Géntár klónok azonosítása a szőlő Rcg1 Agrobacterium

rezisztencia lókusz közelében

DIPLOMAMUNKA

Készítette: ERDŐ-BONYÁR SZABINA

Biológus MSc hallgató

Témavezetők: Dr. PUTNOKY PÉTER, Dr. KUCZMOG ANETT

PTE TTK Biológia Intézet

Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék

PÉCS, 2018.

TARTALOMJEGYZÉK

1. BEVEZETÉS ................................................................................................................................ 3

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS ........................................................................................................ 4

2.1. Az agrobaktériumok, mint növényi kórokozók .................................................................. 4

2.2 Az agrobaktérium fertőzés folyamata .................................................................................. 4

2.3. Szőlő agrobaktériumos megbetegedése ............................................................................... 6

2.4. Az Rcg1 Agrobacterium rezisztenciagén térképezése ........................................................ 7

2.5. Géntárak, vektorok ............................................................................................................. 10

2.6. CopyRight v2.0 vektor ........................................................................................................ 11

3. A MUNKA ELŐZMÉNYEI ...................................................................................................... 13

4. CÉLKITŰZÉSEK ...................................................................................................................... 14

5. ANYAGOK ÉS MÓDSZER ...................................................................................................... 15

5.1. A géntár elkészítése és tárolása .......................................................................................... 15

5.2. A géntár klónok azonosítása specifikus primerekkel ....................................................... 15

5.3. PCR....................................................................................................................................... 16

5.4. Agaróz gélelektroforézis ..................................................................................................... 17

5.5. Plazmid DNS izolálás .......................................................................................................... 17

5.6. DNS szekvencia meghatározás ........................................................................................... 18

5.7. DNS szekvencia elemzés ...................................................................................................... 18

6. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK ................................................................................. 20

6.1. A géntár klónok eltevése és tárolása .................................................................................. 20

6.2. A géntár klónok azonosítása specifikus primerekkel ....................................................... 21

6.3. A cos4820 géntár klón szekvenciájának elemzése ............................................................ 23

6.4. A cos4831 géntár klón szekvenciájának elemzése ............................................................ 24

7. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................................... 26

8. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................................................ 27

9. INTERNETES HIVATKOZÁSOK .......................................................................................... 30

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................................. 31

11. FÜGGELÉK ............................................................................................................................. 32

11.1. Függelék: A WAX2-5 jelű gén (LOC100854413) exonjainak szekvenciái ........................ 32

11.2. Függelék: A WAX4AMU2 gén és a cos4831 páros illesztése. ............................................ 33

3

1. BEVEZETÉS

A környezet, amelyben élünk mikroorganizmusokban gazdag, melyekkel az

élőlények sokrétű kölcsönhatásban állhatnak. A mikrobák egy része kórokozó hatású,

fertőzést, betegséget okozhat, melyeket patogéneknek nevezünk, ide tartoznak a

baktériumok, gombák, vírusok. Szinte az összes gazdaságilag fontos növényünk jelentős

kórokozó körrel rendelkezik, melyek jelenléte súlyos gazdasági károkhoz vezethetnek,

azonban a védekezés ellenük gyakran nehézkes. A kórokozók jelentős terméscsökkentő és

minőségrontó hatásának felismerésével a betegség ellenállóság kialakítása egyre

fokozottabb elvárás lett.

Kezdetben a növénynemesítés során egyszerű keresztezésekkel próbálkoztak,

azonban ez hosszadalmas és alacsony hatékonyságú folyamat, ráadásul sok esetben a kívánt

tulajdonság mellett számos kedvezőtlen tulajdonság jelenlétével is számolni kellett. Később

a tudomány fejlődésének köszönhetően egyre nagyobb teret nyertek a különböző

biotechnológiai módszerek alkalmazása, melyek segítségével specifikusabban lehet a

növények ellenállóságát fokozni. Nagy áttörést a különböző genetikai térképek elkészítése

és a genomszekvenálás fejlődése hozott, mellyel számos élőlény genomja ismertté és ezáltal

vizsgálható vált. A genomok ismerete utat nyitott annak kutatására, hogy mi állhat a

rezisztenciák hátterében. Számos esetben megfigyelték, hogy a rezisztenciát különböző

rezisztenciagének jelenléte okozza, melyek eltérő és gyakran eddig ismeretlen módon

felelősek a rezisztenciáért. A rezisztencia gének genetikai térképezésén alapuló klónozása

(map based cloning) egy új lehetőséget nyújthat az ellenálló növények körének szélesítésére

azáltal, hogy az izolált rezisztencia gének bizonyos fajokba sikeresen bevihetők és

kifejezhetők, és így e fajok ellenállósága is fokozható az adott betegségekkel szemben.

Munkánk célja egy Agrobacterium rezisztenciáért felelős Vitis amurensis gén

azonosítása és izolálása, mely később lehetővé tenné több ellenálló szőlőfajta és esetleg más

gazdasági növény létrehozását.

4

2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

2.1. Az agrobaktériumok, mint növényi kórokozók

Smith és Towsend bizonyította be először 1907-ben, hogy a golyvásodás hátterében

bakteriális fertőzés áll. Végül 1942-ben kapta meg a patogén a ma is használatos nevét

[Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend)Conn] (Allen and Holding, 1974).

A Rhizobiaceae családba tartozó agrobaktériumok talajlakó, Gram-negatív

mikroorganizmusok, többségük szaprofitaként korhadó szerves anyagokon él, azonban

találhatóak köztük olyan fajok, melyek a növények daganatos megbetegedését okozzák

(Escobar and Dandekar, 2003). Kezdetben az általuk okozott megbetegedés alapján

különítették el az Agrobacterium fajokat, mint a szőrősgyökerűséget (hairy root) okozó

Agrobacterium rhizogenes, a málna szárán golyvásodást (cane gall) okozó Agrobacterium

rubi, a gyökérgolyvát (crown gall) indukáló Agrobacterium tumefaciens és a szőlő

koronagubacsos megbetegedését okozó Agrobacterium vitis. Az Agrobacterium radiobacter

fajok nem patogén mikroorganizmusok (Allen and Holding, 1974). Később az

Agrobacterium fajokat biokémiai és fiziológiai sajátságaik alapján három biotípusba

sorolták, melyek közül a szőlőt a 3. biotípus károsítja (Süle, 1978).

Az agrobaktériumok rendkívül széles gazdakörrel rendelkeznek, az általuk okozott

tumoros megbetegedések a nyitvatermők és a kétszikűek akár 60%-át is érinthetik (Decleene

and Deley, 1976). Egyedülállóan képesek a növényekkel géntranszfert megvalósítani, azaz

genetikailag kolonizálva a növényt agrobaktérium géneket juttatnak át és fejeztetnek ki a

növényben, amik kontrollálatlan sejtnövekedést és csak a kolonizáló baktériumok által

metabolizálható speciális tápanyagok szintézisét okozzák (Schell et al., 1979). A

tumorképzéshez szükséges genetikai információ a nagyméretű (180-260 kb) tumor indukáló

(Ti) plazmidon kódolt. A plazmidon két régió kulcsfontosságú a fertőzési folyamatban, a vir

régió és a T-DNS. A virulencia gének felelősek a T-DNS-nek a baktériumból a növényi

sejtekbe történő átjutásáért (Zaenen et al., 1974).

2.2 Az agrobaktérium fertőzés folyamata

Valamilyen sebzés hatására a növényből különböző fenolos vegyületek (pl.

acetosyringon) szabadulnak fel, melyet az Agrobacterium faj érzékelve hozzátapad a

5

növényhez, majd a vir génjei aktiválódása során előkészítik a T-DNS-t a transzferhez és a

növényi genomba történő integrációhoz (Pu and Goodman, 1993). A Ti-plazmidon kódolódó

VirA fehérje detektálja a növényi szignált, autofoszforiláció során aktiválódik és ezáltal

képes lesz foszforilálni a VirG fehérjét, ami a többi virulencia gén aktiválódásához vezet

(Burr et al., 1998). Az így termelődő VirD1 és VirD2 fehérjék közreműködésével a Ti-

plazmidról egyszálú 21-23 kb hosszúságú DNS-fragment (T-DNS) keletkezik, mely két

rövid, 25 bázispár hosszúságú ismétlődő szekvencia által behatárolt. A VirD2 fehérje a T-

szál 5’-végéhez köt, majd a T-szál/Vir fehérje komplex a VirB és VirD4 fehérjék által

alkotott IV-es típusú szekréciós apparátuson keresztül a növényi sejt citoplazmájába jut

(Gelwin, 2003). A T-komplexen lévő nukleáris lokalizációs szignál segíti a sejtmagba jutást,

ahol nem-homológ rekombinációval a növényi sejtmagi genomba integrálódik (Koncz et al.,

1994). A genetikai transzformáció sematikus ábrázolása az 1. ábrán látható.

1. ábra: Az agrobaktérium általi genetikai transzformáció sematikus folyamata (Tzfira

and Citovsky, 2006). A folyamat részletes leírása a szövegben található.

6

A T-DNS-en két fontos géncsoport különíthető el: az opin szintézisért felelős gének

és az onkogének. A T-DNS növényi tumor indukálásért felelős onkogénjei megváltoztatják

a fitohormonok szintézisét és a fertőzött sejtek érzékenységét, így eredményezve a tumor

megjelenését. Az auxin szintézéséhez az iaaM és iaaH gének, a citokinin szinézishez az ipt

gén szükséges (Binns and Costantino, 1998).

