Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar

Gazdag Zoltán, Kerepesi Ildikó Kucsera Judit, Manczinger László, Pesti Miklós, Takács

Krisztina, Uzsoki Boglárka, Vágvölgyi Csaba

KÍSÉRLETES BIOLÓGIAI GYAKORLATOK

Szerkesztette: Kerepesi Ildikó

Pécs

2005

1

TARTALOMEGYZÉK

Oldatok 3

Pufferoldatok 4

Kromatográfiás elválasztási módszerek 10

Spektrofotometria 23

Fiziológiás oldatok összeállítása 27

Higitási sorozatok készítése 31

Bioassay vizsgálatok 36

Táptalajok 40

Sterilezés 44

Mikroorganizmusok tenyésztése 49

2

ELŐSZÓ

A biológia egyetemi oktatásába újonnan bevezetett Kísérletes biológiai gyakorlat című

tárgy legfontosabb célkitűzése az, hogy a hallgatók megismerkedjenek a különböző

tudományterületekhez tartozó biológiai laboratóriumok néhány alapvető eszközével és

módszerével. Így betekintést kapnak néhány, a biokémia, állatélettan, mikrotechnika és

mikrobiológiai laboratóriumokban alkalmazott módszerekbe. Tapasztalatokat szereznek a

spektrofotometriás, kromatográfiás eljárásokról éppúgy, mint fiziológiás oldatok izomműködésre

gyakorolt hatásának vizsgálatáról, vagy mikroorganizmusok tenyésztéséhez tartozó technikákról.

Az itt szerzett elméleti ismeretek és gyakorlati technikák elsajátítása remélhetően jó alapot

szolgáltat majd a későbbi laboratóriumi munkákhoz.

3

OLDATOK

Az oldatok koncentrációja azt fejezi ki, hogy az oldott anyag milyen mennyiségben van

jelen az adott mennyiségű oldatban vagy oldószerben. Az oldószer és az oldott anyag

mennyiségét tömeg és térfogategységekben, illetve mólokban fejezhetjük ki.

A tömegszázalék megadja, hogy az oldott anyag tömege az oldat tömegének hány

százaléka:

Tömegszázalék = 100) (g geOldat töme

) (g tömegeanyagOldott x

A térfogatszázalék megadja, hogy az oldott anyag térfogata hány százaléka az oldat térfogatának.

Térfogatszázalék = 100) (cm ogataOldat térf

) (cm térfogataanyagOldott 3

3

x

A vegyesszázalék megadja, hogy az oldott anyag tömege hány százaléka az oldat térfogatának.

Vegyesszázalék = 100) (cm ogataOldat térf

) (g tömegeanyagOldott 3

x

A molarítás (Mol) az oldott anyag moljainak számát adja meg 1dm3 oldatban.

Molarítás (mol/dm3

) =

) (dm ogataOldat térf

számamóljainak anyagOldott 3

A molalitás megadja az oldott anyag 1kg oldószerre eső moljainak számát.

Molalitás (mol/kg) = ) (kg ömegeOldószer t

számamóljainak anyagOldott

A móltört megadja az egyik komponens móljainak számát az oldatban levő összes komponens móljainak számához viszonyítva.

XA = IcBA

A

nnnn

n

......+++

Koncentráció megadások természetesen más módon is lehetségesek pl.: mg/g; mg/cm3;

g/1000cm3 ….

4

PUFFER OLDATOK

A puffer oldatok olyan pH kiegyenlítő rendszerek, amelyek pH-ja más oldatokhoz

viszonyítva csak kis mértékben változik, ha nagyobb mennyiségű erős savat vagy erős bázist

adunk hozzá. Működésük a közös ion hatásán alapul.

Puffer oldatnak nevezzük a gyenge savat és sóját (konjugált bázisát) vagy gyenge bázist és sóját

(konjugált savát) tartalmazó oldatpárokat. A puffer oldat pH - értékét a gyenge sav (bázis)

disszociáció állandója és a proton-akceptor/proton-donor koncentrációaránya határozza meg.

A pufferkapacitás valamely erős savnak, ill. bázisnak a mol/dm3-ben kifejezett

mennyisége, amely az adott összetételű puffer rendszerben egységnyi pH-változást hoz létre. A

pufferkapacitást a proton-akceptor és a proton-donor koncentrációja, valamint aránya határozza

meg. Például minél több mol sav vagy só van jelen, annál több erős bázis vagy erős sav

hozzáadását egyenlíti ki a puffer a pH lényeges megváltozása nélkül.

Vizes oldatban a sav – bázis reakciók jellemzésére Brönsted definíciója alkalmazható: a savak

proton-donor, a bázisok proton-akceptor vegyületek. Sok reakció sebességét, vizes oldatban,

gyenge savak vagy bázisok is befolyásolják. Ezeket a protondonorokat, illetve proton

akceptorokat Brönsted savaknak vagy bázisoknak nevezzük, vagy nevezhetjük általános

savaknak vagy általános bázisoknak.

Egy BH sav ionizációja a konjugált bázisát, a B- aniont eredményezi. Másfelől a B- anion

protonálása a konjugált sav (BH) képződéséhez vezet:

______________________________________________________

sav bázis protondonor protonakceptor

______________________________________________________ BH - B- + H+

CH3COOH - CH3COO- + H+ NH4 - NH3 + H+

HOH - HO- + H+

______________________________________________________ Az enzimek megfelelő működésének feltétele az állandó hidrogénion-koncentráció. A

fehérjéknek nem jelentős a pufferkapacitásuk, így a közeg hidrogénion-koncentrációja (pH)

könnyen befolyásolja töltéseinek számát. A szervezetben találhatóak pufferrendszerek pl.:

foszfátionok (H2PO4- ↔ HPO4

2-), cukorfoszfátok, hidrogénkarbonát – karbonát. Kísérleti

5

körülmények között lehetőségünk van a puffer megválasztására és ezen keresztül a közeg

hidrogénion-koncentrációjának stabilizálására, illetve a reakció sebességének befolyásolására. A

puffer megválasztásánál az egyik szempont a gyenge sav vagy gyenge bázis pKa értéke. Egy

puffer ugyanis pKa érékétől ± 1 pH érték tartományában fejt ki kellő pufferkapacitást. Tehát azt a

puffert választjuk, amelyeknek pKa értéke a pufferolni kívánt pH értékhez közel esik. A puffer

koncentrációja általában 5 és 100 mmol / l tartományban használatos.

Egy jó puffer tulajdonságai:

Vízben jól oldódjon

Membránon ne hatoljon át, a sejtorganellumokba ne jusson be.

A puffer pKa értékét, amennyire lehet, ne befolyásolja a puffer

koncentrációja, a hőmérséklet, a közeg ionösszetétele.

Az enzimek kofaktoraival, mint Ca2+, Mg2+, Mn2+ ne képezzenek

komplexeket.

Ha a puffer fémionokkal komplexet képez, ezek vízben jól oldhatók

legyenek és a kötési állandójuk ismert legyen.

A pufferek enzimatikus és nem enzimatikus behatásnak

ellenálljanak.

Szerkezetükben ne hasonlítsanak az enzim szubsztrátjaira vagy

inhibitoraira.

Ne reagáljanak a keletkező metabolitokkal vagy a reakcióközeg más

komponenseivel.

Az alkalmazott koncentrációban oldatuk 230 nm felett ne

abszorbeálja a fényt.

Lehessen nagy tisztaságban előállítani.

Példa a pufferhatás érzékeltetésére egy protont termelő reakcióval:

LAKTÁT + NAD+ - PIRUVÁT + NADH + H+

A reakcióban a piruváttal ekvimoláris mennyiségben hidrogénion keletkezik. Tehát

10µmol piruvát keletkezésekor 10µmol hidrogénion. A reakciót pH 8-nál, 5ml térfogatban

6

végezzük. Így a hidrogénion mol koncentrációja 10-8 + 10 x10-6 / 5 x 1000 =2 x 10-3. Az oldat

pH-ja – log [H]+ = 2.699 lesz. A változás 5.301 pH érték. Ha a közeg nincsen pufferolva a pH-t

NaOH hozzáadásával állandó pH 8 értéken tarthatjuk, a fogyott lúgból a piruvát mennyisége

kiszámítható.

Ha a reakcióelegy 50 mmol / l töménységű puffert tartalmaz, a pH 8-ról hozzávetőleg csak 7.96-

ra csökken.

Foszfátpuffer

A pufferhatást a foszforsav (H3PO4) 2. disszociációs egyensúlyában szereplő H2PO4− és

HPO42− - ionok hozzák létre:

H2PO4− ↔ H+ + HPO4

2− Ks = 6,2 . 10−8

gyenge sav konjugált bázis

A foszfátpuffer hidrogénion - koncentrációját a dihidrogén-foszfát- és hidrogénfoszfát - anionok

aránya szabja meg :

[H+] = Ks [ ][ ]H PO

HPO

2 4

42

−

−

Innen a foszfátpuffer pH- ja :

pH = pKs + log [ ][ ]

HPO

H PO

42

2 4

−

− azaz pH = 7,21 + log

[ ][ ]

HPO

H PO

42

2 4

−

−

Az élő szervezet sav-bázis egyensúlya különlegesen fontos. A szervezetben a legtöbb

reakció vizes közegben játszódik le. A hidrogénion-koncentráció megváltozása sebességüket

jelentősen módosítja, mivel az enzimek optimális aktivitása csak igen szűk pH-tartományban

érvényesül. A mozgékony hidrogénion befolyásolja a sejtek környezetében az ionok, pl. Na+, K+,

Cl− eloszlását is. A foszfátpuffer a szervezet egyik legfontosabb intracelluláris puffer rendszere,

H2PO4− - és HPO4

2− - anionként a cukorfoszfátokban és a nukleotidokban, elsősorban ATP-ben

kötött foszfátionok szerepelhetnek.

Hidrogén - karbonát - szén - dioxid puffer

A hidrogén-karbonát-szén-dioxid puffer a szervezet alapvető pufferrendszere, a vér pH-t

tartja állandó értéken. Egészséges személynél az artériás pH 7,4 körül, 7,35 és 7,45 között van.

Ha növekszik a pH (pH> 7,6), akkor a sejtek már nem tudják a vérnek kellően átadni a biológiai

oxidáció során képződött szén-dioxidot, a pH csökkenése (pH< 7,3) pedig a gázcserét segíti elő a

7

tüdőben a szén-dioxid leadásával. A vér pH < 7,0 kómát idéz elő. A pufferrendszer fontos

komponensei a szénsav (H2CO3) és ionjai (HCO3−, CO3

2-).

A vér pufferrendszerében a vérben oldott szén-dioxid, CO2 (aq) és a tüdőben lévő gázállapotú

szén-dioxid, CO2 (g) is szerepet játszik. A pH-t három egyensúlyi folyamat alakítja ki.

1, A szénsav első disszociációs lépése:

H2CO3(aq) + H2O (l) ↔ H3O+ + HCO3

−

K1= [ ][ ]

[ ]H HCO

H CO

+ −3

2 3

2. Az oldott szén- dioxid és szénsav egyensúlya :

CO2 (aq) + H2O(l) ↔ H2CO3(aq)

K2 = [ ][ ]H CO

CO aq

2 3

2( )

3. A szén - dioxid oldódása:

CO2(g) + H2O (l) ↔ CO2(aq)

K3 = [ ][ ]CO

CO

aq

g

2

2

( )

( )

pH = 6,1 + log [ ]HCO

pco

3

20 0226

−

,

A vérbe kerülő metabolitok (pl. tejsav) növelhetik átmenetileg a hidrogénion -

koncentrációt, ami H2CO3 képződéséhez vezet. Ez oldott szén- dioxiddá, CO2(aq) alakul át és a

tüdőben gázfázisba lép: CO2(g). A bevitt H+ tehát növeli a pCO2- t , de nem változtatja meg a vér

pH-t mindaddig, amíg elegendő koncentrációjú bikarbonát van jelen (alkáli tartalék). A vér pH

átmeneti emelkedése növeli a [HCO3−]-t, ami a CO2- gáz oldásából, H2CO3 képződésén át

pótlódik.

Feladat:

Az alábbi táblázatok felhasználásával készítse el a gyakorlat vezető által megadott puffer

törzsoldatait majd a megadott pH-jú elegyet. pH mérővel állítsa be a pontos értéket.

