GAMA IŞINLAMANIN T H E I L E R I A A N N U L A T A ÜZERİNE ETKİLERİ

TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU

TEKNİK RAPOR

GAMA IŞINLAMANIN THEILERIA ANNULATA

KÜLTİVASYONU ÜZERİNE ETKİLERİ

TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU

2690 sayılı kanun ile kurulmuş olan Türkiye Atom Enerjisi Kurumunun ana görevi; atom enerjisinin barışçıl amaçlarla ülke yararına kullanılmasında izlenecek ulusal politikanın esaslarını ve bu konudaki plan ve programları belirlemek; ülkenin bilimsel, teknik ve ekonomik kalkınmasında atom enerjisinden yararlanılmasını mümkün kılacak her türlü araştırma, geliştirme, inceleme ve çalışmayı yapmak ve yaptırmak, bu alanda yapılacak çalışmaları koordine ve teşvik etmektir.

Bu çalışma TAEK personeli tarafından gerçekleştirilmiş araştırma, geliştirme ve inceleme sonuçlarının paylaşımı amacıyla Teknik Rapor olarak hazırlanmış ve basılmıştır.

Teknik Rapor 2017/1Türkiye Atom Enerjisi Kurumu yayınıdır.İzin almaksızın çoğaltılabilir.Referans verilerek kullanılabilir.

TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMUAdres : Mustafa Kemal Mah. Dumlupınar Bulv.

No: 192 Çankaya/ANKARATel : +90(312) 295 87 00Fax : +90(312)287 87 61Web : www.taek.gov.tr

ONSOZ

Tropikal Theileriosis’in etkeni zorunlu hücre-içi protozoer bir parazit olan Theileria annulata'dır. Hyalomma soyuna bağlı keneler yoluyla büyük ruminantlara aktarılan parazit hayat siklusunun bazı evrelerini sığırlarda (şizont, merozit vepiroplasın), bazı evrelerini kenelerde (gamet ve sporozoit) tamamlar.

T annulata, dünyada çok geniş bir alanda sığırcılığın en önemli problemlerinden biridir. Theileria enfeksiyonlarının neden olduğukayıpların (ölüm, yavru atma, sütten kesilme, genç hayvanlarda gelişmenin yavaşlaması ve erişkinlerde et veriminde düşüş gibi) ekonomik boyutları çok büyük olmaktadır. Enfekte hayvanlardaki ölüm oranı dünyada %5-80 dolaylarında seyretmekte olup kültür ırkı ve melez hayvanların hastalığa direnci daha düşüktür.

Hastalığın tedavisinde kullanılan anti-theilerial kemoterapötiklerin maliyeti yüksektir ve enfeksiyon etkenini tamamen ortadan kaldıramamaktadır. Hastalıkla mücadelede aşılama güvenilir ve yüksek düzeyde koruyucu bağışıklık sağlamaktadır. İsrail Uluslararası Tarımsal İşbirliği Merkezi ile Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü arasında 1974 yılından itibaren başlayan ortak bilimsel çalışmalar sonucunda T annulata Ankara suşunun 250. pasajının patojenitesini kaybettiği ve bağışıklık sağlayıcı olduğu tespit edilmiştir. Yapılan saha denemeleri ile güvenilirliği ve koruyucu bağışıklık verme özellikleri saptanan Ankara suşu canlı aşısı 1982yılından beri ülkemizde başarıyla uygulanmaktadır.

Kullanılan aşının üretim ve dağıtım aşamalarında üzerinde çalışılması gereken bazı sorunları bulunmaktadır. Bunlar aşının ticaretini kısıtlamaktadır. Aşının zayıflatılma işlemi uzun süren, zahmetli ve pahalı hücre kültürü pasaj işlemlerini gerektirmektedir. Zayıflatılmış aşının uygulanan sığırda ateş oluşturmaması, kanda şizont veya piroplasmların görülmemesi gerekmektedir. Bu ancak 250. pasaj sonrasında mümkün olmaktadır. Ayrıca, aşılanan sığırlardan kan

yoluyla alman zayıflatılmış etken kenelerde tekrar hastalık yapma yeteneği (virulans) kazanabilmektedir. Bu durum hastalığın oluşum döngüsünün devam etmesine neden olmakta, koruyucu bağışıklığın sağlanmasını engellemektedir.

Gama ışınlamanın son yıllarda hastalık etkeninin zayıflatılma (attenüasyon) işleminde kullanılarak aşı yapımında önemli gelişmelere neden olduğu bilinmektedir. T. annulata aşı kültürlerinin gama ışınlama ile zayıflatılması amacıyla yürütülen ve rapor olarak sunulan bu çalışmada attenüasyon için gerekli optimal doz çalışmaları yapılmış, gama ışınlamanın aşının kararlılığı ve virulans kazanma yeteneği üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Bir dizi test ve hayvan denemeleri sonucunda gama ışınlama uygulanan hücre kültürlerinde T. annulata virulansının zayıfladığı ve aşı olarak kullanılabileceği belirlenmiştir.

Bu çalışma “Gama ışınlamanın Theileria annulata kültivasyonu üzerine etkileri ” başlıklı TAEKprojesi kapsamında Sarayköy Nükleer Araştırma ve Eğitim Merkezi, Nükleer Teknikler Bölümü, Hayvancılık Birimi ile T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı İstanbul Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü, Theleria Annulata Referans Teşhis LaboratuvarEnin işbirliği ile yürütülmüştür. Çalışma sonunda Gama ışınlamanın T. annulata aşısının üretimindeki zaman kaybını engellediği, güvenli ve ekonomik bir çözüm getirdiği belirlenmiştir. Bu raporda sunulan verilerin yararlı olması en büyük dileğimizdir

İÇİNDEKİLER

Tablolar Dizini.................................................................................... iŞekiller Dizini.................................................................................... iiYönetici Özeti.................................................................................. iiiExecutive Summary........................................................................ v1. GİRİŞ........................................................................................... 12. GEREÇ ve YÖNTEM.................................................................10

2.1 Enfektif Hücre Kültürü........................................................ 102.2 Enfekte Hücrelerin Işınlanması......................................... 102.3 Aşı materyalinde ışınlama öncesi ve sonrası

lenfosit sayımı/canlılık testi................................................112.4 Işınlanmış Theileria annulata’da ve kenelerin

tükrük bezinde Tamsl geninin analizi...............................122.5 Theileria annulata’mn ELISA ile teşhisi.132.6 Indirect flourescent antibody testi (IFAT)........................ 142.7 Hayvan deneyleri................................................................15

3. BULGULAR................................................................................183.1 Gama ışınlama...................................................................183.2 Aşı materyalinde ışınlama öncesi ve sonrası

lenfosit sayım ı/canl ılık testi................................................193.3 Işınlanmış Theileria annulata’daTamsl

geninin analizi (PCR)......................................................... 193.4 Teşhis..................................................................................24

3.4.1 Perifer kan frotisi örneklerinde Giemsa boyama ..243.4.2 Aşılama sonrası deneme hayvanlarının ortalama

vücut ısıları............................................................. 253.4.3 Lenf nodüllerinin biyopsisi.....................................253.4.4 ELISA......................................................................253.4.5 IFAT........................................................................27

3.5 Kenelerin tükrük bezinde Theileria nınPCR ile belirlenmesi..........................................................27

4. TARTIŞMA................................................................................ 285. SONUÇ ve ÖNERİLER............................................................ 336. KAYNAKLAR............................................................................. 34

TABLOLAR DİZİNİ

Tablo 1. Deney hayvanları aşı programı................................... 16Tablo 2. Işınlanmış hücrelerde Tamsl geninin

dizilimi (CLUSTAL W )..................................................20Tablo 3. Giemsa boyama sonuçları.......................................... 24Tablo 4. ELISA sonuçları (Soluble şizont antijen kullanılarak) .26

ı

ŞEKİLLER DİZİNİ

Şekil 1. Lenfoblast içindeki şizontlar.......................................... 1Şekil 2. Sporozoitlerle kaplı bir monosit..................................... 1Şekil 3. Enfeksiyonun akut fazında eritrositler içindeki

piroplasm formları.......................................................... 2Şekil 4. Theileria annulata’nın yaşam siklusu..............................2Şekil 5. Theileria annulata’nın Türkiye’nin coğrafi

bölgelerindeki dağılımı....................................................5Şekil 6. T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı T. annulata aşısı....8Şekil 7. Neubauer lamında lenfosit sayımı...............................11Şekil 8. 10 gözlü test lamı......................................................... 15Şekil 9. Işınlanmış hücrelerin (0, 50, 100, 150, 200 Gy)

inkübasyon öncesi durumları........................................ 18Şekil 10. Işınlanmış hücrelerde iki gün inkübasyon

sonrasında hücre kültürlerinde metabolikaktiviteyi gösteren renk değişimleri..............................18

Şekil 11. Çeşitli ışınlama dozlarında lenfositlerincanlılık oranları (% )....................................................... 19

Şekil 12. PCR sonrası Ethidium bromid ile boyanmış jeldeTamsl geni....................................................................20

Şekil 13. Işınlanmış T.annulata hücrelerinin PubMed BLASTfilogenetik ağaç üzerindeki konumu............................ 23

Şekil 14. Enfeksiyonun akut evresinde alyuvarlar içindeparaziti k form lar............................................................ 24

Şekil 15. Soluble şizont antijen kullanılarak elde edilenELISA sonuçları............................................................ 25

Şekil 16. Kenelerin tükrük bezinde Theileria annulata’yıbetimleyen Tamsl geninin durumu............................. 27

ii

YÖNETİCİ ÖZETİ

Tropikal theileriosis’in de içinde bulunduğu kene-kaynaklı hastalıklar hayvan yetiştiriciliğinde sorun teşkil etmekte ve önemli ekonomik etki yaratmaktadır. Theileria annulata’mn neden olduğu tropikal theileriosis önemli bir sağlık ve işletme sorunu olarak sadece Türkiye’de değil Kuzey Afrika, Güney Avrupa ve Asya’da da büyük önem taşımaktadır. Theileriosis’den kaynaklanan kayıpların kontrolünde halen üç yöntem kullanılmaktadır: Kenelerin kimyasal ilaçlarla kontrolü, hastalanan hayvanların ilaçlarla tedavisi ve aşılama. Akarisidlere direnç kazanan keneler nedeniyle kimyasal ilaç kullanımı kısıtlı kalmakta, ayrıca süt, et ve çevrede bıraktıkları kalıntılar nedeniyle halk sağlığını tehdit etmektedir. İlaçlarla tedavi etkili görünmekle birlikte birçok olumsuzluğu da birlikte getirmektedir. Kemoterapötikler hayvanlarda ilk enfeksiyona engel olsa bile ikinci bir enfeksiyona karşı koruyuculuk sağlamamaktadır. Bu durum sık ilaç kullanımını gerektirmektedir. İlaçların sık kullanılması kenelerde ilaca karşı genetik direnç geliştirmekte ve ilacın etkisiz olmasına yol açmaktadır.

Tropikal theileriosis’e karşı geliştirilen zayıflatılmış hücre-kültürü aşısı tüm sığır ırklarında güvenle kullanılmaktadır. Yine de keneler tarafından bulaştırılan etkenlere karşı kanda piroplasmlar görülebilmekte, immunizasyon ile hastalığın eradikasyonu mümkün olamamaktadır. Sadece lenfositlerdeki şizontların zayıflatılması yoluyla hastalığın virulansının geri dönmesi engellenebilmektedir. T.annulata şizontlarının kültür yoluyla zayıflatılması uzun süren pasajları gerektirmektedir. Son yıllarda yeni moleküler biyolojik yöntemler ve bağışıklık sistemi hücrelerinin kullanılmasıyla bazı viral ve bakteriyel aşıların geliştirilmesi mümkün olmuştur. Paraziter aşılarda rekombinant teknikler çok etkili olmamış, geliştirilen aşılar ya zayıf kalmış ya da bağışıklık sağlayamamıştır. Alternatif teknik olarak gama ışınlama ile zayıflatılan organizmaların metabolik olarak aktif kalsalar bile enfeksiyon yaratmadıkları, ayrıca

111

konakçıya verildiklerinde hücresel ve bağışıklık mekanizmalarının aktif hale gelebildiği ortaya konmuştur.