A másik géncsoport olyan speciális anyagok termeltetésére kényszeríti a transzformált

növényi sejteket, melyek csak a fertőző Agrobacterium faj számára hasznosítható, így

teremtve számára saját ökológia niche-t. Ezek a speciális kisméretű molekulák az opinok,

melyek aminosav és cukor vagy szerves sav összekapcsolódásával alakulnak ki. A Ti-

plazmidon helyezkednek el azok a gének, melyek az opinok felvételét és katabolizmusát

segítik. Több, mint 20 fajta opin azonosítható, azonban egy törzs csak kevés félét képes

termelni, a termelt opin alapján kategorizálhatóak is a törzsek: oktopin, nopalin és agropin-

típusúak (Dessaux et al., 1993; Escobar and Dandekar, 2003).

2.3. Szőlő agrobaktériumos megbetegedése

A szőlő agrobaktériumos golyvásodásáért elsősorban az Agrobacterium vitis,

ritkábban az Agrobacterium tumefaciens felelős (Szegedi, 2007). Szőlőn a tünetek főleg a

fás részeken figyelhetőek meg, de a gyökereken is előfordulhatnak (2. ábra), azonban a fiatal

zöld hajtásokon sosem jelennek meg, mivel valószínűleg a fiatal hajtásokban még nincs jelen

a patogén (Szegedi and Németh, 1996). A tumorok mindig a még osztódásra képes kambiális

sejtekből alakul ki, melyek így nem tudják ellátni normál funkciójukat, azaz nem hoznak

létre új háncs és fa elemeket, melyek következtében a növény tápanyagszállítása zavart

szenved. Ezáltal a fertőzött tőkék a tumor kiterjedésétől függően legyengülnek vagy

elpusztulnak. Emiatt a szőlőtermesztésben világszerte nagy károkat okoz a járványos

megbetegedés (Szegedi, 2007).

7

2. ábra: A szőlő agrobaktérium által okozott golyvásodása (fotó: Szegedi Ernő).

A szőlőben a betegség lefolyását két szakaszra tudjuk elkülöníteni. Az első (látens)

szakasz tünetmentes, ekkor történik a baktériumok felszaporodása a növényben. Majd

valamilyen sérülés, például fagyhatás hatására megindul a tumorképződés (Szegedi, 2007).

Mivel jelenleg nincs megfelelő hatékonyságú védekezési mód a tumor képződés ellen,

a legjobb megoldást az új, rezisztens fajták előállítása jelentené (Szegedi et al., 1984). Az

1960-as évek közepén tesztelték, hogy agrobaktériummal történő fertőzés során néhány Vitis

fajon, például a V. labrusca és a V. amurensis nem képződtek tumorok (Tamm, 1954), és a

rezisztencia számos hibridjükön is megfigyelhető volt. A Vitis vinifera alapvetően fogékony

a betegségre, azonban a V. amurensis-ből keresztezéssel átvihető a rezisztencia lókusz, mely

Mendeli, domináns öröklődést mutat, így a keletkező hibrid utód rezisztenssé válhat az

agrobaktérium fertőzéssel szemben (Szegedi et al., 1984; Szegedi and Kozma, 1984).

2.4. Az Rcg1 Agrobacterium rezisztenciagén térképezése

A rezisztencia molekuláris hátterének megértéséhez nélkülözhetetlen a rezisztencia

gén genetika térképezése és izolálása, melyhez az ilyen természetesen előforduló, ismeretlen

funkciójú rezisztenciagének esetében a genetikai térképezésen alapuló génklónozás (map

based cloning) nyújt lehetőséget. Ami során a keresett génnel szoros kapcsolatban lévő DNS

8

markerek keresése és azonosítása után a megfelelő klónok kiválogathatóak és szekvenciájuk

meghatározható.

A genetikai térkép elkészítéséhez a megfelelő térképező populáció előállítását

követően különböző markerekre nézve meg kell határozni az egyedek genotípusát. Genetikai

markereknek azokat a különböző tulajdonságokat meghatározó változatokat (allélok)

nevezzük, melyek fenotípus vagy molekuláris szinten, a fehérjék vagy a DNS jellemzésével

megkülönböztethetőek egymástól. A markerek a köztük lévő rekombinációs frekvencia

meghatározásával különböző kapcsoltsági csoportokba rendezhetőek, melyek segítségével

megszerkeszthető a genetikai térkép (Kole and Abbott, 2008).

Az általunk tanulmányozni kívánt Agrobacterium rezisztencia, Rcg1 lókusz

(resistance of crown gall) esetében az agrobaktérium fertőzéssel ellenálló V. vinifera

Kunbarát és a fertőzésre fogékony V. vinifera Sárfehér fajták keresztezéséből származó BC2

hibridcsalád utódait illetve a szülőket vizsgálták különböző RAPD (Random Amplified

Polymorphic DNA), SCAR (Sequenced Characterized Amplified Region) és SSR (Simple

Sequence Repeat) markerekkel. Az adatok alapján megfigyelték, hogy a rezisztens Kunbarát

fajta a V. amurensis teljes 15. kromoszómáját tartalmazza, amin az Rcg1 lókusz található. A

markersorrend meghatározásával sikerült egy hozzávetőleges genetikai térképet

szerkeszteni, illetve a markerek alapján vizsgálva a 15. kromoszóma szekvenciáját és

összehasonlítva a Pinot Noir fajtáéval sikerült meghatározni, hogy az Rcg1 lókusz a 15.

kromoszómán 7,87 Mb és 9,31 Mb között helyezkedik el (3. ábra) (Kuczmog et al., 2012).

3. ábra: Az Rcg1 régió genetikai térképe. A felső vonal a Pinot Noir 15. kromoszóma

megfelelő részének a fizika térképét reprezentálja. Az alsó rész mutatja a Rcg1

régióban használt markerek sorrendjét és genetikai távolságaikat. A pontozott vonalak

jelölik a DNS markerek helyét a 15. kromoszóma szekvenciáján. A térképtávolságok

centimorganban (cM) értendők (Kuczmog et al., 2012).

9

A térképezési adatok arra utalnak, hogy az Rcg1 régióban szokatlanul nagy a

rekombinációs frekvencia, mely a régió magas repetitív szekvencia tartalmának lehet

következménye. A Pinot Noir genom szekvenciájának annotációja szerint ebben a régióban

kilenc teljes vagy csonka WAX gén kópia található két csoportban. A WAX2-szerű

(ECERIFERUM, CER2) gének hét kópiája található meg 9,040 Mb és 9,360 Mb között (4.

ábra), illetve két további WAX2 homológ azonosítható 7,343 Mb és 7,549 Mb között. Egy

átlagos WAX gén tíz exont tartalmaz és 7 kb kiterjedésű.

4. ábra: A Vitis vinifera 15. kromoszóma szekvenciája (12xWGS), melyen a nyilak

jelzik a DCC1 és a WAX2 gének elhelyezkedését, a nyilak iránya mutatja a gének

irányát.

A kutatócsoportunk által előállított 15. kromoszómára homozigóta rezisztens szőlő

esetében a rezisztencia génnel kapcsoltan feltehetőleg több és eltérő szekvenciájú WAX gén

kópia található (Kutatócsoportunk még nem közölt eredményei). A WAX géncsoport egyik

végén található DCC1 gén a Pinot Noirban egyedi szekvencia.

A sokszoros ismétlődő szekvenciák miatt újabb, rezisztenciához kapcsolt genetikai

markerek kifejlesztése nehézségekbe ütközött. A további cél a régió szekvenciájának a

meghatározása lett. Ehhez el kellett készíteni egy szőlő géntárat a megfelelő genotípusú

növényből, és azonosítani majd megszekvenálni a régióhoz tartozó klónokat.

10

2.5. Géntárak, vektorok

A géntár egy organizmus teljes genetikai anyagát reprezentáló klónok gyűjteménye.

Készítése során a DNS-t izolálják és darabolják, majd a gélelektroforézissel kiválogatott

megfelelő méretű fragmenteket a választott vektorba klónozzák. A klónozó vektorok a

klónozandó DNS hordozómolekulái, alkalmasak az idegen DNS tárolására és

felsokszorosítására. A vektoroknak saját replikációs origóval kell rendelkezniük, ezáltal

önálló replikációra képesek, tartalmazniuk kell egy szelekciós markert, és rendelkezniük kell

klónozó hellyel, ez legtöbbször multiklónozó hely (MCS), amely a vektorban csak egyszer

előforduló, egymás mellett elhelyezkedő különböző restrikciós endonukleáz hasítóhelyek,

ezek segítik az inszert DNS beépülését. A ligálás után a vektorokat a megfelelő

gazdaszervezetbe juttatva a klónok fenntarthatóak és vizsgálhatóak.

A kísérleti organizmustól illetve a klónozandó DNS méretétől és típusától függően

többféle könyvtár létrehozására van lehetőség (Sharma and Alex, 2017). A jelenlegi

kísérletünkhöz a BAC, a YAC és a kozmid vektorok közül választottunk, melyek mind

alkalmasak egy eukarióta géntár készítéséhez.