8

Trisz (hidroxi-metil)-amino-metán pufferoldat (pH=7,2…9,10;;;;23οοοοC)

A pufferoldat komponensei: 0,5057 g trisz(hidroxi-metil)-amino-metán 50cm3-re oldva, 0,1 mol . dm-3HCL (8,0cm3 cc. HCL 1 dm3-re hígítva). 50,0 cm3 trisz(hidroxi-metil)-amino-metán-oldathoz a táblázatban megadott mennyiségű sósavoldatot adunk és 100,0 cm3-re egészítjük ki.

pH Oldattérfogat, cm3 pH

Oldattérfogat,

cm3

7,20 45,0 8,23 22,5 7,36 42,5 8,32 20,0 7,54 40,0 8,40 17,5 7,66 37,5 8,50 15,0 7,77 35,0 8,62 12,5 7,87 32,5 8,74 10,0 7,96 30,0 8,92 7,5 8,05 27,5 9,10 5,0 8,14

Michaelis-féle foszfátpuffer (pH=5,3…8,3;;;;18 °°°°C)

A pufferoldat komponensei: 1/15 mol.dm-3 kálium-dihidrogén-foszfát-oldat (9,07g KH2PO4 1 dm3-re oldva), 1/15 mol.dm-3 dinátrium-hidrogén-foszfát-oldat (11,88 Na2HPO4.2H2O 1 dm3-re oldva). A pufferoldat komponenseit a táblázatban megadott arányokban elegyítjük.

KH2PO4 Na2HPO4 KH2PO4 Na2HPO4 pH oldattérfogat, cm3

pH oldattérfogat, cm3

4,53 5,29 5,59 5,91 6,24 6,47 6,64

10,00 0,0 9,75 0,25 9,5 0,5 9,0 1,0 8,0 2,0 7,0 3,0 6,0 4,0

6,81 6,98 7,17 7,38 7,73 7,9 8,2

5,0 5,0 4,0 6,0 3,0 7,0 2,0 8,0 1,0 9,0 7,9 9,5 8,2 9,75

9

McIlvaine-féle pufferoldat (pH = 2,2…8,0;;;; 18°°°°C)

A pufferoldat komponensei: 0,2 mol. dm-3 Na2HPO4-oldat (35,60 g Na2HPO4.2H2O 1 dm3-re oldva), 0,1 mol.dm-3 citromsavoldat [21,01 g C3H4(OH) (COOH)3.H2O 1 dm3-re oldva]. A pufferoldat komponenseit a táblázatban megadott arányokban elegyítjük

Na2HPO4 Citromsav

Na2HPO4 Citromsav

pH

Oldattérfogat, cm3

pH

Oldattérfogat, cm3

2,2 0,40 19,60 5,2 10,72 9,28 2,4 1,24 18,76 5,4 11,15 8,85 2,6 2,18 17,82 5,6 11,60 8,40 2,8 3,17 16,83 5,8 12,09 7,91 3,0 4,11 15,89 6,0 12,63 7,37 3,2 4,94 16,06 6,2 13,22 6,78 3,4 5,70 14,30 6,4 13,85 6,15 3,6 6,44 13,56 6,6 14,55 5,45 3,8 7,10 12,90 6,8 15,45 4,55 4,0 7,71 12,29 7,0 16,47 3,53 4,2 8,28 11,72 7,2 17,39 2,61 4,4 8,82 11,18 7,4 18,17 1,83 4,6 9,35 10,65 7,6 18,73 1,27 4,8 9,89 10,14 7,8 19,15 0,85 5,0 10,30 9,70 8,0 19,45 0,55

10

KROMATOGRÁFIÁS ELVÁLASZTÁSI

MÓDSZEREK

A kromatográfiás módszerek elve

A kromatográfiai eljárások azon az elven alapulnak, hogy az áramló folyadékban vagy

gázban (a mozgó fázisban) oldott anyagok egy porózus szilárd hordozón (az álló fázison)

áthaladva különböző mértékben vándorolnak. A vándorlási sebességet a mozgó fázis és az álló

fázis molekulái között kialakuló fizikai, kémiai kölcsönhatások határozzák meg. A fázisok között

dinamikus egyensúly van. Bármely időpontban a mozgófázisban található molekulák relatív

mennyisége határozza meg azt, hogy a komponens milyen gyorsan halad át az oszlopon, mert

amíg a molekulák az állófázisban tartózkodnak, addig az oszlop hossztengelyén nem mozdulnak

el. Ezért azok a molekulák, amelyek időben többet vannak az állófázisban lassabban jutnak át az

oszlopon. Az eltérő mozgássebesség a komponensek eltérő egyensúlyi megoszlása révén alakul

ki. Ezért a mozgássebességet az egyensúlyi megoszlást meghatározó tényezők szabják meg, így

a mozgó és az állófázis összetétele, az elválasztás hőmérséklete.

A kromatográfiás módszerek csoportosítása

- Az elválasztás elve, azaz az álló és a mozgó fázis molekulái között kialakuló

kölcsönhatások alapján beszélhetünk megoszlási, adszorpciós, ioncserés, gél-, affinitás-, illetve

kovalens kromatográfiáról. Az esetek többségében azonban ezek az elvek nem elkülönülten

jelentkeznek, hanem két vagy több hatás eredőjével kell számolnunk (pl. adszorpciós és

megoszlási kromatográfia).

Megoszlási kromatográfia.

A folyadék-folyadék vagy megoszlási kromatográfia állófázisa olyan folyadék, amelynek

összetétele eltér a mozgófázisétól. A minta molekulái megoszlanak a két folyadék között –

ugyanúgy, ahogy a rázótölcsérben végzett extrakció során. A mozgó és álló fázis két, nem

elegyedő folyadék. Az állófázist kémiai úton a hordozó szemcséire is köthetik. Az álló és mozgó

fázis, a hordozó polaritásától függően, az elúció során jön létre. Például a sok hidroxil csoportot

tartalmazó cellulóznál, víz – alkohol keverékével egy cellulóz – víz komplex alakul ki és képezi

az álló fázist. Ugyanez az oldószerkeverék a fordított fázisú kromatográfiánál, C18 alkil

csoportot rögzítve a szilicium-dioxid mátrixhoz, az alkohol adja az álló fázist és a polárosabb víz

11

a mozgó fázist. Az oldatban levő anyagok a megoszlási hányadosuk arányában tartózkodnak az

álló, illetve mozgó fázisban.

Adszorpciós vagy folyadék-szilárd kromatográfia esetében az állófázist nagy felületű,

szilárd szemcsék alkotják. A minta az álló fázis (pl. aktív szén, alumíniumoxid, szilikagél,

zeolitok, keményítő, cellulóz, dextrán) szilárd szemcséinek határfelületein felhalmozódik,

melynek mértékét a komponensek adszorpciós együtthatói határozzák meg. A megfelelően

megválasztott rendszerben az elválasztandó anyagok adszorpciós együtthatói különböznek, így a

komponensek fokozatosan hagyják el a szilárd fázist. Az adszorpciót leginkább befolyásoló

tényező a minta polaritása az álló, illetve a mozgó fázishoz viszonyítva.

Oldószerek tapasztalati eluotróp sora alumíniumoxid adszorbensre és dielektromos

állandóik.

________________________________________________________________

eluáló képesség dielektromos állandó

________________________________________________________________

hexán 0.01 1.88

ciklohexán 0,04 2.02

CCI 0.18 2.24

diizoprppiléter 0.28 3.88

dietiléter 0.38 4.33

CHCI 0.40 4.80

CHCI 0.42 8.93

aceton 0.56 21.40

etilacetát 0.58 6.11

acetonitril 0.65 37.50

etanol 0.88 25.80

metanol 0.95 33.60

víz nagy 80.40

formamid nagy 110.00

ecetsav nagy 6.10

12

Ioncserés kromatográfia.

Az ioncserélők állófázisa olyan anyag, (pl. dextrán, cellulóz, polisztirol), amelyre

kovalens kötéssel elektrolitos disszociációra képes pozitív vagy negatív töltésekkel rendelkező

funkciós csoportokat (pl. szubsztituált kvaterner ammóniumion, illetve szulfát-, karboxil-

csoportokat) köthetünk, melyeknek az ellen-ionjai a mozgó vizes fázis ionjaival reverzibilisen

kicserélhetőek. Az elválasztás alapja ebben az esetben a töltések nagyságának különbözősége.

Ha a szilárd hordozón pozitív töltéseket rögzítettünk, akkor anion-cserélőről, ellenkező esetben

kationcserélőről van szó. A reverzibilisen kötött ionokat az álló fázis felületéről leszoríthatjuk

egy másik iont nagy koncentrációban tartalmazó eluens áramoltatásával.

Biológiai anyagoknak ioncserés kromatográfiás elválasztására alkalmas funkciós csoportjai

vannak, melyek köthetők cellulóz, SEPHADEX, agaróz, stb. OH-csoportjaihoz. A fehérjék, mint

ionok szétválasztásában nagy jelentőségre tettek szert különböző kémiai módosításokkal

ioncserélő sajátosságúvá tett cellulóz származékok. A legáltalánosabban elterjedt ilyen

származék a DEAE-cellulóz (Dietil-Amino-Etil-cellulóz), ahol a cellulóz OH-csoportjainak egy

részéhez éter kötéssel kapcsolt gyök, mint tercier amin anion cserélő sajátosságokat kölcsönöz a

cellulóznak. Így a DEAE-cellulóz az izoelektromos pontjuknál magasabb pH-n a fehérjéket

anion formában megköti. Az ionerősség vagy a pH fokozatos változtatásával a fehérje anionok

elektromos töltésük erősségétől függően frakcionáltan eluálhatók.

Affinitáskromatográfia.

Specifikus biokémiai kölcsönhatásokat kihasználó elválasztási módszer. Ha egymáshoz

szelektíven kötődő molekula párok (pl. antitest-antigén, enziminhibítor, receptorligand) egyik

tagját a funkció károsodása nélkül egy szilárd hordozóhoz (pl. agaróz, poliakrilamid) kovalens

kötésekkel rögzítjük, akkor a molekula pár másik tagját igen nagy hígításban, illetve nagy számú

komponenst tartalmazó elegyből is kinyerhetjük. A reverzibilisen megkötött anyagot az elúciós

körülmények megfelelő megváltoztatásával nyerhetjük vissza.

Egy szacharóz táptalajon növesztett gomba (Leuconostoc mesenteroides) terméke az 1,6

kötésekkel összekapcsolt, glükóz egységekből álló, láncot képező poliszacharid, a dextrán. A

polimer molekulatömege egy millió Daltonnál nagyobb, nyálkás anyag. A glükóz

hidroxilcsoportjain keresztül epiklórhidrinnel keresztkötések alakíthatók ki. Ha a reakciót

emulzióban végzik, a megszilárduló cseppek gyöngypolimert képeznek, ez a SEPHADEX. A

reakciót úgy vezetik, hogy a gömböcskék átmérője 40-100µm körül alakuljon. Az epiklórhidrin

mennyiségével a keresztkötések száma változtatható. Sok keresztkötés szilárdabb terméket ad,

13

vízmegkötő képessége csökken. A keresztkötésekre és a molekulaszűrésnél mutatott elválasztási

tartományra a vízmegkötő képességből következtethetünk. A SEPHADEX G100 azt jelenti,

hogy 10g száraz termék, szabványkörülmények mellett, 100 g vizet képes megkötni. G a

gélszűrésre utal. A térhálósítás után még megmaradó OH-csoportokra töltést viselő, funkciós

csoportok kapcsolhatók. Ezzel kémiailag módosított, ioncserés kromatográfiára alkalmas

SEPHADEX termékekhez jutunk.

Gélszűrés.

A molekulaszűrők különféle, vízben oldhatatlan polimerek (pl.dextrán, poliakrilamid)

megfelelően térhálósított származékai, Sephadex, Biogel, Molselect, Acrylex stb. néven kerülnek

kereskedelmi forgalomba. A térhálósítás mértékétől függően a gyöngyszerű polimer részecskék

belsejében kisebb-nagyobb hézagok vannak. A szétválasztandó anyagok, méretűktől függően

vagy behatolnak a hézagokba vagy nem.

A nagyméretű részek az üregekbe nem hatolnak be, és akadály nélkül áthaladnak a

molekulaszűrőkből készített oszlopon. A kisebb méretűek behatolnak a hézagokba, és csak

késleltetve haladnak át az oszlopon. Ha az oszlopról lecsurgó anyagokat frakciónként gyűjtjük,

akkor először a nagy molekulasúlyú komponensek jelennek meg, majd rendre a kisebb méretű

anyagok is.

Kovalens kromatográfia.

Olyan elválasztási módszer, amelyben egy specifikus hordozó és az oldat egy

komponense között kémiai kötés alakul ki, míg az oldat többi komponense változtatás nélkül

eluálható. A megkötött anyag egy újabb kémiai reakcióval szabaddá tehető.

A mozgó fázis halmazállapota szerint megkülönböztetünk folyadék-, illetve

gázkromatográfiát.

Az elválasztandó anyagok az álló fázisról történő kinyerése, eluálása alapján

folyamatos, lépcsőzetes és gradiens elúciót különböztethetünk meg.

