DAIRY HEALTH

奶牛保健

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布鲁氏菌病实验室诊断技术及其适用性评析高明春1,2，王君伟 1,2

（1.东北农业大学动物医学学院微生物与免疫学教研室，哈尔滨 150030；

2.国家奶牛产业技术体系疾病控制功能室，北京 100193）

摘 要：布鲁氏菌病严重阻碍我国养牛业的健康发展，控制乃至根除布病是世界范围内各布病负担国的共

识。本文就各种布鲁氏菌病实验室诊断技术及其在布病净化程序中的适用性加以客观评述，谨供布病防控工

作者参考。

关键词：布鲁氏菌病；实验室诊断技术；奶牛；肉牛

布鲁氏菌病（布病）是一种公认的人畜共患传染

病，人、畜布病均归因于6个陆生动物布鲁氏菌经典种

中的5个种所致的感染，即人间布病全部源于动物布

病，并且各国的研究表明消灭动物布病能够有效地从根

本上减少人间布病。近年，我国家畜布鲁氏菌病（布

病）与人间布病暴发频繁，给畜牧业与人民健康带来了

巨大损失，而控制及消除布病影响的一个前提是能够对

布病动物进行有效的诊断。

国内外对布病系统性的研究有近150年的历史，期

间开发了许多布病体外和体内诊断方法，这些诊断方法

服务于不同的应用目的，例如：证实疫情发生、全国性

普查、确诊、国际贸易检测以及“无布病”地区的布病

监测等等，如何选择诊断策略取决于布病的流行状况及

检测的目的[1～5]。本文对新近探讨各种布病诊断方法的

文献进行回顾，并评价其在净化程序中的适用性。

1 布鲁氏菌病概述

布鲁氏菌病主要通过消化道、呼吸道、生殖道传

播，也可通过损伤的皮肤、黏膜等感染，造成以生殖系

统为主的多器官损伤。牛群中暴发布病会导致大量怀孕

母牛流产和奶产量降低，如发生流行，则会严重影响整

个产业链。布病还是公认危害最为严重的人畜共患病之

一，人感染后反复发作，难以根治。因此，世界上绝大

多数“布病国家”积极开展了本国的布病根除计划，并

且北美、中欧的几个国家及加拿大、日本、澳大利亚和

新西兰等已确认根除了布病，取得“无布病国家”称号[6-8]。

布病最重要的临床表现是患畜在第一次怀孕期间流

产，虽然通常怀孕母畜只流产一次，但在这些动物的生

命周期中依然会保持感染状态。仅根据临床流产症状无

法确诊动物是否感染布病，因为许多致病菌都能引起流

产，因而实验室检测手段是不可缺少的。

2 布鲁氏菌病实验室诊断方法

布鲁氏菌实验室诊断方法分为直接检测法（检测病

原）与推断性检测法（通过抗体检测或变态反应来推测

感染）。直接法有微生物学分析和利用聚合酶链式反应

（PCR）进行DNA检测；推断法又分为应用于体外（主

要包括奶和血液中的抗体）和应用于体内（变态反应测

试）的检测方法。…

2.1  直接诊断法

只有通过分离到布鲁氏菌或通过PCR检测布鲁氏菌

DNA才能确定布鲁氏菌感染，指纹分析方法则能够提供

更多的分子流行病学信息。

2.1.1… 病料染色… 布鲁氏菌是一种革兰氏阴性细菌，

可以抵抗弱酸性处理，并在复染之后显示为红色。但由

于其他致流产性病原，例如流产衣原体以及贝氏立克次

氏体也能够被染成红色，因而此法缺乏特异性。但由于

收稿日期：2011-08-12

基金项目：本文由现代农业产业技术体系专项资金资助（CARS-

37）。