A kozmid könyvtárak kifejlesztése nagy lépést jelentett a genetikai kutatások során,

mivel kétszer akkora méretű inszert befogadására volt képes, mint az addig elérhető λ-fág

vektorok. A kozmid vektorok ötvözik a plazmidok és a λ-fág vektorok előnyeit. A

klónozandó DNS fágként csomagolódik be és jut be a sejtbe, de a sejtben plazmidként képes

replikálódni. A λ-fág genomból csak a cos szekvencia jelenléte szükséges a plazmidon. A

fágfejbe történő csomagolás limitált mérete miatt a bejuttatható inszert maximum 45 kb

nagyságú. Tehát a kozmid vektorok előnye, hogy az in vitro pakolás hatékonysága jóval

magasabb, mint a transzformációé. Hátránya, hogy a kisebb inszert méret miatt több klón

előállítása szükséges, aminek tárolása és átvizsgálása nehéz és hosszadalmas (Preston, 2003;

Sharma and Alex, 2017).

A nagyméretű genomok még nagyobb inszertet befogadni képes vektorokat

igényeltek, ezért fejlesztették ki a mesterséges kromoszóma vektorokat.

A BAC (bakteriális mesterséges kromoszóma, bacterial artificial chromosomes) az

E.coli F-plazmidján alapú vektor, mely nagyméretű, akár 350 kb méretű inszertek

befogadására képes és alapvetően sejtenként egy kópiában van jelen. Az E.coli sejtekbe a

géntár hatékonyan bejuttatható elektroporációval, melyekben több generáción keresztül

stabilan képes fennmaradni.

11

A YAC (élesztő mesterséges kromoszóma, yeast artificial chromosomes) egy

eukarióta eredetű vektor, amit plazmidként lehet szaporítani Escherichia coli sejtekben, az

elkészített géntárat pedig Saccharomyces cerevisiae sejtekben tartják fent, ahol lineáris

mesterséges kromoszómaként replikálódik. Az élesztőben való replikációhoz

nélkülözhetetlen az élesztő kromoszómáról három szerkezeti elem: az ARS (autonomously

replicating sequence), a centromer (CEN) és két telomer (TEL). Akár 1000-2000 kb

nagyságú inszertet is képes hordozni, azonban alacsonyabb stabilitással jellemezhető

(Monaco and Larin, 1994; Sharma and Alex, 2017).

A megfelelő könyvtár kiválasztásához meghatároztuk, hogy a Vitis vinifera genom

reprezentálásához a különböző könyvtárak esetében mennyi klón létrehozása szükséges,

ehhez a Clarke- Carbon összefüggést hívtuk segítségül, amivel kiszámolható, hogy hány

klón szükséges a teljes genom reprezentálásához (Clarke and Carbon, 1976). A Vitis vinifera

genomja 486,2 Mb nagyságú. Kozmid könyvtár készítése során átlagos 40 kb-os inszert

mérettel számolva 64.398 klón előállítása szükséges, hogy a teljes szőlő genom

reprezentálva legyen 99,5%-os valószínűséggel. BAC könyvtár esetében átlag 150 kb-os

inszerttel számolva csak 17.170 klón, míg az átlag 500 kb-os inszert méretű YAC esetében

csupán 5.149 klón szükséges. Tehát BAC illetve YAC könyvtár esetében lényegesen

kevesebb klón előállítása szükséges, ami megkönnyíti a klónok tárolását és későbbi

átvizsgálását, azonban ezek követélményeinek megfelelő nagyméretű DNS előállítása

technikailag nagyon nehéz. Jelen esetben is ebbe a problémába ütközve végül a kozmid

könyvtár készítése mellett döntött a kutatócsoport.

64.398 klón eltevése és tárolása lehetőségeinket meghaladó munka lett volna, ezért

célszerűbbnek tűnt csoportokban eltenni a géntár klónjait. Különböző tesztek eredménye

alapján végül a 96 zsebes mikrotiter lemez minden egyes zsebébe 20-20 klónt helyeztek, így

670 darab mikrotiter lemez helyett akár 34 darab mikrotiter lemez is elégséges a teljes

reprezentációhoz.

A kozmid géntár készítésénél a lehetséges vektorok közül a CopyRight v2.0 vektorra

esett a választás, számos előnyös tulajdonsága miatt.

2.6. CopyRight v2.0 vektor

A kozmid könyvtár készítéséhez a CopyRight v2.0 pSMART FOS vektort (Lucigen

Corporation, Middleton, USA) használtuk, mely az E.coli F-plazmidján alapuló kozmid

12

vektor. A vektor mérete 7,5 kb és 35-45 kb nagyságú inszertet képes hordozni az in vitro

bepakolás után.

Az egykópiás replikációs origó mellett tartalmaz egy indukálható közepeskópia

(medium copy) replikációs origót is, ami lehetővé teszi az alapvetően egy kópiában jelenlévő

plazmid in vivo felsokszorozódását. Az egykópiás állapot az ori2 (oriS) replikációs origó, a

repE gén és a parABC megoszlási lókusz által szabályozott. Indukálva a TrfA replikátor

fehérje génjét aktiválódik a közepeskópia replikációs origó (oriV), ami a plazmid sejtenkénti

akár 50 kópiára történő amplifikálódását eredményezi (5. ábra).

A vektor klóramfenikol rezisztencia gént tartalmaz, ezt kihasználva válogattuk ki az

inszertet tartalmazó klónokat. Emellett a feldolgozatlan vektor más direkt szelekciós

markereket is tartalmaz, a lacZ/sacB géneket, melyek szintén segítik az üres, vágatlan

vektort tartalmazó sejtek kiválogatását. A Bacillus subtilis levansucrase enzimét kódoló

sacB letális az E. coli sejtek számára 5% szacharóz jelenlétében, mivel a levansucrase enzim

a szacharózt az E. coli számára toxikus levánná alakítja, így csak a sikeres inszerción átesett

és ennek következtében elromlott sacB gént tartalmazó sejtek maradnak életben. Szacharóz

hiányában a lacZ gén jelenléte miatt kék-fehér szelekcióval is kiválogathatóak a klónok

(Sharma and Alex, 2017, 1. weboldal).

5. ábra: pSMART FOS vektor szerkezete.

sacB - levansucrase gén, lacZ – β-galaktozidáz α-peptidje, Cmr – klóramfenikol

rezisztencia gén, ori2 – egy kópiás replikációs origó, oriV – indukálható replikációs

origó, par A,B,C- aktív megosztási rendszer (partitioning) gének, cosN - lambda

csomagolási szignál; T - transzkripció terminátor (1. weboldal).

13

3. A MUNKA ELŐZMÉNYEI

A géntár készítéshez célszerűnek látszott egy, az Rcg1 rezisztencia lókuszra és

környezetére homozigóta szőlővonal előállítása, ami megkönnyíti a rezisztencia gén

közelében lévő klónok azonosítását. Az elmúlt években több heterozigóta vonal

önbeporzásával is olyan utód populációkat állítottak elő, melyek tartalmazták a kívánt

homozigóta egyedeket. Ezt különböző DNS markerek segítségével igazolták. A géntár

készítéséhez az Rcg1 régióra homozigóta növényből tisztítottak DNS-t, sejtmag izolálás után

(nem publikált eredmények).

A kutatás következő lépcsője egy géntár elkészítése volt, amihez a szőlő DNS

random összetörése után PFGE futtatás segítségével válogatták ki a megfelelő méretű (35-

45 kb) fragmenteket, melyeket a CopyRight v2.0 vektorba ligálták be. A fágok

összeszerelődését követően ezzel a fágszuszpenzióval fertőzték a Replikátor FOS törzseket,

melyek genotípusa: F¯ mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) endA1 recA1 φ80dlacZΔM15

ΔlacX74 araD139 Δ(ara,leu)7697 galU galK rpsL (StrR) nupG (attL araC-PBAD-trfA250

bla attR) λ−. A klónokat klóramfenikol tartalmú LB táptalajon növesztették fel.

Én a géntár klónok eltevésénél és a megfelelő géntár klónok azonosításánál

csatlakoztam a kutatáshoz.

14

4. CÉLKITŰZÉSEK

Kutatócsoportunk távlati célja az Agrobacterium fertőzéssel szembeni rezisztenciát

kialakító Rcg1 rezisztenciagén azonosítása és a rezisztencia molekuláris biológiai hátterének

megismerése. Ennek érdekében a jelen munkában a következő célokat tűztük ki magunk elé:

1. Egy megfelelően reprezentatív szőlő géntár létrehozása

2. Az Rcg1 lókusz környezetében azonosított WAX és DCC1 géneket tartalmazó géntár

klónok izolálása és szekvenciájuk meghatározása, a régió teljes szekvenciájának

meghatározása érdekében.

15

5. ANYAGOK ÉS MÓDSZER

5.1. A géntár elkészítése és tárolása

A géntárat reprezentáló klóramfenikol rezisztens telepeket tartalmazó normál, kilenc

centiméter átmérőjű Petri-csészékről minden egyes kisméretű, hat centiméter átmérőjű Petri-

csészére 20-20 db telepet szaporítottunk tovább (átcsíkozással). Másnap a kisméretű Petri-

csészéken felnőtt telepek LB 15% glicerin tároló folyadékban történő felszuszpendálást

követően csoportonként 300-300 μl folyadékot helyeztünk párhuzamosan két 96 zsebes, 500

μl zsebtérfogatú MegaBlock mikrotiter lemez egy-egy zsebébe. Ezen felül az egy sorba

tartozó minden csoportból 30-30 μl mintát összegyűjtöttünk egy Eppendorf csőbe. Így a

lemez zsebenként 20-20 klónt, míg az egyes sorokban lévő 12 zsebet összesítő Eppendorf

cső 12*20, azaz 240 klónt tartalmazott. A 240 klónt tartalmazó mintákat használtuk fel a

géntár klónok azonosításának első lépéseként (5.2. fejezet).