A folyamatos elúcióban az oldószert tisztán, folyamatosan adagoljuk. Akkor alkalmazzák, ha a

komponensek állófázishoz való affinitása nem különbözik nagy mértékben, ezért az egyes

komponensek nem nagy intervallumokkal, viszonylag kevés oldószerrel eluálhatók. Lépcsőzetes

elúciónál a komponensek kinyerése növekvő eluáló képességű oldószerekkel, szakaszosan

14

történik. A folyamatosan változó összetételű oldószer eleggyel történő eluálást gradiens

elúciónak nevezzük. Előnye, hogy csökkenti a sávszélességet és megszünteti az elhúzódást.

A módszer kivitelezése alapján beszélhetünk oszlop-, vékonyréteg-és

körkromatográfiáról.

Az oszlopkromatográfiánál a szilárd álló fázist egy inert (pl. üveg, műanyag, fém)

oszlopba töltik, míg a vékonyréteg kromatográfiánál a hordozót egy sík felületre viszik fel. Az

előbbi esetben a mozgó fázis áramoltatását a természetes gravitáció, illetve különböző

kialakítású pumpák, míg az utóbbi esetben a száraz álló fázis és a nedves mozgó fázis határán

kialakuló kapilláris hatás biztosítja. Körkromatográfia esetében a mintát kör alakban viszik fel a

korongot formáló álló fázisra, az eluáló szert pedig a kör középpontjába vezetik. A mozgó fázis

folyása centrifugálással gyorsítható.

Az elválasztás méretei alapján megkülönböztethetünk analitikai, preparatív, kísérleti

üzemi, ipari kromatográfiát.

Analítikai célokra inkább vékonyréteg-, preparatív, illetve üzemi célokra pedig inkább

oszlopkromatográfiát használnak.

A detektálás szempontjából megkülönböztetünk belső és külső kromatogrammot.

A belső kromatogram a kromatográfiás töltetlen láthatóvá tett eredmény (pl. vékonyréteg

kromatográfiánál a lemez valamilyen festékkel való lefújása, vagy oszlopkromatográfiánál

színes vagy fluoreszkáló anyagok elválasztása), elsősorban analitikai alkalmazásoknál. A külső

kromatogram az elválasztó rendszeren kívül regisztrált eredmény (pl. az oszloptól szedett

frakciók fehérjetartalmának mérése, vagy az oszlop után kötött UV-detektor által folyamatosan

mért abszorbancia változás), elsősorban preparatív célokra.

A hagyományos kromatográfiás eljárások mellett napjainkra széleskörűen elterjedt az

úgynevezett nagy nyomású (High Pressure) vagy nagy felbontású (High Performance)

folyadékkromatográfia (Liqid Chromatograhy), azaz a HPLC technika is. Jellemzője, hogy kis

szemcseméretű tölteten, 30-400 bar nyomással, gyorsan, kevés oldószer felhasználásával, nagy

precizitású pumpák és detektorok automatizált rendszerbe foglalásával a hagyományos

módszereknél hatékonyabb és jobban reprodukálható elválasztás érhető el.

15

Sok komponenst tartalmazó elegyek elválasztásánál fontos, hogy az egyes anyagok nagyon kis

térfogatban eluálódjanak, a csúcsok keskenyek legyenek, a feloldóképesség nagy legyen. Az

egyik tényező, mely a feloldóképességet befolyásolja az oszloptöltet anyagának szemcsemérete.

Minél kisebb részecskékből áll a töltet, annál nagyobb a feloldóképesség. Analitikai célokra ma

már 3-5 µm átméretű golyó alakú sziliciumdioxid mátrixokat használnak. Ezek a golyócskák

porózusak, az oldószerek a gömb belsejéhez is hozzáférhetnek. Oszlopba töltve a kis átmérők

miatt igen szűk járatok alakulnak ki a gömbök között. Az átfolyatott eluálószer viszkozitása

függvényében alakul ki a szükséges, 30-400 bar nyomás, mellyel a megkívánt áramlási sebesség

elérhető. Ilyen nagy nyomások elviselésére a sziliciumdioxid mátrix kiválóan alkalmas. A

sziliciumdioxid mátrix számos OH-csoportot hordoz, melyhez kovalens kötéssel különböző

csoportok kapcsolhatók. Ilyen csoportok: fordított fázisú kromatográfiához a C2, C8 és C18

szénatomot tartalmazó alifás láncok (etil, oktil, oktadecil). Aminopropil, cianopropil csoport más

típusú elválasztásokra. Ezekkel a módosított sziliciumdioxid mátrixot tartalmazó

oszloptöltetekkel a nagynyomású folyadékkromatográfia rendkívül széles alkalmazási területre

tett szert.

Gyakorlatok:

1,Pirospaprika őrlemény színanyagainak vékonyréteg-kromatográfiás vizsgálata

A paprika színanyagainak szétválasztását Kieselgel G vékonyrétegen adszorpciós

folyadék-kromatográfiával végezzük. Ebben az esetben a szilárd fázis a vékonyréteg, amelyre a

szétválasztandó elegyet felcseppentjük, a mozgó fázis a folyadékelegy, amelyet kapilláris erők

mozgatnak. A színanyagok szétválasztása szemmel is jól követhető. A paprika színanyagainak

abszorpciós maximuma különbözik egymástól, benzolban:

λλλλmax színanyag λλλλmax színanyag

465 mutatoxantin 493 β-kryptoxantin

483 violaxantin 493 zeaxantin

486 kapszantin 494 β-karotin

486 kryptokapsin 508 kapszantin

epoxid

488 anteraxantin 522 kapszorubin

16

Ha a szétválasztott színanyagok egyikét a vékonyrétegről levakarjuk, és megnézzük az

abszorbancia változását a hullámhossz függvényében, az abszorpciós maximum alapján a

színanyagot azonosíthatjuk.

Karotinok

H3C

H3C

H3C

CH3

CH3

CH3

CH3CH3

CH3 CH3

β-karotin

A poliénmolekula két gyűrűjét egy 22 szénatomos lánc köti össze, amelyben a kettős

kötések konjugált rendszerben helyezkednek el. A gyűrűket ββββ-jonongyűrűnek nevezzük. A

gyűrűben a telítetlen kötés az oldallánc mellett helyezkedik el. Ezzel szemben αααα-jonongyűrűről

beszélünk akkor, ha a telítetlen kötés az oldallánchoz viszonyítva egy atommal távolabb

található. Maguk a gyűrűk is képzeletben 2 izoprénegységre bonthatók. A gyűrűket összekötő

lánc építőeleme is izoprénváz.

A β-karotin táplálkozástani szempontból rendkívül fontos, mert az A-vitamin

provitaminja. A szervezetben oxidatív behatásra középen kettészakad, miközben két molekula A-

vitamin képződik:

CC

C

C

C

C

C

CCH2OH

H H H H

HH

CH3 CH3

CH3

H3C CH3

A-vitamin

A β-karotin szerkezetére jellemző, hogy molekulájában 11 olefinkötést tartalmaz

konjugált rendszerben. Ez a szerkezet okozza mély színét. Kristályai sárgásvörös színűek,

17

kékesen fénylő felülettel. A zöld levelek fő karotinoid alapanyaga. A spenót kloroplasztisz-

lamelláiban pl. a klorofill:karotinoid arány: 1:0.25.

A növényekben előfordul még α- és γ-karotin is. Felépítésük a β-karotinéhoz hasonló.

Különbség csak a molekulák kis részletében van: az α-karotin második gyűrűje α-jonon

szerkezetű, a γ-karotinban az egyik gyűrű már felszakadt:

H3C

H3C

CH3CH3CH3

CH3CH3

CH3

CH3H3C

α-karotin

H3C

H3C

CH3CH3CH3

CH3CH3H3C

CH3

CH3

γ-karotin

Az oxigént nem tartalmazó karotinoidok további fontos tagja a likopin. Nevét onnan

kapta, hogy először a paradicsomból (Lycopersicon esculentum) állították elő:

CH3 CH3

CH3 CH3CH3

H3C

H3C

H3C CH3

CH3

15'

15

likopin

Xantofillok

A karotinoidok második fő csoportját az oxigént tartalmazó karotinoidok alkotják.

Bennük az oxigén különböző funkcionális csoportot képez. A xantofillokat a megfelelő

18

karotinokból vezethetjük le. Eszerint az α-karotin dihidroxi-származéka a lutein vagy más néven

xantofill, a β-karotin dihidroxiszármazéka a zeaxantin. Az oxigént tartalmazó karotinoidokhoz

tartozik a piros paprikában előforduló kapszantin és kapszorubin:

CH3H3C

H3C

CH3CH3

CH3CH3H3C

CH3

CH3

HO

H

OH

H

lutein

H3C

H3C

CH3CH3

CH3CH3H3C

CH3

CH3

HO

H

OH

H

CH3

zeaxantin

H

OH

H

HO

H3CCH3 CH3

CH3 CH3

H3C

H3C CH3

CH3

CH3

C O

kapszantin

H

OH

H

HO

H3CCH3 CH3

CH3 CH3

H3C

H3C CH3

C O

CH3

CH3

CO

kapszorubin

19

Anyagok és eszközök:

Kieselgel G vékonyréteg

futtatóelegy (a méréshez előre elkészítve), melynek összetétele:

petroléter (40.0 ml)

benzol (10.0 ml)

ecetsav ( 2.5 ml)

aceton ( 2.5 ml)

fűszerpaprika benzolos kivonata (15 g/ml), pipetták, kapillárisok, futtatókád, kés,

spektrofotométer, küvetták, hajszárító

A gyakorlat menete:

A Kieselgel G rétegre az aljától kb. 1.5 cm-re ceruzával vékony startvonalat húzunk

úgy, hogy a vonal vége a lap két oldalától 1-1 cm-re legyen. 0.1 ml paprika kivonatot több

részletben kapilláris segítségével erre a vonalra visszük fel, a vékonyréteget megszárítjuk és a

futtatóelegyet tartalmazó kádba helyezzük. A futtatókádat lefedjük és kb. 45 percig

kromatografálunk (az oldószer útja kb. 18 cm). A lapot kivesszük, megszárítjuk, majd a

szétválasztás hatásfokának növelésére a futtatást megismételjük.

A 2. futtatás után a vékonyréteget ismét megszárítjuk. Az egyik, közösen kiválasztott

sávot késsel fehér papírra vakarjuk, a port kémcsőbe töltjük, 2 ml benzollal összerázzuk és redős

papírszűrőn történő szűrés után különböző hullámhosszoknál fotometrálunk (a fotométert

minden hullámhossznál benzolra nullázzuk).

Feladat:

A megfuttatott és megszárított lemezt rajzoljuk le. A fotometrálás után ábrázoljuk az

abszorbanciát a hullámhossz függvényében; a görbe lefutásából következtessünk arra, melyik

színanyagot izoláltuk!

2. Szérumfehérjék elválasztása ioncserével DEAE-cellulóz oszlopon

A fehérjék, mint ionok szétválasztásában igen nagy jelentőségre tettek szert különböző kémiai

módosításokkal ioncserélő sajátságúvá tett cellulóz származékok. A legáltalánosabban elterjedt

ilyen származék a dietil-amino-etil (DEAE) cellulóz. A cellulóz OH-csoportjainak egy részéhez

éter kötésben kapcsolt gyök, mint tercier amin, anioncserélő sajátságokat kölcsönöz a

20

cellulóznak. A DEAE-cellulóz gyenge ioncserélő, így az izoelektromos pontjuknál magasabb

pH-n a fehérjéket anion formájában megköti. Az ionerősség vagy a pH folyamatosan

(gradiensben) történő változtatásával a fehérje anionok elektromos töltésük erősségétől függően

frakcionáltan eluálhatók.

Anyagok és eszközök:

Aktivált DEAE cellulóz

Szérum 0,05 M Tris/HCl puffer-rel (pH=7,7) szemben dializálva

0,05 M Tris/HCl puffer (pH=7,7)

1,0 M KCL 0.05 M Tris/HCl pufferben (pH=7,7)

kromatografáló oszlop, mágneses keverő, 2 db 250ml-es főzőpohár, hébércső, mérőhenger,

ultraibolya fotométer, vezetőképesség mérő

DEAE cellulóz előkészítése:

1, Tisztítás

Az oszlopba töltés előtt el kell távolítani a túl finom és a túl durva részeket az

ioncserélőkből. A durva részecskék (150µm) eltávolítása megkönnyíti az oszlopkészítést és

megakadályozza a csatornaképződést az oszlopban. A finom részek eltávolítása javítja az oszlop

átfolyási sebességét.

a, A finom részek eltávolítása: 10g ioncserélőt 200 ml ionmentes vízben

szuszpendáljuk, gyengén megkeverjük, egyenletesen elosztva a részecskéket 30 percig állni

hagyjuk, majd leöntjük a folyadékot a leülepedett ioncserélőről. A leöntött folyadékkal a le nem

ülepedett túl finom részecskéket távolítjuk el az anyagból.

b, A durva részek eltávolítása: Az ioncserélőt 200 ml ionmentes vízben szuszpendáljuk,

gyenge keveréssel elosztva egyenletesen a részecskéket a folyadékban, 1-2 perc állás után a

durva részek leülepednek. Ekkor dekantáljuk a még lebegő, közepes szemcsenagyságú részeket a

leülepedett durva szemcsék visszahagyásával. A maradékot használjuk oszlop készítésére.

