FABAD Farın. Bil. Der.

8, 181 - 196, 1983

FABAD J. Phann, Sci,

8, 181 - 196, 1983

(}3ilün51,el 'Uatantalaı '

Lipozomlar. 1. Özellikleri ve Hazırlama Yöntemleri

Hayat ALKAN(*)

- ---- ---------özet : Fosfolipid moleküllerinin sulu ortamda özel dizilişiler gös­

tererek ve aralarına sulu fazı alarak kapalı cisimcikler (lipozomlar) oluşturduğu yaklaşık yirmi yıldır bilinmektedir. Önceleri bu cisimcikler ınembran modeli , daha sonralarıda ilaç taşıyıcıları olarak kullanılmış­lardır.

Lipozomlar üzerinde hazırlanan ve iki bölümden oluşacak olan der­lemenin bu birinci bölümünde konu, fizikokimyasal ve teknolojik açıdan incelenmiştir. Lipozomların yapısal özellikler i ve hazırlanış yöntemleri ~.nlatılmıştır. Derlemenin ikinci bölümünde lipozomların eczacılık ve tıptaki uygulanışından bahsedilecektir.

LIPOSOMES .1. PROPERTIES AND METHODS OF PREPARATION

Sununary : For the !ast twenty years it h as been known that , aqueous dispersions of phospholipids form closed bilayer structures (li­posomes). These lipid vesicles were first used as model membrane systems and more recently as drug carrier systems.

This review article on !iposomes will be composed of two parts. The physico - chemical and technical aspects of the topic are covered in this first part. The morphological properties and the preparation techniques of the liposomes are described. In the second part of the review the use of liposomes in medical and pharmaceutical sciences will be explained and discussed.

- - - -- - --- - --- --·--- ----

( * ) A.Ü. Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı, Tan­doğan - Ankara.

181

GİRİŞ

Bir ila~ şeklinin içindeki etken madde, etkisini gösterebileceği hüc­relere ulaşabilinceye kadar vücutt<t­

ki birçok molekül, hücre, membran ve organlarla karşılaşır. Farmakolo­

jik etkisi olan maddelerin bir kısmı sağlam dokular için belirgin dere­cede toksiktir. Aynca, madde vücıı­

da girdikten sonra değişikliğe u~­

rayabilir, inaktive olabilir veya has­

ta dokuya az bir miktarda ulaşa·

bilir. Yukarıda bahsedilen sakın­

calar nedeniyle son yıllarda etken maddeyi istenen dokuya taşıyan özel

taşıyıcı sistemlerin geliştirilme>i

konusunda yoğun araştırmalar ya­pılmaktadır (1, 2). Bu taşıyıcı sis­temler, etken maddeyi yapılarınd'l.

saklıyarak, hasta dokulara ulaştı­

rırlar ve ancak etki istenen bölg~­

de, serbest bırakırlar. Böylece sağ­lam dokular ilacın yan etkilerin­den, ilaç da yıkıcı ortam koşull9.­

rından korunmuş olur. Ayrıca ilaç taşıyıcı preparatlar, etken madde­

nin hemen hemen tümünü hasta dokuya ilettiği için çok daha düşük dozlarda hazırlanabilirler. İşte son yıllarda üzerinde çok araştırma ya­

pılan bu taşıyıcı sistemlerin en önemlilerinden biri lipozomlard :.r (3 - 6).

Lipozomların yapıları hücre membran yapısına çok benzediği

için ilk kullanımları hücre memb­

ranı ile ilgili çalışmalarda model

olaraktır (7 - 10). Lipozomlar tok­sik ve immunojenik değildirler, hüc­re membranı ile geçimlidirler, or­

ganizmada istenen belli bölgele ~·e

182

gönderilebilirler ve biyolojik olar~~k

yıkılabilirler. Bütün bu çekici özel­liklerinden dolayı Iipozomlar yet· mişli yılların başından beri ilaç taşıyıcıları olarak geliştirilmekt.':­

dir (3 - 6).

Bu tarama yazısında oldukça yeni bir ilaç şekli olan lipozomla­rın tanıtılması ve lipozomlarla ilgi­

li günümüze dek geçirilen aşamala­

rın anlatılması amacı güdülmüştür.

Konu çok geniş kapsamlı olduğu

için iki kısımda incelenmesi uygun görülmüştür. Birinci bölümde lipo­zomların morfolojik özellikleri ve hazırlanış yöntemleri anlatılmaya

çalışılacaktır. Derlemenin ikinci bö­lümünde ise lipozomların tıp ı.:e

eczacılıktaki kullanım yerleri ve bu

arada klinik uygulamalarından bah­sedilecektir.

LİPOZOMLARIN TANIMI VE

YAPILARI

Lipozomlar, aralarında sulu faz bulunan, bir veya daha çok sayıda biyolojik membrana benzer _ yapı­

daki lipid tabakalarının oluştu_rdu­

ğu, mikroskopik boyutlarda, genr.1-likle küre şeklinde cisimciklerdir (Şekil 1 ve Şekil 3).

İlk defa Bangham ve arkad:ı5-

ları (11) tarafından fark edilen li­

pozomlar, isminden de anlaşılaca~~ı gibi lipid moleküllerinden oluşur­

lar, yapılarının temel elemanı fos­folipidlerdir. Benzer şekilde yağ

asitlerinden ufazomların (12) ve yü­

zey etken maddelerden de, yüzey

etken madde keseciklerinin (13) h:.ı-

Foafolipid Mcl•küllt ri

Htk5ogo-nııt F.aı.

Smel<tlk Mezofaz

d

.Lipozom

Şekil ı. Fosfolipid Moleküllerinin Sulu Ortamda Dizilişleri

zırlanabileceği ve bu cisimcikleriı1

özellik ve yapılarının Upozomların­

kine yakın olduklan gösterilmiştir.

Bazı yayınlarda lipozom sözcüğü

onlar için de kullanılmıştır. Bu derlemede lipozom sözcüğü ile ılo­

ğal veya sentetik fosfolipidlerin oluşturduğu kesecikler kastedilecek­tir .

