,977965
1000nM 0,000143 0,749217 0,934881 0,962238 0,999998
SH 0,000143 0,764247 0,955104 0,977965 0,999998
Figura 1. Expansión grado 3 de las células del cúmulo de oocitos bovinos a las 24 horas de
maduración in vitro.
29
Con respecto al grado 2 de expansión el menor porcentaje se observó en el grupo de
gonadotropinas (17,22%), sin embargo, no se encontró diferencia significativa (p>0,05)
con los demás grupos evaluados, 1nM (32,16%), 10nM (23,96%), 100nM (46,68%),
1000nM (37,41%) y sin gonadotropinas (23,28%) (ver tabla 5).
Tabla 4: Análisis descriptivo de la expansión grado 2 de las células del cúmulo en oocitos
bovinos madurados in vitro con un p<0,05.
Tratamientos Medias N Desviación Estándar
Gonadotropinas 17,221 11 16,113
1 32,164 9 31,379
10 23,967 5 23,709
100 46,684 7 16,169
1000 37,413 8 21,852
Sin Hormonas 23,184 11 25,433
Tabla 5: Comparación de medias mediante el test de Tukey para pruebas con N desigual
para la expansión grado 2 de las células del cúmulo en oocitos bovinos madurados in vitro
con un p<0,05.
Tratamiento GON 1nM 10nM 100nM 1000nM SH
µ=17,222 µ=32,165 µ=23,968 µ=46,684 µ=37,413 µ=23,184
Gonadotropinas 0,744524 0,997267 0,184667 0,510552 0,990254
1nM 0,744524 0,993151 0,846898 0,997467 0,961733
10nM 0,997267 0,993151 0,633410 0,939733 1,000000
100nM 0,184667 0,846898 0,633410 0,974407 0,415757
1000nM 0,510552 0,997467 0,939733 0,974407 0,820106
Sin Hormonas 0,990254 0,961733 1,000000 0,415757 0,820106
30
Figura 2. Expansión grado 2 de las células del cúmulo de oocitos bovinos a las 24 horas de
maduración in vitro.
En el grado 1 de expansión, el menor porcentaje se observó en el grupo de oocitos
madurados en presencia de gonadotropinas (1,65%), presentando diferencia
estadísticamente significativa (p<0,05) con los grupos de 1nM (43%), 1000nM (50,19%) y
sin gonadotropinas (63,45%), pero no con los grupos 10nM (52,81%) y 100nM (32,90%)
(p>0,05) (Ver tabla 7).
31
Tabla 6: Análisis descriptivo de la expansión grado 1 de las células del cúmulo en oocitos
bovinos madurados in vitro con un p<0,05.
Tratamiento Medias N Desviación Estándar
Gonadotropinas 1,652 11 5,482
1nM 43,002 9 34,548
10nM 52,812 5 44,775
100nM 32,895 7 19,712
1000nM 50,159 8 26,825
Sin Hormonas 63,450 11 36,035
Tabla 7: Comparación entre medias mediante el test de Tukey para pruebas con N
desigual para la expansión grado 1 de las células del cúmulo en oocitos bovinos
madurados in vitro con un p<0,05.
TRATAMIENTO GON 1nM 10nM 100nM 1000nM SH
µ=1,6529 µ =43,003 µ =52,813 µ =32,896 µ =50,159 µ =63,451
GON 0,046117 0,080359 0,355449 0,020405 0,000272
1Nm 0,046117 0,994598 0,986532 0,996311 0,673306
10nM 0,080359 0,994598 0,886587 0,999991 0,992101
100nM 0,355449 0,986532 0,886587 0,875489 0,380070
1000nM 0,020405 0,996311 0,999991 0,875489 0,941430
SH 0,000272 0,673306 0,992101 0,380070 0,941430
32
Figura 3. Expansión grado 1 de las células del cúmulo de oocitos bovinos a las 24 horas de
maduración in vitro.