21

2, Aktiválás

Minél nagyobb kromatográfiás hatásosság elérésére az ioncserélőt ajánlatos egyszer H+

és OH- cikluson átvinni. Nem célszerű a kezelést oszlopban végezni, hanem az oszlopba töltés

előtt lombikban.

10 g ioncserélőt szuszpendálunk 150 ml 0.5 N sósavban és 1 órán át állni hagyjuk. Büchner-

tölcséren leszűrjük, és ionmentes vízzel pH=5.0-ig mossuk. Az ioncserélőt 150 ml 0.5 M NaOH-

ban szuszpendáljuk, egy órán át állni hagyjuk, szűrjük, és ionmentes vízzel pH=7.0-ig mossuk.

Végül a használandó pufferoldatban szuszpendáljuk az ioncserélőt az oszlopba töltés előtt.

A kationcserélők ciklizálása ugyancsak a fent leírtak szerint történik, csak a savas és a lúgos

kezelést fordított sorrendben kell végezni.

3, Oszlopkészítés

Az ismert kromatográfiás oszlopok jól felhasználhatók a cellulóz ioncserélő oszlopok

készítésére is. A normál oszlopmagasság 10-20 cm, a magasság és a belső átmérő aránya 5-10

között változik. A töltést úgy kell elvégezni, hogy a töltet buborékmentes, egyenletesen töltött és

vízszintes ágyfelszínű legyen!

Első lépésként az előkezelt cellulóz ioncserélőt szuszpendáljuk a megfelelő pufferben

(szilárd – folyadék arány kb. 1:20). Az oszlop aljára üveggyapotot teszünk, az oszlop tetejére

pedig tölcsért rögzítünk. Az oszlop kifolyócsapját elzárjuk, és a cellulóz ioncserélő

szuszpenzióját lassan a tölcsérbe öntjük. Mikor a leülepedett ioncserélő réteg néhány cm

magasságot elért, kinyitjuk az oszlop csapját, és az ülepítést áramló rendszerben folytatjuk. A

kívánt töltetmagasság elérése után a tölcsért leszereljük.

Közvetlen használat előtt az oszlop felületéről leengedjük a puffer oldatot a töltet

felszínéig, és a minta oldatát óvatosan a felület felkavarása nélkül visszük fel az oszlopra, a töltet

felszínére. A töltet felkeveredését meggátolhatjuk, ha a tetejére szűrőpapírkorongot helyezünk. A

maximális kromatográfiás hatásosság eléréséhez a teljes elméleti kapacitás alapján számolt minta

mennyiségnek csak kis részét célszerű felvinni az oszlopra. Jó szeparálás eléréséhez 1.0 g száraz

cellulóz ioncserélőre számítva maximálisan 0,1 g fehérje vihető fel.

4, Regenerálás

Használat után az oszlopot 0,5 N nátriumhidroxiddal ill. sósavval lehet regenerálni az

előciklizálásnál leírtak szerint.

22

A gyakorlat menete:

1. Az anyag felvitele az oszlopra

A gyakorlathoz 2 cm átmérőjű és 16 cm magas DEAE cellulóz oszlopot készítünk 0,05

M Tris/HCl puffer segítségével (pH=7,7). Az oszlopra 30 mg fehérjét viszünk fel (amit előzőleg

ugyanezzel a pufferrel szemben dializáltunk) 0,5-1,0 ml pufferben. Az anyagot 2 x 1,0 ml fenti

pufferrel bemosunk az oszlopba. Körülbelül 1 ml/perc átfolyási sebességgel dolgozunk.

2. Eluálás

A nem kötődött fehérjéket pufferrel kimossuk az oszlopból addig, amíg E280-on követve

a frakciók fényelnyelését, az eluens fehérjét már nem tartalmaz. 3.5 ml-es frakciókat szedjünk

(kb. 12 darabot).

A megkötődött fehérje eluálását lineáris KCl gradiens elucióval végezzük. A gradiens

előállítására két, hébercsővel összekötött egyenlő nagyságú főzőpohár szolgál, melyek közül az

egyik 200 ml 1,0 M KCl-ot (Tris/HCl pufferben pH =7,7), a másik 200 ml KCl-mentes Tris/HCl

pH = 7,7 puffert tartalmaz. Az utóbbi főzőpohárból – melyben az egyenletes keveredést

mágneses keverő segítségével biztosítjuk – tápláljuk az oszlopot egy kapilláris csövön keresztül.

Az első pohárból a másodikba való folyadékáramlás sebességét az oszlopból kifolyó folyadék

sebessége szabja meg. Az eluálás során 30-35 db 3,5 ml-es frakciót gyűjtünk.

Feladatok:

1. Mérjük meg a 3,5 ml-es frakciók extinkcióját 280 nm-nél, és a vezetőképességüket!

2. Ábrázoljuk az abszorpciót és a KCl koncentrációt a frakciók számának függvényében,

ugyanazon a grafikonon! A frakciók KCl koncentrációját kalibrációs egyenes alapján

határozzuk meg 1M KCl oldatból, öt lépcsős hígítási sort készítve 0,05 M Tris/HCl puffer

(pH=7,7) segítségével!

23

SPEKTROFOTOMETRIA

Igen elterjedt vizsgálati módszer a színkép megfelelő tartományában fényelnyelő

tulajdonságú vegyületek (anyagok) azonosítására és meghatározására. A módszer kis

mennyiségű anyagok gyors és pontos mérésére alkalmas.

A spektrofotometriát az alkalmazott hullámhossz tartománya szerint több csoportba

oszthatjuk fel, a gyakorlatok során közülük kettőt használunk:

- a látható fény tartományában végzett mérések, ahol az abszorpciós maximum 350-850 nm

közé esik (színes anyagok),

- az UV spektroszkópia, ahol az abszorpciós maximum 200 és 350 nm közé esik.

- ebben a tartományban csak kvarcüveg küvetta használható.

A spektrofotometria alkalmazása szerint is több csoportba osztható, ezek közül az alábbiakkal

foglalkozunk:

- Anyagok minőségi azonosítása: különböző vegyületek fényelnyelése a külső elektronhéj

állapotától függ, a különböző lehetséges gerjesztett elektronállapotok közötti elektronátmenetek

más és más hullámhossznál okoznak abszorpciós maximumot. Az abszorpciós maximum (ok)

helye jellemző a megfelelő gerjesztett és alapállapotú elektronpályák közötti elektronátmenetre,

így jellemző a megfelelő molekularészletre, sőt az egész molekulára is. Ha az abszorpciót a

hullámhossz függvényében ábrázoljuk, jellegzetes, egy vagy több maximumot (és

értelemszerűen minimumot) tartalmazó, a vegyületre jellemző görbét kapunk, amelyet az illető

anyag azonosítására is felhasználhatunk.

- A spektrofotometria legelterjedtebb alkalmazása fényelnyelő tulajdonságú vegyületek

mennyiségi meghatározása az anyag abszorpciós maximumához tartozó hullámhosszon. Ha a

vizsgálandó anyagnak a kérdéses hullámhossz tartományban nincs fényelnyelése, valamilyen

kémiai reakcióval gyakran fényelnyelő tulajdonságú vegyületté alakítható.

A spektrofotometriás mennyiségi analízisek az oldatok fényelnyelésére vonatkozó Lambert-Beer

törvényen alapulnak.

A fényáteresztő képesség, vagy transzmisszió (T) egyenlő: valamely oldatból kilépő fény

intenzitásának (I) aránya a beeső fény (I0) intenzitásához.

24

T= 0I

I

Gyakorlatilag a fotometrálásnál nincs szükségünk a beeső I0 intenzitásának mérésére, hanem

ehelyett mérjük a vizsgált oldatból kilépő fény viszonyát a tiszta oldószerből kilépő fényhez (Ib).

Eszerint módosítva a

T= bI

I

A transzmisszió tehát relatív érték, mely 1-nél mindig kisebb. Mérésnél a tiszta oldószerből

kilépő fény intenzitását önkényesen 100-nak véve meghatározzuk, hogy ennek hány %-át

bocsátja keresztül az oldat. Eszerint a

T % = bI

I⋅ 100

Egy oldat transzmissziója függ:

a) az oldott anyag természetétől

b) az alkalmazott fény hullámhosszától

c) a fényt abszorbeáló anyag koncentrációjától.

A Lambert-Beer törvény szerint:

T= 10-k l c

k = az anyagra jellemző koncentráció vagy moláris fényelnyelési együttható (moláris

extinciós koefficiens), mely egyenlő 1M oldat 1 cm vastag rétegénél mért fényelnyeléssel.

c = koncentráció mólokban,

l = rétegvastagság, melyen a fény áthatol, cm-ben.

Az egyenlet logaritmálásával

- log T = k l c = A (abszorbancia, extinkció)

25

Az (1) egyenletből ugyanezt az értéket kifejezve:

- log T = 1og

A 1og kifejezést abszorbanciának (A), extinkciónak (E) vagy optikai sűrűségnek (OD) nevezzük.

Abszorbeáló anyagok oldatának extinkciós koefficiense olyan hullámhossznál, amelynél az

oldószer nem abszorbeál, a Lambert-Beer-törvény szerint arányos az oldat koncentrációjával, ha

az oldott anyag a hígítás alkalmával nem megy át molekuláris változáson.

1 cm-es küvetta (planparallel üvegből, vagy kvarcból készült mérőedény) használata esetén

c = k

A

Ha a mérendő anyag nem követi pontosan a Lambert-Beer törvényt, egyéb módon

pontosan meghatározott koncentráció sorozat segítségével kalibrációs görbét készítünk. Ennek

alapján megfelelő korrekcióval elvégezhetőek a mérések.

Gyakorlatok:

1, A metilénkék oldat abszorpciós spektrumának felvétele.

Anyagok és eszközök:

spektrofotométer küvettákkal, kémcső, pipetta, 0.01 %-os metilénkék oldat

Az abszorpciós maximum megállapítása céljából felvesszük a metilénkék oldat

spektrumát. Ezt elvégezhetjük szakaszos fotométerrel, vagy folytonos spektrofotométerrel. Az

abszorpciós maximum megállapítása olyan módon történik, hogy egy alkalmas koncentrációjú

metilénkék oldatot több hullámhosszon megmérünk. Az így kapott értékeket grafikusan ábrázolva

(abszorbanciát a hullámhossz függvényében) megkapjuk az abszorpciós maximum helyét.

0.01 %-os metilénkék oldatból húszszoros hígítást készítünk. A hígított oldat

abszorbanciáját megmérjük 500 és 675 nm között, legalább 5 nm-enként. A kapott abszorbancia

értékeket grafikusan ábrázoljuk.

26

2, Ismeretlen koncentrációjú metilénkék oldat koncentrációjának meghatározása.

Ha egy adott anyag oldatára érvényes a Beer törvény, akkor ennek különböző

koncentrációjú oldatait adott hullámhosszon mérve, a kapott abszorbanciának arányosnak kell lenni

a koncentrációkkal.

A 0.01 %-os metilénkékből hígítási sorozatot készítünk, a következő módon:

hat kémcsövet megszámozunk, az 1-es számú kémcsőbe bemérünk 1 ml 0.01 %-os metilénkéket és

feltöltjük 10 ml-re. A következő kémcsövekbe (2-6) bemérünk 5-5 ml desztillált vizet, ezután az 1-

es sz. kémcsőből 5 ml-t bemérünk a 2-es sz. kémcsőbe. Összekeverés után a 2-es sz. kémcsőből 5

ml-t bemérünk a 3-as számú kémcsőbe, majd a 3-asból összerázás után 5 ml-t a 4-esbe stb. Így

minden kémcsőben fele olyan tömény metilénkék oldatot kapunk, mint a vizsgált kémcsövet

megelőző kémcsőben. Az oldatokat fotometráljuk 625 nm-nél. A kapott extinkciókat a koncentráció

függvényében ábrázoljuk.

Feladat:

Határozzuk meg az ismeretlen hígítású metilénkék oldat koncentrációját.