作者简介：高明春（1977-），男，主要从事奶牛传染病防控与免疫机

理研究。

通讯作者：王君伟，教授。

中图分类号：S858.23 文献标识码：A 文章编号： 1004-4264（2012）04-0035-03

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该方法可以在第一时间分析流产材料，因此在生产实践

中依然经常使用。

2.1.2… 分离培养鉴定

细菌分离是布鲁氏菌检测的金标准，通常是生物

型鉴定所必需的，但其敏感性很低。分离培养样品的选

择取决于所观察到的临床现象，有效样品包括流产胎儿

（胃、脾、肺）、胎衣、阴道分泌物、初乳、奶、精子

以及从关节炎及肿瘤中收集到的液体。在屠宰厂，为证

实布鲁氏菌疑似病例，可采集生殖道与咽喉淋巴结、

脾、乳腺及其相关淋巴结进行检测。

鉴定布鲁氏菌可结合以下测试：革兰氏染色、菌落

形态、生长特性、尿酶活性、氧化酶活性以及抗布鲁氏

菌光滑型或粗糙型因子血清的凝集测试等等。除以上指

标外，其他分型依据还有噬菌体裂解试验、初代生长时

是否需要CO2、H2S试验、在含有复红、硫堇染料的培

养基的生长表现以及吖啶黄测试等等，PCR方法也可用

于鉴定与分型。

2.1.3… 核酸检测方法

已有多种基于PCR的检测方法，其中最有效的方法

是通过检测布鲁氏菌属的特异性序列，例如16S-23S…

基因、IS711…插入序列或bcsp31基因等序列基础上开

展的，这些技术最初发明时需要进行细菌分离，现已可

用于直接检测临床样品。一般来说，临床样品PCR检测

的敏感性低于培养法，但特异性高达100%，因此有学

者研究出了一种将细菌培养与PCR相结合的快速检测技

术，可有效检测临床样品。

多种多重PCR法可用于布鲁氏菌检测与分型，

AMOS … PCR (因其经常检测的4个种的布鲁氏菌…

Abortus、…Melitensis、Ovis、Suis而得名)可以将布鲁

氏菌种、疫苗株及野生型菌株加以区分，但不能分辨到

生物型。而“Bruce… ladder”多重PCR法是第一个能够

在一次测试中就鉴定和区分所有已知布鲁氏菌种和疫苗

株的方法。近年发展起来的几种新颖而实用的指纹分析

方法具有区分给定布鲁氏菌种中的各生物型以及同一生

物型的不同分离株能力，这些方法都是基于对可变数目串

联重复序列（VNTR）的分析[9-12]。

2.2  推断性诊断法

实用性的推断性诊断方法很多，分血清学、奶样

检测、体内检测等多种方法。血清学检测包括试管凝

集反应（SAT）、补体结合反应（CFT）、平板凝集

反应（BAT）、间接ELISA（iELISA）、竞争ELISA

（cELISA）、荧光偏振检测（FPA）等；奶液检测方

法包括全乳环状测试（MRT）、FPA、奶液间接ELISA

（iELISA）等；体内检测包括皮肤变态反应测试等。这

些方法的建立大多来自对牛布病诊断的研究，但经过验

证，除全乳环状检测以外，其他方法均只适用于对绵羊

和山羊的检测，因为其应用于牛会产生大量假阳性结

果。这些方法的特异性、敏感性各不相同。已发表文献

中各种牛布鲁氏菌病推断性诊断方法的敏感性、特异性

数据如表1所示。

表1 牛布鲁氏菌病推断性检测方法的敏感性与特异性

检测方法 敏感性(%) 特异性(%)

