エピジェネティックス 3 エピジェネティックス...- 59 -...

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エピジェネティックス

Ⅲ

全ゲノム Bisulfiteメチル化解析

Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS)

MeDIP-seq 解析

ChIP-seq 解析

エピジェネティックス3

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Ⅲ

全ゲノム Bisulfiteメチル化解析

製品概要Bisulfiteシーケンシングは、DNAメチル化を研究するための有力な手段として注目を集めています。次世代ハイスルー

プットシーケンサプラットフォームに基づいて、全ゲノム Bisulfite 処理とデータ解析技術を組み合わせ、低コスト・

高効率・高解像度な全ゲノムDNAメチル化地図を作成します。特定種の高精度なメチル化パターンの解析は、エピジェ

ネティクス研究で役に立つのみならず、細胞分化・組織発育などの基礎研究・動植物の育種・人類の健康と疾患研

究の土台を築きます。

技術特長 • 高精度：単一塩基解像度、各 C 塩基のメチル化の程度を精確に解析可能

• 高効率：次世代ハイスループットプラットフォームを用いて、全ゲノムの 5- メチルシトシン (5mC) 情報を効率

よくスキャニング

• 高コストパフォーマンス：PCR+Sanger シーケンシング法に比べ、低コスト

ワークフロー

ゲノム DNA

ライブラリー作製

（Bisulfite 処理）

生データ

品質管理

クリーンデータ

アノテーション

• マッピング率 / ユニークマッピング率

• カバー率 / シーケンスのリード深度統計 • リードの分布分析

可視化

アライメント

5mC 同定

• メチル化程度の計算

• 全体メチル化趨勢の予測

• 全ゲノムメチル化マップの作成

可視化

生物学解析異なる領域でメチル化の程度分析（DMR）

シーケンシング

データ解析

1.標準データ解析 • データのフィルタリング：生データからアダプター

配列・コンタミネーション・低品質リードを除去

• リファレンス配列とのアライメント

• シーケンス深度とカバー率の解析

• C 塩基メチル化レベルの評価

• 全ゲノムメチル化レベルの分布動向

• 全ゲノムメチル化プロファイリング

• 異なるメチル化領域（DMR）の同定

2.カスタマイズ • お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ

ズします。

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Ⅲ

※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、予備のサンプルの同梱を推奨しています。

※特殊な DNA サンプル (FFPE サンプルあるいは分解した DNA サンプル）は、サンプルの品質によって要件が異なりますので、

　詳細はお問い合わせください。

2.シーケンス解析：101PE

3.推奨ライブラリーサイズ：200 ～ 300bp

納品物

1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイルで納品

2. 納品データ例

a upstreamb first exonc first intrond internal exone internal intronf last exong downstream

a b c d e f g

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

Mea

n M

ehty

latio

n

TSS

Methylation level (%)

Per

cent

age

of to

tal m

C

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

4030

2010

0 0

CGCHGCHH

納期単一サンプル：約 11 週間

※ Bisulfite プロジェクトのデータ量は種によって異なりますので、ライブラリー作製量に大きな違いがあります。

※サンプル数が多い場合の納期は、別途お問い合わせください。

図 2 CG・CHG・CHHのメチル化レベルの分布

技術パラメーター

1.サンプル要件

図 1 標準的な DNAのメチル化プロファイル

サンプルDNA（電気泳動写真を必ず添付してください。DNAの分解がされていないことを確認してください。）

サンプル量 ≧ 5µg（データ量≦25Gbの場合）

サンプル濃度 ≧ 50ng/µL

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Ⅲ

Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS)

製品概要Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) は酵素でカットしたプロモーターと CpG 島を集めて Bisulfiteシーケンシングを行い、DNA メチル化程度の高解像度検出とシーケンシングデータの高利用率を実現できる DNAメチル化解析ソリューションです。