27

FIZIOLÓGIÁS OLDATOK ÖSSZEÁLLÍTÁSA

A szervezet normális működéséhez elengedhetetlen a homeosztázis fenntartása, melybe

bele tartozik az ozmotikus viszonyok állandósága (isozmozis), a pH állandóság (isohydria) és az

állandó ionösszetétel (isoionia) biztosítás is. A homeosztázisban bekövetkező változások a sejtek

rendellenes működéséhez vezetnek. A testfolyadékok jellemezhetők ozmolaritásuk alapján, mely

1 dm3 oldatban megadja az ozmotikusan aktív ionok mennyiségét molban. Például 1 mol/l NaCl-

oldat ozmolaritása: 2 osmol. Az emberi vér esetében az osmolalitás 300 mosmol.

Feladat:

1, Készítsen fiziológiás só-oldatot emberek számára! Az ozmolaritás alapján számolja ki,

mennyi NaCl-ot kell bemérni 100 ml desztillált vízhez, hogy isozmotikus só-oldatot kapjunk!

2, Készítsen 100 ml fiziológiás só-oldatot békáknak, melynek koncentrációja az emberi

fiziológiás só- oldat 65%-a. Számolja ki az oldat ozmolaritását!

Anyagok és eszközök:

főzőpohár/ lombik, mérőhenger, vegyszer adagoló kanál, mérleg, mágneses keverő

NaCl, desztillált víz

Adatok: Na 23 g/mol; Cl 35,5 g/mol

A gyakorlatban fiziológiás só-oldatot vér-térfogat pótlására, kiszáradás elkerülésére

alkalmazzák. Ha a vérbe hipoozmotikus folyadék kerülne, az a sejtek duzzadását, a vörösvértestek

kipukkadását (hemolízist) okozna. Ha viszont a vér töményebb, hiperozmotikus folyadékkal kerülne

kapcsolatba, akkor a vörösvértestek vizet veszítenének, buzogány alakot vennének fel. Egyik esetben sem

lennének képesek ellátni szerepüket, vagyis a légzési gázok szállítását a szervekhez. Az ozmotikus

viszonyok fenntartása tehát nélkülözhetetlen az életben maradáshoz.

A szervek normális működéséhez azonban a fiziológiás só-oldatban lévő Na+ és Cl- -on kívül egyéb ionok

is elengedhetetlenek, úgymint Ca2+, K+ vagy HCO3-. A testnedvekéhez hasonló ion-összetételű,

izozmotikus folyadék a Ringer-oldat. Komponenseinek koncentrációja fajonként eltérő.

Feladat:

Számolja ki a béka-Ringer tömegszázalékos összetételét, ha a moláris összetétele: 0,111 mol NaCl

0,00268 mol KCl

0,0018 mol CaCl2

0,00595 mol NaHCO3 literenként. A pH 7,2.

28

Ezek alapján készítsen el 1 liter béka Ringer-oldatot!

Anyagok és eszközök:

főzőpohár, mérőkanál, mágneses keverő

NaCl, KCl, CaCl2, NaHCO3, desztillált víz

Adatok: Na 23 g/mol; Cl 35,5 g/mol; K 39 g/mol; Ca 40g/mol; C 12 g/mol; O 16 g/mol

Ringer-oldat összetételének megváltoztatásával következtethetünk egyes ionoknak a sejtek

működésében betöltött szerepére. A későbbiekben a kálcium hatását fogjuk vizsgálni béka izmon.

Feladat:

Készítsen 100 ml kálcium-mentes béka-Ringert.

Anyagok és eszközök:

főzőpohár, mérőkanál, mágneses keverő

NaCl, KCl, NaHCO3, desztillált víz

Mérleggel történő mérések alapja, hogy az ismeretlen tömeget ismert nagyságú tömegsorozattal

hasonlítjuk össze. A laboratóriumi gyakorlatban a lemérendő test (anyag) tömegétől és a mérés kívánt

pontosságától függően az összehasonlításhoz különböző nagyságú és szerkezetű, különböző érzékenységű

mérleget használunk. Tulajdonképpen valamennyi kétkarú emelő. A hagyományos mérlegeken kívül

elterjedtek újabban az elektronikus működésű félautomata és automata mérlegek is.

A mérlegek jellemzői:

- méréshatár - az a maximális tömeg, amivel a mérleg terhelhető

- érzékenység - az a legkisebb tömeg, amelyre a mutató egy osztással kitér,

- pontosság - a valós tömeg és a mért tömeg közötti százalékos eltérés.

Táramérleget vagy laboratóriumi kézimérleget használunk, ha 0,01 g pontossággal akarunk mérni. Ezek

méréshatára 100-500 g lehet.

Az analitikai mérlegen 0,0001 g (0,1 mg) pontossággal mérhetünk. Ez a mérleg igen érzékeny, ezért

üvegezett szekrényben tartjuk, hogy a portól, huzattól megvédjük. Méréshatára 100-200 g. Az egyszerű

analitikai mérleg helyett a gyakorlatban manapság a hagyományos típusú, légfékes analitikai mérleggel

találkozunk, amelynek érzékenysége kisebb ugyan (0,2-0,4 mg), de a mérést lényegesen meggyorsítja.

Az igen érzékeny, 20 g méréshatárú mikroanalitikai mérlegen a milligramm ezredrészét (l µg = 10-6 g) is

megmérhetjük.

Mindegyik mérlegfajtához megfelelő pontosságú tömegminták, azaz mérőtest készlet (tömegsorozat)

tartozik

29

Kétkarú mérleggel történő mérésnél a bal serpenyőre helyezzük a mérendő tömeget, a jobb

serpenyőre pedig a súlysorozat megfelelő tagjait. A mérendő vegyi anyagot soha nem

közvetlenül a serpenyőre helyezzük, hanem mérőedényben, óraüvegen, vagy bemérő csónakon

mérjük le! A mérőtestek felhelyezésekor a mérleg mindig rögzített (arretált) állapotban legyen!

Méréskor a mérőtesteket csak csont, vagy műanyag végű csipesszel szabad megfogni, sohasem

ujjal, mert a legcsekélyebb szennyezés is hamis mérési adatokat eredményez! A mérőtesteket ne

tegyük le a laboratóriumi asztalra, azok vagy a mérlegen, vagy a dobozban legyenek! A mérés

megkezdése előtt meg kell vizsgálni a mérleg használhatóságát! A mérlegen található vízszint-

jelző buborék ellenőrzésével győződjünk meg a mérleg helyes felállításáról, valamint állapítsuk

meg a mérleg egyensúlyi helyzetét, vagyis hogy terheletlen állapotban a mutató a nulla-ponton

álljon be.

Analitikai mérlegen történő mérésnél a mérés előtt 5-10 percig nyitva hagyjuk a mérlegszekrény ajtóit,

hogy a szekrény levegője azonos állapotú legyen a környezet levegőjével. Szobahőmérsékletűnél

melegebb tárgyat ne helyezzünk a mérlegre, mert a mérlegkarok egyenlőtlen felmelegedése sok hibát

okoz! A mérés befejezése után a mérleg terhelését a lehető legrövidebb idő alatt szüntessük meg! A

mérlegszekrényben a kiszóródott vegyszereket puha ecsettel szedjük össze! A kicsöppent folyadékot

azonnal itassuk fel és alkoholos papírvattával töröljük át a szennyezett területet!

Ha meghatározott mennyiségű anyagot kell lemérnünk, úgy járunk el, hogy először a

bemérőedény (lombik, pohár, bemérő csónak) tömegét az előzőekben leírt módon meghatározzuk. Ezután

a jobb oldali serpenyőre a kívánt anyagmennyiségnek megfelelő mérőtömegeket helyezzük, a

bemérőedénybe pedig az anyagunkat. Az előre kiszámított skála-értékre további kevés lemérendő anyag

elvételével, illetőleg hozzáadásával állítjuk be az egyensúlyi helyzetet.

Légfékes mérlegeken gyorsabb a mérés, mert nem kell a lengéseket figyelni és megvárni, amíg

a mutató lassan beáll az egyensúlyi helyzetbe. A serpenyőre szerelt légfék ugyanis gyorsan csillapítják a

lengéseket, így az egyensúlyi helyzet pontosan és hamar áll be.

Napjainkban a mérlegek már elektronikai elven működnek, és digitális kijelzésűek. A testre ható súlyerőt

elektromos jellé alakítják, és a kijelzőn a tömeg közvetlenül leolvasható. A mérleg arretálása (kioldása) és

az egyensúlyi nulla pont beállítása egy-egy gomb megnyomásával történik. A teljes mérési tartományon

belül a mérleg a Tara gomb megnyomásával nullázható. A mérleg az egyensúlyi állapot elérést azzal jelzi,

hogy a kiírt érték mellett megjelenik a mértékegység.

Automata mérlegen történő mérés esetén a bekapcsolás után (ON gomb) a mérőedényt helyezzük rá a

mérlegre. A tárázó gomb megnyomásával nullázzuk, majd bemérjük a kívánt mennyiségű vegyszert. A

kijelző folyamatosan mutatja a tömegváltozást, a végleges tömeget a mértékegység megjelenésével jelzi.

A mérés végeztével a mérőedényt leemeljük, a mérleget kikapcsoljuk.

30

Desztillált víz bemérésére használhatunk mérőhengert. Ez betöltésre hitelesített

térfogatmérő eszköz. Mivel vizes oldatok esetén a meniszkusz homorú, így a mérőhenger

beosztásának a folyadékfelület legmélyebb pontjával kell egybeesnie.

A lombikot körkörösen mozgatva elősegítjük az oldódást. A keveredés biztosításához

használhatunk mágneses keverőt is. A berendezés két részből áll: egy keverőből és egy mágneses

keverőbotból.

A lombikba beletesszük a keverőbotot, majd a keverő közepére helyezzük. A

keverőmotor fordulatszámát tekerőgombbal szabályozhatjuk.

Az elkészített oldatokat lefedjük, és további felhasználásig hűtőben tároljuk.

31

HÍGÍTÁSI SOROZATOK KÉSZÍTÉSE

A hígítási sor egy kiindulási, ismert koncentrációjú törzsoldatból adott oldószer adagolásával

készített, oldatonként egyre hígabb összetételű, egyre kisebb koncentrációjú oldatsor. Biológiai

vizsgálatoknál egy anyag hatásos dózisának meghatározására használják az ilyen oldatsorokat, a

kísérletek kezdeti fázisában szokványosan tízszeres lépésközökkel haladva. Készítéskor a kiindulási

oldatból adott mennyiséget, például 10 ml-t veszünk ki, és tízszeresére hígítjuk, azaz 100 ml-re egészítjük

ki az oldószerrel (1 sz. oldat; 10-szeres hígítás). Majd az elkészült 1. sz. oldatból veszünk 10 ml-t és 100

ml-re, jelig töltjük (2. sz. oldat, 100-szoros hígítás). És így tovább sorra elkészíthetjük a kívánt

hígításokat. A hatásos dózist a hígítási sorozat tagjainak biológiai hatásából, hatásának erősségéből

adhatjuk meg. Biológiai mintán a dózisok lépésenkénti csökkentése eredményezhet például fordított U-

alakú hatásgörbét: a legkisebb és legnagyobb hígítások nem, vagy alig váltanak ki választ, míg a fordított

U közepén lévő koncentrációk hatásosnak bizonyulnak.

hígítás mértéke

hatá

s e

rősség

e

A következő gyakorlaton harántcsíkolt izmon, mint biológiai mintán fogunk vizsgálódni. A végtagizmok

működését a gerincvelőből kilépő és az izmok membránjához (szarkolemma) futó motoros neuronok

irányítják. A motoros idegsejt és az izom közti kapcsolatot neuromuszkuláris junkciónak nevezzük. Ez

egy kémiai szinapszis, melynek neurotranszmittere az acetilkolin.

Az acetilkolin a kolin ecetsavas észtere.

www.farmakologija.com

FORDÍTOTT U-

ALAKÚ DÓZIS-

HATÁS GÖRBE

32

Az emberi szervezetben megtalálható még a vegetatív preganglionáris rostok, a posztganglionáris

paraszimpatikus rostok végződésénél, valamint elterjedt mediátor anyag a központi idegrendszerben is.

A motoros neuronon végigterjedő akciós potenciál hatására a vezikulák az ingerületátvivő

anyagot kijuttatják a szinaptikus résbe, mely a posztszinaptikus oldalon, az izom membránján lévő

nikotinos-acetilkolin receptorokon megkötődik, és depolarizálja a harántcsíkolt izmot.

Neuromuszkuláris junkció. Forrás: fourtee.apptechnc.net

Az izom kontrakciójának előfeltétele azonban akciós potenciál kialakulása. Tehát akkora

nagyságú depolarizációt kell létrehozni, mely eléri az akciós potenciál kiváltásának küszöb-feszültségét.

