genų inžinerija (pildoma)
TRANSCRIPT
Genų inžinerija
Pagrindinės kryptys
Rekombinantinės DNR technologija;
Transgeniniai augalai ir gyvūnai; Kamieninių ląstelių tyrimai;
Pagrindiniai rekombinantinės DNR technologijos etapai
1. Reikiamo geno išskyrimas2. Įterpimas į tikslinę ląstelę
panaudojant vektorių3. Padauginti ląstelių, kiek įmanoma4. Atskirti ir išgryninti gautą produktą
(baltymą)
1 etapas. Geno išskyrimas
1 etapas. Alternatyvus metodas (naudojant atvirkštinę transkriptazę)
Atvirkštinė transkriptazė; Pagal iRNR sintezuoja viengrandę
DNR; Komplementarioji grandis gaunama
panaudojant DNR polimerazę; Šis būdas turi privalumų, nes
normalioje ląstelėje iRNR yra daug daugiau, nei DNR.
II etapas. Geno įterpimas į vektorių
Vektorius – DNR molekulė, kuri panaudojama tam, kad įneštų svetimą geną į tikslinę ląstelę
III etapas. Vektoriaus įterpimas į ląstelę
See worksheet
Replica plating
IV etapas. Ląstelių dauginimasis
Visos gaunamos genetiškai vienodos, nes dauginasi nelytiniu būdu
Transgenai
Transgenezė - procesas, kurio metu svetimi genai ar egzogeninė DNR įterpiami į gyvūno genomą
Transgeninis gyvūnasDNA introduced
•Mice•Cows•Fish•Birds•Sheep•Goats
Kam reikalinga transgenezė?
•Naminių gyvūnų savybėms pagerinti;•Sukurti gyvūnų modelius žmonių ligų tyrimams;•Naudojant naminius gyvūnus juose gaminti žmonėms skirtus vaistinius preparatus (piene);•Gyvūnų genų reguliacijai ar gyvūnų vystymuisi tirti
Retroviral Vectors Microinjection Embryonic stem cells
Kaip įterpiami transgenai?
Mikroinjekcija
A. Remove eggsB. Fertilize in vitroC. DNA is microinjected into male pronucleus (prior to nuclear fusion)
100-1000 copies of gene
D. Implant eggs into surrogate
Fig 22.13 The production of transgenic animals by microinjection of DNA into
fertilized eggs.© 2003 John Wiley and Sons Publishers
Retrovirusiniai vektoriai
Infect early stage embryo with replication-defective retrovirus
Limitationsonly small DNA insertsno regulatory sequencessafety
Engineered Embryonic Stem Cells
FIGURE 19.4
• Remove pluripotent ES cells from blastocyst• Transfect ES• [Site specific Integration - advantage]• Selection• Microinject back into blastocyst• Implant
Transgeninių linijų kūrimas
1. Determine whether the progeny are TRANSGENICpiece of tail, PCR, Southern Blot
2. Mate this transgenic animal to determine whether the transgene is in GERM line
3. Breed to get homogenous transgenic line
Integration of DNAG0 generation -Mosiacs(G1 progeny)
all cells contain transgene
Cloning by Nuclear Transfer
Quiescent [G0] cells Plus EGG
First 3 cell division of Fertilized Egg•no gene expression•embryo-initiating protein factors in
cytoplasm bind to embryonic development genes
When G0 nucleus is transferred•cell specific regulatory proteins are stripped•EIPF bind to EDG
Pelės gamina žmogaus antikūnūs
Transgeniniai galvijai
Pritaikymas•Increasing casein content of milk increase cheese production•Lactose free milk (transgene lactase)•Resistance to bacterial infections•In vivo immunization
•transgene is specific Heavy and Light chain genes which•create mAn against a specific antigen
Kodėl žmogui reikalingi baltymai gaminami piene?
Easy to purify - few other proteins in milkDoesn’t harm transgenic animal- no change to physiology
rProtein is authentically modified post-translationally
Large quantities
Renewable source
Mammary Gland-specific Promoterspromoter and transcription termination sequences are present
Avys ir kiaulės
PIGSPST porcine somatotropin (growth hormone)
adverse effects- kidney, stomach, heart, sterility
human Hemoglobin to replace whole blood transfusions
SHEEPIncrease wool production
keratin promotergrowth factor
Organų persodinimas
Pr
Problema: atmetimasAntibodies from Host bind to Donor OrganElicits Inflammatory ResponseTransplanted Organ Lost
Solution:Transgene in Donor for Complement-
Inhibiting Protein
Paukščiai ir žuvys
Birdstraditional methods can not be used because of avian embryogenesis differences no ES cells found
ALV resistant chickenstransgene - defective ALV genome
makes viral RNA and protein, but blocks assembly of wt viral particlesFish
aquaculturetransgene - growth hormone