技術特長 • 高解像度：単一塩基レベルの解像度

• 高再現率：サンプル間 85％から 95％に至るまでのオーバーラップ

• 高網羅率：全ゲノムにわたる 500 万以上の CpG 部位を検出可能

• 高コストパフォーマンス：CpG-rich 領域を中心に、少量のデータで良いシーケンス深度を取得可能

ワークフロー

ゲノム DNA

　ライブラリー作製

　（Bisulfite 処理）

生データ

品質管理、データのフィルタリング


• マッピング率 / ユニークマッピング率

• カバー率 / シーケンスのリード深度統計 • リードの分布分析

可視化

アライメント

5mC 統計

• メチル化程度の計算

• メチル化分析

• DMRs の同定可視化

生物学解析

異なる領域でメチル化の程度

（DMR）分析

関連分析

・WGBS と Small RNA データの組み合わせ解析

・WGBS と mRNA 発現データの組み合わせ解析

・WGBS･Small RNA と mRNA 発現データの組み合わせ解析



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Ⅲ

データ解析

標準データ解析 • データのフィルタリング：生データからアダプター

配列・コンタミネーション・低品質リードを除去

• 産出データの統計

• RRBS 配列とリファレンス配列のアライメント

• プロモーターと CGI（CpG アイランド）のカバー率

の分析

• プロモーターと CGI のメチル化の程度の解析

• 異なるメチル化領域（DMR）の同定


1.サンプル要件

※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、

　予備のサンプルの同梱を推奨しています。

※ヒト・マウスのみ。特殊な DNA サンプル (FFPE サンプル

※あるいは分解した DNA サンプル）は、サンプルの品質によっ

※て要件が異なりますので、詳細はお問い合わせください。



納品物

1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイル

　で納品


表 1 DMR鑑定

Chromosome Numbers of DMR Length of DMR region

chr1 247 79539

chr2 244 80743

chr3 145 49380

chr4 137 47258

chr5 185 62457

chr6 108 35249

chr7 193 64155

Per

cent

age

0 10 20 30

Depth

40 50

100

8060

4020

0

CGI:

CGCHGCHHC

図 1 シトシンにおけるシーケンス深度の累積分布

Methylation level(%)

Per

cent

age

of to

tal m

C

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

mCGmCHGmCHH

1020

3040

0

図 2 CG・CHG・CHHのメチル化レベルの分布

納期約 9 週間

サンプルDNA （低分子の混入及び分解がないこと）

※電気泳動写真を必ず添付

サンプル量 ≧ 3μg

サンプル濃度 ≧ 50ng/μL

サンプル純度 OD260/280=1.8～2.0

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Ⅲ

MeDIP-seq 解析

製品概要Methylated DNA immunoprecipitation (MeDIP) はメチル化 DNA を全ゲノムに渡って解析する技術です。5- メチルシ

トシン (5mC)という抗体でメチル化DNA断片を沈降させ、ハイスループットシーケンシングを行います。MeDIPシー

ケンシングは高メチル化や CpG が高密度にあるゲノム領域を検出することができます。

技術特長 • 全ゲノム領域でメチル化 DNA を検出可能

• 抗体でメチル DNA を濃縮させ、DMRs 解析することで低コストを実現

ワークフロー

ゲノム DNA


（5mC 抗体の集まり）


生データ

品質管理、データのフィルタリング


アライメント

ピークのスキャニング

可視化可視化

生物学解析

マルチサンプルの差異解析

ピークのスキャニングの

品質管理

• ピークの長さの分布

• ゲノムのピーク分布

・ピークに関する遺伝子の差異解析

・GO 解析

・KEGG pathway 解析

関連分析

・MeDIP と smallRNA の組み合わせ解析

・MeDIP と mRNA 発現データの組み合わせ解析

・MeDIP と smallRNA と mRNA 発現データの組み合わせ解析

・マッピング率 / ユニークマッピング率

・カバー率 / シーケンスのリード深度統計・リードの分布分析


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Ⅲ

データ解析

1.標準データ解析 • データフィルタリング：生データからアダプター配

列・コンタミネーション・低品質リードを除去

• リファレンス配列とのアライメント

• ユニークにマッピングされたリードの分布

• ピークのスキャニングとゲノム全体での分布情報

• 複数サンプルの差異解析

2.オプションデータ解析 • MeDIP・smallRNA の統合解析

• MeDIP・mRNA の統合解析

• MeDIP・smallRNA・mRNA の統合解析

3.カスタマイズ • お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ

ズします。

技術パラメーター1.サンプル要件

※ライブラリー作製が困難と判断される場合がありますので、　予備のサンプルの同梱を推奨しています。


3. 推奨ライブラリーサイズ：200 ～ 300bp

納品物1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイル

　で納品


表 1 ピーク領域の情報

SampleTotal

Peaks

Peak Mean

Length

Peak Median Length

Peak Total

Length

Peak Covered Size In

Genome

Sample 1 138,508 1029.71 815 149,756,980 6.61%

Sample 2 152,689 1018.57 965 156,945,069 6.93%

upstr

eam2k

5’UTR

CDS

Intro

n

3’UTR

downs

tream

2k

7000

6000

Num

ber o

f Gen

es

Differential Genes(A vs B)