A küszöb-érték elérésekor akciós potenciál mindig kialakul és az izom ennek következtében mindig

összehúzódik. Az izomrostok minden vagy semmi törvénye szerint működnek, vagyis ha küszöbértéket

meghaladó inger éri a rostot, arra maximális összehúzódással válaszol. Több izomrostból felépülő

izmokra viszont ez a törvény már nem vonatkozik, ugyanis az egyes izomrostok ingerküszöbe eltérő.

A küszöb eléréséhez megfelelő mennyiségű acetilkolin jelenléte szükséges. Hasonló hatás érhető

el acetilkolin receptor agonisták alkalmazásával, például nikotinnal, fenil-trimetil-ammóniummal.

A nikotin a Nicotiana tabacum leveleinek alkaloidja, 1928-ban izolálták.

33

A nikotin volt az az anyag, amelynek segítségével a ganglionális átkapcsolódás mechanizmusát

Langleg 1889-ben felfedezte. Nagyon toxikus, ezért terápiás jelentősége nincs. A nikotin színtelen, lúgos

kémhatású, olaj sűrűségű, jellegzetes szagú folyadék, amely fény hatására megbarnul. Vízben és

zsírokban oldódik, savakkal vízoldékony sókat képez. A bőrön keresztül és belélegezve is felszívódik. A

halálos adag 20-60 mg.

A nikotin képlete. www.tocris.com

Ha az acetilkolin receptorok működését gátoljuk, akkor nem tapasztalható izom kontrakció.

Kísérletekben alkalmazható a d-tubokurarin, mely az acetilkolin kompetitív antagonistája. Dél-

Amerikában az Amazonas és Orinoco környékén élő bennszülöttek ősidők óta készítették a kurarénak

nevezett, igen hatékony nyílmérget a Strichnos-félék kérgéből.

34

Strychnos guianensis www.tropilab.com

A kurare több rokon alkaloida gyűjtőneve. Közülük a legjelentősebb a tubokurarin. A kurare

hatás lényege, hogy a motoros véglemezen az acetilkolin receptorokhoz kötődik és meggátolja az

ingerületátvivő anyag kapcsolódását. Izomrelaxáns hatása emberre is veszélyes lehet, mert gátolja a

rekeszizom működését, így légzésbénító hatású. Tubokurarin-klorid formában hozzák forgalomba.

www.tocris.com

Feladat: Az említett anyagok hatásos dózisának meghatározása érdekében készítsen belőlük hígítási sort!

1.) Az előző gyakorlaton elkészített normál Ringer-oldat felhasználásával hígítsa az acetilkolint

102-106-ig, 10-szeres lépésekkel haladva. Az öt különböző hígítás mindegyikéből 10-10 ml-re

lesz szükség.

2.) Hasonló módon készítsen öt lépésben 10-104-ig Ringerrel higított d-tubokurarin oldat-sort,

valamint

3.) 10-104-ig higított nikotin oldatsort.

35

Anyagok és eszközök:

kémcsövek, pipetták

béka-Ringer, acetilkolin törzsoldat, d-tubokurarin törzsoldat, nikotin törzsoldat.

Kisebb mennyiségű folyadék térfogatának pontos mérésére szolgálnak a különböző pipetták. Főbb

típusaik: az egy-, illetve két-körjeles hasas-, valamint az osztott- és a mikro-pipetta. Egyre elterjedtebbek

az ún. a u t o m a t a - p i p e t t á k is. Ezek cserélhető, kb. 10 cm hosszúságú és 1 cm átmérőjű, végükön

beszűkített műanyag szívócsővel (pipetta-hegy) ellátott dugattyús megoldású eszközök, amely vagy adott

térfogat kimérésére szolgálnak (fix térfogatú), vagy kisebb intervallumban (pl. 1-5 cm3) beállítható a

kívánt folyadéktérfogat is (változtatható térfogatú). Pontosságuk kissé elmarad a hagyományos üveg esz-

közökétől (kb. ±2%). A gyorsaság és a kiváló ismételhetőség azonban nagyon előnyös sorozatmérések

esetén, így jól helyettesítik az osztott-pipettát. Automata pipetta használatakor először tiszta, száraz

pipetta-hegyet helyezünk fel, majd a kívánt térfogatértéket állítjuk be (ez legtöbbször egy rögzíthető kis

csavar eltekerésével valósítható meg). Ezután a marokra fogott eszközből a dugattyú segítségével

kinyomjuk a levegőt, folyadékba merítjük és hüvelykujjunk lassú emelésével teleszívjuk a pipettát. A

dugattyú ismételt lassú megnyomásával engedjük ki a folyadékot, egészen ütközésig lenyomva, miközben

a pipetta végét az edény falához érintjük. A pipetta-hegyben mindig marad némi folyadék, amit nem

távolítunk el. Használat közben figyeljünk, hogy a pipetta hegye ne érintkezzen az oldószeren kívül

mással, ellenkező esetben cseréljük le. Egyes automata pipettákon külön gomb lenyomásával a pipetta-

hegy eltávolítható. Használaton kívül lehetőleg állványon tároljuk!

Mivel mérgező vegyi anyagokkal dolgozunk, tartsuk be a munkavédelmi előírásokat! Az

előírások betartása mindenkinek a legszigorúbban vett egyéni érdeke, de a laborvezető köteles is

mindenkivel betartatni. Vegyszergőzök ellen használjunk szellőző berendezést, és minden műveletet fülke

alatt végezzünk. A nikotin bőrön keresztül is felszívódhat, ezért puszta kézzel ne fogjuk meg, hanem

használjuk a megfelelő laboratóriumi eszközöket! Ha mégis a bőrre jutna, akkor azonnal mossuk le! A

tubokurarin emésztőrendszeren keresztül felszívódva mérgez. Gondosan ügyeljünk arra, hogy ne jusson a

szánkba. Ezért a laboratóriumban szigorúan tilos enni, inni és dohányozni! Ha mégis a szánkba kerül,

akkor öblítsük ki bő vízzel. Ha már a gyomorba jutott, akkor azonnal hívjunk orvost!

Munka közben ügyeljünk a rendre és a tisztaságra! Ha a mérgező oldatok kifolynak, akkor

célszerű bő hideg vízsugárral felmosni. Tilos a mérgező anyagokat a lefolyóba önteni. Gyűjtsük őket

össze az arra kijelölt tárolóedénybe! Mindenféle kárt és balesetet azonnal jelenteni kell a laborvezetőnek!

Az elkészített oldatokat lefedjük, és további felhasználásig hűtőben tároljuk.

36

BIOASSAY VIZSGÁLAT

Az előző két gyakorlaton elkészített oldatok hatását biológiai mintán fogjuk megvizsgálni, mely

béka izolált sartorius izma (szabóizom) lesz. A tapasztalatok alapján megismerhetünk néhány tényezőt,

mely az izom kontrakciót befolyásolja.

Izolált m. sartorius preparátum készítése a következő módon történik. A békát dekapitáljuk, gerincvelőjét

bonctűvel elroncsoljuk, miután is a végtagok elernyednek, tónustalanokká válnak. A békát hátára

fektetjük, a has bőrét és az izmokat haránt irányban átvágjuk, a symphysist szabaddá tesszük. Mindkét

combtőnél a bőrt körbevágjuk, majd lenyúzzuk a lábról. A symphysist éles ollóval középen átvágjuk,

vigyázva, hogy a sartorius izom rostjait meg ne sértsük. A térdizületnél, a sartorius inas vége alá fonalat

húzunk és megkötjük, de úgy, hogy az izomrostok ne essenek a lekötésbe. A hurok alatt az inat elvágjuk,

az izmot pedig a fonallal emelve egészen a medencei eredéséig felfejtjük. A rövid eredési ín alá is fonalat

vezetünk és átkötjük, majd az izmot levágjuk.

Béka m. sartorius preparálása. Forrás: Fehér Ottó: Összehasonlító élettani gyakorlatok és bemutatások.

A sartorius izom egyik végére kötött fonalat erősen meghurkoljuk, majd a sartorius-edény alsó részén

lévő horogra akasztjuk. Az izom másik végén lévő fonallal az izmot a sartorius-edény nyitott végén át az

állványra rögzített transzducer érzékelő nyelvéhez csatlakoztatjuk. A sartorius-edény végére gumicsövet

húzunk, szorítóval elzárjuk, és normál Ringer-oldattal töltjük fel. A szorító segítségével eresztjük majd le

a felül betöltött különböző oldatokat.

A transzducer erő-feszültség átalakító berendezés: az izom összehúzódásait, mechanikai munkáját

elektromos jelekké fordítja. Az erő-feszültség transzducert analóg-digitális konverterhez kötjük, mely a

transzducer analóg jelét a számítógép számára értelmezhető digitális jellé alakítja. Az analóg jelek

megszakítás nélküli, folytonos jelek, mint például a mutatós óra. A biológiában analóg szignálnak

tekinthetjük az idegi akcióspotenciálok időben gyorsan változó feszültségét, vagy a membránpotenciál

37

lassú változását is. A számítógépes felhasználás érdekében ezeket a jeleket digitalizálni kell, ami

általában az időben változó mennyiségek diszkrét értékekben, számokban való megjelenítését jelenti. A

digitalizálással lehetőség nyílik az adatok tárolására, átalakítására, akár továbbítására is. A számítógépben

történik az adatok grafikus megjelenítése is.

Kísérleti összeállítás:

Feladat:

A vizsgálat során a sartorius edényben adott sorrendben cserélje ki az inkubáló

oldatokat:

1. normál béka-Ringer

2. béka fiziológiás só-oldat

3. kálcium mentes Ringer

4-8. acetilkolin hígítási sor (a leghígabbtól kezdve).

9-13. d-tubokurarin hígítási sor (a leghígabbal kezdve)

14-18. nikotin hígítási sor (a leghígabbal kezdve)

Figyelje meg az izom spontán kialakuló kontrakciós válaszait! 1., 3., 9-13. inkubáló oldatok leeresztése

után az izom felső, edényből kilógó részét az ingerlővel direkt módon, növekvő erősségű egyes

ingerekkel ingerelje, és vizsgálja a számítógépen regisztrált kontrakciókat! Jegyezze fel, mely oldat-

koncentrációknál tapasztalható izom összehúzódás! Minden oldat használata után normál Ringerrel mossa

át a preparátumot, mert így elkerülhető a sartorius irreverzibilis károsodása!

TRANSZDUCER A/D KONVERTER COMPUTER

SARTORIUS-EDÉNY INGERLŐ

38

Ringer-oldat esetén egyes ingerekre rángásokkal válaszol az izom. Fiziológiás só-oldat hatására az izom

fibrilláris rángásokat végez, mert bizonyos nélkülözhetetlenül fontos ionok hiányoznak az oldatból.

Kálcium mentes Ringerrel kezelt sartoriuson szintén fibrilláris rángások tapasztalhatók, ingerlékenysége

fokozódik. Normál Ringer adásával a hatás megszüntethető. Acetilkolin bizonyos hígítása spontán, lassú,

reverzibilis, tartós kontrakciót eredményez. Ugyanez tapasztalható adott koncentrációjú nikotin-oldat

esetén is. Ez bizonyítja, hogy a harántcsíkolt izom kontrakcióját az acetilkolin transzmitter kiváltja, és

hatása nikotinos acetilkolin receptorokon keresztül történik. A tapasztalatot megerősíti, hogy a

tubokurarin egyik hígítása sem okoz önmagában összehúzódást, az izom csak direkt módon ingerelhető.

Ha még működőképes a preparátum, akkor vizsgáljuk meg az acetilkolin és tubokurarin

egymást antagonizáló hatását. 1%-os tubokurarin oldattal töltsük fel a sartorius edényt, és fél órán át

inkubáljuk benne az izmot. Majd cseréljük ki az antagonistát az acetilkolin azon dózisával, mely korábban

összehúzódást váltott ki a preparátumon. Figyeljük meg az izom válaszát!

A d-tubokurarin az acetilkolin kompetitív antagonistája: a nikotinos acetilkolin receptorokhoz bekötődve,

nem engedi a transzmitter kapcsolódását. Ezért nem tapasztalhatunk kontrakciót! A kompetitivitást

meghatározza az anyagnak a receptorhoz való kötődési affinitása.

39

TÁPTALAJOK

A mikrobák vizsgálata tenyésztés közben vagy tenyésztés után történik. A tenyésztésre

táptalajokat használunk. A mikroorganizmusok tápanyagszükségletüket a táptalajból fedezik. A

különböző mikróbák tápanyagigénye rendkívül változatos lehet, de vannak olyan táptalaj

összetevők amelyek alapvetően szükségesek.

A tápközeg komponensei két fő részből állnak:

Esszenciális összetevők Járulékos összetevők:

-víz→ oldószer -prekurzorok

-energiaforrás→ redukált, nagy energiatartalmú vegyüetek -vitamiok

-szén-forrás

-nitrogén-forrás

-ásványi anyagok→ enzimek

A táptalajok osztályozása különböző szempontok alapján történhet.