Egy mikrotiter lemezre 96*20, azaz 1920 klónt helyeztünk és összesen 40 mikrotiter

lemezt töltöttünk meg, így összesen 76.800 klónt tartalmaz az elkészített géntár. A

párhuzamosan elkészített két-két mikrotiter lemez közül az egyik -80°C-ra került a hosszú

távú tároláshoz, míg a másikat -20°C-on tárolva a mindennapi klónkeresésre használtuk fel.

5.2. A géntár klónok azonosítása specifikus primerekkel

A klónok keresésére PCR reakciókat használtunk, melyekhez WAX és DCC

specifikus primereket alkalmaztunk (1. táblázat). A mikrotiter lemezek egy-egy sorának

összes klónját (240 klón) tartalmazó mintákat használtuk fel a géntár klónok azonosításának

első lépéseként, amivel meghatározhattuk, hogy mely mikrotiter lemez melyik sorában

található egy-egy keresett klón (6. ábra). Ezáltal csupán nyolc PCR reakcióval

megállapítható, hogy melyik sor tartalmaz pozitív klónt. A klónkeresés második lépéséhez

12 PCR teszt szükséges a soron belüli pozitív zseb azonosításához. Végül a géntár klónok

azonosításának harmadik lépésénél a pozitív zseb tartalmát egyedi telepekre hígítását (-5x,-

6x) követően 200 klónt szaporítottunk fel egyedileg LB klóramfenikol tartalmú táptalajon,

majd kolónia PCR segítségével teszteltük a pozitív klón jelenlétét, először tíz-tíz klónonként,

majd pozitív csoport találása után a tíz klón egyedi PCR tesztjével.

16

5.3. PCR

A klónok keresésére, átvizsgálására polimeráz-láncreakciókat (PCR) használtunk,

melyekhez a 1. táblázatban feltüntetett WAX és DCC1 specifikus primereket alkalmaztunk.

A reakció körülményei 24 μl-ben: 0.2 mM dATP, 0.2 mM dCTP, 0.2 mM dGTP, 0.2

mM dTTP, 1.5 mM MgCl2 (1-4 mM), 200-200 nM primer, 20 ng templát DNS, 1 U Taq

polimeráz, 1xPCR puffer (10 mM TRIS-pH: 8,8; 50 mM KCl; 0,08% Nonidet P40). Az

alkalmazott PCR programot az 2. táblázat tartalmazza.

A reakció során pozitív kontrollként szőlő DNS-t, illetve a klónok keresése során az

előző munkafolyamatban talált pozitív mintát használtuk

1. táblázat: Alkalmazott primerek

Primer Nukleotid szekvencia (5’-3’)

WAX001 GATGCTCCACAAG

WAX001R GGAAGGGAAATATGGAGAAG

DCC1 TTTGTTATTTTAATTGGTTTGCG

DCC1-1R TTGCTTGAATTTTGGAGTTC

WAX005R GCATAATTTTTTGAAAGAGCCAA

B5602 GAAATCCTAAGCTCAAAATCAAG

B8102 CAAGTGGCTCTTCTCCATA

B8103 GGTGTGATGTAGAGTGAAAC

(Tm= 58°C+/-1°C)

2. táblázat: Alkalmazott PCR reakció

Program

1. 5:00 – 95°C

2. 0:30 – 95°C

3. 0:30 – 58°C

4. 0:40 – 72°C

5. 35x go to 2

6. end

17

5.4. Agaróz gélelektroforézis

A PCR reakciók után a DNS fragmentek elválasztására 2%-os agaróz gélt

használtunk, melyet TBE pufferrel készítettünk (89 mM Tris, 89 mM Bórsav, 2 mM EDTA)

és 0,1 μg/ml végkoncentrációban etídium-bromidot adtunk hozzá. Az elválasztás előtt a

DNS mintákhoz 0,2 térfogatnyi 5xSTOP (10 % ficoll-400, 0.25M EDTA pH: 8.0, 0.2 %

brómfenolkék) oldatot adtunk. A futtatásokhoz 100 bp GeneRuler DNS Ladder Plus-t

(fragmentek hossza: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1031, 1200, 1500, 2000,

3000 bp; az aláhúzottak erősebben látszanak a gélen) alkalmaztunk (FERMENTAS). A

kiértékelést BioDoc-ItM fotodokumentációs rendszer (BioImaging system, www.uvp.com)

segítségével végeztük.

5.5. Plazmid DNS izolálás

Az Ish-Horowicz és Burke módszert használva alkalikus lízissel preparáltuk a

plazmid DNS-t (Ish-Horowicz and Burke, 1981). Az E. coli sejteket egy éjszakán át 3-3 ml

LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében növesztették, majd a plazmid

instabilitásának csökkentése érdekében és kihasználva az arabinózzal indulkálható

kópiaszám növelést, még 4 órán át lettek növesztve a sejtek arabinóz jelenlétében. Ezután

1,5 ml baktériumkultúrát 20 másodperces centrifugálását követően, a felülúszót leöntve a

leülepedett sejteket 100 μl TEG oldatban (50 mM glükóz, 25 mM Tris, 10 mM EDTA,

pH:8.0) szuszpendálták fel. A sejtek feltárása 200 μl NS oldat (0,2 N NaOH, 1 % SDS)

hozzáadásával és óvatos keveréssel történt. A minták 5 perces 0°C-os inkubálását követően

160 μl hideg NaAc (3 M NaAc, pH:4.8) hozzáadása után pelyhes csapadék megjelenéséig

rázzuk. 5 perces 0°C-os inkubálás után 5 perc centrifugálás következett, majd a felülúszóból

kb. 400 μl izopronallol történt a plazmid DNS kicsapása. A minták 5 perces 0°C-on történő

inkubálása után újra 5 perc centrifugálás következett, majd ezt 70 %-os etanollal történő

mosás és szárítás követte. A csapadékot 100 μl TRIS-Ac oldatban (50 mM Tris, 100 mM

NaAc, pH:8.0) oldották fel és 200 μl 96%-os etanollal csapták ki ismét. Az 5 perces

inkubálás, centrifugálás, mosás és szárítás ismétlése után a kapott DNS-t 30-50 μl RNáz (50-

100 μg/ml) tartalmú steril desztillált vízben oldották fel.

A DNS minták szekvenálásához a DNS további tisztítására volt szükség. A

mintákhoz 0,1 térfogat 10% SDS és 1 térfogat 7,5 M NH4Ac hozzáadását követően 20 percig

-20°C-on történt az inkubáció, majd 5 perces centrifugálás után a felülúszókat új csőbe

18

pipettázták át. Ezekhez 0,6 térfogat izopropanolt adva 20 percig -20 °C-on lettek inkubálva,

majd 70%-os etanolos mosás és szárítás következett. A keletkezett csapadék 40 μl steril

desztillált vízben lett felvéve.

5.6. DNS szekvencia meghatározás

A munkánk során tisztított DNS minták nukleotid szekvenciáit új-generációs

szekvenálással (NGS) határozták meg. A szekvenálást a Szentágothai János

Kutatóközpontban a Mikrobiális Biotechnológiai Kutatócsoport tagjai végezték az Ion

Torrent PGM készülék segítségével.

5.7. DNS szekvencia elemzés

A DNS szekvenciák elemzése különböző bioinformatikai programok használatával

végeztük.

Először a vektor szekvenciájának megkeresése és eltávolítása történt. Az inszert a

vektorba a PmlI klónozó helynél épült be, ezáltal a vektor szekvencia két végét cac-gtg

határolta, ezek előtt, illetve után található az inszert. A vektor szekvenciájával történő

egyszerű keresés nem mindenesetben hoz sikert, ennek több oka is lehet. Lehetséges, hogy

a szekvencia fordítva van, ilyenkor megvizsgáljuk a reverz komplementerét, vagy néhány

bázis eltér a szekvenciában, ilyenkor érdemes jellegzetes motívumokra keresni, mint például

a cac-gtg közelében lévő gcggccgc motívum (NotI hasítóhely).

Különböző génkereső programok segítségével meghatározható, hogy az adott

szekvenciában milyen kódoló szakaszok prediktálhatóak, ezek mekkora kiterjedésűek és

irányúak, illetve kiíratható az általuk kódolt fehérjék szekvenciája is. A szekvenciák

vizsgálatához az FGENESH (2. weboldal), egy eukarióta génkereső program Vitis vinifera

fajokra érzékenyített verzióját használtuk.

Az FGENESH által prediktált fehérjék azonosítására a BLASTP (3. weboldal)

fehérjeszekvenciák elemzésére alkalmas programot használtuk, mely megmutatja, hogy a

fehérje adatbázisban fellelhetőek-e a prediktált fehérjékkel teljesen vagy részben homológ

fehérjék. Az eredmény során számszerűen és ábrán is jelzi a homológia mértékét. Első

körben érdemes a Vitis vinifera genom oldalán (4. weboldal) elérhető BLASTP alkalmazást

használni a szőlő specifikus fehérjék keresésére, majd a BLASTP teljes adatbázisát

19

használni a nemszőlő, például különböző transzpozonok jelenlétének vizsgálatára. A

rokonfehérjék alapján következtethetünk a prediktált fehérje tulajdonságaira, funkciójára.