5.2 Objetivo específico número uno: Determinación del porcentaje de maduración
nuclear in vitro de oocitos bovinos
Al comparar los porcentajes de metafase II de oocitos bovinos madurados in vitro bajo
diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976,con el obtenido en presencia de
gonadotropinas, se encontró el mayor porcentaje en la concentración 10nM del inhibidor
de PDE4 (88,33%), sin presentar diferencia estadísticamente significativa (p>0,05)con el
grupo madurado en gonadotropinas (79,62%) (ver tabla 8).Sin embargo al compararlas
con las demás concentraciones del inhibidor, 1nM (60,39%), 100nM (61,78%) y 1000nM
(45,05%), y el con el grupo madurado sin gonadotropinas (55,87%), se encontró una
diferencia significativa con cada uno de estos grupos (p<0,05)(ver tabla 9)
33
Los porcentajes de metafase II en los grupos de 1nM (60,39%) y 100nM (61,78%), no
presentaron diferencia significativa (p>0,05), sin embargo cuando se comparan con el
grupo de 1000nM (45,05%) se observa diferencia significativa (p<0,05), pero ninguno de
estos tres grupos presenta diferencia con el grupo madurado sin gonadotropinas (55,87%)
(p>0,05).
Tabla 8: Análisis descriptivo de la continuación de la Metafase II de oocitos madurados in
vitro.
Tratamientos Medias Desviación Estándar Valid N
Sin Hormonas 55,871 7,507 11
Gonadotropinas 79,204 4,321 12
1 nM 60,391 9,220 9
10 nM 84,027 13,199 6
100 nM 61,785 6,219 7
1000 nM 45,059 5,956 8
Tabla 9: Comparación de medias mediante el test de Tukey para pruebas con N desigual
para la Metafase de oocitos bovinos madurados in vitro con un p<0,05.
TTO SH GON 1 10 100 1000
µ=55,87196 µ=79,20496 µ=60,39087 µ=84,02778 µ=61,78572 µ=45,05952
Sin Hmns 0,00014561 0,81404454 0,00014615 0,70694554 0,07493347
Gon 0,00014561 0,00020146 0,88606292 0,00156939 0,00014561
1 nM 0,81404454 0,00020146 0,00017983 0,99942952 0,00324595
10 nM 0,00014615 0,88606292 0,00017983 0,00025201 0,00014561
100 nM 0,70694554 0,00156939 0,99942952 0,00025201 0,00256288
1000 nM 0,07493347 0,00014561 0,00324595 0,00014561 0,00256288
34
Figura 4: Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la maduración nuclear in vitro de
oocitos bovinos a las 24 horas de cultivo.
5.3 Objetivo específico número dos: Determinación del porcentaje de embriones
bovinos producidos in vitro en etapa de clivaje, a partir de oocitos madurados con
gonadotropinas o diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976.
Los porcentajes de clivaje fueron determinados a las 72 horas pos inseminación (hpi)
contando el número de embriones con dos o más células, sobre el total de oocitos
inseminados. Al comparar este porcentaje entre los grupos no se encontró diferencia
significativa (p>0,05) (ver tabla 11).
35
Tabla 10. Análisis Descriptivo para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4
YM976 y gonadotropinas el clivaje de oocitos madurados y fertilizados in vitro con un
p<0,05.
Tratamientos Medias N Desviación Estándar
1nM 73,55 5 22,150
10nM 62,73 6 2,715
100nM 69 3 9
1000nM 50,33 4 9,920
GON 72,74 5 19,890
.
Tabla 11. Comparación de medias mediante el test de Duncan para las diferentes
concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas, en el clivaje de oocitos
bovinos madurados y fertilizados in vitro; con un p<0,05.
1nM 10nM 100Nm 1000nM GON
µ= 73,550 µ= 62,733 µ= 69,000 µ= 50,325 µ= 72,740
1nM 0,34167849 0,67755352 0,05270545 0,93743216
10nM 0,34167849 0,54522471 0,23784083 0,36399258
100nM 0,67755352 0,54522471 0,09770477 0,71720554
1000nM 0,05270545 0,23784083 0,09770477 0,05622295
GON 0,93743216 0,36399258 0,71720554 0,05622295
36
Figura 5. Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de clivaje de oocitos bovinos
fertilizados a las 24 horas de maduración in vitro.
5.4 Objetivo específico número dos: Determinación del porcentaje de embriones
bovinos de cuatro o más células, producidos in vitro, a partir de oocitos madurados con
gonadotropinas o diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976
Al comparar el porcentaje entre los grupos de gonadotropinas (44,77%) y del inhibidor
1nM (42,35%), 10nM (40%) y 100nM (43,6%), no se encontró diferencia significativa
(p>0,05), sin embargo el grupo 1000nM (15,76%) mostró el porcentaje más bajo
significativamente (p<0,05) con respecto a los demás tratamientos (ver tabla 13).