Halmazállapot szerint

1. Folyékony táptalajok: a tápoldat komponensek összemérése során a szilárdító anyagot

kihagyjuk (táplevesek, tápoldatok).

2. Szilárd táptalajok: a folyékony táptalajt szilárdító anyaggal egészítjük ki.

Szilárdító anyagok az alábbiak lehetnek:

A) Agar-agar: poliszacharid, 1-3%-ban használatos (1% lágyagar), dermedéspontja

koncentrációtól függően 38°C feletti, tengeri moszatokból készítik, csak igen kevés

mikroorganizmus hidrolizálja.

B) Zselatin: polipeptid, 10-30%-ban használatos, dermedéspontja a koncentráció függvénye,

számos mikroba bontja.

C) Szilikagél: előnye, hogy szerves anyagokat nem tartalmaz. A táptalaj készítése időigényes.

Ritkán alkalmazzák, általában kemolitotróf mikroorganizmusok tenyésztésekor.

Felhasznált anyag szerint

1. Természetes táptalajok: szerves eredetű anyagok, melyeknek pontos összetételét nem

ismerjük, pl. húsfőzet, élesztő kivonat, maláta, melasz, gyümölcslevek, tej.

2. Szintetikus táptalajok: összetételüket pontosan ismerjük.

3. Félszintetikus táptalajok: természetes és szintetikus összetevők keverékei.

Az alkalmazott tápanyagkomponensek szerint

1. Alaptáptalajok: a növekedéshez szükséges alapanyagokon kívül (esszenciális

összetevők) speciális adalékanyagokat nem tartalmaznak, pl. T1 – univerzális táptalaj

40

2. Szelektív táptalajok: alaptáptalaj + szelektív gátlóanyag (pl. antibiotikum). Egyes

mikroba csoportok visszaszorítását célozzák.

3. Differenciáló vagy indikátor táptalajok: alaptáptalaj + indikátor anyag, amely speciális

anyagcsere reakciókat jelez (pl. laktóz bontás, savképzés).

4. Speciális táptalajok: különböző vizsgálatok céljainak megfelelően, vagy különböző

speciális igényű mikrobák számára összeállított táptalajok.

Táptalaj készítés: először a szilárd alkotókat mérjük be, majd feloldjuk nem teljes térfogatban.

Oldódás után állítjuk be a végleges térfogatot. A pH érték beállítása 5%-os HCl ill. 5→%-os

NaOH-dal történik finomskálás indikátor papírral vagy műszerrel történő ellenőrzés mellett,

majd autoklávozunk. Autoklávozás után az agar tartalmú táptalajok pH-ja 0,1-0,5 pH értékkel

csökken a szilárdító anyag enyhe hidrolízise és változása miatt. Agar tartalmú táptalajok nyomás

alatt sterilezhetők, zselatin tartalmúak csak áramló gőzben (nyomás alatt erős hidrolízis

következik be).

A hőérzékeny táptalaj komponenseket szűréssel való sterilezés után adjuk az autoklávozott és

megfelelően lehűtött alaptáptalajhoz.

TENYÉSZTÉSHEZ HASZNÁLT EDÉNYEK

Minden tenyésztéshez használt laboratóriumi edényt a táptalaj kifejtése előtt

vattadugóval kell ellátni (gyapot- vagy papírvatta egyaránt használható).

Kémcsövek: folyékony táptalajból 5 ml mérendő be. Szilárd táptalajból magas agar esetén 10

ml, ferde agarhoz 5 ml szükséges. A ferde táptalaj készítésével célunk a nagyobb felület

biztosítása.

Lombikok: Erlenmeyer-lombikban és talpas gömblombikban létrehozhatunk folyadék-

tenyészetet, de önthetünk lemezt és ferde táptalajt is.

41

A kémcső mint tenyészedény

Erlenmeyer-lombik mint tenyészedény

42

Roux-plack Kolle-csésze

Speciális tenyészedények: a Roux-palack és a Kolle-csésze .

A fenti edényféleségek (beleértve a nem speciális Erlenmeyer-lombikot is) mind szilárd, mind

nyugvófelszínes folyadékkultúra nevelésére alkalmasak (a táptalaj rétegvastagsága kicsi, felülete

nagy). A tenyészedényeket a táptalaj betöltése után vattadugóval zárjuk, majd autoklávozással

sterilezzük. Célszerű az edényeket papír, celofán vagy alufólia "sapkával" ellátni sterilezés előtt,

nehogy az autokláv gőzterében a vattadugók átnedvesedjenek.

Petri-csésze: a leggyakrabban használt laboratóriumi tenyészedény. A táptalaj kiöntése előtt

szárazon sterilezzük. A táptalaj kiöntésekor a fedőt csak a szükséges mértékig emeljük. A 9–10

cm átmérőjű csészébe 20-25 ml táptalaj szükséges.

A tenyészedényeket az alábbiak szerint jelöljük: 1.) a mikroorganizmus neve és laborkódja, 2.)

az oltás dátuma, 3.) a táptalaj típusa, 4.) a gyakorlat száma, 5.) a kivitelező neve.

Petri-csésze

A fermentor olyan változatos méretű tenyészedény, amely gépi segédletekkel a tenyészetek

nevelésére használható, ahol a tenyésztés körülményeit megfelelő ellenőrző rendszerekkel tudjuk

biztosítani. A tápoldatban szaporodó mikroorganizmusok homogenitását keveréssel, oxigénnel

való egyenletes ellátásukat steril levegőbefúvással érjük el.

43

OLTÓESZKÖZÖK

Oltótű és az oltókacs: hőszigetelt végű, leégethető fémnyelű (Kolle-nyél) tűzálló fémtűvel vagy

hurokkal (kaccsal) ellátott eszköz. Sterilezése lángban, leégetéssel történik.

Mikrotiterkacs: a hurok helyett kalibrált térfogatú fémkosara van, amely ismert térfogatú

folyadék (szuszpenzió) átvitelére alkalmas.

Oltótű, oltókacs

Pipetták: Folyadéktenyészetek ismert térfogatának átoltására használhatók az üvegpipetták,

amelyeket fémdobozban, vagy alufóliába csomagolva száraz hővel sterilezzük.

Biopipetták: (automata pipetták) különböző térfogat adagolására alkalmas (rögzített, vagy

szabályozható méretű) eszközök, cserélhető sterilezhető műanyag pipetta heggyel.

44

STERILEZÉS

A tiszta tenyészetekkel végzett munkák előtt az eszközökön, tenyészedényekben, tápközegben

lévő mikrobákat el kell pusztítani. Sterilezés során minden mikróbát elpusztítunk. A dezinficiálás pedig

csak a kórokozó mikroorganizmusok elpusztítását jelenti.

A sterilezésnek különböző módjai vannak.

I. Fizikai módszerekkel történő sterilezés

A) Sterilezés hővel

• Leégetés lánggal: oltótű, oltókacs esetében alkalmazzuk átoltások során.

• Száraz hővel: üveg, fémeszközöket, pl. pipettákat, Petri-csészéket sterilezünk így. A

hőlégsterilizálók megadott hőmérsékletre állítható önreguláló elektromos berendezések. A sterilezés

időtartama 4 óra 140°C-on vagy 2 óra 160°C-on.

• Nedves hővel

� Pasteurözés: magas hőmérsékleten (60-96°C) a vegetatív sejtek nagy részének elpusztítása,

időtartama 1-40 perc, pl. 65°C – 30 perc; 85°C – 5 perc. Hátránya, hogy a Clostridium spórák túlélik.

� Arnoldozás: sterilizálás áramló gőzben 100°C-on 20-30 percig. Ekkor a vegetatív sejtek

elpusztulnak, a spóráknak azonban csak egy része. Kivitelezése le nem zárt autoklávban vagy szelep

nélküli kuktafazékban történik.

� Tyndallozás: három egymást követő napon arnoldozunk. A kezelések közötti időben a spórák

kihajtanak és elpusztíthatók (frakcionált csíramentesítés). Hőérzékeny tápkomponensek esetén (pl.

zselatin) alkalmazhatjuk.

� Autoklávozás: sterilezés nyomás alatt (autokláv). A leggyakrabban alkalmazott körülmények:

120°C, 1,0 atmoszféra túlnyomás, 15-30 perc. Egy adott nyomáson elérhető hőmérséklet az

autoklávtérben a levegő és gőz arányától függ.

túlnyomás (atm) gőz teljes levegő (°C) gőz 1/2 levegő (°C) gőz levegő nélkül

(°C)

0,66 90 105 115

1,00 100 112 121

1,66 115 124 130

2,00 121 128 135

A sterilezésre használt berendezésének megfelelő működését ismert hőtűréssel rendelkező

mikroorganizmusokkal ellenőrizetjük, pl. autokláv esetén→ B. stearothermophilus; hőlég estetén→

Bacillus speciesek.

45

Szimplafalú autokláv kezelése:

1. Ellenőrizzük, hogy van-e megfelelő mennyiségű víz az autoklávban.

2. Behelyezzük a sterilizálandó anyagokat (edény, eszköz, tenyészet).

3. Lezárjuk az autokláv fedelét, szorítócsavarokkal egyenletesen leszorítjuk.

4. Ellenőrizzük, hogy a gőz-szelep nyitva van-e.

5. Bekapcsoljuk az autokláv fűtését.

6. Megvárjuk, amíg az autokláv felmelegszik. A gőzszelepet csak az intenzív gőzkiáramlás

megindulása után 2-3 perc múlva zárjuk el.

7. Bekapcsolt autoklávot magára hagyni tilos! A nyomás emelkedésekor ellenőrizzük, hogy a

biztonsági szelep működik-e.

8. A kívánt nyomásérték elérésekor az autoklávot 20 percen keresztül megfelelő hőmérsékleten

tartjuk, majd a fűtést kikapcsoljuk.

9. Megvárjuk amíg a túlnyomás nullára csökken. Nyitjuk a gőz-szelepet, majd az autokláv

fedelét. Vigyázzunk! A felszálló gőz éget! A duplafalú és automata autoklávok kezelése a

készülékekhez mellékelt használati utasítás szerint történik.

l. gőz-szelep, 2. nyomásmérő, 3. biztonsági szelep, 4. hőmérő, 5. fedél,

6. vízszintjelző, 7. rakfelület, 8. fűtőtest, 9. vízszint

Gyakorlatainkban gyakran alkalmazunk autokláv helyett kuktafazekat sterilezésre. Így is teljes

csírátlanítás érhető el. A kuktafazékba desztillált vízet kell tölteni kb. kétujjnyi magasságban,

behelyezni az eszközöket, majd lezárjuk és gázlánggal melegítjük a kuktát. A forrástól számítva

20 percig sterilezünk.

46

B) Sterilezés UV-sugárzással: különböző sugárzások (Röntgen-, radioaktív-, UV-sugárzás)

csíraölő hatásúak. A gyakorlaton 260-265 nm sugárzási maximumú UV (germicid)-lámpákkal

sterilezünk.

C) Sterilezés szűrőkkel: folyadék sterilezésére vagy folyadék és szilárd táptalajok hőérzékeny

komponenseinek csíramentesítésére szűrőket alkalmazunk.

• Abszorpciós szűrők: Chamberland (zománc nélküli porcelán), Berkefeld (kovaföld),

Seitz (azbeszt); ezek egy idő után telítődnek.

• Pórus szűrők: leggyakrabban a szinterüveg (zsugorított porózus üveglemez) szűrők és a

membránszűrők használatosak. A bakteriológiai szinterüveg szűrők között legismertebb a G-5

jelzésű szűrő, 0,1µm pórusátmérővel. A membránszűrők anyaga különböző szerves polimer

lehet: leggyakrabban a 0,22 vagy a 0,45 µm pórusátmérőjű készítményekkel dolgozunk

(Millipore- vagy Sartorius szűrők). A baktériumok eredményes szűréséhez max. 0,3 µm

pórusátmérőjű szűrőt használjunk.

A szűrés elősegítésére vízlégszivattyút, olajlégszivattyút, vagy fecskendőhöz hasonló

nyomópumpát alkalmazunk.

l. szűrőtölcsér, 2. szűrőlap l. dugattyú, 2. fecskendőház

3. gumidugó, 4. szívópalack 3. szűrőtartó, 4. szűrőlap,

5. vattazár (membrán)

47

D) Sterilezés ultrahanggal: Ritkán alkalmazott eljárás.