Lipozom oluşturan fosfolipid molekülleri amfifil özelliktedir v~

suyu seven hidrofilik baş ile yağı

seven hidrofobi~ hidrokarbon zin­cirlerinden oluşurlar (Şekil ıa.1 •

Fosfopilid çözeltisi kuruluğa kad2.r uçurulduktan sonra geriye kalan artık üzerine az bir miktar su il::l.­ve edilirse bu su lipid molekülleri­nin hidrofilik başlan tarafınd:ın

tutulur ve moleküller birbirine ya~­laşarak ortada su bulunan silindi­rik şekilde partiküller oluşturur

(Şekil 'lb). Heksagonal faz olarak tanınan bu geometrik diziliş lipid moleküllerinin hidrofil başların•.'l.

elektriksel özelliğinden ve suya kar­şı olan ilgisinden doğmaktadır. Bu tip diziliş ortamdaki su miktaıı

%5 a/a civarında iken izlenir. Fo:;­folipid molekülleri sabun ve deter­janlar şeklindeki diğer amfifil mad-

deler gibi daha fazla sulu ortamda

(%15 • %50 a/a) miseller ve mono· merler halinde dağılmayıp, tab:ı-

kalar şeklinde dayanıklı oluştururlar. Bu yapı sıvı

özelliğindedir ve myelin

dizilişler

kristal şekiller

veya smektik mezofaz isimleri ile de anlatılabilir (Şekil le). Ortamda %50 a/a dan fazla su bulunursa, hidrofobik uçların sudan kaçma. eğilimi sonucu fosfolipid molekül­leri çift moleküllü tabakalar halin­de dizilerek iç içe dairesel halk:ı·

lar oluşturur. Lipozom adı yerileı:ı

bu küresel parçacıklar ortama bir· birinden bağımsız olarak dağılırlar (Şekil ld) (9).

Lipozomlann özellikleri kendi­lerini oluşturan fosfolipid bileşik­

lerinin dizilişleriyle ve yapılarıyh

çok yakından ilişkilidir. Şekil 2 ~e lipozom oluşturan fosfolipidler göa­teril.miştir. Hldrofilik baş grupları

pH ye göre anyonik veya zwitteri­yonik olabilir. Hidrokarbon zinciri ise değişik uzunlukla ve değişik öl­çüde doymuş olabilir. Biyolojik kay­

naklı fosfollpidlerin alkil zlncirle~i

oldukça uzundur (en aşağı 16 kar­bon içerirler ) ve doymamış yağ asit­leri içerirler.

183

•

o il

·-

R-C-0-CH 1 2

I

R-C-0-CH o il 1 il O CH-0-P-X

2 . l o-

X = -OH Fosfatidik Asit

X = -OCH2CH2N+ (CH3) 3 Fosfa­

tidilkolin

X = -OCH2CH2NH2 Fosfatidileto­

nalamin

X =. -OCH2CHNH Fosfatidilserı!'l

1 COOH

X -OCH2CHCH20H Fosfatidil-

j gliserol

OH

R ve Rl = !ı:ağ Asitleri

Hoymuş Yağ Asitleri

CH3(CH2 )nCOOH

n = 10 laurik

n = 12 miristik

n = '14 palmitik

n = 16 stearik

n = 18 araşidik

Doymamış Yağ Asitleri

Oleik

Linoleik

Linolenik

Şekil 2. Lipozom Oluşturan Fosfolipidlerin Yapısı

Moleküler seviyede lipozomları:1

morfolojisinin anlaşılması. fosfoli­

pidlerin kimyasal yapılarının inc..:­

lenmesi ile gerçekleşebilir. Alkil

zincirinin oluşma şekli, baş gru.11-

Iarının sayısı, baş gruplarını hitl­

rate eden su moleküllerinin sayısı

ve ,c;u - lipid etkileşme kuvvetleri !i­

pozom oluşmasına ve özelliklerine

çok etkiyen faktörlerin arasında

sayılabilir (14) .

Normalde bir fosfotidilkolin

molekülü 23 molekül su ile birle­

şir. Bunların 11 molekülü lipidin

iç kısmında tutulmuştur, 12 mole­

külü ise baş gruplarını hidratiz.?

eder. Lipozomlardan suyun ayrıl-

184

ması için gerekli işin deneysel ola­

rak ölçülmesi, faz değişimine sebep

olan serbest enerji yüklerinin direkt

saptanmasını sağlar (15).

Hidrokarbon klsımlar arasında­

ki hidrofobik etkileşme ve baş grup­

larındaki elektrostatik itme ku·ı­

vetleri sonucu, lipidler çift mole­

küllü tabakalar halinde ve bükük

bir diziliş gösterirler. Küresel 5e­

killerde bükülme en yüksek düzey­

de olduğu için dış yüzey alanı iç

yüzeyden büyüktür. Dış yüzeydeki

moleküllerin sayısı iç taraftakile­

re kıyasla iki kat daha fazladır.

Bütün bu belirtilen noktalar göz

önüııe alınacak olursa, ileride anla-

tılacağı gibi tek tabakalı lipozom­ların hazırlanmasında ultrasonik enerji gereksinimine şaşmamak ge­rekir (16) .

Lipozomların yapılarına fosfo­lipidlerin yanında başka maddeler de girer. Bunlar :

- Stabiliteyi artırıcı maddel~r

(kolesterol, a - tokoferol gibi)-. - Hedeflenmeyi sağlayıcı mad­

deler (immunoglobulinler, stearil amin, seti! fosfat, glikolipidler gi­bi) .

- Etken maddeler (antineoplas­tik maddeler, enzimler, hormonlar, şelat yapıcı ajanlar gibi), diye üç

grupta toplanabilir. Bu katkı mad­deleri ve etki mekanizmaları il~

ilgili bilgiler derlemenin ikinci bö­lümünde ayrıntılı olarak verilecek­tir.

Lipozomların yapısal özellikle­ri elektron mikroskop <I 7 - 21), nük­leer magnetik resonans (21 - 24), floresans (25 - 29), !eser. raman ve infrared spektroskopi (30 - 31 ), di­feransiyel skenning kalorimetfi (532), ve X- ışını difraksiyonu (21)

~ibi yöntemleriyle incelenmiştir .