5000

4000

3000

2000

1000

0

DownUp

図 1 異なるコンポーネントにおける異なる遺伝子の分布

chr1chr2chr3chr4chr5chr6chr7chr8chr9

chr10chr11chr12chr13chr14chr15chr16chr17chr18chr19chr20chr21chr22chrXchrY

0 5000 10000 15000 2000 25000

sample 1

図 2 各染色体における MeDIPシーケン

シングのリードの分布

図 3 Gene bodyとその周辺ドメインのメチル化 DNAの分布

納期約 9 週間

サンプル DNA

サンプル量 ≧ 5μg


サンプル純度OD260/280=1.8～2.0 (RNAのコンタミネーションなし)

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Ⅲ

ChIP-seq 解析

製品概要　クロマチン免疫沈降法（ChIP）は生体内のタンパク質と DNA との相互作用を研究する手法であり、ヒストン修飾

と特異転写因子の遺伝子発現制御作用などの分野で広く使われます。次世代シーケンシング技術の発展に伴い、ク

ロマチン免疫沈降法とハイスループットシーケンシング技術を組み合わせた ChIP シーケンシングにより、全ゲノム

範囲で DNA 結合タンパク質の結合部位を効率良く、且つ精確に同定できます。

　ChIP-Seq 解析では、特異抗体を用いて目的タンパク質を免疫沈降した後、それと結合した DNA 断片を分離します。

ハイスループットシーケンシング技術とデータ解析で、全ゲノム範囲で目的タンパク質の DNA 結合部位を探し、複

数のサンプルを比較し、差異を研究します。

技術特長 • 広い検出範囲：全ゲノム範囲での免疫沈降とシーケンシング分析

• 高い費用対効果：抗体濃縮の標的領域に基づいて、データ量を効率的に減少

• 少量のサンプルで解析可能：わずか 10ng の DNA（免疫沈降済み）で解析可能（ヒトの場合は 5ng）

ワークフロー

ChIPed DNA



生データ

・マッピング率 / ユニークマッピング率

・カバー率 / シーケンスのリード深度統計・リードの分布分析

・ピークに関連する遺伝子の検出とその GO、Pathway エンリッチメント解析

・サンプル間の差異解析、ピークアノテーションと関連遺伝子の GO、Pathway ・enrichment 解析

・UCSC ゲノムブラウザ

・Motif 解析

ピークスキャニングの品質管理

・ピークの長さの分布

・ピークのゲノム全体での分布クリーンデータ

可視化


生物学解析

可視化

品質管理

SOAP アライメント

ピークスキャニング

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Ⅲ

データ解析

1. 標準データ解析 • 生データからアダプター配列・コンタミネーション・

低品質リードを除去し、産出量を統計

• 参照ゲノム配列とアラインメント

• 全ゲノムにおける ChIP シーケンシングリードの分布

• ピークのスキャニングと分布情報

• ピーク関連遺伝子のスキャニングと GO 機能解析

• 複数サンプルの差異分析

• UCSC Genome Browser の使用説明

2. オプションデータ解析 • Motif 解析

3. カスタマイズ • お客様のご要望に合わせ、データ解析をカスタマイ

ズします。


1. サンプル要件

サンプル DNA

サンプル量 ≧ 10ng ChIPed DNA


サンプル純度 OD260/280=1.8～2.0

DNA 断片サイズ：

100-500bp に分布（メインバンドは 250bp 前後）

DNA 断片サイズが要件を満たすかどうかを判断するた

めに、抽出した DNA の電気泳動の写真を提出してく

ださい。また、Sample Information Sheet と ChIP 後の

q-PCR 検出結果も提出してください。

2. シーケンス解析：50SE


納品物1. シーケンシング結果 (clean data) は FASTQ ファイル

　で納品


表 1 ピークスキャニング

Sample PeakPeak

length(bp)

Average peak

length(bp)

Median length(bp)

Percentage(%)

Sample 1

1726 1147367 665 659 0.038

Sample 2

604 324771 538 495 0.011

Sample 3

1118 253561 227 195 0.008

図 1 ピークの長さの分布

sample 1

Position relative to Tss (bp)

60-10

80-10

40-10

20-10

0

Nor

mal

ized

Cou

nts

-1000 -5000 0 5000 10000

hlghlowsilent

図 2　TSS付近のリード分布

納期25 個以下の免疫沈降後の DNA：約 6 週間

Num

ber o

f pea

ks

Length of peaks (bp)

※ サンプル数と規模によって、納期は変わります。

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