血清检测

SAT(SAW)/MAT 81.5 98.9

CFT 90-91.8 99.7-99.9

BAT 87 97.8

iELISA 97.2 97.1-99.8

cELISA 95.2 99.7

FPA 96.6 99.1

乳液检测

MRT 88.5 77.4

FPA 76.9 100

iELISA 98.6 99.0

皮肤测试 skin test 78-93 99.8

2.2.1… 血清学检测方法

B.…ovis和B.…canis种的抗体检测需要使用粗糙型布

鲁氏菌制备的抗原，对其他种检测均使用光滑型布鲁氏

菌制备的抗原。

2.2.1.1… 试管凝集试验（慢凝集试验）

SAT可检测的布鲁氏菌特异性抗体主要为IgM类，

当检测阳性样品时，检测抗原与被检抗体形成肉眼可见

的凝集片（抗原抗体复合物）附着在试管的底部，同

时上部液体变得清亮。相对于快速凝集反应，SAT需要

22～24h才能完成，因而称为慢凝集试验。SAT也可在

微量板中以100μL体系进行反应，这时可以加入染料

从而使反应的判定更为简便。敏感性与特异性均不高是

SAT的主要缺陷，但它是一种标准化方法，在几个已宣

称为“无布病”国家的布病根除运动中都得到了良好的

应用。虽然SAT不再是OIE检测牛布病的推荐方法，但

SAT依然广泛应用于人类布病感染检测[13-16]。

2.2.1.2… 平板凝集试验

这类方法包括众所周知的虎红平板凝集试验

（RB）和缓冲平板凝集试验（BA），RB与BA是快速

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凝集反应，可在pH值为3.65…±…0.05的环境内4min内完