LİPOZOMLARIN FAZ DEGİŞİMİ

Lipozomların faz değiştirme

özelliklerinden gerek lipozom pre­paratları hazırlanırken gerekse kul­lanılmalarında çok yararlanılır. Ay­rıca bu özellikleri lipozomlann sta­bilitelerini de çok etkiler. Burada bahsedilen fazlar jel (katı) ve sıvı

kristal (sıvı) fazlarıdır. Bir fazdan diğer faza geçiş üç şekilde sağla­

nabilir.

Sıcaklığa Bağlı Faz Değişikliği :

Lipozomlar ısıtıldlltları vey.ı

soğutuldukları zaman, belli bir sı­caklıkta faz değişimi görülür. Bu sıcaklığa faz değişimi sıcaklığı ve­ya kritik sıcaklık denir. Lipozom­lar faz değişimlerinde belirgin ya­pısal değişiklikler gösterirler, an­cak ·bu değişiklikler dış görünüm­lerini etkilemez yani yine smektik mezofaz veya çift moleküllü taba­kalar halinde kapalı cisimciklerdir . Kritik sıcaklığın altında tabakala­rı oluşturan çift sıra dizilmiş fos­folipidler çok muntazam dizilmiş­

lerdir ve katı haldedirler. Belirti­len sıcaklığın üzerinde ise lipid mo­leküleri sıvıdırlar. Lipozomların jel halinden sıvı kristal şekline dönüş­

leri çeşitli araştırıcılar tarafından

değişik yöntemler kullanılarak in­celenmiştir (31 - 37). Termodim.­mik parametreleri elde etmede uy­gulanan en iyi metod diferansiyel skennig kalorimetridir. Bu yön­temle yapılan yeni bir çalışma.,

fosfotidilkolin tabakalarının faz değişmesine fosfolipidlerin zincir :.ı­

zunluğunun ve bu zincirlerln gli­serol iskeletine ·bağlanış durumu­nun etkisi olduğunu göstermiştir

(32).

Konsantrasy~n_a Bağlı Faz De­

ğişimi:

Lipozom oluşturan fosfolipid­ler suda çözünmeyip şişen cinsten­dir. Yukarıda anlahldığı ve. Şekil

ı de gösterildiği gibi değişik su konsantrasyonunda değişik fazlara rastlanır (9, 19). Yüksek lipid kon-

185

santrasyontında si·;ı kristaller olu­

şur, daha düşük lipid konsantras­

yonlarında ise tabakaları oluşturan

1'osfolipid molekülleri ortamın faz­

la suyundan kaçabilmek için daha

sıkışık bir diziliş oluşturur. Aşağıda

bahsedilecek olan tek tabakalı ve

yakın büyüklükteki lipozomlar %i1

den daha düşük lipid konsantras­

yonlarında hazırlanırlar.

Katkı Maddelerine Bağlı Faz

Değişimi:

Aynı cins saf Iıpid molekülleri

için çok keskin olan faz değişimi,

katkı maddelerin varlığında daha ya­

vaş olabilir veya hiç oluşmuyabi­

Iir. Kardiolipid 1e fos1'atidilglise­

rolün çift moleküllü tabakalannı.n

faz değişimine bir ve iki değerlikli

metal iyonlarının etkili olduğu gös­

terilmiştir (19). Doğal membranda­

ki varlığından dolayı lipozomlara

kolesterol ilavesinin etkisi araştı­

rıbnıştır (19, 38 - 42). Genelde ko­

lesterol lipozomların jel şeklinden

sıvı kristal şekline dönmesini zor­

laştırır, ve lipozomların sertliğini

faz değişimi sıcaklığının altında

azaltır, üzerinde ise arttırır. Saf

dipalmitoilfosfotidilkolin Iipozomla­

n 22°C de jel durumunda iken ko-

. lesterol ilave edilince aynı sıcak­

lıkta sıvı kristal özelliği gösterirler

(41). Yakın zamanda yapılan bir

çalışma lipozomlann faz değiştirme

sıcaklığını ölçmek için yeni bir tek­

nik ileri sürmektedir (42). Fosfo­

lipidlerin polar gruplarının oluş­

turduğu komplekslerin, fluoresans

spektrumları ile saptanması esası·

186

na dayanan bu te.lmikle kolestero­

lün dipalmitoilfosfotidilkolin lipo­

zomlarına etkisi araştırılmıştır. El­

de edilen bulgulara göre, kolestero­

lün %9 gibi az konsantrasyonları

polariteyi arttırıcı ve %13 veya da­

ha fazla konsantrasyonlarının po­

larileyi azaltıcı etkisi vardır. Koles­

terolün, fosfolipid molekülleri ar~ı­

sındaki yerleşim durumu henüz tam

açıklanamamıştır, ancak fosfolipid­

lerin zincirlerine paralel olarak, ve

3{3 - OH grubunun, gliserol iskele­

tine yakın bir şekilde durduğu, ve

alkil zincirlerinin hareket serbest­

liğini kısıtlayıcı bir etkisi olduğu

hakkında genel bir kanı vardır (39).

LİPOZOMLARIN

SINIFLANDIRILMASI

Lipozomlar büyüklüklerine, ta­

baka sayılarına ve elde ediliş

yöntemlerine göre dört sınıfta top­

lanabilirler ~ - Çok Tabakalı Lipozomlar

(Multilameller Vesicles, MLV)

- Küçük Tek Tabakalı Lipo­

zomlar (Small Unilameller Vesicles,

SUV) - Büyük Tek Tabakalı Lipo-

zomlar {Large Unilameller Vesicles,

LUV) 1

- Ters Faz Buharlaştırma Tek-

niği İle Hazırlanan Lipozomlar (Re·

verse Phase Evaporation Vesicles,

REV). Lipozonıların gruplarına göri?

özellikleri Papahadjopoulos ve ar·

kadaşları (3) tarafından saptanmış

ve sonuçlar Tablo l 'de gösterilmiş­

tir.

Tablo 1. Lipozom Sınıflarının Karşılaştırılması

ÇAP

(mikrometre) TUTMA

KAPASİTESİ (%) TUTULAN HACIM (µ1 ml-1)

LİPOZOMLARIN

HAZIRLANMASI

MVL

0.2 - ıo

5 - 15

4

Lipozomları hazırlama tekniği

oluşacak lipozomların tabaka sayı­

sına, büyüklük dağılımına, sulu fa­zın ne kadar etken madde tutabi­leceğine ve tabakaların geçirgenli­ğine etkiyeceği için, kullanılacak

metocl amaca yönelik seçilmelidir. Lipozom hazırlarken ilk önce

dikkat edilecek nokta kullanılaca!~

lipidin saf olmasıdır. İçerdikleri

serbest yağ asitleri ve lizofosfoli­pidler lipozomların yüküne, ve ge­çirgenliğine etkirler (43) . Bütün fosfolipidler kullanılmadan önce en az iki çözücü sisteminde ince ta­baka kromatografisi ile kontrol e­dilmelidir ( 43).