Bu çalışmada şizontların tam olarak zayıflatılması için gerekli ışınlama dozunun saptanması amacıyla çeşitli denemeler yapılmış, ışınlanmış şizontların metabolik aktivitesi incelenmiş, ışınlanan aşı deney hayvanlarında test edilmiştir. Şizont evresinin zayıflatılması amacıyla sığır lenfositleri 60Co kaynağında 0, 50,100,150,200,250 ve 300 Gy dozlarda ışınlanm ıştır. Denemeler sonucunda parazitlerin metabolik aktivitesi üzerinde en etkili dozun 150 Gy olduğu belirlenmiştir. 150 ve 200 Gy dozda ışınlanan aşılar hayvanlar üzerinde denenmiş, 150 Gy dozda ışınlanan aşı ile immunize edilen hayvanların aynı kene suşu ile yapılan sınama testine direnç gösterdikleri görülmüştür. Bir yıl sonra 150 Gy dozdaki aşı ile aynı hayvanlara ikinci aşılama yapılmıştır. Aşılamayı izleyerek gerçekleştirilen kene uygulaması kanda etkenin bulunmadığını göstermiştir. Kenelerin enfeksiyon almadıkları ayrıca PCR testiyle de belirlenmiştir.

Sonuç olarak, gama ışınlama ile zayıflatılmış T. annulata şizontlarının laboratuvar koşullarında sığırlarda bağışıklıkoluşturduğu saptanmıştır. T. annulata hücre kültürü aşısının geliştirilmesi amacıyla şizontların zayıflatılmasında gamaışınlamanın yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

Anahtar kelimeler: Theileria annulata, tropikal theileriosis, aşı, in- vitro hücre kültürü

IV

EXECUTIVE SUMMARY

Tick-borne diseases including tropical theileriosis, constitute a major constraint of livestock production and have considerable economic impact. Tropical theileriosis caused by Theileria annulata is a major health and management problem of cattle in Turkey as well as in North Africa, Southern Europe and Asia. Chemical tick control, treatment of animals and vaccination are the measures available to limit losses incurred by theileriosis. Chemical control is limited owing to selection of acaricide-resistant ticks, in addition, residues in meat, milk and environment have raised public health concerns. Chemotherapy can be effective, however has a number of disadvantages. Firstly, even though animals are cleared of infection after tratment, it often fails to prevent re-infection thereby requiring frequent administration of the drug. Secondly, parasites are able to adapt genetically to the action of the drugs, resulting in the development of drug resistance - a common cause of overuse.

The attenuated cell-culture-derived vaccine against tropical theileriosis has proved to be safe for all breeds of cattle, however doesnot always prevent development of piroplasms following tick transmission, eradication of the disease cannot be achieved by immunization. Reversion of virulence is not possible when the schizonts are completely attenuated. Attenuation of T. annulata schizonts is achieved by prolonged growth and passage in culture. During the last decade or so vaccine development has been facilitated by advances in the molecular and cell biology of the immune system. A new generation of vaccines produced for parasitic diseases through recombinant technology are only weakly or non-immunogenic. Gamma irradiation - attenuated organisms are proved to be metabollically active, however they fail to develop into a mature infection. Moreover, they activate both cellular and immune responses when they are introduced to the host.

V

In this study, a series of experiments were carried out to investigate the metabolic activity of irradiated schizonts for the determination of optimum radiation dose for complete attenuation, and to test irradiated T.annulata vaccines in experimental calves. The possibility of attenuation of the schizontal stage of T. annulata within bovine lymphocytes was investigated using 60Co radiation at 0, 50,100, 150, 200, 250 and 300 Gy levels. It was demonstrated that 150 Gy was the most effective dose for the metabolic activity of the parasites. 150 and 200 Gy irradiated vaccines were tested on animals, vaccinated calves with 150 Gy irradiated vaccine were resistant to subsequent tick challenge with the same virulent strain. One year later, second vaccination with 150 Gy vaccine was applied to the same group of calves. The challenge realized with the Hyalomma ticks, did not show any infection in the peripheral blood. These results were assessed by PCR.

As a result, immunoprophylaxis of susceptible cattle with gamma- irradiated T. annulata schizonts seems to be potentially practical under laboratory conditions. The use of gamma irradiation for the attenuation of schizonts for the improvement of T. annulata vaccine is proved to be very beneficial.

Key words: Theileria annulata, tropical theileriosis, vaccine, in-vitro cell-culture

VI

1. GİRİŞ

Theileria annulata’nın yol açtığı tropikal theileriosis Türkiye’desığırların en önemli ve en sık görülen hastalıklarından biridir. Hastalık Türkiye’de mevsimsel aktivite gösterir ve ülkenin tüm iklim kuşaklarında görülür. Theileriosis aynı zamanda Avrupa’nın güneyinde, Kuzey Afrika, Orta Asya, Ortadoğu, Hindistan ve Rusya’nın güneyinde sığırlarda yaygındır (1,2). T. annulata zorunlu hücre içi bir protozoon parazittir ve Ixodidae ailesinde yer alan Hyalomma türü kenelerle, özellikle Hyalomma anatolicum anatolicum ve Hyalomma detritum tarafından aktarılır. Memeli hayvanlarda parazitlerin hayat siklusu üç gelişim safhası gösterir: Sporozoit, Şizont ve Piroplasm. Kan emme sırasında nimf veya ergin kene tarafından verilen sporozoitler monosit ve makrofajlara girerek burada şizontlara dönüşürler. (Şekil 1 ve 2). Şizontlar konak hücrelerin bölünmesi ve kardeş hücre (daughter cells) oluşturmasıyla çoğalırlar.

Şekil 1. Lenfoblast içindeki Şekil 2. Sporozoitlerle kaplı birşizontlar monosit

Şizontlar içinde gelişen merozoitler enfekte hücrenin yırtılmasıyla serbest hale geçer ve eritrositlere girerler, eritrositler içinde piroplasmik formları oluştururlar (Şekil 3) (3). Larva ve nimf safhasında enfekte konaktan kan emen keneler, kanla birlikte bu piroplasm formlarını alırlar. Kenenin bağırsak lumeninde

1

gametogenesis ve fertilizasyon gerçekleşir. Zigot mide epitellerine girer ve hareketli kinetler oluşur. Kinetler mide duvarını delerek tükürük bezlerine ulaşır ve burada sporogonik çoğalma sonucunda binlerce sporozoit meydana gelir. Siklus bu şekilde döngüsünü tamamlar ve devam eder (Şekil 4).

Şekil 3. Enfeksiyonun akut fazında eritrositler içindeki piroplasm formları

The life-cycle o f T. annul at a

merogony

leucocyteClonal expansion

erythrocyte

Salivary gland Nymph gut

spo rorrt

Şekil 4. Theileria annulata'nin yaşam siklusu

2

Bu safhaların içinde sadece şizontlar in vitro gelişebilirler ve uzun süren bir kültivasyon sonrasında zayıflatabilirler. Bu özellik hücre kültürü aşısının temelini oluşturmaktadır (4).

T. annulata en patojen Theileria türlerinden biridir ve sığırlarda lenfoproliferatif karakterde, yüksek morbidite ve mortalite ile seyreden theileriosis’e neden olur. Hastalığın patogenezi parazitin lenf hücreleri ile eritrositlerde yaptığı tahribat sonucu ortaya çıkar. (5,6,7).

Hastalık belirtileri, sporozoitlerin vücuda girişinden ortalama 15 gün (9-25 gün) sonra ortaya çıkar. T. annulata'mn neden olduğu tropikal theileriosis'de, şizont (lenfosit evresi) ve piroplasm (eritrosit evresi) formları patojendir ve kenelerle iletilen hastalıklar arasında en önemli yeri tutmaktadır (8). Lenf hücrelerinin sınırsız çoğalmasından sonra bu hücrelerin tahribatına yol açan hastalık etkeninin en patojen dönemi başlangıçtaki şizont evresidir. Şizont evresi sığırların bağışıklık sisteminde tahribat oluşturur ve diğer oportünist patojenlerin de hastalık yapabilme kabiliyetlerini arttırır (3,5).

Theileriosis özellikle Mayıs-Eylül ayları arasında %40-60 mortalite ile seyretmektedir. Kültür ırkı sığırlar hastalığa daha duyarlıdır. (9). Türkiye’de saf ve melez kültür ırklarının hastalığa yakalanma ve ölme riskinin % 60 olduğu bildirilmektedir (10). Hastalığın en önemli belirtileri, ateş yükselmesi (ilk günlerde 41-42°C) ve lenf bezelerinin asimetrik şişmesidir. Bundan başka ağız, göz, burun akıntısı, nabız ve solunum artışı, konjuktiva ve mukozalarda önce hiperemi, daha sonra anemi ve ikterle birlikte peteşiler görülür. Hemoglobinuri tablosuna bilirubinuri ve bilirubinemi eşlik eder. Hasta inekler sütten kesilir ve bazı gebe inekler yavru atar. Şiddetli durumlarda ateş yükselmesinden 1 -2 hafta sonra ölümler meydana gelir (2,6,11).

Türkiye’de theileriosis ile ilgili araştırmalar, uzun yıllar lenf ve perifer kan frotilerinin mikroskobik bakısına dayanılarak yapılmıştır (8,12). Daha sonra geliştirilen serolojik yöntemler, özellikle IFAT (13,14,15) yerini moleküler yöntemlere bırakmıştır (7,16,17,18). Bu çalışmalar, Türkiye’de sığırlarda patojen Theileria türlerinden T.annulata’mn yüksek oranda bulunduğunu göstermiştir. Moleküler teknikler diğer yöntemlere göre daha hassas olup latent enfeksiyonları da ortaya

3

çıkarması bakımından teşhiste daha etkili görünmektedir. Theileria annulata’ya karşı recombinant subunit aşı ve tanı amaçlı test geliştirme çalışmalarında kullanılan proteinlerden (30 kDa) biri olan Tamsl, parazitin en belirgin immunodominant merozoit yüzey antijenidir (19). Bu antijen analizi yapılan bütün T annulata suşlarında bulunmuştur. Tamsl genini belirleyen primerler tüm T. annulata sekanslarında bulunmaktadır. Sekans diğer Theileria türlerinde varyasyonlar göstermektedir (20). Moleküler tekniklerle yapılan teşhis çalışmalarının çoğu Tamsl primerini temel almaktadır (21,22).

Theileria annulata’mn aktarılmasında rol oynayan en önemli kene türünün Hyalomma anatolicum anatolicum olduğu belirlenmiştir (13). Elazığ, Malatya ve Tunceli yöresinden toplanan toplam 7455 Hyalomma türü üzerinde yapılan çalışmada Hy. a. anatolicum türü kenelerde enfeksiyon oranının %34 olduğu bulunmuştur. Enfeksiyonu taşıyan ikinci önemli tür ise %18.4 ile Hy. detritum’dur (23).

Theileria annulata’mn yol açtığı tropikal theileriosis, Türkiye’nin bütün coğrafik bölgelerinde görülen en önemli sığır hastalıklarından biridir. Türkiye’de sığırlarda Theileria annulata’mn yaygınlığı Şekil 5’te gösterilmektedir. Hastalık genel olarak Marmara Bölgesinde %33.3, Ege Bölgesinde % 40, Akdeniz Bölgesi’nde % 3.4, İç Anadolu’da % 29, Kapadokya Bölgesinde %60, Karadeniz Bölgesinde %46.8, Doğu Anadolu’da % 48.2, Güneydoğu Anadolu’da % 91.4 oranında görülmektedir (14, 24, 25, 26).

Theileriosis, ateş yükselmesini takiben çok kısa sürede gelişir ve çoğunlukla ölümle sonuçlanır. Enfeksiyona yakalanan hayvanlarda hızlı zayıflama ile meydana gelen canlı ağırlık kayıpları, süt veriminde kesilme veya azalma, yavru atma, ölümler ve ilaç masrafları ekonomik kayıplara neden olur (27). Yapılan analizler en yüksek ekonomik kaybın (%51.62) hastalığın yayılmasından kaynaklandığını ortaya koymaktadır. Bunu sırasıyla ölümler (%22.84), diğer kayıplar (%9.29) ve kontrol için harcanan para (%3.45) izlemektedir (28). Hastalıkla mücadelede kenelere karşı kimyasal maddeler yaygın olarak kullanılmaktadır.

4

Şekil 5. Theileria annulata'nm Türkiye'nin coğrafi bölgelerindeki dağılımı S: Froti testi, ABT: Antikor testi, MP: Moleküler teknikler kullanılarak

belirlenmiştir.

Bununla birlikte, anti-paraziter moleküllere karşı kenelerin geliştirdiği direnç, bu kimyasalların yüksek maliyetleri ve ülkedeki hayvan hareketlerinin kontrolsüz oluşu kenelerle mücadelede çok yetersiz kalınmasına yol açmaktadır. Hastalığın tedavisinde kullanılan ilaçlar yurtdışı kaynaklıdır ve fiyatları yüksektir. Bu ilaçlar enfeksiyon etkenini tamamen ortadan kaldıramamakta üstelik döviz kaybına neden olmaktadır (9, 26, 27, 28).