Esetünkben a keresés elsősorban a DCC1 és a WAX génekre irányult.

Érdemes lehet a szekvenciák BLASTX (2. weboldal) futtatását is elvégezni, mely

mind a hat lehetséges leolvasási keretben vizsgálja a szekvenciákat a lehetséges összes

kódoló rész és az általuk kódolt fehérjék megtalálása végett.

Az FGENESH program nem feltétlenül képes a szekvenciában jelenlevő összes

exont megfelelően detektálni, ezért érdemes a BLASTN (2. weboldal) nukleotidszekvencia

elemző program segítségével összehasonlítani a szekvenciákat a WAX gének mind a 10 exon

szekvenciájával (Pinot Noir 15. kromoszómáján található WAX2-5 jelű gén exon

szekvenciái, lásd 11.1. Függelék). Az exon szekvenciákkal történő vizsgálat segítségével a

csonka, elmutált gének is kimutathatóak. A szekvenciák beillesztése után az „Align two or

more sequences” funkció segítségével elvégezzük az irányított BLASTN elemzést. Az

eredmény számszerűsítve kiírja az azonosság mértékét és ábrán is jelzi a bázisok egyezését.

A megtalált hasonló exon szekvenciák segítségével könnyen beazonosítható a

szekvenciákban az exonok helye, melyeket nagybetűvel jelölünk ki a szekvenciákban.

Ezután, szintén a fenti BLAST alkalmazás segítségével, ellenőrizzük, hogy melyik

klón szekvenciája mutat hasonlóságot a korábbi kísérletek során a különböző specifikus

primerek és markerek segítségével meghatározott WAX szekvenciákkal.

Két szekvencia pontos illesztését a PAIRWISE (5. weboldal) páros illesztőprogram

segítségével végeztük.

20

6. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK

6.1. A géntár klónok eltevése és tárolása

Az eddig elkészített 76.800 klónt tartalmazó géntár átvizsgálása során a DCC1

primerekkel eddig összesen hat zseb bizonyult pozitívnak, melyekből négy klónt sikerült

azonosítani és megszekvenálni. A WAX specifikus primerekkel eddig 14 pozitív zsebet

sikerült azonosítani. Ezekből eddig hat klónt sikerült izolálni és megszekvenálni.

További öt klón azonosítása során nem jártunk sikerrel, a pozitív PCR ellenére több,

mint 400 telep levizsgálása után sem tudtuk azonosítani az egyedi klónt. Úgy tűnik, hogy a

klónok egy része valami ok folytán instabil. Ez a klón azonosítás több fázisában is előfordult.

Volt, hogy a pozitív sor és zseb azonosítása ellenére a pozitív klónt egyedi telepek

formájában lehetetlen volt azonosítani, illetve hogy a pozitív reakciót adó egyedi klón

tisztítás közben elveszett és már nem adta a PCR reakciót. Ennek több oka is lehet.

Lehetséges, hogy vannak olyan klónok, melyek így nem fenntarthatóak E. coli-ban, vagy,

hogy a kis Petri-csészére történő továbbszaporítás során valamelyik csík kevert telepből állt,

így csak töredékében tartalmazta az adott pozitív klónt, ami túl alacsony mennyiségű

jelenléte miatt később már nem volt azonosítható.

A géntár klónok készítésének sematikus ábrázolása az 6. ábrán látható.

21

6. ábra: Az ábrán a géntár elkészítésének és a klónok keresésének sematikus

folyamata látható. (A) A kozmid géntár eltevése és a pozitív sor azonosítása. (B) A

soron belül a pozitív zseb azonosítása. (C) A pozitív klón azonosítása. A római

számok a klónkeresési lépéseket jelölik. A folyamat részletes leírása az 5.1.

fejezetben található.

6.2. A géntár klónok azonosítása specifikus primerekkel

A géntár klónok azonosítása többlépcsős folyamat során DCC1 és WAX génekre

specifikus primerekkel történt (6. ábra, 1. táblázat). A pozitív klón azonosításához először a

mikrotiter lemez egy sorát, majd a zsebet, végül magát a telepet azonosítottuk. Az eltevés

során a mikrotiter lemez soronkénti összes zsebéből származó 240 klón került egy-egy

Eppendorf csőbe, így kiderült melyik mikrotiter lemez melyik sorában található pozitív klón.

A pozitív sor beazonosítása után a zsebenként történő PCR teszttel azonosítottuk melyik a

22

pozitív zseb. Ennek tartalmát egyedi telepekként történő felnövesztését követően, először

kolónia PCR-ral meghatároztuk, hogy melyik tízes csoportban található a keresett klón, majd

újabb kísérletben az egyedi klónt is azonosítottuk.

Szemléltetésképpen az 7. ábrán látható az egyik mikrotiter lemezen megtalált pozitív

soron belüli pozitív zseb azonosítása. Az 8. ábrán pedig a pozitív zseb tartalmának tíz telepre

történő leszűkítését figyelhetjük meg, mely során kiderült, hogy a pozitív klón az első tíz

egyedileg továbbszaporított telep között van.

7. ábra: A gélfotón a pozitív zseb azonosítása látható. Az ötös számú mikrotiter lemez

C sorának tesztelésekor az ötös zseb adott pozitív reakciót, azaz az ötös zsebben

található a keresett klón. A hetedik oszlopban található a DNS Ladder, a 14. oszlopban

pedig a pozitív kontroll, ami a sorazonosításból származó pozitív minta (Nagy Dávid).

8. ábra: A gélfotón az ötös számú mikrotiter lemez A sorának hatodik zsebéből

továbbszaporított egyedi telepek tízes csoportjainak tesztelése látható. Az első tízes

csoport adta a reakciót, azaz abban található a keresett klón. Az ábrán látható (a) és (b)

a pozitív kontrollt jelenti, az (a) a pozitív zsebből származó minta, míg a (b) szőlő

DNS. Az utolsó helyen (L) látható a DNS Ladder (Nagy Dávid).

23

Az általam elemzett két kozmid klón szekvencia, a cos4820 és cos4831, melyek a

B5602/WAX005R primerpárral lettek kiszedve. Szekvenálásukat Urbán Péter végezte a

Szentágothai János Kutatóközpont Genomikai Laborjában.

6.3. A cos4820 géntár klón szekvenciájának elemzése

A cos4820 klón szekvenciája egy 47.871 bázispár hosszú összefüggő részből áll,

melynek elején és végén azonosítható a vektor szekvenciája. Ennek eltávolítását követően

az FGENESH program Vitis vinifera génekre érzékenyített verziója a 40.380 bázispár hosszú

szekvenciában négy gén, illetve 14 exon jelenlétét jelezte. A négy gén által kódolt

feltételezett fehérjék BLASTP elemzését elvégezve megállapítható, hogy az első, második

és a negyedik gén egy-egy ismeretlen tulajdonságú Vitis vinifera fehérjével mutat némi

hasonlóságot az adatbázisban, míg a második gén esetében található részleges homológia

egy RNase H retrotranszpozon szekvenciával is. A harmadik gén által kódolt fehérje nagy

hasonlóságot mutatott egy WAX fehérjével, tehát a kilenc exonból álló gén egy csonka WAX

génnek tűnt. Ennek ellenőrzésére irányított BLASTN elemzést végeztünk a cos4820

szekvencia és a WAX gén exonok között, mely során kiderült, hogy mind a tíz WAX exon

néhány bázis eltéréssel megtalálható volt a szekvenciában, tehát egy teljes WAX gén

azonosítható. A 9. ábrán látható a cos4820 kozmid klón szekvenciáján predikált gének

sematikus ábrázolása.

A szekvenciát az illesztőprogram segítségével összehasonlítva az előzőleg

azonosított WAX szekvenciákkal kiderült, hogy megtalálható a cos4820 kozmid klón

szekvenciájában a WAX2-3b jelű gén 5’- nem kódoló régiója és nyolc exon szekvenciája

(exon 1-8)(4.977-10.080 bázispár), sőt utána megtalálható még a 9. és 10. exon is, tehát a

teljes WAX2-3b gén azonosítható a géntár klón szekvencián.

24

9. ábra: A cos4820 klónon prediktált gének elhelyezkedése.

6.4. A cos4831 géntár klón szekvenciájának elemzése

A cos4831 kozmid klón szekvenciája nem volt egybefüggő, négy kontigból állt. A

vektor szekvencia az első kontig közepén volt azonosítható, azonban a vektor szekvencia

eltávolítását követően az első kontig két része nem illeszthető össze, mert nem ismert a

kontigok pontos sorrendje. Mind az öt különálló rész (1.a,1.b,2.,3.,4. kontigok) esetében

külön végeztük el a génkeresést az FGENESH programmal. A génkereső program az első

kontig egyik részében sem talált prediktálható kódoló szakaszt, azonban a BLASTX elemzés

az 1.a részben talált egy valószínűleg csonka, nem működő citokróm b6/f komplex VI.

alegységét kódoló domént, az 1.b kontigban pedig egy Ty1/Copia family retrotranszpozáz

domént. Az FGENESH a második, 15.262 bázispár hosszú kontig esetében egy három

exonból álló gént azonosított, és az általa kódolt fehérje a BLASTP adatbázisban egy

ismeretlen Vitis vinifera fehérjével és MULE transzpozáz elemekkel mutatott hasonlóságot.