Fosfotidilkolin lipozomların ha­zırlanmasında en yaygın olarak kul­lanılan fosfolipiddir ve yumurta sarısından ekstraksiyonla elde edi­lir ('23) . Fosfatidilserin, fosfatidik asit ve sifingomiyelin ise öküz bey­ninden elde edilir (44) . Yüksek ba­sınç sıvı kromatografisi ile de soıı

suv LUV REV

0.02 - 0.05 0.2 - 1.0 0,2 - 0.8

o.5 - ı.o 5 - 15 36 - 65

0.5 9 14

zamanlarda karışımlardan saf fos­f olipidler elde edilmiştir (45). Saf­laştırılmış fosfolipidler inert gaz altında organik çözücüler içinde, -20°c de saklanmalıdır (43).

Çok Tabakalı Lipozomlarm (MLV) Hazırlanması:

MVL ler tam anlamıyla bütün özellikleri bilinmemesine rağmen,

en ilk hazırlanışı açıldanan ve en yaygın olarak kullanılan lipozom şeklidir (Şekil 3) .

Bangham (11) tarafından orta­ya atılan ilk MLV hazırlama me­todu ince lipid filminin hidratasyo­nu esasına dayanır. İnce lipid ta­bakası, lipidlerin kloroformdaki ÇÖ·

zeltisinin bir balon içinde önce rotovaporda sonra da vakumlu de­sikatörde iyice uçurulması sonuc~t

elde edilir. Tabakaların arasınd'.:ı.

tutulması istenen sulu çözelti ile balonun iç yüzeyindeki lipid filmi, ya el veya vorteks karıştırma ile lipozom tanecikleri halinde ortama dağıtılır. Lipozomlar ancak fosfo-

187

Sulu Faz

Şekil 3. Çok Tabakalı Bir Lipozomun Şematik Görünüşü

lipidler faz değiştirme sıcaklığı üze­

rinde h idratize edildikleri zaman

oluşurlar. Hidratasyon zamanını'1

oluşan lipozomların kapladıkları ~u

fazı miktarına çok etkisi vardır.

Benzer lipid konsantrasyonları 2

saat yerine, yavaş yavas çalkalana­

rak 20 saat hidratasyona bırakılır­

sa, bir mol lipid başına %50 dah:ı

fazla sulu faz düşecek şekilde lipo­

zom oluşturulabilir. Ancak bu iki

preparat hemen hemen aynı parti­

kül büyüklüğüne sahiptir (46).

İlk defa Bangham tarafından

uygulanan (11) klasik yöntemle el­

de edilen lipozomlar çok farklı bü­

yüklükte ve küre yanında uzunc:ı

şekillere de sahip olabilirler. İste­

nen büyüklük ve şekilde çok taba­

kalı lipozomlar, heterojen karışımın

188

basınç altında polikarbonat filt­

relerinden (Nucleopore Inc.) geçi­

rilmesi ile elde edilir ( 46) . F il tre­

lerin gözenek çapı 0.2, 0.4, 0.6, 0.8

ve ı.o µm olan cinsleri kullanılır.

Ancak filtrasyon işlemi faz değişi­

mi sıcaklığının altında yapılmalıd ı<.

Küçük Tek Tabakalı Lipozom­

ların (SUV) Hazırlanması :

Benzer büyüklükte ve tek kom­

partmanlı olan Jipozomlar, fiziko­

kimyasal özelliklerinin daha iyi bi ­

linmesi nedeniyle araştırma ve UY ·

gulamalar için MLV lere kıyasla çok

daha elverişlid ir. SUV lerin hazır­

lanması için ultrasonik enerjinin

kullanılma fikri ilk Huang (47) ta­

rafından öne sürülmüştür. Ya çu­

buk veya banyo tipi sonikatör kul­

lanarak işlem gerçekleştirilir. Çu-

ouk tipi kullanılırsa daha çok ener­

jiden yararlanılır ve daha kısa sü­rede sonuç elde edilir, ancak çu­

buğun ucundan kopan titanyum

parçacıklarının sonradan ultrafilt­rasyon veya santrifüj ile temizlen­

mesi gerekir. Sonikasyon, faz de­ğişim sıcaklığının hemen üzerinde­

ki bir sıcaklıkta yapılmalıdır. Ak~i

halde lipozomların yapılarında ku­

surlu kısımlar oluşur (41, 48, 49).

Belli bir lipid dispersiyonunun so­

nikasyon süresi arttıkça, dispersi­

yonun bulanıklılığı ve viskozitesi semilogaritmik olarak azalır . Pla­toya ulaşıldığında ışığa karşı geçir­

~en ve tek düze bir dağılımdadır.

Sonikasyon ile 215 - 500 A 0 boyutı~­

rında lipozomlar elde edilir.

Deterjan ayrılması tekniğiyle

de tek tabakalı lipozomlar hazı:·­

lanmıştır. Fosfolipidlerin sodyum

kolat gibi bir deterjanla karışık

miselleri hazırlanır ve bu miseller­den deterjan moleküllerinin jel filt­rasyonu (50) veya diyaliz (51) il<.

ayrılması sonucu lipozomlar oluşuı".

pH değişikliği ve farklı miktarlar­

da kolestrol kullanılması istenen boyutlarda lipozomların hazırlan ­

masını sağlar. Diyaliz yöntemi ile

lipozom hazırlayan ticari bir alet de gelştirilmiştir (Lipoprep R Bi­

layer Liposome Preparation Device Bachover, Reutlinger, Batı Alma n­ya).