Yarattığı ekonomik kayıplar nedeniyle theileriosis sığırcılık endüstrisinin en önemli tehditlerinden biridir. Kültür ırkı sığırlar ve aşısız hayvanlar yüksek risk taşımakta ve bu hayvanlarda ölüm oranı %70 den fazla olmaktadır (29). İnci ve ark. (28) hastalığın sığırlarda %30 süt, %37 et kaybına neden olduğunu belirtmişlerdir. Kapadokya Bölgesi’nde yapılan bir araştırmada aşısız ve kültür ırkı 554 sığırın 156 sına (%27.61) akut theileriosis teşhisi konduğu, bunlardan 86 sının (%56.21) öldüğü bildirilmektedir (26).

Primer Theileria enfeksiyonunu takiben gelişen kazanılmış bağışıklık, homolog parazit suşuna bağlı ikinci enfeksiyona karşı çok etkin koruyuculuk sağlamaktadır (9). Bu konuda yapılan araştırmalardan çıkan sonuçlara göre, "natural killer" (NK, doğal öldürücü) hücreler ve makrofajlar, primer Theileria enfeksiyonuna karşı doğal savunma reaksiyonlarının en önemli kısmını oluştururlar

5

(30). Buna karşılık, spesifik antikorlar ve T-lenfositleri (CD4+T- hücreleri ve sitotoksik T-lenfositleri (CTLs), kazanılmış aktif bağışıklıkta yeni enfeksiyonlara karşı en önemli rolü üstlenmektedirler (31). Belirli bir suşa karşı kazanılmış koruyucu bağışıklığın bazı başka suşlara karşı da koruyucu olabildiği gözlemlenmiştir (32).Kazanılmış bağışıklığın en etkin "effector" mekanizması olan CTLs cevabı, Hissar (Hindistan aşı suşu) suşu ile bağışıklanmış sığırlarda otolog parazitle enfekte hücrelere (Hissar suşu ile enfekte lenfoblastoid hücreler) karşı etkili olmasına rağmen, Gharb (Fas aşı suşu) ve Ankara (Türkiye aşı suşu) suşları ile enfekte hücrelere sitotoksik etki göstermemektedir (33). Buna karşılık Ankara suşu ülkemizde değişik yörelerden elde edilen izolatlar ile Hindistan ve Fas'ta izole edilen heterolog patojen T. annulata suşlarına karşı çapraz-bağışıkİık sağlamaktadır (34).

Hastalık halen Türkiye için sorun olmaya devam etmektedir. Hastalıkla mücadele üç şekilde yapılmaktadır: Kene mücadelesi, aşılama ve ilaçlar (kemoterapi):

- Kenelerle kimyasal mücadelede kullanılan akarisidler kenelerin tamamına etki edememektedir. Ayrıca keneler zaman içinde bu kimyasallara karşı direnç kazanmaktadırlar. Bu kimyasalların yüksek maliyetleri ve ülkedeki hayvan hareketlerinin kontrolsüz oluşu da kenelerle mücadelede yetersiz kalınmasına yol açmaktadır (9,26).

- Hastalığın tedavisinde Parvaquone, Buparvaquone ve Halofuginone gibi bazı kemoterapötik ilaçlar kullanılmaktadır. Bu ilaçlar enfeksiyon etkenini tamamen ortadan kaldıramamakta, sığırlarda taşıyıcı formların gelişmesine neden olmaktadır (2).

- Theileria annulata Ankara suşu zayıflatılmış doku kültürü aşısı 30 yıldır Türkiye’de yaygın ve başarılı biçimde kullanılmaktadır. Theileria şizontlarını taşıyan lenfoid hücrelerin doku kültüründe sürekli pasajı sonucu zayıflatılan etken aşı olarak hazırlanmakta, her 20-30 pasajda bir virulans kontrol edilmektedir. İstenilen attenüasyona genellikle 250. pasajda ulaşılmaktadır ve aşı 250. pasajın üstündeki pasajların subkültivasyonu şeklinde hazırlanmaktadır (32). Endemik bölgelerde yaklaşık yılda 170.000 doz aşı uygulanmaktadır (35). Kullanılan aşının üretim ve dağıtım

6

aşamalarında üzerinde çalışılması gereken bazı sorunları bulunmaktadır. Bunlar aşının ticaretini kısıtlamaktadır (34,35):

1. Aşının zayıflatılma işlemi uzun süren, zahmetli ve pahalı hücre kültürü pasaj işlemlerini gerektirmektedir. Zayıflatılmış aşının uygulanan sığırda ateş oluşturmaması, kanda şizont veya piroplasmların görülmemesi gerekmektedir. Bu ancak 250. pasaj sonrasında mümkün olmaktadır.

2. Aşılanan sığırlardan kan yoluyla alınan zayıflatılmış etken kenelerde tekrar hastalık yapma yeteneği (virulans) kazanabilmektedir. Bu durum hastalığın oluşum döngüsünün devam etmesine neden olmakta, koruyucu bağışıklığın sağlanmasını engellemektedir.

3. Aşının üretimi ve kullanım alanı arasında, taşınma ve dağıtımda soğuk zincirin kırılmaması gerekmektedir. Bu nedenle aşı sürekli sıvı azot veya kuru buz içinde (-196°C) tutulmaktadır.

Gama ışınlama son yıllarda hastalık etkeninin zayıflatılma (attenüasyon) işleminde kullanılarak aşı yapımında önemli gelişmelere neden olmuştur. Özellikle hazırlanma aşaması zahmetli aşılarda gama radyasyonun büyük kolaylık sağladığı, güvenilir ve etkili bir teknik olduğu bildirilmektedir (36,37).

Uluslararası Atom Enerjisi Ajansı (IAEA) canlı aşı etkenlerinin zayıflatılmasında gama radyasyon ile başarı sağlanabileceğini yürüttüğü ve halen yürütmekte olduğu çeşitli çalışmalarla belgelemektedir. Örneğin, gama ışınlama son yıllarda sıtma ve insanlarda enfeksiyon oluşturan Schistosoma mansoni etkenlerinin zayıflatılmasında çok iyi sonuçlar vermektedir. Bu sonuçlara rekombinant aşılarla ulaşmak mümkün olmamıştır (38,39). Gama ışınlamanın dayanıklı, virulent Babesia bovis suşlarını baskılaması için 350 Gy doz yeterli olmaktadır. Zayıflatılmış avirulent B. bovis etkenlerinin immunojenitelerinin yüksek olduğu, bir yıl sonra bile virulans kazanmadığı ve kenelerce nakledilmediği belirtilmektedir (40). Srivastava and Sharma (36) 0.5 ve 1 kR (kiloroentgen) dozlarda gama ışınlamanın sığır lenfositleri içindeki şizontlar üzerindeki etkilerini incelemişlerdir. Işınlanan zayıflatılmış parazitler enfeksiyona duyarlı hayvanlara verildiğinde hastalığın şiddetli

7

seyretmediğini, ateşin, paraziteminin, mortalite ve morbiditenin düşük olduğunu görmüşler, hastalığı yenen danalarda aynı virulent suşa karşı direnç geliştiğini belirlemişlerdir. Araştırıcılar şizontlardaki hasar ve zayıflama oranının dozla doğru orantılı olduğunu saptamışlardır. Gama ışınlama ile zayıflatılmış aşının profilaksi amacıyla kullanılabileceğini göstermişlerdir.

Bu veriler, gama ışınlamanın, halen üretilmekte olan T.annulata aşısında yaşanan sorunlara çözüm getirebileceğini, İyonlaştırıcı radyasyonun steril ve güvenilir bir yöntem olarak aşının zayıflatılmasında konvansiyonel tekniklerden daha etkili ve başarılı olacağını göstermektedir. Gama ışınlamanın ayrıca şizont kültürlerinin zayıflatılmasında stabilizasyon problemini çözebileceği düşünülmektedir (39).

Aşılama en etkin kontrol ve eradikasyon yöntemidir. Bir enfeksiyonun yaratacağı maddi-manevi tüm kayıpları önleyecek, koruyucu tek sağlık yatırımıdır. Aşılar çoğunlukla enfeksiyonu yaratan canlı etkenin zayıflatılarak vücuda verilmesi asasına dayanır ve bu yolla hastalığa karşı koruyucu bağışıklık oluşması sağlanır. Aşı üretim teknolojsii sürekli yenilenmekte, üretilen aşıların etkinlikleri ve kolay kullanılır olmaları yönünde çalışmalar devam etmektedir. Son yıllarda paraziter hastalıklarla mücadelede rekombinant aşılar denenmiş, immunojenitelerinin zayıf veya hiç olmadığı görülmüştür. Bu yönde yeni stratejilere gerek duyulmuş, gama ışınlamanın bu amaçla kullanılabileceği düşünülmüştür (38).

Şekil 6. T.C. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı T. annulata aşısı

8

Bu çalışma ülkemizde T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü tarafından Ankara suşu kullanılarak üretilen T. annulata aşı kültürlerinin gama ışınlama ile zayıflatılması amacıyla yürütülmüştür. Bu amaçla, attenüasyon için gerekli optimal doz çalışmaları yapılmış, gama ışınlamanın aşının kararlılığı ve virulans kazanma yeteneği üzerindeki etkileri araştırılmıştır.

9

2. GEREÇ ve YÖNTEM

2.1 Enfektif Hücre KültürüEnfekte hücreler Glaskow Minimal Essential Medium (GMEM), %20 buzağı serumu, penisilin (100 ünite/ml), streptomisin (50pg/ml) ve mikostatin (75 ünite/ml) içeren besi yerleri içinde, 25 ml’lik kapaklı doku kültürü şişelerinde kültüre edildiler. Besi yerleri her 2 günde bir yenilendi, vasat içinde parlak ışınım veren hücrelerin varlığı faz- kontrast ve ters mikroskopta incelenerek kontrol edildi, hücrelerin çoğalıp çoğalmadığı izlendi. Vasat değişirken tek sıra (monolayer) üreyen hücrelerin etkilenmemesi için vasata %0.025 EDTA (Versene) eklendi. Şişelere bölüştürülen hücre sayısı mikroskopta sayılarak belirlendi. Her 25 ml’lik şişeye yaklaşık 107 hücre konuldu. Işınlama dozları için her biri 5x107 hücre içeren 10’arşişe hazırlandı.

2.2 Enfekte Hücrelerin IşınlanmasıGama ışınlama Sarayköy Nükleer Araştırma ve Eğitim Merkezi bünyesindeki 60Co kaynağında (Tenex-lssledovatel) ve oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Çeşitli tarihlerdeki ışınlamalarda kaynağın doz hızı 0.710-0.640 kGy/h arasında olup ışınlama süresi doz hızı dikkate alınarak aşağıdaki şekilde hesaplandı.

D = R x T

D = Uygulanan radyasyon dozu (Gy)R = Doz hızı (Gy/h)T = Işınlama süresi (h)

İlk ışınlama 0-350 Gy doz aralığında yapıldı [0 (kontrol), 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350 Gy]. Her ışınlama dozu için her biri 5x107 hücre içeren 10 adet hücre kültürü şişesi kullanıldı. İn vitro değerlendirme sonrası doz aralığı 0, 100, 150, 200 Gy olarak daraltıldı. Işınlamalar sonrası ikişer seri pasaj çalışması yapıldı. Ayrıca hücrelerdeki canlılık oranları belirlendi.

10

Ayrıca ışınlama sonrası Theileria annulata merozoite surface antigen geni (Tamsl) üzerinde moleküler düzeyde çalışmalar yapılarak antijenin nükleotid diziliminde değişiklik olup olmadığı incelendi.

2.3 Aşı materyalinde ışınlama öncesi ve sonrası lenfosit sayımı /canlılık testiAşı materyali sulandırıldıktan sonra içinden alınan miktar (0.2 mİ), PBS (pH.6.8) ile 5 katı sulandırıldı, Trypan blue katıldı. Sayımlar Neubauer lamında 5 büyük karedeki canlı ve ölü hücreler sayılarak yapıldı (Şekil 7).

Şekil 7. Neubauer lamında lenfosit sayımı.Oklar ölü (mavi renkli) ve canlı (renksiz) lenfositleri göstermektedir.

Toplam hücre sayısı ve canlılık oranları canlı hücrelerin mavi renkteki Trypan blue boyasını almamaları esasına dayanarak aşağıdaki formüllere göre hesaplandı.

Toplam Hücre Sayısı = Sayılan Hücre x 2 x 1000 x 13.5 x 5

Canlı Hücre Sayısı / Toplam Hücre Sayısı x 100

11

2.4 Işınlanmış Theileria annulata’da ve kenelerin tükrük bezinde Tamsl geninin analiziIşınlanmış enfekte lenfositlerden DNA ekstraksiyonu için 10x106 hücre içeren ve sıvı azot içinde -196°C de dondurulmuş örnekler 37 °C lik su banyosunda çözdürüldü. Total DNA ticari kit kullanılarak (QIAGEN) ekstrakte edildi.