A harmadik, 6.859 bázispár hosszú kontigban a program egy csonka gén, négy exonjának

jelenlétét jelezte. A kódolt fehérje egy WAX fehérjével mutatott bizonyos homológiát. A

negyedik, 5.710 bázispár hosszú kontigban szintén egy csonka gén, hat exonjának jelenlétét

jelezte. A kódolt fehérje szintén WAX fehérje részlettel mutatott hasonlóságot. A WAX

exonok helyének azonosítására a klón szekvenciája és a tíz WAX exon között irányított

BLASTN elemzést végeztünk, ami bizonyította, hogy a harmadik kontigban az első négy,

míg a negyedik kontigban az 5-10. exon volt megtalálható, tehát ebben a klónban is egy

25

teljes WAX gén volt megfigyelhető. Az exonok megfelelő irányba állása miatt érdemes a

harmadik és negyedik kontig szekvenciájának reverz komplementerét venni (10. ábra).

Ezután ellenőrizve, hogy az előzőleg meghatározott WAX szekvenciákkal található-e

homológia, kiderült, hogy a 1.265 bázispártól a 3.815 bázispárig tartó szekvencia részlet (4.

kontig) tökéletes egyezést mutat a már korábban meghatározott WAX4AMU2 szekvenciával

(az illesztést lásd a 11.1. Függelék-ben). Így a WAX4AMU2 szekvencia eddig beazonosított

5-9. teljes exon és csonka 10. exon szekvenciája mellett fény derült az első négy exon

szekvenciájára is, tehát a teljes WAX4AMU2 gén kódoló rész szekvenciája ismertté vált.

10. ábra: A cos4831 klónon prediktált gének elhelyezkedése (A kontigok sorrendje a

többi átfedő klón segítségével lett megállapítva).

Az újonnan megismert illetve kiegészített szekvenciák felhasználhatók arra, hogy új

PCR alapú markereket lehessen az egyedi szekvenciájukra tervezni, melyekkel a géntár

átfedő klónjainak eddig még nem ismert szekvenciái is azonosíthatók.

Érdemes lehet a szekvenciákban lévő transzpozon szekvenciákat is megvizsgálni,

mert beépülhetnek olyan helyre transzpozonok, melyek Pinot Noir illetve más fajtákban

nincsenek ott jelen. Így ezeket az egyedi szekvenciákat is fel lehet használni új DNS-

markerek tervezésére.

26

7. ÖSSZEFOGLALÁS

Gazdasági növényeinket számos súlyos betegség veszélyeztetheti, ilyen az

Agrobacterium törzsek által okozott tumoros megbetegedés is, mely a szőlő és

gyümölcstermesztésben világszerte jelentős károkat okoz. A fertőzés szisztematikus jellege

miatt a leghatékonyabb védekezést az ellenálló fajták létrehozása jelentené. Megfigyelték,

hogy a V. amurensis fajok, illetve a tőlük származó domináns, egygénes Agrobacterium

(Rcg1) rezisztenciát hordozó V. vinifera hibrid utódok is ellenállóak a patogén törzsekkel

szemben. A munkánk távlati célja ennek az Rcg1 lókusznak az azonosítása és a rezisztencia

molekuláris hátterének feltárása. A rezisztencia gén azonosítására a genetikai térképezésen

alapuló klónozás nyújt lehetőséget.

Az elmúlt években különböző DNS markerek használatával sikeresen

meghatározták, hogy az Rcg1 lókusz a 15. kromoszómának nagyjából a közepén helyezkedik

el. Az ismert Pinot Noir genomszekvencia alapján megállapítható, hogy ez a régió gazdag

ismétlődő szekvenciákban. Ezek WAX2-szerű (ECERIFERUM), Arabidopsis-ban CER2

gének, melyek számos kópiában fordulnak elő és a kutikula viasz minőségét befolyásolják.

Az Rcg1 lókuszt tartalmazó régió szekvenciájának megismeréséhez első lépésként

elkészítettünk egy kozmid géntárat egy rezisztens növényből származó DNS-ből kiindulva.

Különböző WAX specifikus primerekkel történt a régió első klónjainak azonosítása. Ezek

közül két klón szekvenciáját elemeztem.

Mindkét általam elemzett kozmid klón, a cos4820 és cos4831, szekvenciájában

megtalálható egy teljes WAX gén mind a tíz exonjával. Sőt ezeket összehasonlítva a

korábban markerek és primerek segítségével meghatározott WAX szekvenciákkal, tökéletes

egyezést mutatnak a meglévő WAX2-3b és WAX4AMU2 részleges szekvenciákkal, ráadásul

felfedték ezen szekvenciák eddig ismeretlen részeit is, így a teljes WAX2-3b és WAX4AMU2

szekvencia ismertté vált. Az átfedő klónok segítségével meghatároztuk a cos4820 és

cos4831 klónon prediktált gének elhelyezkedését.

A további, átfedő géntár klónok azonosításával és e szekvenciák elemzésével

remélhetően összeállítható a rezisztenciagént tartalmazó régió szekvenciája, és azonosítható

az Rcg1 lókusz is.

27

8. IRODALOMJEGYZÉK

Allen, O. N. and Holding, A. J. (1974): Genus II. Agrobacterium. In: Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology, 8th Edition : 264–267, eds.: Buchanan, R. E. and Gibbons, N.

E. , Williams and Wilkins Co, Baltimore.

Binns, A.N. and Costantino, P. (1998): The Agrobacterium oncogenes. In: The

Rhizobiaceae: 251–266, eds.: Spaink, H.P. et al., Academic Publishers, Kluwer.

Burr, T. J., Bazzi, C., Süle, S., Otten, L. (1998): Crown gall of grape: Biology of

Agrobacterium vitis and the development of disease control strategies. Plant Disease 82:

1288-1297.

Clarke, L., Carbon, J. (1976): A Colony Bank Containing Synthetic Col El Hybrid Plasmids

Representative of the Entire E. coli Genome. Cell 9: 91-99.

Decleene, M. and Deley, J. (1976): The host range of crown gall. Bot. Rev. 442:389- 466.

Dessaux, Y., Petit, A., Tempé, J. (1993): Chemistry and biochemistry of opines, chemical

mediators of parasitism. Phytochemistry 34: 31-38.

Escobar, M. A., Dandekar, A. M. (2003): Agrobacterium tumefaciens as an agent of

disease. Trends Plant Sci 8: 380-386.

Gelvin, S. B. (2003): Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the

„gene-jockeying” tool. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67: 16-37.

Ish-Horovicz, D., and J. F. Burke (1981): Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids

Res. 9: 2989-2998.

Kole, C., Abbott, A.G. (2008): Principles and practices of plant genomincs. Volume 1:

Genom mapping: 393. Science Publishers. Enfield, NH, USA.

28

Koncz, Cs., Németh, K., Rédei, Gy., Schell, J. (1994): Homology recogniotion during T-

DNA integration into the plant genome. In: Homologous recombination and gene silencing

in plants: 167-189, ed.: J. Paszkowszki, Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The

Netherland.

Kuczmog, A., Galambos, A., Horváth, Sz., Mátai, A., Kozma, P., Szegedi, E., Putnoky, P.

(2012): Mapping of crown gall resistance locus Rcg1 in grapevine. Theor Appl Genet 125:

1565–1574.

Monaco, A. P., Larin, Z. (1994): YACs, BACs, PACs and MACs: artificial chromosomes as

research tools. Trends Biotechnol, 12: 280-286.

Preston, A. (2003): Choosing a cloning vector. Methods in Molecular Biology 235: 19- 26.

Pu, X.-A., Goodman, R. N. (1993): Attachment of Agrobacteria to Grape Cells. App Environ

Microb 59: 2572-2577.

Schell, J. et al. (1979): Interactions and DNA transfer between Agrobacterium tumefaciens,

the Ti plasmid, and the plant host. Proc. R. Soc. London Ser B 204: 251–266.

Sharma, G., Alex, L. (2017): Vectors: Its importance in biotechnology and different types of

vectors. Recent Advances in Biotechnology 2: 72-114.

Süle S. (1978): Biotypes of Agrobacterium tumefaciens in Hungary. J Appl Bacteriol 44:

207-213

Szegedi, E. (2007): Az Agrobaktériumos golyvásodás biológiája és az ellene való védekezés.

Kertgazdaság 39: 46-56.

Szegedi, E., Korbuly, J., Koleda, I. (1984): Crown gall resistance in East-Asian Vitis species

and in their V. vinifera hybrids. Vitis 23: 21-36.

Szegedi, E., Kozma, P. (1984): Studies on the inheritance of resistance to crown gall disease

of grapevine. Vitis 23: 121-126

29

Szegedi, E., Németh, J. (1996): Szőlő hajtások Agrobacterium vitis tartalmának vizsgálata.

Növényvédelem 32: 605–609.

Tamm, B. (1954): Experimentelle Untersuchungen über die Verbreitung des bakteriellen

Pflanzenkrebses und das Auftreten von Sekundärtumoren. Arch Mikrobiol 20: 273-292

Tzfira, T., Citovsky, V. (2006): Agrobacterium-mediated genetic transformation of plants:

biology and biotechnology. Curr Opin Biotechnol 17:147–154.