Küçük tek tabakalı lipozomlar enjeksiyon metoduyla da elde edi­lebilir. Lipidlerin etanollü çözelti­leri bir Hamilton iğnesi kullanıla­

rak yavaş yavaş karıştınlan, faz

değiştirme sıcaklığının üzerinde ısı­

tılmış sulu çözeltinin üzerine en­jekte edilir (52). Oluşan lipozom­

ların büyüklükleri alkol çözeltisin­

deki lipid konsantrasyonuna göre değişir (53). Bu yöntemin bir de­

zavantaj ı çok seyreltik lipozom prz­paratlarının oluşmasıdır. French

basınç hücresi ile de küçük tek ta­bakalı lipozomlar hazırlanmıştır.

(54, 55). Lipidlerin sulu sjspansiyonu

French basınç hücresinin odacığı­

na konur ve 20.000 psi basınçl::ı

ufak bir delikten fışkırtılır. Olu­şan lipozomlar 150 - 300 A büyüklü­

ğündedir.

Büyiik Tek Tabakalı Lipozom­

Iarın (LUV) Hazırlanması : KüçüK

tek tabakalı lipozomlar her ne ka­dar fizikokimyasal özelliklerin in­celenmesi açısından uygunsa da

pratikte makromoleküllü maddele­rin preparatlarının hazırlanma:;ı

için ve fazla miktarda sulu fazrn tutulmasvı için uygun değildir. Bu nedenden LUV lerin hazırlanma-;ı

için yöntemler geliştirilmiştir. Li­

pid tabakasının yavaş yavaş hidra­tasyonla şişmesi ile bu tip lipo

zomlar elde edilebil ir (56>.

Bu yöntemde şişme olayı dış­

tan hiçbir ŞE.kilde sarsma oımadarı

~erçekleşmelidir. Yavaşça su buha. rı ile doyurulmuş azot gazının

cam üzerindeki lipid filminin üze­tine üflenmesi ile lipid tabakasının .~iı;mesi ve ayrılması sağl anır. µ ..

nun üzerine bir miktar su damlatı­l ı rsa büyük tek tabakalı lipozom ­

lar oluşacaktır (56) .

189

Oo- <;)~ o ·-- 0 ~+ Q ~(\-+ ----t~- TA o o ~(,) ~ - -

0 0 0 .O . -

suv Ko klt <ıt -LUV Şekil 4. Kalsiyum ve EDTA Etkisiyle LUV Hazırlanması

Eter enjeksiyon yöntemi ile de LUV ler elde edilebilir (57). Fosfo­

lipidlerin eterdeki çözeltilerinin ılık

(55° - 65°C) sulu çözeltiye enjeksi­

yonu sonucu organik çözücünün u­çurulması ile lipozomlar hazırla­

nır. 1.2 µm milipor filtrelerinden

süzüldükten sonra lipozom dispersi­

yonunun ortalama partikül büyük­lüğü 1500 - 2500 A0 arasındadır.

Papahadjopoulos ve arkadaşla­

rının (58) önerdiği LUV elde etme

tekniği ise asidik fosfolipidlerden hazırlanmış SUV ler üzerine kal­

siyum ilavesiyle büyük silindiri!~

kıvrık çok tabakalı yapılar oluştu­

rulması prensibine dayanır. Bu si­lindirik yapıların (kokleat} üzerine

etilendiamintetraasetik asit ilavesi büyük tek tabakalı lipozomların el­desine neden olur (Şekil 4).

Ters faz buharlaşma yöntemi LUV hazırlanması için önerilen ye­

ni bir metodtur (59). Fosfolipidle­rin eterdeki çözeltisine sulu çözel­

tinin ilavesinden sonra organik çö­zücünün alçak basınçta uçurulması ile lipozomlar hazırlanır. Fosfoli­pidler önce dietileter, izopropileter

veya izopropileter ve kloroform ka-

190

rışımı (1 : 1) gibi organik çözücü­

lerde çözülür. Sulu çözelti bunun üzerine ilave edilir. Kısa bir süre

sonikasyon uygulanır ve homojen.

bir S/Y emülsiyonu oluşur. Orga­nik faz alçak basınçta uçurulunca faz değişimi sonucu viskoz jel bir

yapı oluşur, sonra bu jelden roto­

vaporda organik çözücünün uçurul­masına devam edildikçe lipozomlar meydana gelir. Şayet buharlaştırma

çok hızlı olursa, bir miktar su da

buharlaşabileceğinden çok tabakalı

lipozomların da oluşması mümkün­

dür. Daha sonraki bir çalışmada

orta büyüklükte (0.1 - 0.2 µm) lipo­

zomlar elde etmek için REV ler polikarbonat filitrelerindeıi geçi­

rilmişlerdir (60) .

Tek tabakalı ve büyük lipu­

zomların hazırlanması için son za­

manlarda yeni bir yöntem daha ö­

nerilmiştir (61). Dondurup eritme

prensibine dayanan bu yöntemde

önce klasik şekilde çok tabakalı li­

pozom süspansiyonu hazırlanır. 1 O

dakika kadar sonikasyon uygulanıp

- 196°C sıvı azot içerisinde yavaş

yavaş çalkalayarak dondurulur. 15

dakika 23°C de eritilip 25°C de tek­

rar 30 saniye sonikasyona tabi tu­

tularak istenen özellikte LUV ler

elde edilir.

Yukarıda anlatılan tekniklerle

elde edilen lipozomlardan ortamd':l.­

ki Jipozom yapısına girmeden ka-

lan maddeler,- jel

(62, 63) (Sephadex kromatografisi

G - 50, G - 75),

ultrasantrifüj (64, 65), ultrafiltras­

yon (66), ve diyaliz (67, 68) yön­

temleri ile ayrılır.

Hazırlanmış lipozomlarda, et­

ken maddeyi en randımanlı ş.ekil­

de tutma, büyük molekülleri de

yapılarına alabilme, dayanıklı ol ­

ma, dar büyüklük dağılımı göster­

me ve bilinen tabaka sayısına sa­

h ip olma gibi özellikler aranır. Bu

özelliklerin hepsini sağlayabilecek

tek bir hazırlama yöntemi bulmak

çok zordur. Her hazırlama tekni­

ğinde birtakım arzu edilmeyen nok­

talar bulunur. Ancak mevcut yön­

temler arasında, yukarıda sayılan

özelliklerin çoğuna sahip lipozom­

ların hazırlanmasını sağlıyabilen

ve son zamanlarda ilerisi için en

çok ümit vadeder gibi görülen yön­

tem ters faz buharlaştırma yönte­

midir (3) (Bak. Tablo 1). Günü­

m üze dek, üzerinde bu denli çalı­

şılmasına rağmen istenen özellik­

lerde lipowmlann endüstriyel çap­

ta büyük miktarlarda hazırlanma­

sını sağlayacak bir teknik henüz

geliştirilememiştir.