İkinci aşılama sonrası danaların kulaklarından alınan keneler dondurularak steril havanda ezildi, 500 |Jİ PBS içinde homojenize edildi. Bu homojenattan DNA ticari kit (QIAGEN) protokolü izlenerek elde edildi.

PCR Amplifikasyonu: Theileria annulata’nın protein yapısındaki (30 kDa) olup 776 baz çifti (bp) taşıyan merozoit yüzey antijeni (Tamsl) total DNA örneklerinden aşağıdaki primerler kullanılarak amplifiye edildi (22):

Tamsl F (5’-ATGCTGCAAATGAGGAT-3’)

TspmsIR (5’-GGACTGATGAGAAGACGATGAG- 3’)

DNA amplifikasyonu 50 pl hacımda gerçekleştirildi. Her bir reaksiyon için 0,5 pl primer, 0,2 pl dNTP, 20 pM tris HCL, 5 mM (NH4)2S04, 3mM MgCİ2, 150pl BSA, 0,025U/pl Taq Polymerase ve 5 pl DNA kullanıldı.

PCR Programı:94°C 3 dk

94°C 1 dk ~ 60C 1 dk 72 C 1 dk _

72 C 10 dk

40 tur

Jel Elektroforez: 20 pl PCR ürünü %1,5’luk agaroz jelde yürütüldü. Spesifik DNA bantları UV transilluminatör yardımıyla belirlendi.

Sekanslama: 25 pl saflandırılmış örneklerin sekansları Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Genetik Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi. Sonuçlar BLAST ve CLUSTALW programları kullanılarak değerlendirildi.

12

2.5 Theileria annulata’nin ELISA ile teşhisiT. annulata’ya karşı oluşan antikorların teşhisi amacıyla ELISA yöntemi farklı antijenler kullanılarak çalışıldı. Tüm antijenler için T.annulata şizontları içeren hücreler kullanıldı (hücre konsantrasyonu 5x107/2ml, canlılık >%90).

SelülerŞizont Antijeni: Antijen canlı T. annulata taşıyan hücrelerden hazırlandı (41). Hücreler 3 kez soğuk PBS (pH.7.2) ile yıkandı (200g, 10 dk, 4°C). Trypan blue boyası kullanılarak canlılık sayıldı. Ayrıca, %0.1 poly-L-Iysine (Sigma)/ PBS ELISA plaklarının (Dynatech MicroELISA) gözlerine pipetlendi ve plaklar oda sıcaklığında 2 saat bekletildi. Daha sonra 3 kez PBS ile yıkandı. Her göze hazırlanan antijenden 60.000 şizont /200pl olacak şekilde pipetlendi ve 37°C’de 1 saat bekletildikten sonra 3 kez PBS ile yıkandı. Gözlere tam dolduracak şekilde % 0.25 gluteraldehyde /PBS koyuldu. Üç dakika sonra plak PBS ile yıkanıp kurutuldu. Plak gözleri %1 Bovine Serum Albumin (BSA) ile bloke edildikten sonra plaklar kapatıldı ve test gününe kadar 4°C’de saklandı.

Çözülmüş (Soluble) Şizont Antijen: T.annulata ile enfekte hücreler 3 kez soğuk PBS (pH 7.2) ile yıkandı. Son pelete 130 pl soğuk PBS eklendi. Süspansiyon buz içinde ve 4°C’de 30 saniye aralarla 5 kez 45’er saniyelik ultrasonikasyona tabi tutuldu. Daha sonra süspansiyon 10.000 g’de 10 dk santrifüj edildi. Üst fazlar toplandı, 150pl PBS eklendi ve tekrar santrifüj edildi. Bu işlem 5 kez tekrar edilerek üst fazlar toplandı, porsiyonlara ayrılarak -20°C’de antijen olarak saklandı (42).

Şizont Antijen: T.annulata ile enfekte hücreler 200 g, 2 dk, 4°C’de santrifüj edildiler. Üst faz atıldı, hücre peleti soğuk PBS ile sulandırılarak tekrar santrifüj edildi. Bu işlem 3 kez tekrarlandı. Son hücre peleti 107 hücre/ml olacak şekilde sulandırılarak -20°C’de antijen olarak saklandı. Protein içeriği kolorimetrik biüret total protein testi ile 2.0 mg/ml olarak belirlendi (43).

ELISA protokolü: Antijenlerin, pozitif /negatif serumların ve konjugatın optimum konsantrasyonları titrasyon testleriyle belirlendi. Titrasyonlarda en iyi sonucu çözülmüş şizont antijen verdi ve ELISA testlerinde bu antijen kullanıldı.

13

96 gözlü ELISA plakları (Dynatech MicroELISA) 200pl antijen (1:200 sulandırma/ coating buffer, pH 9.6) ile kaplandı ve kapatılarak 4°C’de bir gece bırakıldı. Ertesi sabah gözlerin bağlanma olmayan alanları %1 BSA ile bloke edildi (250 pl/göz), 37°C’de 1 saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası plaklar boşaltılarak PBS-Tween 20 %0.01 (PBST) ile 3 kez ve PBS ile 2 kez yıkandı. Yıkama sonrası PBST içinde 1:100 oranında sulandırılan serum örnekleri (referans pozitif ve negatif serumlar dahil) belirlenmiş gözlere 200pl olarak pipetlendi. Plaklar kapatılarak 4°C’de bir gece bırakıldı. Ertesi sabah plak boşaltılarak yukarıda belirtilen şekilde yıkandı. Yıkama sonrası PBST içinde 1:1000 oranında sulandırılan konjugat (Rabbit antibovine IgG, whole molecule horseradish peroxidase, Miles Scientific) her göze 200pl pipetlendi. Pipetleme öncesi konjugatın özgünlüğünü artırmak ve antijen-konjugat bağlanmasını önlemek amacıyla konjugata %0.2 oranında at serumu katıldı. Plaklar 37°C’de 1 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrası plaklar aynı şekilde yıkandı. Yıkama sonrası tüm gözlere 200 pl substrat solüsyonu (5- Aminosalicylic acid) pipetlendi. Plaklar çalkalayıcı üzerinde 30 dk inkübe edildi. Oluşan renklerin optik dansitesi (OD) ELISA okuyucuda (Multiskan Titertek) 492 nm’de okundu. Pozitiförneklerin ayrım değeri (cut off value) aşağıdaki şekilde hesaplandı:

Cut off değeri: 10 negatif örneğin OD değerleri ortalaması ± __________________ 2 standart sapma__________________

2.6 Indirect flourescent antibody testi (IFAT)Deneme hayvanlarında deneme öncesi ve birinci aşılamadan sonra uygulanan bu serolojik test aynı zamanda ELISA testi sonuçlarının karşılaştırılması amacıyla kullanıldı. IFAT testi OIE tarafından önerilen protokole göre gerçekleştirildi (2).

IFAT antijeni: T. annulata ile hafif enfekte 2 günlük kültürlerden toplanan şizont enfekte hücreler 500 g’de 10 dk santrifüj edildiler. PBS ile yıkandılar (3 kez, 500 g 10 dk). Son yıkamayı takiben hücrelerin canlılığı saptandı ve hücreler 5x107 olacak şekilde sulandırıldı. Buna 1:10 sulandırılmış formaldehit eklenerek 10 dk buz içinde bekletildi. Daha sonra 3 kez aynı şekilde PBS ile yıkandı. Bu antijenden aşağıda resmi görülen 10 gözlü lamların her bir gözüne 30pl pipetlendi, kurutuldu, alüminyum folyoya sarılarak test

14

gününe kadar-20°C’de bekletildi.

Şekil 8. 10 gözlü test lamı

IFAT protokolü: Antijen içeren lamlar silikajel içinde 30 dk bekletildi (4°C). Lamlar aseton içinde fikse edildi ve 4 kez PBS içinde yıkandı. Gözlere farklı serum dilüsyonları pipetlendi (10pL), 30 dk oda sıcaklığında bekletildi. Her lama protokol dahilinde pozitif, negatif ve substrat kontrolleri pipetlendi. İnkübasyon sonrası lamlar 3 kez PBS ile yıkandı. Her göze 10 pl FITC işaretli anti bovine IgG konjugat eklendi. Lamlar karanlık, nemli ortamda 30 dk. bekletildikten sonra tekrar 3 kez PBS ile yıkandılar. Lamlar %66 gliserol içeren 50 mM Tris HCL ile kaplandılar. Lamlardaki gözler tek tek floresan mikroskop altında incelendi. Değerlendirmede 1:40 ve üstü titreler pozitif, bu titrelerin altındaki titreler negatif kabul edildi.

2.7 Hayvan deneyleriDeneme hayvanları kene ve diğer akarisidlerden arındırılmış temiz ahırlarda tutuldular. Tüm hayvanlara deneme öncesi Giemsa boyama testi ve IFAT uygulanarak T. annulata taşıyıp taşımadıkları belirlendi. Tüm hayvanlar negatif bulundu. Aşılama sonrası ateş yükselmesi ve lenf yumrularının şişme durumu hergün muayene edilerek kaydedildi. Aşılama denemesi aşağıdaki tabloda (Tablo 1) belirtilen şekilde gerçekleştirildi. Deneme sırasında toplanan serum örnekleri test gününe kadar - 20°C’de tutuldular.

15

Tabl

ol.

Den

ey h

ayva

nlar

ı aş

ı pr

ogra

mı

00)

CD■o

(/)CDCD

CD■oCDCD

(/)C

LÜCDECD

<D>

O

0)0)>

r—

<1)

16

Hay

van

Gru

plar

ı (H

er g

rupt

a 5

hayv

an o

laca

k şe

kild

e)

Deneme sonrası T. annulata teşhisi için aşağıdaki parametreler kullanıldı:

• Giemsa boyama (sınamayı izleyen 8. haftadan sonra bir hafta arayla sürekli): Danalardan kan alınarak lam üzerine ince froti preparatları hazırlandı, kuruduktan sonra 5 dk. metanolde fikse edildi ve deiyonize su ile hazırlanmış %5 Giemsa içinde 30 dk. boyandı. Boyanan preparatlar 100 büyütme ile Theileria piroplasmları yönünden incelendi. Bu uygulama hayvanlar hastalanıncaya ve/veya ölünceye kadar devam etti.

• Vücut ısısı (Deneme süresince sürekli, tüm gruplarda hergün)

• Lenf nodülü ponksiyonu (Lenflerin şişmesini takiben hergün)

• Sınama amaçlı kene stabilatı (1. aşılamayı izleyen haftada): Kene stabilatı olarak T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü laboratuvarlarındaki mevcut stok kullanıldı. Bu stok Theileria annulata enfeksiyonu taşıyan Hyalomma detritum kenelerinden hazırlanarak sıvı azot içinde (-196°C) saklanmaktaydı.

• Kene Uygulaması (ikinci aşılama sonrasında): 150 Gy aşı ile ikinci aşılama birinci aşılamadan bir yıl sonra, C grubundaki aynı hayvanlara uygulandı. Aşı yapıldıktan 1 hafta sonra enfeksiyon taşımadığı bilinen Hyalomma keneleri, her kulağa 20 kene olacak şekilde danaların kulaklarına yerleştirildiler. Önce havayı geçirebilecek bir bez kullanılarak bir yanı açık özel torbalar hazırlandı. Torba tabanından plasterle kulağa tesbit edildi. Keneler yerleştirildikten sonra açık kenar da plasterle kapatıldı. Keneler hergün kontrol edildi, doyup düşen keneler bir şişeye alındı ve muayene gününe kadar sıvı azot içinde (-196°C) muhafaza edildi.

17

3. BULGULAR

3.1 Gama ışınlama50 ve 100 Gy dozda ışınlanan hücreler canlılıklarını korudular, bölünmeye devam ettiler. 150 Gy dozda ışınlanan hücreler canlılıklarını korudular fakat çoğalmaları azaldı. > 200 Gy dozda ışınlanan hücrelerin metabolizmaları durdu ve öldüler (Şekil 9 ve 10). Dolayısıyla 150 Gy dozun optimum doz olduğuna karar verildi. Aşı denemelerinde de 150 Gy dozda ışınlanan aşının koruyucu özelliğinin konvansiyonel attenüe T.annulata aşısı ile aynı olduğu görüldü.