成反应。由于其操作非常简单以及考虑到相对于SAT具

有更高的敏感性，RB与BA已被多个国家引进作为标准

筛选方法。OIE规定其为“贸易适用”方法。

2.2.1.3… 补体结合试验

CFT检测的是能够激活补体反应的免疫球蛋白，对

牛来说为IgM、IgG。据文献描述该方法敏感性不高但

特异性很高。虽然CFT也是OIE规定的“贸易适用”方

法，但由于该方法难于标准化，正逐渐被ELISA所取代。

2.2.1.4… ELISA

ELISA分为两大类，即间接ELISA（iELISA）和竞

争ELISA（cELISA）。大部分iELISA使用纯化的光滑型

LPS作为诊断抗原，但iELISA中抗牛免疫球蛋白结合物

的使用却多种多样。大多数iELISA检测的是IgG类免疫

球蛋白，iELISA敏感性极高，但同时非特异性反应（假

阳性）也较多，这些假阳性结果大多是由小肠结肠耶尔

森O9(YO9)的类属抗原成分所致，iELISA可能引入的假

阳性可由cELISA所排除。光滑型布鲁氏菌LPS与YO9…

LPS在O多糖侧链上存在不同的抗原表位，因而有可能

开发出更加特异的cELISA。OIE认定上述ELISA为“贸

易适用”方法。

2.2.1.5… 荧光偏振测试

荧光偏振分析（FPA）是一种利用物质分子在溶液

中旋转速度与分子量大小呈反比的特点，定量检测抗原

或抗体的一种分析方法。FPA非常易于自动化，可以快

速准确地对布鲁氏菌病进行诊断，虽然敏感性稍低于

iELISA、特异性稍低于cELISA，但具有方便、成本低

且检测速度快的优点，可大量节省检测时间，减少设

备、材料和试剂的消耗，是具有发展前景的牛种布鲁氏

菌检测方法之一。FPA已用于北美和欧洲的布病根除运

动，其是OIE规定的“贸易适用”方法。

2.2.2… 奶液检测方法

MRT（全乳环状试验）、ELISA和FPA（荧光偏振

试验）都是奶样检测方法，它们被OIE规定为控制与根

除布病运动可采用的方法，但不推荐其用于国际贸易检测。

2.2.2.1… 全乳环状试验

MRT以染色的布鲁氏菌全菌作为诊断抗原，可用其

检测混合奶样，当存在布鲁氏菌抗体时，红色的抗原抗

体复合物转移到乳脂层，形成有色乳脂环（红色为紫红

色）。MRT被认为缺乏敏感性，但由于检测成本低廉，

这种缺陷可通过反复检测来加以弥补。OIE规定MRT只

能用于奶牛检测。

2.2.2.2… ELISA与荧光偏振测试

上文提到的用于检测血清样本的ELISA与FPA，优

化改进后也适用于对奶样检测，但用于奶样检测时的敏

感性低于血清样，因此当其用检测奶缸样品时，需要

预先测定其对于混合奶样的检测敏感性。同样，奶样

ELISA与奶样FPA的敏感性也可通过提高检测频率予以

弥补。上述方法被OIE规定可用于奶牛、小反刍兽的布

病检测。

2.2.3… 皮肤测试

皮肤测试本质上是一种超敏反应，检测由布鲁氏菌

引起的特异性细胞免疫反应。在皮肤上注射由粗糙型布

鲁氏菌提取的布氏菌素后，会在注射部位发生局限性的

炎性反应，表现为红、肿、热、痛等。此法不能区分疫

苗免疫与自然感染，但在区分真正的布鲁氏菌动物与血

清学假阳性动物上有较高的效率。较高的特异性与较低

的敏感性决定了该法更适用于整群检测而不适用于个体

检测。皮肤检测被OIE规定为可选的方法。

3 总结

布鲁氏菌病的各种诊断技术具有不同的适用范围，

并且各自都存在着一些缺点和局限性，因而不能相互取

代。血清学方法仍然是动物布病检测的常规方法，但存

在以下不足，例如，检测依赖于体内抗体水平；测试会

因为抗体交叉反应而出现假阳性；血清学阳性只能推断

感染，不能确定感染状态是持续感染还是耐过状态。虽

然血清学检测具有诸多不足，但由于其具有快速、简

便、费用低等优点，目前仍然是动物布鲁氏菌病检疫最

常用的诊断方法。

实践中，通常需要根据检测目的（证实疫情、全国

普查、确诊、国际贸易检测、无疫区监测等）来拟定诊

断策略，往往需要几种方法互相配合，才能取得较为科

学、合理的检测结果。选择诊断方法的原则是：选用简

便、敏感性高的方法进行初筛，防止漏检，随后再以特

异性高的方法进行确诊，以剔除假阳性。例如，首先用

虎红平板凝集试验筛选，再用试管凝集试验确诊，或者

iELISA筛选、cELISA确诊。

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人间布病的扑灭取决于动物布病的根除，随着分子

生物技术、方法的不断革新，必将出现更加有效、准确

的布病诊断方法，为综合防治人畜布鲁氏菌病提供保障。

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新生牛血清中大肠杆菌噬菌体检测方法的建立庄金秋，王艳，梅建国，沈志强

（山东省滨州畜牧兽医研究院，滨州 256600）

摘 要：本研究用大肠杆菌标准噬菌体株选择确定的大肠杆菌C-3000作为宿主菌，采用增殖法和噬斑法与双

层琼脂平板法，对多个厂家的新生牛血清进行了大肠杆菌噬菌体检测，建立了兽用生物制品细胞培养用新生

牛血清中大肠杆菌噬菌体的检测方法。

关键词：细胞培养；新生牛血清；大肠杆菌噬菌体；检测

中图分类号：S852.5 文献标识码：A 文章编号： 1004-4264（2012）04-0038-03

收稿日期：2011-05-25

作者简介：庄金秋（1978-），女，山东潍坊人，在职兽医硕士，助理

研究员，主要从事细胞培养和动物用病毒疫苗研制。

通讯作者：沈志强。

细胞工程是现代生物技术的重要组成部分。细胞

培养的发展，培养基质量是关键，而在培养基的众多组

成成分中，动物血清对细胞的生长发挥着举足轻重的作

用。而在动物血清中牛血清的应用又是最为广泛的，

所以牛血清是医药生物技术产品中重要的原辅材料之

一，故加强牛血清的质量控制是促进生物制品质量提高

的重要环节。为此，2000年版《中国生物制品规程》

中，首次将牛血清的质量标准纳入《中国生物制品主要

原辅材料质控标准》，规定了生产管理和质量控制中需