37
Tabla 12. Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4
YM976 y gonadotropinas de embriones en estado de cuatro o más células, producidos in
vitro a partir del total de oocitos madurados y fertilizados in vitro.
Tratamientos Medias N Desviación Estándar
GON 44,77 7 23,84
1nM 42,35 6 22,96
10nM 40,05 8 10,16
100nM 43,60 5 9,73
1000nM 15,77 5 2,03
Tabla 13. Comparación de medias mediante el test de Duncan para las diferentes
concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas, en embriones de cuatro
o más células; con un p<0,05.
TTO GON 1nM 10nM 100nM 1000nM
µ= 44,771 µ= 42,350 µ= 40,051 µ= 43,600 µ= 15,768
GON 0,814567 0,658648 0,903845 0,010313
1nM 0,814567 0,812611 0,897432 0,013446
10nM 0,658648 0,812611 0,730974 0,017880
100nM 0,903845 0,897432 0,730974 0,011924
1000nM 0,010313 0,013446 0,017880 0,011924
38
Figura 6. Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de embriones en estado de
cuatro o más células a las 72 hpi.
5.5 Objetivo específico número dos: Determinación del porcentaje de embriones
bovinos producidos in vitro, en etapa de blastocisto, a partir de oocitos madurados con
gonadotropinas o diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976.
Los mayores porcentajes de embriones en etapa de blastocisto, a partir de oocitos
inseminados, fueron obtenidos en los grupos madurados con el inhibidor de PDE4 YM976
en las concentraciones 1nM (26,18%) y 10nM (22,96%) los cuales no presentaron
diferencia estadísticamente significativa (p>0,05) al compararlos con el grupo madurado
39
con gonadotropinas (21,03%), pero siendo mayor que los porcentajes encontrados con los
grupos de 100nM (10,50%) y 1000nM (10,76%) (ver tabla 15).
Tabla 14. Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4
YM976 y gonadotropinas de blastocistos producidos in vitro a partir del total de oocitos
madurados y fertilizados in vitro.
Tratamiento Medias N Desviación Estándar
1nM 26,19 6 13,31
10nM 22,9 6 4,41
100nM 10,5 3 0,5
1000nM 10,7 4 1,42
GON 21,0 7 2,7
Tabla 15. Comparación de medias utilizando el test de Duncan para las diferentes
concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas, en tasa de blastocistos a
partir de oocitos bovinos madurados y fertilizados in vitro; con un p<0,05.
TTO 1nM 10nM 100nM 1000nM GON
µ= 26,185 µ= 22,963 µ= 10,500 µ= 10,765 µ= 21,035
1nM 0,488472 0,004765 0,004717 0,298868
10nM 0,488472 0,019192 0,018514 0,677403
100nM 0,004765 0,019192 0,954376 0,039221
1000nM 0,004717 0,018514 0,954376 0,035507
GON 0,298868 0,677403 0,039221 0,035507
40
Figura 7. Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de embriones a partir de
oocitos bovinos fertilizados a las 24 horas de maduración in vitro.
El porcentaje más alto de producción de embriones se encontró en los grupos madurados
in vitro con YM976 1nM (43,67%) y 10nM (37,72%), que no presentan diferencia
significativa (p>0,05) con el grupo de gonadotropinas (43,51%). A su vez, 100nM y
1000nM presentaron los menores porcentajes (15,35% y 20%, respectivamente)
estadísticamente significativos (p<0,05) al compararlos con los grupos de 1nM, 10nM y
gonadotropinas (ver tabla17).
41
Tabla 16.Análisis descriptivo para las diferentes concentraciones del inhibidor de PDE4
YM976 y gonadotropinas de blastocistos producidos in vitro a partir de oocitos clivados in
vitro con un p<0,05.
Tratamiento Medias N Desviación Estándar
1nM 43,7 6 19,8
10nM 37,7 8 3,4
100nM 15,3 3 1,3
1000nM 20 3 1
GON 43,5 5 15,33
Tabla 17. Comparación de medias utilizando el test de Duncan para las diferentes
concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 y gonadotropinas, en la tasa de blastocistos
a partir de oocitos bovinos clivados in vitro; con un p <0,05.