Şekil 9. Işınlanmış hücrelerin (0, 50, 100, 150, 200 Gy) inkübasyon öncesidurumları

Şekil 10. Işınlanmış hücrelerde iki gün inkübasyon sonrasında hücre kültürlerinde metabolik aktiviteyi gösteren renk değişimleri (Hücre kültürü şişeleri üstüste ikişerli örnekler şeklindedir)

18

3.2 Aşı materyalinde ışınlama öncesi ve sonrası lenfosit sayımı /canlılık testiIşınlama öncesi ve sonrası lenfositlerin canlılığı sayılarak incelendi. 50 ve 100 Gy dozda ışınlanan T. annulata aşısında lenfosit sayılarında ışınlama öncesi ve sonrası canlılık oranlarının benzer olduğu, bu dozlarda ışınlamanın canlı hücre sayısı üzerinde fazla etkili olmadığı belirlendi. 150 Gy dozda ışınlanan örneklerde canlı hücre sayısında %30-40 oranında azalma olduğu hesaplandı. 200 Gy ve üstündeki ışınlamalarda canlı hücre sayısının önemli oranda azaldığı görüldü (Şekil 11).

3.3 Işınlanmış Theileria annulata1 da Tamsl geninin analizi (PCR)Çeşitli dozlarda ışınlama sonrası Theileria annulata merozoit yüzey antijen geni (Tarns 1) PCR amplifikasyonu ile incelenerek genin nükleotidlerinde değişiklik olup olmadığı incelendi Tarns 1 geninin amplifikasyonu sonrasında alınan görüntüde, ışınlanan aşı ile konvansiyonel attenüe T.annulata aşısı arasında Tamsl geni açısından bir farklılık olmadığı görüldü. Şekil 12’de 776 baz çifti taşıyan Tamslgeninin ışınlanmış ve ışınlanmamış hücrelerdeki konumu gösterilmektedir.

19

800 bp

500 bp

Şekil 12. PCR sonrası Ethidium bromid ile boyanmış jelde Tamsl geni A Kontrol, B-G Işınlanmış hücreler (50, 100,150, 200, 250, 300 Gy),

M marker. Gama ışınlamanın Tams 1 geni üzerinde bir etkisinin olmadığıgörülmektedir.

Tamsl geninin sekans sonuçlarıSekans sonuçları ışınlamadan sonra Tamsl geninde nükleotid dizilimi yönünde bir değişim olmadığını göstermiştir (Tablo 2). Bu dizilim PubMed BLAST filogenetik ağaç üzerinde konumlandırılmıştır (Şekil 13).

Tablo 2. Işınlanmış hücrelerde Tamsl geninin dizilimi (CLUSTAL W)TA1 (50Gy), TA2 (100Gy), T A3 (150Gy), TA4 (200Gy), TA5 (250Gy), TA6 (300Gy)

r e f . TA AATGCTGCAAATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT120TA İ ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50TA2 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50TA3 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50TA4 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50T A 6 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50TA5 ATGAGGATGAAAAGAAAAAGGAGGAAAAAAAAGATGTTGTTCTTGATGTT 50

r e f . TA ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA İ ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA2 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA3 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA4 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA 6 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl TA5 ACTCTCACTTCATGTGAGAATGTAACCTTTAAAAACGTCGACTCTAACACCACTGAGTTAl

80101010101010

20

r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA 6 TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

. TA ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT2 4 0 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT170 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT170 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT170 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT170 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT170 ACTGTCGCGGATGGCTACCGTTTCAAGACCCTTAAGGTCGGAGACAAGACCTTGTTCAAT170

. TA GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG3 00 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0 GTTGACACCTCAAAACATACCCCAGTACAGGCATTCAAACTTAAGCATGAATCCGATGAG2 3 0

. TA TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG3 6 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0 TGGTTCAGACTTAATCTTCACCCTGCCCAGCCAAAGATGTTCAAGAAGAAGGGAGACAAG2 9 0

. TA GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC4 2 0 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350 GAATATTCTGAGGTCAAATTCGAGACCTACTACGATGATGTCTTGTTCAAGGGAAAATCC350

. TA GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC4 8 0 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410 GCCAAGGAACTAGATGCTTCCAAGTTCGAAGATACATCTTTGTTCACCTCCTCCGCCTTC410

. TA GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC5 4 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0 GGCACTGGAAAGATGTACACCTTTAAAAAGGAATTTAAACCTTCCAAAGTCACCTTCGAC4 7 0

21

r e f TA1 TA2 TA3 TA4 TA 6 TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

r e fTA1TA2TA3TA4TA6TA5

. TA AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT60 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0 AAGAAAGAAGTCGGAAAACCAAACAATGCCAAGTATCTTGAAGTTGTTGTTTTTGTTGGT53 0

. TA TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG6 60 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0 TCTGATTCCAAGAAGTTCGTCAAACTCTACTACTTCTATACCGGTGACTCAAGGTTGAAG5 9 0

. TA GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC7 2 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0 GAGACCTACTTCGAGCTTAAGGACGATAAGTGGGTTCAAATGACACAGGCAGATGCAAAC 6 5 0

. TA AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG7 8 0 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710 AAGGCCTTGAATGCCATGAACTCATCCTGGTCAACCGATTACAAACCAGTTGTCGACAAG710

. TA TTCTCCCCCCTTGCAGTCTTCGCCTCAGTACTCATCGTCTTCTCATCAGTCCTTTACTTC8 4 0 TTCTCCCCCCTTGCAGTCTTCGCCTCAGTACTCATCGTCTTCTCATCAGTCCTTTACTTC7 7 0 TTCTCCCCCCTTGCAGTCTTCGCCTCAGTACTCATCGTCTTCTCATCAGTCCTTTACTTC7 7 0 TTCTCCCCCCTTGCAGTCTTCGCCTCAGTACTCATCGTCTTCTCATCAGTCCTTTACTTC7 7 0 TTCTCCCCCCTTGCAGTCTTCGCCTCAGTACTCATCGTCTTCTCATCAGTCCTTTACTTC7 7 0 TTCTCCCCCCTTGCAGTCTTCGCCTCAGTACTCATCGTCTTCTCATCAGTCCTTTACTTC7 7 0 TTCTCCCCCCTTGCAGTCTTCGCCTCAGTACTCATCGTCTTCTCATCAGTCCTTTACTTC7 7 0

* * * * * * * * * * * *

TA CTTTAA 8 4 6CTTTAA 7 7 6CTTTAA 7 7 6CTTTAA 7 7 6CTTTAA 7 7 6CTTTAA 7 7 6CTTTAA 7 7 6

22

[I Q gulayvural • Vahoo!7 Mail * 1KEmlakkuhsi.com - Türkiye'nin̂ ̂ % NCBI BlastıTheılerıa annulata J rj Blast Tree View Widget t_________________ S ij

C 0 b last,ncb i.n lm .n ih .gov /b lcS t/tiee vew /tT eeV iew ,eg ☆ a ^

&A sayfanın dili | İngilizce ▼ Çevrilmesini ısöyor m usunuz? | Çevir | Hayır | S e çenek le r*

This tree was produced using BLA5T pairwise alignments, more... ....A

Fast Minimum Evolution v W 10 75r e c ta n g le s la n te d r a d ia l f o r c e

or alignment

Tree view for RID: XBJ8FB4101II, query ID: Icl 148029, database: nrli!a> $e<| Difference

Download l in Newick Formal v y?

0 Sliou distance Mouse over an internal node for a subtree ,

_ îi i c o ır o l e K a n s 1 6 le ase s

ifcl-oUH 31C?5 itikcîoi!»-DifODİaînı sjrtar» antigen lami ı gona, complete cdsa rNcılcH»ânruılat%.İ30İat« 2 3-* mcrorcife piroplasm sürfece antgun lams 1gene, complete cds <W rheilenaannulafeisolate 2 i i meioroifepiioolasm surfece antigen lamsi gene, complete cds 5 rheileriaannulafeisolafe23l meroroife piroplasm surfece antigen lams I gene, complete cds

j iKeilena annulafe isolate Mcl 3 meiozoile- piroplasm surface antigen Tams I gene, complete cds g 8- J Iheileria annulafe isolate gal meroeoiVonoolasm surface antigen lams 1 gene, complete cd

A Iheileria annulafe isolate 9a) merojoile piroplasm surfece antigen lams I gene, complete cds Iheilena annulafeisolate HbSmenwoiVpiroplasm surfen antigen lamst gene, complete cds

’ si' 3 Ttieilena annulafeisolale dS2e meroîoıfe piroplasm surfece antigen Tams I gene, complete cds J Iheilena annulafeisolale Hell meroroile-piroplasm surface antigen rams I gene, complete cds---------3 Iheilena annulafe isolate 9ba merocoile- piroplasm surfece an tigen lams I gene, comole

ItP»-3 Iheileria annulafe isolate 2 i? merotoitie piroplasm surfece antigen ramsl ger 'i-lheileiiaannulafeisolate 2IS meroroite-piroplasm surfece antigen lamst gene, c ^iheilena annulafeisolate 2ismeroeoifepiraplasui surfece antigen tarnst gene, c

j T'lheileria annulafeisolate 218 meroecifepiroplasm surfece antigen lamst gene.c i ■ilheıleıiaannulafeısolatelPSmeroroifepıroplasmsıırfeceantgenlamsi gene,c

. ■t rheilena annulafe isolate tPis meroroi to-piroplasm surface antigen Tamsl ge theilena annulafeisolale tP!2 mero20ile-piroplasm surface antigen Tams I gene

kr -Tle±iia annulafe isolate IPi meracoıfe-proplasın surface antigen ramsl gen v Iheileria annulafe isolate IP? merojoite-piioolasm surfece antigen lamst gene, c.

■Vıheıleıia annulafe isolate HC20mer>Hoitr piroplasm surface antigen lamst gene ■ 0 Iheilena annulafe isolate ti 10 meioroife-piroplasm surface antigen lams' geh.

' Iheileria annulafe isolate l it meroeoile- piroplasm surfece antigen ■9 rheilena annulafeisolale tBt meroeoile- piroplasm surface antigen ramsl gene, comple

greet Vilgm mst'xnuccapaele.

—i> rheilena annulafe isolate IPs meroroile- piroplasm surfece an h gen tamsl gene, complete cds■ ■ TiriEna annulafe isolate fASmeroroite- piroplasm surfece antigen ramsl gene, comp

menenaannuiaiaisolalelA5mero20ite-piropfesm surface antigen Tams' gene, compete cds — i I heıIeiiaannulafe isolate İAU meroroife piroplasm surfece antigen lams' gene, coiriolet* cds

Iheileria aiSharia annulafeisolale t M2 3 meroroile- piroplasm surfece antigen rams I gene, complete cds apicompleeans 15 leanesaWheileiia annulafe isolate nag Sd meroroile-piroplasm surfece antigen ramsl gene, complete cds theileiiaannulafe isolate na3 3 mensroite- piroplasm surfece antigen lams' gene, complete cds Iheileria annulafe mst gene, mstconprl l gene | partial i, ms icon̂ srt2 gene and ms' contort} gene (oartii 1 annulafe lams'-' mPNA tor meroroile surfeceglpcopnolein 1 heileiia annulafe isolate na9 Sc meroroi le- piropfesm surtac e an tigen rams I gene, comple te c d s

ijtoicompleiiansuleaues'A t theileiia annulafe isolate na961 meroroife piroplasm surfece antigen lams' gene, complete cds "* theileiia annulafe meroeoite surface glycoprotein lams i (lamst-1 allele) mRNA, complete cds

theileiia annulafe strsun Aolnia lams i irradiated J theileiia annulafeisolale 1A? mero2oite-piroplasm surfece antigen lams i gene, complete cds

Sequence Label Sequence Idle (it available)

Cnllapce Mode Custom v | V

Bldft namei colei map

V

apicomplexansnkno

Şekil 13. Işınlanmış T.annulata hücrelerinin PubMed BLAST filogenetik ağaç üzerindeki konumu (ok ve sarı vurgu)

23

3.4 Teşhis3.4.1 Perifer kan frotisi örneklerinde Giemsa boyama

Şekil 14. Enfeksiyonun akut evresinde alyuvarlar içindeki parazitik formlarGiemsa boyama (x100)

Tablo 3. Giemsa boyama sonuçları

Hafta/Gün Grup A Kontrol

Grup B Attenue aşı

Grup C150 Gy ışın, aşı

Grup D200 Gy ışın, aşı

Kod No. 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5O.günAşılama

Aşılama yok Giemsa (-)

l.hafta/7. gün2.hafta/14.gün3.hafta/ 21.gün4.hafta/28.gün5.hafta/35.gün6.hafta/42.gün7. hafta/49.gün Challenge/Sınama (kene stab

Tüm gruplarda Giemsa (-ilatı)

8.hafta/56.gün9.hafta/63.gün10.hafta/70.gün + - - + + + - + + +ll.hafta /77.gün + + + + + + + + + +12.hafta/84.gün + + + + + + + + + +13.hafta/91.gün +

Ö+Ö

+K

+K

+Ö

+Ö

+K

+K

+K

+Ö

14.hafta/98.gün15.hafta/105.günÖ. Ölüm K. Kesim

24

3.4.2 Aşılama sonrası deneme hayvanlarının ortalama vücut ısıları:Aşılama sonrası 7. günden sonra B ve C grubunda ateş hafif yükselmiştir. Kontrol ve D grubunda bulunan hayvanlarda ateş dönem dönem 41°C’nin üzerine çıkmıştır.• Kontrol grubu (A): max 41.8°C• Konvansiyonel aşı grubu (B): max 38.8°C• 150 Gy ile aşılanan grup (C): max 38.9°C• 200 Gy ile aşılanan grup (D): max 40.7°C

3.4.3 Lenf nodüllerinin biyopsisiAşılama sonrası 11-13. günlerde kontrol ve D grubundaki hayvanların lenf bezlerinin şiştiği anlaşıldı (70 mm), biyopsilerinde parazitin şizogonik formları görüldü. B ve C gruplarının biyopsilerinde şizontlara rastlanmadı.