Zaenen J, Van Larebeke N, Tenchy H, Schell J. (1974): Supercoiled circular DNA in crown

gall inducing Agrobacterium strains. J. Mol. Biol. 86: 109-127.

30

9. INTERNETES HIVATKOZÁSOK

1. weboldal: A CopyRight vektor leírása:

https://www.bioscience.co.uk/userfiles/pdf/CopyRight%C2%AE%20v2.0%20Fosmid%20

Cloning%20Kits.pdf

2. weboldal: FGENESH eukarióta gén prediktáló program:

http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=fgenesh&group=programs&subgroup=gfind

3. weboldal: BLAST, homológia keresés nukleotid és fehérje szekvencia adatbázisokban:

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

4. weboldal: Vitis vinifera genom oldala

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=vitis+vinifera

5. weboldal: EMBOSS Needle, szekvenciák páros illesztése:

http://www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&context=nucl

eotide

31

10. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Szeretném megköszönni a lehetőséget, hogy a Pécsi Tudományegyetem

Természettudományi Karának Biológiai Intézetében, a Genetikai és Molekuláris Biológiai

Tanszéken készíthettem el a diplomamunkámat.

Hálás köszönettel tartozom témavezetőimnek, Dr. Putnoky Péternek és Dr. Kuczmog

Anettnek munkám irányításáért, hasznos tanácsaikért, rengeteg segítségükért gyakorlati és

elméleti téren is.

Köszönöm a tanszék összes munkatársának, hogy segítségükkel hozzájárultak a

munkám elkészüléséhez.

Végül köszönöm családomnak és barátaimnak a bíztatásért és támogatásért.

32

11. FÜGGELÉK

11.1. Függelék: A WAX2-5 jelű gén (LOC100854413) exonjainak szekvenciái

A gén a Pinot Noir genomban a 15 kromoszóma 9259842 bp és 9267373 bp közötti

szakaszán helyezkedik el.

>1ex

ATGGCTTCTAAACCTGGAATACTCACTGATTGGCCATGGACGCCTCTTGGCAACTTCAAG

>2ex

TACGTGGTCTTGGCACCATGGGCGATTCATGCCATACACTCGTTCCTAGTGAAAGATGAAAAGGAGAGAGACGTTGCTCAC

TTTCTAATATTCCCATTTCTGTTATCGAGGATGCTCCACAACCAGCTTTGGATTTCACTTTCTCGCCATCGAACAGCCAAA

GGCAACAACAGGATTGTTGACAAGGGCATTGAATTTGAGCAAGTTGACAGAGAAAGAAACTG

>3ex

GGATGACCAGATTATTTTCAACGGGATCATATTCTACATAGCCTATTTCATACTTCCAGGGGCTTCTCACATGCCCTTATG

GAGAGCAGATGGTGTGGTTATTACAATTCTGCTTCATACGGGCCCTGTGGAGTTTCTGTATTACTGGCTTCACAGGGCTCT

ACACCATCATTATCTCTACTCACGTTACCATTCTCATCACCATTCCTCTATCGTCACTGAGCCCATCACCT

>4ex

CTGTCATTCATCCATTTGCGGAGCATATAGGATATTTTCTGCTGTTTTCAATACCATTGCTGACCATGATCTTCACCAGAA

CAAGCTCTGTTGTAGCTTTTTTTGGCTATATCTCTTATATTGATTTCATGAACAACATGGGGCATTGCAACTTCGAGCTCG

TGCCCAAGTGGCTCTTCTCCATATTTCCCTTCCTCAAGTATCTTATGTATACCCCCTC

>5ex

GTTTCACTCTTTGCATCACACCCAATTTCGAACCAATTACTCACTCTTCATGCCATTCTACGACTTCATGTATGGTACTAT

GGACAAATCTTCAGATGTGTTATATGAAAAATCACTTACAAGGCCTGAAGAATCGCCTGATGTAGTGCATCTCACCCATCT

CACAACGCCAAACTCCATTTATCATATAAGGCTAGGTTTTGCCTCTGTGGCCTCCAAGCCATACATCTCCAAATGGTACTT

GAGACTAATGTGGCCTCTAACATCTTCGTATATGATGTTGATTTGGATTTGTTCTCGTACATTTGTTCTTGAAAGGAACCA

TTTCAACAAACTCAAGTCACAAACATGGGTCATACCAAAATATAGGGTTCAA

>6ex

TACTTCTTGAAATGGCAAAATGAACCCATCAATAGCTTGATTGAAGAAGCCATACTACATGCAGAGGAAAGAGGTGTTAAA

GTGTTGAGTTTAGGTCTTCTCAACCAG

>7ex

GGTGAAGAGCTTAATCTATATGGTAAGCTTTATATCCATTTAAATCCTAAGCTCAAAATCAAGGTGGTGGATGGGAGCAGC

TTAGCAGTAGCTGTTGTTTTGAACAGCATTCCAAAAGGAACCACTCAAGTACTCTTCAGAGGCAAGCTCTCTAAGGTTGCT

TATTTCACAGCCATTGCTTTGTGCCAAAAGGGCATCCAG

>8ex

GTGACTACTTTCTGTGAGGAAGAGCACAAGAAGATCAAAATGAAGCTGAACACCAAATTGGGAGATAAATTGGCTCTTTCA

AAAAATTATGCCCATAAG

>9ex

ATATGGTTGGTTGGAGATGGCTTGACCGAAGAAGAACAGTTGAAGGCACCAAAAGGAACTCTATTTATTCCCTTTTCTCAG

TTCCCACCAAAGAGAATGCGCAAAGATTGCTTCTACCACACCACACCAGCAATGATGTCTCCCACTTCTTTTGAGAACATG

GATTCTTGTGAG

>10ex

AATTGGTTGCCAAGAAGAGCAATGAGTGCATGGCGTGTGGCTGGAATATTGCATGCATTAGAAGGATGGAATGTGCACGAG

TGCGGTCACACCATATTCGATATTGAGAAGATTTGGGAAGCCAGTTTTCAACATGGATTTCGTTCTTTAATGATTCCCTCT

TAA

33

11.2. Függelék: A WAX4AMU2 gén és a cos4831 páros illesztése.

A cos4831 4. kontig szekvenciája az 1265 bp-3815 bp között tökéletes egyezést mutat a

WAX4AMU2 szekvenciájával.

wax4amu2 1 -------------------------------------------------- 0

4831-4R 1201 CTGCATCACACCCAATTTCGGACCAATTACTCACTCTTCATGCCATTCTA 1250

wax4amu2 1 --------------GTACTATGGACAAATCTTCAGATGTATTATATGAAA 36

||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1251 CGACTACATGTATGGTACTATGGACAAATCTTCAGATGTATTATATGAAA 1300

wax4amu2 37 AATCACTTACAAGGCCTGAAGAATCGCCTGATGTAGTGTATCTCACCCAT 86

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1301 AATCACTTACAAGGCCTGAAGAATCGCCTGATGTAGTGTATCTCACCCAT 1350

wax4amu2 87 CTCACAACACCAGACTCCATTTATCATATAAGGCTAGGTTTTGCCTCTAT 136

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1351 CTCACAACACCAGACTCCATTTATCATATAAGGCTAGGTTTTGCCTCTAT 1400

wax4amu2 137 GGCCTCTAAGCCATACATCTCCAAATGGTACTTGAGACTAATGTGGCCTC 186

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1401 GGCCTCTAAGCCATACATCTCCAAATGGTACTTGAGACTAATGTGGCCTC 1450

wax4amu2 187 TAACATCTTTGTATATGATGTTGATTTGGATTTGTTCTCGTACATTTGTT 236

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1451 TAACATCTTTGTATATGATGTTGATTTGGATTTGTTCTCGTACATTTGTT 1500

wax4amu2 237 CTTGAAAGGAACCATTTCAACAAACTCAAGTTACAAACATGGGTCATTCC 286

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1501 CTTGAAAGGAACCATTTCAACAAACTCAAGTTACAAACATGGGTCATTCC 1550

wax4amu2 287 AAAATATAGGATTCAAgtaagaatcatattttgttgttattttgttttct 336

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1551 AAAATATAGGATTCAAgtaagaatcatattttgttgttattttgttttct 1600

wax4amu2 337 taatttattaatgtattttatcattgtttcttttttttttaagactgatt 386

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1601 taatttattaatgtattttatcattgtttcttttttttttaagactgatt 1650

wax4amu2 387 tatttctagttagttattactcattgaatcaattgttgagtggtgtagTA 436

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1651 tatttctagttagttattactcattgaatcaattgttgagtggtgtagTA 1700

wax4amu2 437 CTTCTTGAAATGGCAAAATGAACCCATCAATAGCTTGATTGAAGAAGCCA 486

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1701 CTTCTTGAAATGGCAAAATGAACCCATCAATAGCTTGATTGAAGAAGCCA 1750

wax4amu2 487 TACTAGATGCAGAGCAAAGAGGCGTTAAAGTGTTGAGTTTAGGTCTTCTT 536

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1751 TACTAGATGCAGAGCAAAGAGGCGTTAAAGTGTTGAGTTTAGGTCTTCTT 1800

wax4amu2 537 AACCAAgtaagttatttctcctttaccattttggttccatttttttttct 586

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1801 AACCAagtaagttatttctcctttaccattttggttccatttttttttct 1850

wax4amu2 587 tcttctttagtttcccccactccctttggtccctttcatgcatagatgta 636

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1851 tcttctttagtttcccccactccctttggtccctttcatgcatagatgta 1900