1nM 10nM 100nM 1000nM GON
µ=43,678 µ =37,722 µ =15,300 µ =20,000 µ =43,510
1nM 0,506624 0,005185 0,015269 0,984142
10nM 0,506624 0,01787 0,04562 0,494225
100nM 0,005185 0,01787 0,578014 0,004728
1000nM 0,015269 0,045620 0,578014 0,013534
GON 0,984142 0,494225 0,004728 0,013534
42
Figura 8. Efecto del inhibidor de PDE4 YM976 sobre la tasa de embriones a partir de
oocitos bovinos clivados in vitro.
43
6 DISCUSIÓN
La adquisición de la competencia para el desarrollo, dependen de la íntima relación del
oocito con las células somáticas (de la granulosa), cuya función principal es la de nutrir al
oocito hasta etapas finales de su desarrollo. Sin embargo, en la última década se han
desarrollado nuevos conceptos en la biología reproductiva, dentro de ellos, el rol que
juega el oocito en la regulación de las células de la granulosa, así como también la
expansión del cúmulo en la maduración y la adquisición de la competencia del oocito para
su posterior desarrollo (Glichrist y Thompson 2007). Sin embargo en la PIVE los oocitos
son aspirados del folículo interrumpiendo la maduración que ha estado adquiriendo
durante la dinámica folicular, para ser sometidos a una maduración forzosa en presencia
de gonadotropinas por 24h., las cuales se unen a receptores específicos de las células del
cúmulo, generando la expansión y maduración nuclear hasta metafase II en el oocito,
procesos que son mediados principalmente por la vía del AMPc.
El AMPc como segundo mensajero ha sido implicado en la regulación de la maduración de
oocitos en mamíferos. Cuando los niveles de AMPc dentro del oocito descienden, se
induce la continuación de la meiosis, caracterizada inicialmente por el rompimiento de la
vesícula germinal (germinal vesicle breakdown GVBD); finalizando con la expulsión del
primer cuerpo polar (Tsafiri et al. 1996). Los niveles de AMPc son regulados por las
enzimas fosfodiesterasas (PDE) que hidrolizan el AMPc en AMP, con una expresión
especifica de compartimiento en la unidad folicular, en donde la PDE 3 se expresa en el
oocito y la PDE4 en las células del cúmulo (Tsafiri et al. 1996).
Al modular concentraciones de AMPc en las células del cúmulo utilizando inhibidores
específicos de PDE4 se logra obtener a las 24h de cultivo, un porcentaje de maduración
44
nuclear similar a la encontrada con gonadotropinas. Sin embargo la expansión en
presencia del inhibidor de PDE4 Rolipram presenta una cinética diferente debido al
mantenimiento de las uniones gap entre el oocito y las células del cúmulo por más tiempo
(Glichrist y Thompson 2007). Esta respuesta también se observó en este trabajo al utilizar
el inhibidor YM976 en todas las concentraciones evaluadas, donde fue menor la expansión
de oocitos grado 3 comparado con los madurados en presencia de gonadotropinas (ver
figura 1). Esta prolongación de las uniones gap durante las maduración in vitro en
presencia de inhibidores de PDE4 podría permitir el paso de metabolitos, iones,
nucleótidos y aminoácidos, que mejoran la maduración citoplásmica del oocito,
aproximándose a una sincronización entre la maduración citoplásmica y nuclear (Glichrist
y Thompson 2007).
Sin embargo con las concentraciones de 100nM y 1000nM, a pesar de prolongarse la
presencia de uniones gap, se observó una disminución en los porcentajes de maduración
nuclear del oocito (ver figura 4), característica necesaria para la fertilización y posterior
desarrollo embrionario. Posiblemente debido a que estas concentraciones de YM976
pueden tener efecto inhibitorio sobre la PDE tipo 3 localizada en el oocito, lo que evitaría
la disminución de concentraciones de AMPc y la continuación de la meiosis de manera
eficiente (López et al. 2008).
Otros compuestos como el Ro 20-1724 (Bilodeau 2003), el Roflumilast (Huang et al. 2001)
y el Rolipram (Tsafiri et al. 1996), han mostrado resultados similares en la expansión del
oocito y la continuación de meiosis, utilizando diferentes concentraciones de acuerdo a la
especificidad y la constante de inhibición de cada uno de éstos.