3.4.4 ELISAELISA testi antijeni olarak üç farklı antijen ile çalışılmış ve en iyi sonuçlara çözülmüş (soluble) şizont antijeni kullanıldığında ulaşılmıştır. Diğer iki antijenin hassasiyeti yeterli olmamıştır (Şekil 15).

Şekil 15. Soluble şizont antijen kullanılarak elde edilen ELISA sonuçları (Grup A ve D / 63, 70, 77, 84 ve 91. günler)

Kolon 11-12 kontroller: A-B (negatif), C-D (pozitif),E-F (konjugat + % 0.2 at serumu), G-H (Ag+konjugat)

25

Tabl

o 4.

ELI

SA s

onuç

ları

(Sol

uble

şiz

ont a

ntije

n ku

llanı

lara

k)

Haf

ta/G

ün

Gru

p A

G

rup

B G

rup

C G

rup

Du y03u y

Ecoşcu y

>%Ooo<N

u y03u y

Ecoşcç*OoLf)

(D

O*£ö ^g i > s£ZO 3̂

CO

m I I I I I I I I I ++++

+++

++ O +

1 I 1 1 1 1 1 I 1 ++

+++

+++

++

+

00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 ++++

+++

++

+CM 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I +

++

+++

++

+

1 1 1 1 1 1 1 1 1 +++

++

++ O

+ + +

m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 I I 1 I I

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

00 1 1 1 1 1 1 1

Cha

lleng

e (k

ene

stab

ilatı)

Tü

m g

rupl

ar

1 1 1 1 1 1 1 1

CM 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

- 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Tt 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

00 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

CM 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

- 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

m 1 1 1 1 1 1 1 1 1 +++

+++

++ o +

yok 1 1 1 1 1 1 1 1 1 +

++

+++

++

+

00 03E

_cç1 1 1 1 1 1 1 1 1 +

++

+++

++

+

CMu y< 1 1 1 1 1 1 1 1 1 +

++

+++

++ o +

1 1 1 1 1 1 1 1 1 ++

++

++ o

+ + +

O.g

ün A

şıla

ma

1 .ha

fta/7

. gün

2.ha

fta/1

4.gü

n3.

hafta

/ 21

.gün

4.ha

fta/2

8.gü

n5.

hafta

/35.

gün

6.ha

fta/4

2.gü

n7.

haf

ta/4

9.gü

n

|8.h

afta

/56.

gün

9.ha

fta/6

3.gü

n10

.haf

ta/7

0.gü

n11

,haf

ta/7

7.gü

n12

.haf

ta/8

4.gü

n13

.haf

ta/9

1 .g

ün

14.h

afta

/98.

gün

15.h

afta

/105

.gün

Kod

No.

26

(ö)

ölüm

(k

) ke

sim

(+)

hafif

enf

eksi

yon

(++)

orta

şid

dette

enf

eksi

yon

(+++

)şid

detli

enf

eksi

yon

3.4.5 I FATDenemeye alınan danalar birinci aşılama sonrasında ELISA ve IFAT testleri yapılarak serolojik yönden incelendiler. 10. haftadan sonra kontrol ve D grubundaki hayvanların hepsi pozitif bulundu.

3.5 Kenelerin tükrük bezinde Theileria nın PCR ilebelirlenmesiPCR sonuçları ikinci aşılama sonrası C grubundaki hayvanların kulaklarından alınan kenelerin T. annulata ile enfekte olmadığını göstermiştir (20 kene/dana). Şekil 16’da bu kenelerden elde edilen DNA örnekleri ile yapılan PCR sonuçları görülmektedir. Kenelerde T. annulata enfeksiyonunu temsil eden Tams 1 (776 bp) geni saptanmamıştır.

l c 1 2 İ 4

776 bp

500 bp

Şekil 16. Kenelerin tükrük bezinde Theileria annulata’y\ betimleyen Tamsl geninin (776bp) durumu

L: DNA marker; C: Kontrol; 1-4: Örnekler

27

4. TARTIŞMA

Theileria annulata’nın neden olduğu tropical theileriosis Türkiye’de sığırlarda yaygın olarak görülen ve ekonomik kayıplara neden olan bir hastalıktır. Zatıflatılmış (attenüe) hücre kültürü ile aşılama hastalıkla mücadelede en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden biridir. Üretimindeki zorluklar nedeniyle aşının geliştirilmesi için çalışmalar yapılmaktadır. Ayrıca hastalığın teşhisinde, taşıyıcı hayvanların belirlenmesinde çeşitli teşhis yöntemleri geliştirilmekte, duyarlı tanı yöntemlerinin sahaya uygulanması çalışmaları yürütülmektedir. Bu amaçla parazitik formların antijenleri İncelenmekte, parazite karşı gelişen immun yanıtın anlaşılması ve kullanılan zayıflatılmış aşının geliştirilmesi için yoğun çalışmalar yapılmaktadır.

Bu raporda anlatılan çalışma halen T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, Pendik Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü tarafından üretilen T. annulata aşı kültürlerinin gama ışınlama ile zayıflatılması amacıyla yürütülmüştür. Bu amaçla attenüasyon için gerekli optimal doz çalışmaları yapılmış, gama ışınlamanın aşının kararlılığı ve virulans kazanma yeteneği üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Ayrıca teşhis açısından ELISA testinin kurulması ve duyarlı hale getirilmesi yönünde çalışmalar yapılmıştır.

Theileriosis’in teşhisi klinik bulgulara (ateş, lenf nodüllerinin şişmesi vb.) ve laboratuvar testlerine (Giemsa boyama, IFAT, ELISA ve PCR) dayanmaktadır. Laboratuvar testlerinin içinde en pratik olanı Giemsa boyama tekniğidir. Bu teknik akut enfeksiyonlarda kan ve lenf yumrusu frotilerinde etkenin tespiti amacıyla kullanılsa da subklinik olgularda teşhis zor olabilmektedir (44). Latent enfeksiyonların teşhisinde kullanılan IFAT ve ELISA serolojik yöntemlerdir. Serolojik testler çapraz reaksiyonlar verebilmekte, yanlış negatif ve pozitif sonuçlara neden olabilmektedir (7,44). Laboratuvarımızda geliştirdiğimiz ELISA yönteminde üretilen antijenler istenilen sonuçları tam verememiştir. Pozitif ve negatif

28

örneklerde en iyi sonuçlar çözülmüş (soluble) şizont antijen ile elde edilmiştir. Bu antijen ile negatif ve kuvvetli pozitif olgularda teşhis kesin olmakla birlikte birlikte hafif pozitif olgularda hassasiyetin düşük olduğu anlaşılmıştır. Manuja ve ark. (45) hayvanların sadece şizont membran antijenlerine cevap verdiklerini bu nedenle ELISA testinde hücresel antijenin daha iyi çalıştığını bildirmişlerdir. OIE el kitabında ELISA testinin her zaman doğru sonuç vermediği ve başka testlerle desteklenmesi gerektiği belirtilmektedir (43). Renneker ve ark (46) tarafından geliştirilen ELISA testinde monoclonal antikor kullanılmasına rağmen hassasiyet % 77 olmuştur. Elde ettiğimiz sonuçlar tüm bu bulgularla benzerlik arzetmektedir. Çok hafif pozitif olgularda yanlış negatif sonuçlar alınabilmektedir. Bu durumda ELISA testine fazlagüvenilemeyeceği, bir başka test ile teşhisin desteklenmesi gerektiği savı doğru olmaktadır. Çalışmamızda ikinci serolojik test olarak IFAT kullanılmıştır.

T. annulata ve T. parva enfeksiyonlarına karşı aşı çalışmaları bu parazitlerin tanımından itibaren başlamıştır. Bugün kullanılan zayıflatılmış şizont hücre kültürü aşısı yıllardır İsrail, İran, Türkiye, Hindistan Kuzey Afrika, Orta Asya ve Çin’de güvenle kullanılmaktadır (32). Tüm bu ülkelerde aynı şekilde üretilen aşının bazı problemleri bulunmaktadır: (i) Etkenin zayıflatılması amacıyla yapılan ve uzun zaman alan, zahmetli hücre kültürü pasajları ve aşı dozunun standardizasyonundaki güçlükler; (ii) Virulansın geri dönme riski; (iii) koruma ve taşımadaki zorluklar. Parazitlerin gama veya X-ışını kullanarak zayıflatılması öncelikle T. parva için denenmiştir. T. parva ile enfekte lenfoid hücreler en yüksek 1200 rad (12 Gy) dozda ışınlanmış, bu dozun parazitlerin çoğalmasına etkili olmadığı belirlenmiştir (47). Srivastava ve Sharma (36,37) 10 kR (kiloroentgen) dozda ışınladıkları T. annulata sporozoit formlarını tekrar hayvanlara vererek ışınlanan sporozoitlerin daha hafif bir enfeksiyon yarattığını ve inkübasyon süresinin uzadığını fakat parazitin morfolojisinde değişiklik olmadığını görmüşlerdir. En başarılı deneme Babesia bovis ile gerçekleşmiş, 350 Gy dozda zayıflatılan B. bovis aşısının yüksek immunite sağladığı, biryıl sonra bile virulans kazanmadığı ve kenelerce nakledilmediği belirtilmiştir (40).

29

Doku kültürü sistemlerinde gama ışınlamanın etkisi karmaşıktır. Kültür sisteminin yanı sıra ışınlama dozu gibi birçok fiziksel faktör bu etkide rol oynar. Işınlama hücrelerin senkronizasyonunu bozmakta, hücre içindeki parazitlerin hücre gelişimine ve davranışına etki etmektedir. Bu etkileri gidermek için besi yerleri belli aralıklarla kontrol edilip değiştirilmekte, böylece hücre yan ürünleri ortamdan atılarak büyüme ortamı yenilenmektedir. Buna rağmen radyasyon dozuyla doğru orantılı olarak hücrelerin ve hücre içi parazitlerin normal gelişimlerini sürdüremediği görülmektedir (47). Bu durum kontrol olarak kullanılan besiyerleri ile karşılaştırıldığında çok belirgin olarak ortaya çıkmaktadır. Çalışmamızda, hücre kültürlerinin 50-300 Gy doz aralığında çeşitli dozlarda ışınlanmasından sonra anlatılan bu aşamaları gözlemlemek mümkün olmuştur. Işınlanan tüm hücre kültürlerinde birinci günün sonunda mitotik indeksin düştüğü belirlenmiş fakat mitosis devam ettiği için ışınlanmış kültürlerle kontrol kültür arasında fazla bir fark oluşmamıştır. 3. günden sonra 150-300 Gy dozda ışınlanan kültürlerde canlı hücre sayısının azaldığı, çoğu hücrenin Trypan blue boyasını aldığı yani öldüğü görülmüştür. 150 Gy dozda ışınlanan kültür 4. günden itibaren mitotik indeks artışı göstermiş fakat canlı hücrelerin sayısı başlangıç sayısına göre azalma göstermiştir. 150 Gy dozun üstündeki ışınlamalarda besi yerinin tazelenmesine rağmen hücrelerin öldüğü, DNA sentezinin normal düzeyine ulaşamadığı görülmüştür. Bu bulguların tümü Irvin ve ark (47) tarafından yapılan çalışma ile benzerlik göstermektedir. Araştırıcılar gama radyasyon dozu arttıkça hücre ölümlerinin doğru orantılı olarak arttığını belirlemişler, ölen hücrelerin 1-3 kez mitoz geçirdikten sonra interfaza geçemediklerini ortaya koymuşlardır. Çalışmamız sonucunda 50 ve 100 Gy dozların etkeni zayıflatmadığı, 200-300 Gy dozların hücre metabolizması üzerinde etkili olduğu, hücrelerin morfolojisinin bozulduğu, duvarlarının yırtılması ile hücrelerin tamamen öldüğü görülmüştür. 150 Gy dozda ise hücrelerin sayıca azaldığı fakat kalan hücrelerin canlı olduğu saptanmıştır. Bu bulgulardan yola çıkılarak hücre kültüründe etkenleri zayıflatan optimum dozun 150 Gy olduğuna karar verilmiştir. Aşı denemelerinde 150 Gy dozda ışınlanan hücre kültürü ile kontrol amaçlı olarak 200 Gy dozda ışınlanan hücre kültürleri kullanılmıştır.