34

wax4amu2 637 gagacattatatgatgatctgcatcctcgcatgtggatattgttcacttt 686

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1901 gagacattatatgatgatctgcatcctcgcatgtggatattgttcacttt 1950

wax4amu2 687 aatcaagtgtcacccttccatatgaatattatccattttaatataatact 736

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 1951 aatcaagtgtcacccttccatatgaatattatccattttaatataatact 2000

wax4amu2 737 aagaaatgatggggataccacaaattcctttcatatagatattatttgct 786

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2001 aagaaatgatggggataccacaaattcctttcatatagatattatttgct 2050

wax4amu2 787 ttaatataatgttaagaaccgattaagatatcataaatcccttttagtga 836

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2051 ttaatataatgttaagaaccgattaagatatcataaatcccttttagtga 2100

wax4amu2 837 atattgtacgctttaatatagtaatagaaattgattgagatattaaaatg 886

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2101 atattgtacgctttaatatagtaatagaaattgattgagatattaaaatg 2150

wax4amu2 887 ttgcgtgtgattatggtgagagacaaacatcccttgtgatgaggtccttg 936

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2151 ttgcgtgtgattatggtgagagacaaacatcccttgtgatgaggtccttg 2200

wax4amu2 937 catgtgtaaatattgtttatttaggcctcacaaatttaaaatacatttac 986

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2201 catgtgtaaatattgtttatttaggcctcacaaatttaaaatacatttac 2250

wax4amu2 987 atgaaacttctttctttaatcaattgggatatcataaattatgactttca 1036

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2251 atgaaacttctttctttaatcaattgggatatcataaattatgactttca 2300

wax4amu2 1037 caagaagatcttggattgatagaagcttggactatcttttattgaaccaa 1086

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2301 caagaagatcttggattgatagaagcttggactatcttttattgaaccaa 2350

wax4amu2 1087 ctttagattgttatacacctgaaatgcacttagataacctattttcatta 1136

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2351 ctttagattgttatacacctgaaatgcacttagataacctattttcatta 2400

wax4amu2 1137 gcatcccctattttcattataaggaaagtaaatctttgatgactagaaga 1186

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2401 gcatcccctattttcattataaggaaagtaaatctttgatgactagaaga 2450

wax4amu2 1187 gaattattgtgcctataaataattttaccatattggtttatagtttatat 1236

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2451 gaattattgtgcctataaataattttaccatattggtttatagtttatat 2500

wax4amu2 1237 atgattaattcactcatttccttctttcatattgagccctccagcaattc 1286

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2501 atgattaattcactcatttccttctttcatattgagccctccagcaattc 2550

wax4amu2 1287 atcatccatatttgaaaagttttagttcaaaaataaatttttatttaatt 1336

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2551 atcatccatatttgaaaagttttagttcaaaaataaatttttatttaatt 2600

wax4amu2 1337 aattaaaaaattatgcagGGTGAAGAGCTTAATATATATGGTGAGCTTTA 1386

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2601 aattaaaaaattatgcagGGTGAAGAGCTTAATATATATGGTGAGCTTTA 2650

wax4amu2 1387 TATCCATAGAAATCCTAAGCTCAAAATCAAGGTGGTGGATGGGAGCAGCT 1436

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2651 TATCCATAGAAATCCTAAGCTCAAAATCAAGGTGGTGGATGGGAGCAGCT 2700

35

wax4amu2 1437 TAGCAGTAGCCGTTGTTTTGAACAGCATTCCAAAAGGAACCACTCAAGTA 1486

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2701 TAGCAGTAGCCGTTGTTTTGAACAGCATTCCAAAAGGAACCACTCAAGTA 2750

wax4amu2 1487 CTCTTCCGAGGCAAGCTCTCCAAGGTTGCTTATTTCACAGCCCTTGCTTT 1536

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2751 CTCTTCCGAGGCAAGCTCTCCAAGGTTGCTTATTTCACAGCCCTTGCTTT 2800

wax4amu2 1537 GTGCCAAAAGGGCATCCAGgtatttttaatataaatggaaaaatgttatt 1586

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2801 GTGCCAAAAGGGCATCCAGgtatttttaatataaatggaaaaatgttatt 2850

wax4amu2 1587 aaaatttgaatggtgcttcatgtatgtatccctacttcatcacctacttg 1636

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2851 aaaatttgaatggtgcttcatgtatgtatccctacttcatcacctacttg 2900

wax4amu2 1637 tatgactagcaaaaactaacttttttaattaatgtcaaacaacaactact 1686

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2901 tatgactagcaaaaactaacttttttaattaatgtcaaacaacaactact 2950

wax4amu2 1687 gttttacctgttcaatcctagttttgatttatattggaatacaattgaaa 1736

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 2951 gttttacctgttcaatcctagttttgatttatattggaatacaattgaaa 3000

wax4amu2 1737 taattcttagGTGGCTACTTTCCATGAGGAAGAGTACGCGAAGATCAATA 1786

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3001 taattcttagGTGGCTACTTTCCATGAGGAAGAGTACGCGAAGATCAATA 3050

wax4amu2 1787 TGAAGCTGAACACCAAATTGGGAGGCAAATTGGCTCTTTCAAAAAATTAT 1836

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3051 TGAAGCTGAACACCAAATTGGGAGGCAAATTGGCTCTTTCAAAAAATTAT 3100

wax4amu2 1837 GCTCATAAGgtaaaatcccttctttcatccttctatatatcttattcttt 1886

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3101 GCTCATAAGgtaaaatcccttctttcatccttctatatatcttattcttt 3150

wax4amu2 1887 ttctttttattttctataatcttccttaatgcttaccattgaaaacttcc 1936

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3151 ttctttttattttctataatcttccttaatgcttaccattgaaaacttcc 3200

wax4amu2 1937 tttttaattagtgtattcattgagaaaaactttttgtttaatgataggct 1986

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3201 tttttaattagtgtattcattgagaaaaactttttgtttaatgataggct 3250

wax4amu2 1987 aatgaaaaaagaactattatgatgaagttaacataattaagcattggaga 2036

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3251 aatgaaaaaagaactattatgatgaagttaacataattaagcattggaga 3300

wax4amu2 2037 ttttacaggctaatgaacaaacaacccaccaccattttctcatttctttt 2086

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3301 ttttacaggctaatgaacaaacaacccaccaccattttctcatttctttt 3350

wax4amu2 2087 ttcttttctttc-ttttttttttttttttgggaaaaaaatggacttagca 2135

|||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3351 ttcttttctttctttttttttttttttttgggaaaaaaatggacttagca 3400

wax4amu2 2136 ttaaagatgtttgagatatagtagtgaaatattgtacagATATGGTTGGT 2185

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3401 ttaaagatgtttgagatatagtagtgaaatattgtacagATATGGTTGGT 3450

wax4amu2 2186 TGGAGATGGCTTGACCAAAGAAGAACAGTTGAAGGCACCAAAAGGAACTC 2235

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3451 TGGAGATGGCTTGACCAAAGAAGAACAGTTGAAGGCACCAAAAGGAACTC 3500

36

wax4amu2 2236 TATTTATTCCCTTTTCTCAGTTCCCTCCAAAGAGAATGCGCAAAGATTGC 2285

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3501 TATTTATTCCCTTTTCTCAGTTCCCTCCAAAGAGAATGCGCAAAGATTGC 3550

wax4amu2 2286 TTCTACCACACCACACCAGCAATGATGTCTCCCACTTCTTTTGAGAACAT 2335

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3551 TTCTACCACACCACACCAGCAATGATGTCTCCCACTTCTTTTGAGAACAT 3600

wax4amu2 2336 GGATTCTTGTGAGgtcagtcaatattattaatttcaaagataacaagcaa 2385

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3601 GGATTCTTGTGAGgtcagtcaatattattaatttcaaagataacaagcaa 3650

wax4amu2 2386 tattatatattagtacaaaagttaattttaagcataatgacacggttcca 2435

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3651 tattatatattagtacaaaagttaattttaagcataatgacacggttcca 3700

wax4amu2 2436 tacaattttggtttatgaaaatatttatctaaatgcagAATTGGCTGCCA 2485

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3701 tacaattttggtttatgaaaatatttatctaaatgcagAATTGGCTGCCA 3750

wax4amu2 2486 AGAAGAGCAATGAGTGCATGGCGTGTGGCTGGAATATTGCATGCATTAGA 2535

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

4831-4R 3751 AGAAGAGCAATGAGTGCATGGCGTGTGGCTGGAATATTGCATGCATTAGA 3800

wax4amu2 2536 AGGATGGAATGTGCA----------------------------------- 2550

|||||||||||||||

4831-4R 3801 AGGATGGAATGTGCACGAGTGCGGTCACGCCATATTCGATATTGAGAAGA 3850

wax4amu2 2551 -------------------------------------------------- 2550

4831-4R 3851 TTTGGGAAGCCAGTCTTCAACATGGATTTCGTCCTTTAATGATTCCCTCT 3900

wax4amu2 2551 -------------------------------------------------- 2550

4831-4R 3901 TAgtgattaagacaactttatttattatttctatttggtgctagtatctg 3950