El porcentaje de clivaje a partir de oocitos madurados en presencia de gonadotropinas fue
del 72,74%, el cual no difiere de los porcentajes obtenidos con el inhibidor YM976 en
todos los grupos, con un rango entre 50 - 73,55% (ver figura 5); porcentajes similares son
reportados por Sagirkaya et al. 2006 (76,15%) y Alm et al. 2004 (67,4%). Estos resultados
45
sugieren que el porcentaje de clivaje no es un buen criterio para evaluar la competencia
del oocito, debido a que se presentaron diferencias en el porcentaje de maduración
nuclear que no se correlacionan con estos porcentajes.
Se evaluó el porcentaje de embriones en estado de cuatro o más células a las 72 hpi,
donde se encontraron porcentajes entre el 15 y 44% (ver figura 6) para los diferentes
grupos. Los grupos encontrados con gonadotropinas (44,8%) y el inhibidor de PDE4
YM976 a concentraciones de 1nM (42,35%), 10nM (40%) y 100nM (43,6%), son similares a
los reportados por Holm et al. 1998 (48%), Sirisathien et al. 2003 (39%) y Duque et al.
2003 (43% y 58% usando 5% de SFB y sustitutos sintéticos de suero respectivamente). Sin
embargo estos resultados son menores a los reportados por Senatore et al. 2010 (73%
usando técnicas de OPU (Ovum Pick Up)). El porcentaje obtenido con el inhibidor de PDE4
YM976 a una concentración de 1000nM (15,76%) fue el más bajo, sugiriendo que esta
concentración tiene un efecto deletéreo durante la maduración de oocito reflejándose en
el clivaje de cuatro o más células.
Con respecto al desarrollo embrionario (etapa de blastocisto), los porcentajes mayores
fueron obtenidos en los grupos 1nM (26,18%) y 10nM (22,96%)del inhibidor, similares al
grupo de gonadotropinas (21,03%), (ver figura 7) acorde a estos resultados, autores como:
Bettegowda et al. 2007 encontraron porcentajes de embriones alrededor del 23,5%,
Sirisathien et al 2003, con un 23% utilizando factor de crecimiento epidérmico, Sagirkaya
et al 2007 con un 26% al suplementar el medio con 10% de suero fetal bovino (SFB). Sin
embargo el porcentaje de blastocistos obtenido con el inhibidor de PDE4 YM976 a una
concentración de 100nM (10,5%) fue el más bajo en este estudio, a pesar de que el
porcentaje en la maduración nuclear y de clivaje fueron similares a la obtenida con la
concentración de 1nM, sugiriendo que los efectos del inhibidor sobre la maduración del
oocito, deben ser complementada con otras evaluaciones como es la competencia de este
oocito para el desarrollo embrionario. Por último el porcentaje de blastocistos obtenido
46
con 1000nM fue del 10,76%, mostrando que esta concentración es deletérea no solo en la
formación de blastocistos, sino también en los procesos de maduración nuclear (45,05%),
clivaje (50,32%) y embriones de cuatro o más células (15,77%).
Con base en estos resultados se sugiere evaluar un rango en el cual se evalúen las
concentraciones 1nM y 10nM, para determinar la concentración óptima del inhibidor para
la producción in vitro de embriones bovinos; adicionalmente, la evaluación de
citotoxicidad, de estas concentraciones planteadas, y la necesidad de estudiar otros
parámetros de evaluación de calidad del oocito y del embrión, tales como la
determinación de la celularidad embrionaria, expresión génica (Sagirkaya et al. 2007),
niveles de glutatión (Wang et al. 2007) y actividad enzimática en el oocito (Alm et al.,
2005), bajo estos protocolos de producción in vitro embriones bovinos.
47
7 CONCLUSIONES
Se concluye que las concentraciones del inhibidor de PDE4 YM976 1 y 10 nM durante la
maduración in vitro del oocito disminuye la expansión de las células de la granulosa,
posiblemente facilitando el paso de metabolitos, iones, nucleótidos y aminoácidos que
mejoran la competencia del oocito para el desarrollo embrionario.
Los oocitos madurados en presencia del inhibidor de PDE4 YM976 a las concentraciones
1nM y 10nM como único estímulo, presentan una maduración nuclear y competencia
para el desarrollo embrionario, similar a los oocitos madurados con gonadotropinas.
Las concentraciones de inhibidor de PDE4 YM976 1nM y 10nM, bajo las condiciones
experimentales usadas en este estudio, pueden ser aplicadas en procesos de maduración
in vitro de oocitos bovinos, mientras que las concentraciones de 100nM y 1000nM
presentan efectos deletéreos sobre la producción in vitro de embriones bovinos.
48
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