SONUÇ Lipozomlar son yıllarda özel­

likle ilaç taşıyıcı sistemler olarak

üzerinde çok çalışılan bir konu ol-

muştur. Temel yapılarını fosfolipid

moleküllerinin çift sıralı dizilişleri

oluşturur. Doğal membrana ben­

zeyen bu yapının özellikleri kendi­

ni oluşturan fosfolipid molekülle­

rinin ve diğer katkı maddelerin

özelliklerine bağlı olarak değişir.

Lipozom hazırlanırken, bitmiş ürün­

den istenen özellikler gözönüne a­

lınarak yöntem saptanmalıdır. Mev­

cut yöntemler arasında şimdilik a­ranan özellikleri en fazla sağlaya­

bilen metod olarak ters faz buhar­

laştırma yöntemi söylenebilir . AP.­

cak henüz endüstriyel çapta lipo­

zom imalatı geliştirilememiştir.

(Geliş Tarihi : 21.10.1982)

KAYNAKLAR

ı. Windder, K.J., Senyei, A.E,

Sears, B., «Experimental Met­

hods in Cancer Therapeutics»,

J. Pharm. Sci, 71, 379 - 387,

1982. 2. Gregoriadis, G., «Targeting of

Drugs: Implications in Medi­

cine», Lancet, 2, 241 - 247, 198!.

3. Papahadjopoulos, D., Fraley,

R ., Heath, T.. «Optimization

of Liposomes As

System for the

A Carrier

In tracell ula ı:

Delivery of Drugs, Macromole­

cules», Tom B.H., Six H.R.

(Ed) ., Liposomes and Iınınu­

nobiology, Elsevier North Hol­

land, Inc., 151 - 164, 1980.

4. Gregoriadis, G ., Allison, A.C .,

(Ed} «Liposomes in Biological

Systems» Chichester, N.Y ..

John Wiley and Sons, 1980.

5. Saunder, R., «Liposomes as

Carriers in Biological Systems»,

191

South African. J. Sci., 76, 297 ·

298, 1980.

6. I'apahadjopoulos, D. «Liposo­mes as Drug Carriers», Amı.

Rep. Med. Chem, 14, 250 - 260,

1979

7. Bangham, A.D., Hill, M.W., Miller, N.G.A., «Preparation and use of Liposomes as MJ­dels of Biological Membranes.», Korn E.D. (Ed) , Methods in Membrane Biology, New Yorıc,

Plenum Press, Vol. 1, 1974.

8. Bangham A.D., «Properties and Uses of Lipid Vesicles An Overview», Ann. N.Y. Acaıl,

Sci., 308, 2 - 7, 1978.

9. Fifield, R., «Liposomes Bags

of Biological Potential», New Scientist, 150 - 153, 16 Oct. 1980.

10. Ceztaro B., Cervato G,, Suman T., Pistolesi E., Bolognani L. «Liposomes as Tool in Studying Functions of the Membranes A Biophysical Approach to the Properties of Sulfatide - Phos­pholipid Bilayers», Basic Ap_(>. Histo - ehem., 26, 28, "1982.

11. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins, J.C., «Diffusion of Unilavent ions across the la­mella of swollen phospholi­pids», J. Mol. Bio., 13, 238 - 252,

1965.

12. Hicks, M., Gebicki J.M., «Mic­roscopic Studies of Fatty Acıd Vesicles», Chem. Phys. Lipids, 20' 243 - 252, 1977.

13. Fendlcr, J.H., «Surfaclant V~­

sicles as Membrane Mimectic Agents Characterization and

192

Utilization», Acc. Chem, Res .• 13, 7 - 13, 1980.

14. Hauser H., Guyer W., Pascher I., Skarabel P., Sundell S., «Polar Group Conformation of Phosphatidylcholine : Effect of Solvent and Aggregatiom. Biochemistry, 19, 366 · 373, 1980.

15. Parsegian V.A., Rand R.P ., Fuller N. Mc Alister M, Lis L.J., «Molecular Forces bet­ween and within Lipid Memb­ranes», Biorheology, 16, 293 -

295, 1979.

16. Tanf0ld C., (Ed) The Hydrop­hobic Effect. Formation of Mi­celles and Biological Membra­nes, John Wiley, N. Y 2nd. Ed. 1980

17. Goto K., Sata H., «Formation of Celi - Sized Single - Laye­red Liposomes in a Simple Sys­tem of Phospholipid, Ethanol

and Water», Tokoku J. Exp.

Med., 131 , 399 - 407, 1980.

18. Bangham A.D., Horne R.W .. «Negative Staining of Phospho­lipids and their Structuml Modification by Surface Acti­ve Agents as Observed in the Electron Microscope», J. Mol. Bio., 8, 660 - 668, 1964.

19. Rainier S., Jain M.K., Ramirez F., Ioannou V.P., Marecek J.F. , Wagner R., «Phase Transition Charecteristics of Diphospha­tidyl - Glycerol (Cardiolipin) and Stereoisomeric Phospha­tidyldiacylglycerol Bilayers. M.o­no and Divalent Metal Ion Ef. fects, «Bioc1lim. Biophys. Act.ı ,

558, 187 - 198, 1979.

20. Goto K. Tamahashi N., «Elet:­

tron Microscopic Studies on

Celi - Sized Bilayer Liposomes-.ı,

Tohoku J. Exp. Med., 134, 97 -

102, 1981.

21. Hui S.W. Stewart T .P ., Yeag­

Je P.L., -Albert A.D., «Bilaycr

to Non - bilaycr Transition in

Mixtures of Phosphatidyletha­

nolaminc and Phosphatidylcho­

line. Iınpications for Memb­

ranc Propcrties», Arch. Bioc­

hcın. Bioplıys, 207, 227 - 240.

1981.