30

Aşı denemelerinde 150 Gy dozda ışınlanan aşının koruyucu özellikte olduğu, aşılanan hayvanların kene stabilatından etkilenmediği gözlenmiştir. Çalışmalar sırasında 150 Gy dozda ışınlanan aşının konvansiyonel attenüe T.annulata aşısı ile aynı klinik sonuçları verdiği kaydedilmiştir. Deneme hayvanlarından belirli aralarla düzenli olarak alınan kan örneklerinde Giemsa sonuçları konvansiyonel aşı ile aynı olmuştur. 200 Gy dozda ışınlanan aşının koruyuculuk açısından etkili olmadığı, parazitleri öldüren bu dozun immunoprofilaktik özellik taşımadığı, hastalığın seyrinde kontrol grubu ile aynı bulguları verdiği görülmüştür. Elde edilen bu sonuçlar yapılan bazı araştırmalarla parallelik arzetmektedir. Samantaray ve ark. (48) 50 ve 100 Gy dozda ışınladıkları sporozoitleri aşı olarak kullanmışlar, 50 Gy dozda ışınlamanın parazitleri etkilemediğini, 100 ve 150 Gy dozlarda parazitlerin dozla doğru orantılı olarak azaldığını, aşı denemelerinde sınama enfeksiyonu sonrası kontrol grubu hayvanların öldüğünü fakat aşılı hayvanların enfeksiyonu hafif geçirdiklerini belirtmişlerdir. Bu araştırıcılar aynı zamanda ışınlama dozu arttıkça parazitin enfektif formlarının zarar gördüğünü, yüksek dozların attenüasyondan ziyade ölüme yol açtığını belirtmişlerdir. Srivastava ve Sharma (36) 60Co kaynağı ile 0.5 ve 10 kR (kiloroentgen) dozlarda ışınladıkları T. annulata ile enfekte lenfositleri hayvanlara verdiklerinde hastalığın hafif seyrettiğini, hayvanların sınama amaçlı uygulanan kene stabilatına direnç gösterdiğini gözlemlemişlerdir. Singh ve ark. (49) kenelerin T. annulata ile enfekte partiküllerini toplayıp 0-9 krad aralığında ışınlamışlar ve aşı olarak kullanmışlardır. 9 krad (90 Gy) dozda ışınlanan partiküllerle aşılanan grupta hayvanlar sınamaenfeksiyonuna karşı klinik bulgu göstermemişler, IFAT antikor testine negatif cevap vermişlerdir.

Theileria annulata’ya karşı recombinant subunit aşı ve tanı amaçlı test geliştirme çalışmalarında kullanılan proteinlerden (30 kDa) biri olan Tamsl parazitin en belirgin merozoit yüzey antijenidir. Tamsl antijeni ile yapılan araştırmalar daha ziyade teşhis amaçlı olmuştur. Tamsl, T. annulata’mn en bilinen immunodominant merozoit yüzey antijenidir (19). Bir polipeptid olan bu antijen Theileria türlerinin hemen hepsinde mevcuttur. Tamsl genini belirleyen primerlertüm T. annulata sekanslarında bulunmaktadır (20). T. annulata Tamsl antijenini kodlayan gen bölgesinin primerleri kullanılarak yapılan

31

saha çalışmaları ile portör hayvanlar tespit edilmiş, tür ayrımı ve polimorfik dizilim çalışmaları yapılmıştır (7,21,22). Çalışmamızda ışınlamanın Tamsl antijeni üzerindeki etkisi PCR testi yapılarak araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar konvansiyonel hücre kültürü aşısı ile ışınlanmış hücre kültürü materyali arasında Tamsl geni açısından bir farklılık olmadığını göstermiştir. Sekans sonuçları nükleotid dizinlerinde bir fark görülmediğini ortaya koymuştur. Elde edilen sekans dizilimleri PubMed BLAST filogenetik ağaç üzerinde konumlandırılmıştır. İkinci aşılama sonrası deneme danalarının kulaklarına yerleştirilen kenelerin tükrük bezlerinde etkenin tespiti yine Tamsl geni yardımıyla gerçekleştirilmiştir. İkinci kez 150 Gy aşı ile immunize edilen hayvanlara kene uygulaması yapılmış, kenelerin tükrük bezinden elde edilen DNA örneklerinde T. annulata’y\ temsil eden 776 bp’lik Tamsl geni görülmemiştir.

32

5. SONUÇ ve ÖNERİLER

İstanbul, Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü tarafından Theileria annulata Ankara suşu kullanılarak üretilen ve koruyucu bağışıklık verme özelliği yüksek olan zayıflatılmış canlı aşı 1982 yılından beri ülkemizde başarıyla uygulanmaktadır. Kullanılan aşının üretimi sırasında uzun süren, zahmetli ve pahalı hücre kültürü pasaj işlemleri kullanılmaktadır. Ayrıca, aşılanan sığırlardan kan yoluyla alınan zayıflatılmış etken kenelerde tekrar hastalık yapma yeteneği kazanabilmektedir. Bu durum hastalığın tekrarlanmasına neden olmakta, koruyucu bağışıklığın sağlanmasını ve hastalığın eradikasyonunu engellemektedir.

Son yıllarda yapılan çalışmalar gama radyasyonun canlı aşının zayıflatılması işleminde başarıyla kullanılabileceğini göstermiştir. Gama ışınlama ile zayıflatılan organizmaların metabolik olarak aktif oldukları halde enfektif olmadıkları ve aşı olarak kullanıldıklarında hücresel ve bağışıklık mekanizmalarını aktive ettikleri ortaya konmuştur.

Theileria annulata aşı kültürlerinin gama ışınlama ile zayıflatılması amacıyla yürütülen bu çalışmada attenüasyon için gerekli optimal doz çalışmaları yapılmış, bir dizi analiz ve hayvan denemeleriyle gama ışınlamanın aşının kararlılığı ve virulans kazanma yeteneği üzerindeki etkileri araştırılmıştır.

Sonuç olarak 150 Gy dozda ışınlanan hücre kültüründe attenüasyonun sağlandığı, Theileria annulata virulansının düştüğü ve aşı olarak kullanılabileceği anlaşılmıştır. Zayıflayan hücrelerde daha sonra geriye dönüp canlanma veya giderek ölüm tespit edilmemiştir.

Gama ışınlama ile zayıflatılan aşının hücre kültürü işlemlerindeki zaman ve emek kaybını önleyeceği, aynı zamanda ekonomik katkı sağlayacağı kesindir.

33

6. KAYNAKLAR

1) Altay K. ve Aktaş M. Sığır theileriosisi. F.Ü. Sağlık Bilimleri Dergisi 18(2):79-86, 2004.

2) World Organisation for Animal Health (OIE)- Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals, Chapter 2.4.16.-Theileriosis, 2009.http://www.oie.int/fileadmin/Home/enq/Health standards/tahm/ 2.04.16 THEILIERIOSIS.pdf

3) Shaw MK. Cell invasion by Theileria sporozoites, TRENDS in Parasitology, 19(1): 2-6, 2003.

4) Shkap V, de Vos AJ, Zweygarth E and Jongejan F. Attenuated vaccines for tropical theileriosis, babesiosis and hearthwater: the continuing necessity. TRENDS in Parasitol, 23(9): 420-426, 2007.

5) Shaw MK. The same but different: The sporozoite entry into bovine cells. Int J Parasitol, 27(5): 457-474, 1997.

6) Urquhart GM, Armour J, Duncan JL, Dunn AM and Jennings FW. Veterinary Parasitology, Longman Scientific and Technical, 1987.

7) Vatansever Z, Nalbantoğlu S. Detection of cattle infected with Theileria annulata in fields by nested PCR, IFAT and microscopic examination of blood smears. Turk J Vet Anim Sci, 26; 1465-1469, 2002.

8) Tüzer E. İstanbul ili ve çevresinde sığırlarda görülen Babesia, Theileria ve Anaplasma türleri ve bunlardan oluşan enfeksiyonların yayılışı üzerinde araştırma. İÜ Vet Fak Derg, 8(1): 97-110, 1982.

9) Karagenç T ve Bilgiç HB. Tropikal theileriosis. Türkiye Klinikleri J Vet Sci, 3(2):35-44, 2012.

10) Sayın F, DinçerS, KaraerZ, Çakmak A, İnci A, Yukarı BA, Eren H, Vatansever Z ve Nalbantoğlu S. Studies on the epidemiology of tropical theileriosis (Theileria annulata Infection) in cattle in Central Anatolia, Turkey. Trop Anim Health Prod, 35: 521-539, 2003.

34

11) The Merck Veterinary Manual “ Theileriases”, 10th edition, Merck and Co.Inc, USA, 2010.

12) Dumanlı N, Özer E. Elazığ yöresinde sığırlarda görülen kan parazitleri ve yayılışları üzerinde araştırmalar. S Ü Vet Fak Derg, 3(1): 159-166, 1987

13) Aktaş M, Sevgili M, Dumanlı N, Karaer Z, Çakmak A. Elazığ, Malatya ve Tunceli İllerinde tropikal theileriosisin seroprevalansı. Turk J Vet. Anim Sci, 25:359-363, 2001.

14) Eren H, Çakmak A, Yukarı BA. Türkiye'nin farklı coğrafik bölgelerinde Theileria annulata'mn seroprevalansı. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 42: 57-60, 1995.

15) Vatansever Z, İça A, Deniz A, Nalbantoğlu S, Karaer Z, Çakmak A ve Sparagano O. Ankara Yöresinde kene kaynaklı protozoon enfeksiyonlarının reverse line blotting (RLB) ve indrekt floresan antikor testi (IFAT) ile saptanması. XIII. Ulusal Parazitoloji Kongresi, Konya. 194, 2003.

16) Aktaş M, Dumanlı N, Çetinkaya B, Çakmak A. Field evaluation of PCR in detecting Theileria annulata infection in cattle in the east of Turkey. Vet Rec, 150:548-549, 2002.

17) Aktaş M, Altay K ve Dumanlı N. A molecular survey of bovine Theileria parasites among apparently healthy cattle and with a note on the distribution of ticks in eastern Turkey. Vet Parasitol, 138: 179-185, 2006.

18) Altay K, Aydın MF, Ulu ışık U, Aktaş M ve Dumanlı N. Theileria annulata ve Theileria buffeli’rim teşhisinde multiplex PCR’in kullanılması. Türkiye Parazitoloji Derg, 32(1): 1 -3, 2008.

19) Shiels B, D’Oliveira C, McKellarS, Ben-Miled L, Kawazu S and Hide G. Selection of diversity at putative glycosylation sites in the immunodominant merozoite}piroplasm surface antigen of Theileria parasites. Mol Biochem Parasito, 71: 149-162, 1995.

20) Katzer F, McKellar S, Kırvar E and Shiels B. Phylogenetic analysis of Theileria and Babesia equi in relation to the establishment of parasite populations within novel host species and the development of diagnostic tests. Mol Biochem Parasitol, 95: 33-44, 1998.

21) Altay K, Aydın MF, Dumanlı N ve Aktaş M. Molecular detection of Theileria and Babesia infections in cattle. Vet Parasitol, 158:295-301, 2008

35

22) Kırvar E, İlhan T, Katzer F,Hoosmand-Rads P, Zweygarth E, Gerstenberg C, Phipps P and Brown CGD. Detection of Theileria annulata in cattle and vector ticks by PCR using the Tamsl gene sequences. Parasitology 120:245-254, 2000.

23) İça A, Vatansever Z, Yıldırım A, Düzlü Ö ve İnci A. Detection of Theileria and Babesia species in ticks collected from cattle. Vet Parasitol, 148:156-160, 2007.

24) Aktaş M, Dumanlı N ve Angın M. Cattle infestation by Hyalomma ticks and prevalence of Theileria in Hyalomma species in the east of Turkey. Vet Parasitol, 119:1-8, 2004.