22. Pctcrsen, N.O., Chan SJ., «Mo-

re on the Motional State of Lipid Bilayer Membranes : In­

terpratations of Order Para­

meters Obtained frorn Nııcleo.:­

Magnetic Resonance Experi­

men ts», Biochcmistry, 16 .. 2687 -

2660, 1977.

23. Mason J.T., Huang, C., «Hyd­

rodynamic Analysis of Eg",

Pho~phatidylcholin Vesicles·\

Aıın. N,Y. Acad. Sci, 308, 29 -

49, 1978.

24. Wu P.S., Tin G.W., Ba\desclı­

wieler J.D., Shen T .Y., P on­

pipom MM., «Effect of SıJrf'.l­

ce Modification on Aggregatio11

of Phospholipid Vesiclesıı. Pro-:.:

Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6211 -

6215, 1981.

2!1. H ichols J.W , Hill M.W., Bang­

harn A.D., Dearner D.W, «Me:o.­

surement of Net Proton - Hyd­

roxyl Permeability of Largc

Unilamellar Liposornes with

the Fluorencent pH Prob , !l -

Aminoacridine», Biochim. Bi­

ophys, Acta., 596, 393 - 403 ,

1980.

26. Wilschut J ., Düzgüneş N., Frn­

Iey R., Papahadjopoulos D ,

«Studies on the Merhanism of

Membrane Fusion Kinetics

of Calcium Ion Induced Fusi­

on of Phosphatidylserine Vc­

sicles Followed by a New As­

say for Mixing of Arıueous Ve­

sicles Contcntsıı, Biochemistry,

19, 6011 - 6021, 1980.

27. Clement N.R., Gould J.M.,

«Pyraninc (8 - Hydroxy - 1, 3. 6

Phospholipid Vesiclc», Bioc­

be of Internal Aqueous Hydro­

gen Ion Concentration in

Phospholipid Vesicelsıı, Bio·;­

hcmistry, 20, 1534 • 1538, 1981.

28 Clement N.R , Gould J.M ..

<(Modulation by Srnall Hydrop­

hobic Mo!ecules of Valinomy ·

cin Mediated Potassiura

Transpor t across Phosph olipid

Vesicl e Membranesıı. Bioch~­

mistry, 20, 1534 - 1538, 1981.

2fl. Clement N R ., Gould .J.M., «Ki­

netics for Develooment ·of Gr,ı­

micidin - Induced Ion Perm<:­

ability in Unilameller Phosn­

holipid Vesicles», Biochemistry,

20. 1544 - 1548, 1981.

30. Wallach D.F., Verma S.P

Fookson J ., «Applic·ıtion of

Laser Raman and Infrared

Spectroscopy to the Ana lysi';

of Membrane Structure», Bi·

ochim, Biophys. Acta. 550, 153 ·

208, 1979.

31 Pink D.A, Green T.J., Chap ·

193

man D., «Raman Scattering in Bilayevrs of Saturated Phosp-hatidylcholines. Experiment and theory ,)> Biochcmistry 22,

349 - 356, 1980.

32. Mason J.T., Huang C., Bilto­nen R.L., «Calorimetric Inves­tigations of Saturated Mixed -Chain Phosphatidylcoline Bi­layer Dispersions». Biochc­mistry, 20, 6086 - 6092, 1981.

33. Lee A.G., «Lipid Phase Transi­tions and Phase Diagrames I. Lipid Phase Transitivns», Bi­ochim, Biophys. Acta, 472, 237

281, 1977.

34. Lee A.G., «Analysis of the De­fect Structure of gel - phase Lipid», Biochcmistry, 16, 835 -

841, 1977.

35. Mabrey S., Mates P.L, Sturte­vant J .M., «High Sensitivity Scanning Calorhnetric Study Qf Mixtures of Cholesterol with dimyristoyl and Dipalmitoyl­phosphatidylcholines», Biochı>

mistry, 17, 2464 - 2468, 1978.

36. Hınz H.J .,Stu r tevant J .M., «Calorimetric Investigation of the Influence of Cholesterol on the Transition Properties of Bilayers Formed From Synthe­tic - L - Lecithins in Aqueous Suspensions.», J. Biol. Chem., 247, 3697 - 3700.

37. Gruenewald B_, Blume A., Wa-

194

tanage F ., «Kinetic Investigations on the Phase Transition of Phospholipid Bilayers», Bio<:­him. Biophys. Acta., !>97, 41 - 52,

1980.

38. Dresdner G ., Ehrenberg A ,

Hammarström L., Smith E , «Interaction Between Lymp­hocytes and Lecithin - choles­terol Vesicles», Acta. Chem. Scand_, 33, 599, 1979.

39. J ain M.K., Ramirez F., McCaf­

frey T.M., Ioannou P.V., Mare­cek J.F., IHjvelt J.L., «Phos-phatidylcholesterol

A Model For

Bilayers

Phvspholipid Cholesterol Interaction», Bioc­him. Biophys. Acta., 600, 678 -

688, 1980.

40. Kirby C., Gregoriadis G., «The Effect of the Cholesterol Con­tent of Small Unilamellar Li­posomes on the Fate of Lipid Components In Vivo», Life Sci , 27 (23) : 2223 - 2230, 1980.

41. Brendzel A.M., Miller I.F_, «Ef­fects of Lipid - Soluble Subs­tances on the Thermotropic Properties of Liposoıne Filtra­tion», Biochim. Biophys. Acta, 601, 260 - 270. '1980.

42. Georghiou S.. Mukhopadhyay A.K., «Phase Transitions and Cholesterol Effects in Phos­pholipid Liposomes, A New Method Employing the Enhan­cement of the O - O Vibronic Transition of Pyrene», Bioc­him. Biophys. Acta., 645, 365 -

368, 1981.

43. Szoka Jr. F., Papahadjopoule;

D., «Comparavtive Properties and Methods of Preparation of Lipid Vesicles (Liposomes) )), Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9 :

467 - 509, 1980.

44. Papahadjopeulos D. Miller, N.

«Ph ospholipid Model Membra­

nes I Structural Characteris­

tics of Hydrated Liquid Crys­

tals», Biochim. Biopbys, Acta,

135, 624 - 638, 1967.

45. Nonaka, G., Kishimoto, Y.,

«Simultaneous Determination

of Picomole Levels of gluco -

and galacto Cer ebroside, Mo­

nogalactosyl diglyceride and

sulfatide by HPLC. «Biochim.

Bioph ys. Acta, 572, 423 - 431,

1979.

46. Olson F., Hunt C.A.. Szoka

F.C., Vail W.J., Papahadjopou­

los D., «Preparation of Lipo­

somes of Defined Size Distri­

bution By Extrusion Through

Polycarbonate Membranes», Bi­

ochim. Biophys. Acta, 557,

9 - 2,3 1979.

47 Huang. c., «Studies on Phos­

pha tidylcholine Vesicles For­

mation and Ph ysical Charac­

teristics» Biochemistry, 8, 344 -

352, 1969.

48. Lawaczeck. R-, Kainosho, . M.,

Girardet, J.L., Cha n, S, I ... «Ef­

fects of Structural Defects in

Sonicated Ph ospholipid Vesic­

les on Fusion and Ion Perme­

ability», Nature, 256, 584 - 586,

1975.

49. Lawaczeck. R,, Kainosho, M.,

Chan, S. I,, «The Formation

and Annealing of Structural

Defects in Llpivd Bilayer Vc­

sicles», Biochim. Biophys. Acta.

443, 313 - 330. 1976.

50. Brunner, J., Skrabal, P ., Hau­

ser, H., «Single Bilayer Vesic­

les Prepared Without Sonica­

tion : Physico - Cheınical Pro­

perties», Biochim. Biophys. A•~­

ta 455, 322 - 331, 1976.

51. Milsmann, M.H.W., Schwend~­

ner, R .A., Weder, H.G., «The

Preparation of Large Single

Bilayer Liposomes By A Fa~t

and Controlled Dialysis», Bi­

ochim. Biophys. Acta., 512,

147 -155, 1978,

52. Batzri, S., Korn, E.D., «Single

Bilayer Liposomes Prepared

Wilhout Sonicatiom>, Biochim.

Biophys. Acta., 298, 1015 - 1019,

1973.

53. Kremer, J.M., Esker , M.W.,

Pathmamanohoran, C,, Wier..>e­

ma, P.H., «Vesicles of Variable

Diameter Prepared by a Mo­

dified Injection Method», Bi­

ochemistry. 16, 3932 - 3935, 1977.

54. Barenholz, Y., Amselem, s., Lichtenberg, D., «A New Met­

hod for Preparation of Phos­

pholipid Vesicles {Liposomes) :

French Press», FEBS Letter,

99, 210 - 214, 1979.

55. Hamilton Jr. R .L,, George, .T.,

Guo, L,S.S., Williams, M.C.,

Havel, R.J., «Unilamellar Li­

posomes Made With thc French

Pressure Cell A Simple Pre­

par ative and Semiquantitative

Technique», J. Lipid. Res, 21,

981 - 992, 1980,

56. Reeves, J.P., Dowben, R.M,

«Formation and Properties of

Thin - Walled Phospholipid Ve-

195

sicles», J. Celi. Physiol., 73,

49 - 60, 1969.

57. Deamer. D., Bangham. A.D ,

«Large Volume Liposomes by

an Ether Vaporization Met ­

hod», Biochim. Biophys. Acta,

443, 629 - 634, 1976.

58 Papah adjopoulos, D.P ,, Vail ,

W.J., Jacobson, K., Postc, G.

«Cochleate Lipid Cylinders

Formation by Fusion of Uni­

lamellar Lipid Vesicles», Bl­

ochim, Biophys. Acta , 394, 483

491, 1975.

59. Szoka, F C., P apahadjopoulos,

D., «A New Procedure for Pr<!­

paration of Liposomes Witll

La.rge Internal Aqueous Spacc

and High Capture, by R everse

Phasc Evaporation (REV )ı>,

Proc. Natl. Acad . Sci., USı\,

75, 4194 - 4198, 1978.

GO Szoka, F ., Olson, F., H~ath, T.,

Vail, W., Mayhem, E., Pap·.ı­

hadjopoulos, D, «Preparation

of Unilamellar Liposomes of

Intermediate Size (0.1 - 0.2 iJ.m)

by a Combination of Rcversc

Phase Evaooration · and Extru-

sion Through Polycarbom.t.~

membranes», Biochim. Biop-

hys, Acta., 601, 559 - 571. 1980.

Gl. Pick, U., «Liposomes With "

L:ırge Trapping Capacity Pr .>

pared by Freezing and Tha­

wing of Sonicated Phospholi­

pid Mixtures», ı\.rch . Biochcm.

Eiophy., 212, 186 - 194, 1981.

62. Nichols, J .W., Deamer, D .W ..

«Net Proton - h ydroxyl Per­

meability of La.rge Unilamellar

196

Liposomcs Measured by .. 111

Acid - base Titra tion Techni­

que», Proc, Natl. Acad, Sci.

USA., 77, 2038 - 2042, 1980.

63. Kawada, J ., Tanaka, N., Noza­

ki, Y ., «No R eduction of Blocd

Glucose in Diabetic Rats Af­

ter Oral Administration or Insulin Liposomes Preparc~l

Under Acidic Conditions.», Eo­

docrinol. Jap., 28 (2), 235 - 238,

1981.

G4. Abra, R M., Bosworth, M E ..

Hunt. C.A., «Liposome Dispo­

sition In Vivo I Effects of

Pre - Dosing With Liposomes».

Rcs. Com. Chcm. Patholo1nı

Pharma col., 29, 349 360, 1980

65. Barrow, DA., Lentz, B.R .,

«La.rge Vesiclc Contamination

in Small llnilamellar Vesicles.ı,

Biochim Biophys. Acta., 597,

92 - 99, 1930.

66. Strauss, G.. Ingenito, E P .,

<ıStabilization of Liposome Bi­

layers to Freezing and Tha­

wing : Effects of Cryoprotecti ­

ve Agents and Membrane Pr0-

teins», Cryobiology, 17, 508 -

515, 1980.

67. Kin sky, C, «Preparation of Li­

posomes and a Spectrophoto­

metric Assay for Release of

Trapped Glucose Markero ,,

Methods in Enzymologv, 32

501 - 503. 1974.

68. Hunt, C., Tsang, S., «x - To­

copherol Reta rds Autoxidation

and Prolongs the Shelf - Lifz

of Liposomes» .. Int. J. Pharm ..

8, 101 - 110, 1981.