25) Dumanlı N, Aktaş M, Çetinkaya B, Çakmak A, Köroğlu E, Saki CE, Erdoğmuş Z, Nalbantoğlu S, Öngör H, Şimşek S, Karahan M ve Altay K. Prevalence and distribution of tropical theileriosis in eastern Turkey. Vet Parasitol, 127:9-15, 2005.

26) İnci A, İça A, Yıldırım A. Vatansever Z, Çakmak A, Albasan H, Çam Y, Atasever ve Düzlü Ö. Epidemiology of Tropical Theileriosis in the Cappadocia Region. Turk J Vet Anim Sci, 32(1): 57-64, 2008.

27) Çiçek H, Çiçek H, Eser M ve Tandoğan M. Current status of ruminant theileriosis and its economical impact in Turkey. Türkiye Parazitoloji Derg, 33(4):273-279, 2009.

28) İnci A, İça A, Yıldırım A, Vatansever Z, Çakmak A, Albasan H, Çam Y, Atasever A, Sarıözkan S, Düzlü O. Economical impact of tropical theileriosis in the Cappadocia region of Turkey. Parasitol Res, 101: 171-174, 2007

29) Dargouth MA, Bouattour A, Ben Miled L and Kilani M. Epidemiology and economic impact of tropical theileriosis in Tunisia: Importance and the definition of a strategy of vaccination. Trop Anim Hlth Prod, 29, 50S, 1997.

30) Boulter N and Hall R. Immunity and vaccine development in the bovine theileriosis. Adv Parasitol. 44: 41-97, 1999.

31) Ahmed JS and Melhorn H. Review: The cellular basis of the immunity to and immunopathogenesis of tropical theileriosis. Parasitol Res, 85: 539-549, 1999.

32) Pipano E and Shkap V. Vaccination against tropical theileriosis. Ann N Y Acad Sci, 916:484-500, 2000.

33) Conze G, Campbell JDM, Nichani AK, Glass EJ, Spooner RL and Ahmed JS. Evidence for strain specificity in cytotoxic T- lymphocyte-mediated, major histocompatibility complex class I-

36

dependent killing of Theileria annulata-infected cells. Parasitol Res, 84: 593-595,1998

34) Özkoç M and Pipano E. Trials with cell culture vaccine against theileriosis in Turkey. Advances in the Control of Theileriosis, Current Topics in Veterinary Medicine and Animal Science, 14: 256-258, 1981

35) Onar E. Investigations on preparation and application of vaccine against tropical theileriosis (Theileria annulata) in Turkey. In: International Symposium on Mycoplasmosis and Theileriosis. Pendik Animal Diseases Central Research Institute, Pendik Turkey, pp. 47-52, 1989.

36) Srivastava PS and Sharma NN. Studies on the potential of immunoprophylaxis using Theileria annulata attenuated by cobalt-60 irradiation in bovine lymphocytes. Vet Parasitol, 3: 23- SI, 1977a.

37) Srivastava PS and Sharma NN. Potential of immunoprophylaxis using cobalt-60 irradiated Theileria annulata in salivary gland suspensions of the tick Hyalomma anatolicum. Vet Parasitol, 3: 183-188, 1977b.

38) IAEA -The Animal Production and Health Section- Irradiated Vaccines and the Control of Animal Diseases, 2009 http://www-naweb.iaea.org/nafa/aph/stories/2009-control- animal-diseases.html

39) IAEA -The Animal Production and Health Section- The Use of Irradiated Vaccines in the Control of Infectious Transboundary Diseases of Livestock (D3.20.29), 2010 http://www-naweb.iaea.org/nafa/aph/crp/aph-transboundary- diseases.html

40) Wright IG, Goodger BV, Schunther CA, Waltisbuhl DJ and Düzgün A. Nuclear techniques in the study and control of parasitic diseases of livestock, IAEA Panel Proceedings Series, pp: 157-172, 1988.

41) Manuja A, Nichani AK, Kumar R, Rakha NK, Kumar B. and Sharma RD. Comparison of schizont, soluble schizont and soluble piroplasm antigens in ELISA for detecting antibodies against Theileria annulata. Vet Parasitol, 87: 93-101, 2000.

42) Kachani M, Spooner RL, Rae, P, Bell-Sakyi L. and Brown CG. Stage-specific responses following infection with Theileria annulata as evaluated using ELISA. Parasitol Res, 78(1): 43­47, 1992.

37

43) World Organisation for Animal Health (OIE)- Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. Chapter 2.3.11 .- Theileriosis, p.435, 2000.

44) Deniz A, Öncel T, İçen H ve Şimşek A. Diyarbakır Yöresinde Sığırlarda Theileria annulata ve T. buffeli’rim Multiplex PCR ile Saptanması. Kafkas Üniv Vet Fak Derg, 18(Suppl-A): A111- A1114, 2012.

45) Manuja A, Rakha NK, Kumar R, Nichani AK, Sharma RD, Gupta SK and Suri D. A fixed cell ELISA for detecting antibodies against Theileria annulata. J Immunol Immunopathol, 1: 41-48, 1999.

46) Renneker S, Kullmann B, Gerber S, Dobschanski J, Bakheit MA, Geysen D, Shiels B, Tait A, Ahmed JS and Seitzer U. Development of a competitive ELISA for detection of Theileria annulata infection. Transboundary and Emerging Diseases. 55: 249-256, 2008.

47) Irwin AD, Brown CGD and Stagg DA. Theileria parva: Effects of irradiation on a culture of parasitized bovine lymphoid cells. Exp Parasitol, 38: 64-74, 1975.

48) Samantaray SN, Bhattacharyulu Y and Gill BS. Immunisation of calves againstbovine tropical theileriosis (Theileria annulata) with graded doses of sporozoites and irradiated sporozoites. Int J Parasitol, 10(5-6):355-35, 1980.

49) Singh DK, Jagadish S and Gautam OP. Immunization against bovine tropical theileriosis, using 60Co-irradiated infective particles of Theileria annulata (Dschunkowsky and Luhs 1904) derived from ticks. Am J Vet Res, 40(6): 767-769, 1979.

38

YAYIN BİLGİ FORMU

Rapor Bilgileri 1. Yayın Yılı/No2017/1

2. Rapor BaşlığıGAMA IŞINLAMANIN TH E İLE R İA A N N U L A T A KÜLTÎVASYONU ÜZERİNE ETKİLERİ

3. Yayın KuruluTarih(Gün/Ay/Yıl)-No16.12.2016/2-2

4. YazarlarDoç. Dr. Zışan EMRE, Dr. Alı DÜZGÜN, Yusuf VATANSEVER, Dr. Alı SÖĞÜT, Dr, Gülay ALTAY ÇAPIN, Doç. Dr, B. Metin ALABAY, Dr, Harun ÇERÇİ

5. Yayın TipiTeknik Rapor

6. Çalışmayı Yapan BirimlerTAEK, SANAEM, Nükleer Teknikler Bölümü, Hayvancılık Birimi7. Destekleyen veya Ortak Çalışılan KuruluşlarT.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı, İstanbul Pendik Veteriner Kontrol Enstitüsü, T he ile ria ann u la ta Referans Teşhis Laboratuvarı_______________________________________________________________________8. ÖzetTropikal theileriosis'in de içinde bulunduğu kene-kaynaklı hastalıklar hayvan yetiştiriciliğinde sorun teşkil etmekte ve önemli ekonomik etki yaratmaktadır. The ile ria a n n u la ta 'mn neden olduğu tropikal theileriosis önemli bir sağlık ve işletme sorunu olarak sadece Türkiye'de değil Kuzey Afrika, Güney Avrupa ve Asya'da da büyük önem taşımaktadır. Theileriosis'den kaynaklanan kayıpların kontrolünde halen üç yöntem kullanılmaktadır: Kenelerin kimyasal ilaçlarla kontrolü, hastalanan hayvanların ilaçlarla tedavisi ve aşılama. Akarisidlere direnç kazanan keneler nedeniyle kimyasal ilaç kullanımı kısıtlı kalmakta, ayrıca süt, et ve çevrede bıraktıkları kalıntılar nedeniyle halk sağlığını tehdit etmektedir. İlaçlarla tedavi etkili görünmekle birlikte birçok olumsuzluğu da birlikte getirmektedir. Kemoterapötikler hayvanlarda ilk enfeksiyona engel olsa bile ikinci bir enfeksiyona karşı koruyuculuk sağlamamaktadır. Bu durum sık ilaç kullanımını gerektirmektedir, ilaçların sık kullanılması kenelerde ilaca karşı genetik direnç geliştirmekte ve ilacın etkisiz olmasına yol açmaktadır.

Tropikal theileriosis'e karşı geliştirilen zayıflatılmış hücre-kültürü aşısı tüm sığır ırklarında güvenle kullanılmaktadır. Yine de keneler tarafından bulaştırılan etkenlere karşı kanda piroplasmlar görülebilmekte, immunizasyon ile hastalığın eradikasyonu mümkün olamamaktadır. Sadece lenfositlerdeki şizontların zayıflatılması yoluyla hastalığın virulansının geri dönmesi engellenebilmektedir. T .annu la ta şizontlarının kültür yoluyla zayıflatılması uzun süren pasajları gerektirmektedir. Son yıllarda yeni moleküler biyolojik yöntemler ve bağışıklık sistemi hücrelerinin kullanılmasıyla bazı viral ve bakteriyel aşıların geliştirilmesi mümkün olmuştur. Paraziter aşılarda rekombinant teknikler çok etkili olmamış, geliştirilen aşılar ya zayıf kalmış ya da bağışıklık sağlayamamıştır. Alternatif teknik olarak gama ışınlama ile zayıflatılan organizmaların metabolik olarak aktif kalsalar bile enfeksiyon yaratmadıkları, ayrıca konakçıya verildiklerinde hücresel ve bağışıklık mekanizmalarının aktif hale gelebildiği ortaya konmuştur.

Bu çalışmada şizontların tam olarak zayıflatılması için gerekli ışınlama dozunun saptanması amacıyla çeşitli denemeler yapılmış, ışınlanmış şizontların metabolik aktivitesi incelenmiş, ışınlanan aşı deney hayvanlarında test edilmiştir. Şizont evresinin zayıflatılması amacıyla sığır lenfositleri 60Co kaynağında 0, 50, 100, 150, 200, 250 ve 300 Gy dozlarda ışınlanmıştır. Denemeler sonucunda parazitlerin metabolik aktivitesi üzerinde en etkili dozun 150 Gy olduğu belirlenmiştir. 150 ve 200 Gy dozda ışınlanan aşılar hayvanlar üzerinde denenmiş, 150 Gy dozda ışınlanan aşı ile immunize edilen hayvanların aynı kene suşu ile yapılan sınama testine direnç gösterdikleri görülmüştür. Bir yıl sonra 150 Gy dozdaki aşı ile aynı hayvanlara ikinci aşılama yapılmıştır. Aşılamayı izleyerek gerçekleştirilen kene uygulaması kanda etkenin bulunmadığını göstermiştir. Kenelerin enfeksiyon almadıkları ayrıca PCR testiyle de belirlenmiştir.

Sonuç olarak, gama ışınlama ile zayıflatılmış T. ann u la ta şizontlarının laboratuvar koşullarında sığırlarda bağışıklık oluşturduğu saptanmıştır. T. ann u la ta hücre kültürü aşısının geliştirilmesi amacıyla şizontların zayıflatılmasında gama ışınlamanın yararlı olduğu kanıtlanmıştır.

9. Anahtar KelimelerT he ile ria annu la ta , tropikal theileriosis, aşı, in-vitro hücre kültürü

10. Gizlilik DerecesiTasnif Dışı_________

GİZLİLİK DERECELERİ

TASNİF DIŞI (U N C L A S S IF IE D ): İçerdiği konu itibarıyla, gizlilik dereceli bilgi taşımayan, ancak devlet hizmetiyle ilgili bilgileri içeren evrak, belge ve mesajlara verilen en düşük gizlilik derecesidir.HİZMETE ÖZEL (R E S T R IC T E D ): İçerdiği konu itibarıyla, gizlilik dereceli konular dışında olan, ancak güvenlik işlemine ihtiyaç gösteren ve devlet hizmetine özel bilgileri içeren evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir.ÖZEL (C O N F ID E N T IA L ): İçerdiği konu itibarıyla, izinsiz olarak açıklandığı takdirde, milli menfaatleri olumsuz yönde etkileyecek evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir.GİZLİ (S E C R E T ): İzinsiz açıklandığı takdirde, milli güvenliği, milli prestij ve menfaatleri ciddi ve önemli bir şekilde zedeleyecek olan evrak, belge ve mesajlara verilen gizlilik derecesidir.

TÜRKİYE ATOM ENERJİSİ KURUMU