II. Sterilezés kémiai úton

A kemikáliák fehérjékkel és egyéb sejtkomponensekkel való reakciók révén fejtik ki sterilező hatásukat. A hatás a koncentráció és az idő függvénye. Alkalmazhatók nehézfémsók (HgCl2,

AgNO3), oxidálószerek (KMnO4, H2O2), halogének (klór, jód), szerves oldószerek (pl. 70%-

os etanol, dimetilszulfoxid), a fenol 3%-os vizes oldata (karbol), a formalin 3%-os vizes oldata;

gáz (etilénoxid). Felületaktív, zsíremulgeáló kation szappan, membránkárosító, spórákat nem öl.

A neomagnol (benzol-szulfonkloramid-nátrium) 0,1%-os vizes oldatában a keletkező NaOCl a

fehérjék aminocsoportjait klórozza. Megfelelő koncentrációban sporocid. Hatástalanítja a

toxinokat is.

Steril oltófülke

Használata a táptalajoknak steril edényekbe való kifejtésekor, Petri-csészékbe történő lemez

készítésekor, ezek leszárításakor, valamint oltási műveletek végzése esetén ajánlatos. Különösen

Petri-csészék, illetve folyadéktenyészetek, hosszú tenyészidőre beállított kultúrák inokulálását

célszerű a steril fülkében elvégezni.

Az ún. "biohazard" típusú oltófülke lényege, hogy a levegő a beépített szívó és nyomóhatást

kifejtő elektromotorok hatására a fülke hasznos belső terének tetején elhelyezett szűrőn keresztül

csíramentesen kerül a munkatérbe, ott lefelé áramlik, majd a lyuggatott munkalapon keresztül

elhagyja a munkateret. Az ismételt steril szűrőn való átjutás előtt egy előszűrőn halad át a

levegőáram. Ez a mozgásirány, valamint a munkatér és a külvilág határfelületén egyéb

segédberendezések (kiküszöbölendő az örvénymozgást) megakadályozzák, hogy a fülkébe a

külső térből bárminemű szennyezés, fertőzésforrás bekerülhessen, egyben megakadályozza a

munka során a belső térben használt mikroorganizmusok kikerülését is. A steril fülkék ezen

típusa alkalmas a patogén mikroorganizmusokkal való munkára is.

48

A MIKROORGANIZMUSOK TENYÉSZTÉSE

A mikrobákat kontrollált körülmények között kell tenyészteni. Fontos az optimális

hőmérsékleten való tartás a gyors növekedés biztosítása érdekében. Erre a célra termosztátokat

használunk (duplafalú, vízköpennyel, önreguláló elektromos fűtéssel ellátott szekrények). A

mikróbák különböző levegőztetést igényelnek. Az aerob szervezetek nevelésekor – ha azok nem

szilárd táptalaj felületén nőnek – a megfelelő levegőztetésről körkörös rázatással vagy

fermentorban való tenyésztéssel gondoskodhatunk. A rázógépek termosztálását vízfürdő

segítségével vagy száraz levegő befúvással biztosítjuk. Anaerobok esetén oxigén elvonást, illetve

reduktív körülményeket kell a tápközegben biztosítani. Az egyes mikroorganizmusok

tápnygszükséglete eltérő, ezért tenyésztéskor a megfelélő táptalajt kell alkalmazni. Végül pedig

a tenyésztési időt is figyelembe kell venni, mivel ez is más-más az egyes mikróbáknál

(baktériumoknál 1-2 nap, élesztőgombáknál 2-3 nap, penész- ill. fonalasgombáknál 1 hét).

MIKROSZKÓP-ISMERET

Ebben a fejezetben röviden áttekintjük a mikroszkóp használatával kapcsolatos

tudnivalókat. Mikroszkópunk binokuláris tubussal, keresztasztallal, négy revolverváltóval,

cserélhető achromát objektívvel, két pár okulárral rendelkező készülék. A fényforrás beépített

alacsonyfeszültségű lámpa (10. ábra).

Az objektíveken néhány jellemző érték van feltüntetve, pl.:

Az első szám az objektív nagyítóképességét jelzi, ha a tubus hossza mm-ben az alatta lévő

számmal (160) egyenlő. Az első sorban a törtvonal utáni szám az objektív numerikus aperturája.

A második sorban a törtvonal utáni szám azt a fedőlemez vastagságot jelzi mm-ben, melynél a

felette lévő numerikus apertura érték érvényes.

A legnagyobb nagyítású objektíven a nagyítást jelző szám előtt álló HI a "homogén

immerzió" szavak rövidítése. Azt jelzi, hogy ennél az objektívnél a jelzett numerikus apertura és

HI 100/1,25 160/0,17

olajimmerzió (WI - vízimmerzió

Glyc - glicerin immerzió)

nagyítás

numeriks apertura

fedőlemez vastagsága

tubushossz

49

nagyítás értékek akkor érvényesek, ha az objektív frontlencséje és a preparátum között nem

levegő van (mint a többi, úgynevezett száraz-objektívnél), hanem immerziós olaj (cédrus olaj

vagy anizol), melynek fénytörése az üveg fénytörésével azonos. Az okulárokon jelzik a

nagyítóképességet és (kis körbe írva) az ún. mező számot (lásd később).

Műszerünk teljesítőképességét a fenti adatok alapján egyszerűen kiszámíthatjuk.

A feloldóképesség annak a legkisebb tárgynak az átmérője, amelyet a műszerrel még

éppen felismerhetünk. A feloldóképesség (F) a megvilágításra használt fény hullámhosszától (λλλλ)

és az objektív numerikus aperturájától (NA) legkedvezőbb megvilágítási viszonyok esetén az

alábbi képlet szerint függ:

λλλλ

F = –––––––

2 x NA

A numerikus apertura a tárgy és az objektív frontlencséje között lévő közeg

törésmutatója (n) valamint a frontlencse félnyílásszöge (α) sinusának a szorzata:

NA = n x sinαααα

A nyílásszöget a tárgy egy pontjából a frontlencse széleihez húzott két egyenes adja (élesre

állított kép esetén!). A sinα maximális értéke 1; gyakorlatban 0,95 az elérhető érték, ekkor a

teljes nyílásszög kb. 140°. Száraz objektíveknél n = 1 (levegő) homogén immerziós

objektíveknél n = 1,51. (cédrusolaj)

Számításainknál a fény hullámhosszát 500 nm-nek vegyük; ez az emberi szem által legjobban

érzékelhető, világoszöld színű fény hullámhossza.

A mikroszkóp nagyítása az objektív nagyításának és az okulár nagyításának szorzata.

Az objektíven jelölt nagyítás 160 mm tubushosszra vonatkozik. Egyes mikroszkópoknál a

binokuláris tubus 160 mm-nél hosszabb; ebben az esetben a nagyítás kiszámításánál a

binokuláris tubuson látható faktorral (1,6x) is szorozni kell.

Azt, hogy a mikroszkóp látómezejében megfigyelt terület mekkora a valóságban,

kiszámíthatjuk, ha az okuláron jelzett mezőszámot elosztjuk az objektív nagyításával, így mm-

ben kapjuk a kérdéses kör átmérőjét. Természetesen a tubushosszat itt is figyelembe kell

vennünk. A binokuláris tubust mindenki beállítja a saját pupillatávolságára, a tubuson lévő 55-

től 75-ig számozott skála a pupillatávolságot jelzi mm-ben.

A binokuláris tubuson korrigálható a két szem közötti esetleges dioptriakülönbség. A

bal szemet behunyva a képet a mikrométer-gombbal élesre állítjuk, majd a jobb szemet behunyva

a képet a tubuson lévő gyűrűvel állítjuk élesre. Akiknél a két szem egyforma, a 0-jel vonása

egybeesik a tubus oldalán lévő vonással.

Az élesre állítást úgy végezzük, hogy oldalról ellenőrizve először a tárgyasztalt a durvabeállító

gombbal az objektív felé közelítjük, míg az objektív a preparátumot csaknem érinti, majd a

50

mikroszkópba nézve a tárgyasztal süllyesztésével (előbb a durvabeállítóval, majd amikor a kép

már látszik, a mikrométer gombjával) állítunk élesre.

A mikroszkópos kép jó minőségét és egyenletes kivilágítottságát a lámpa égőjének és

blendéjének, a kondenzor magasságának és blendéjének megfelelő beállításával, továbbá a

kondenzorba homályos üveg illetve színszűrő behelyezésével igyekszünk elérni. A kondenzor

alsó részén található, kihajlítható lencsét csak a 6,3x-os nagyítású objektívvel kapcsolatban

iktassuk be. A mikroszkóphoz csatlakoztatható fáziskontraszt berendezés, sötétlátóteres

kondenzor és UV-fényforrás is (lásd a megfelelő gyakorlatokat).

Mikroszkópos fotózás

Amikor a mikroszkópozás során látott képet rögzíteni akarjuk, akkor szükségessé válik a

mikroszkóp és a fényképezőgép (kamera) összekapcsolása. Ez történhet egyszerű mechanikai

úton, de az összekapcsoláskor közbeiktathatunk különböző típusú automatikus rendszereket

elsősorban a vizsgált tárgyon áthaladó fény mérésére, és az ehhez szükséges expozíciós idő

automatikus mérésére.

Gyakorlatunkban a BA2 típusú fénymérő és exponáló automatát használjuk. Ezen keresztül

csatlakoztatjuk a kamerát a fáziskontraszt mikroszkóphoz. (Többféle típusú kamera használható

mikroszkópos fotózáshoz, ha a normál fényképezőgép optikáját eltávolítva illeszteni tudjuk a

mikroszkóphoz.) Az exponáló automata segítségével különböző fedettségű, sötét illetve világos,

jól megvilágított és gyenge világítottságú preparátumról készíthető jól exponált film. Az

automata fénymérő üvegszál optikán beméri az adott preparátum megvilágítási viszonyait és

ennek megfelelően vezérli a felvétel expozíciós idejét (ez a másodperc tört részeitől 5-6 perc

hosszúságú lehet).

A fényképezésre szánt mikroszkópos preparátummal szemben magas minőségi követelményeket

támasztunk:

l.) A tárgylemezek, fedőlemezek teljesen tiszták, karcmentesek és optikailag is megfelelőek

legyenek.

2.) A vizsgálandó anyag, élő sejt, vagy rögzített preparátum mindig egyrétegben (egy síkban)

helyezkedjen el. Ez lényeges, mert az átvilágítás során egyik réteg zavarja a másikat. Az egy

síkban elhelyezkedő mikrobák mélységélessége jelentősen javul, így morfológiájuk jól

tanulmányozható és a képi látvány is tökéletesebb.

3.) Beszáradt, vagy zsugorodott preparátum nem fényképezhető.

4.) A tárgylemezre felvitt anyag (intakt sejtek, fonalak, konidiumok) mindig folyadékba legyen

ágyazva. Ez a fénytörésből eredő zavaró problémákat csökkenti, a fényképezéshez

elengedhetetlen kontúrélességet fokozza.

A tárgylemezre vitt anyagra cseppentsünk az alkalmazandó folyadékból, vagy eleve ebbe a

folyadékcseppbe készítsük el a fényképezendő preparátumot, tiszta fedőlemezzel fedjük le, a

felesleges folyadékot itassuk fel. (Ne ússzon a fedőlemez!)

51

5.) Az expozíciós idő alatt állítsuk le, vagy fékezzük le a preparátum mozgását. A pillanatnyi

mozdulatlanság előfeltétele az éles felvételnek. A mozgás leállítása, vagy lassítása történhet

zselatinba, glicerinbe történő ágyazással, tárgylemezhez történő fixálással, ragasztással, vagy pl.

konidiumok cellux szalagra történő ragasztásával.

6.) Válasszunk ki jellemző, nem zsúfolt látómezőt a fényképezésre.

7.) A felvételeket viszonylag gyorsan készítsük el, mert a fényforrás melegít, a preparátum

száradása megindul, és beindul a Brown-féle mozgás is.

8.) A kép "megszerkesztésekor" síkban gondolkodjunk (a binokuláris mikroszkópok térben adják

a képet). A fénykép "kevesebbet" ad vissza a binokuláris feltétben látottaknál.

9.) A mikroszkópos felvétel készítése előtt ügyeljünk a preparátum élesre állítására. Itt a

képkeresőben látható szálkereszt élesre állításához igazodjunk.

A mikroszkópos fekete-fehér felvételek készítéséhez leggyakrabban a közepes érzékenységű

(15/10, vagy 17/10 din) filmek alkalmazhatók. Ezek szemcsézettsége finom, jól nagyíthatók,

kontrasztosak, a részleteket jól visszaadják. Színes felvételek készítésekor műfény diafilm,

fluorescens-mikroszkóp esetében napfény diafilm használható 18/10 din alsó érzékenység

határral.

Mikroszkópunk vázlata. l: talp; 2: durva beállítógomb; 3: mikrométer beállítógomb; 4:

kondenzor emelő-süllyesztő gomb; 5: kondenzor, kihajlítható alsó lencse, kihajlítható tartógyűrű

színszűrő vagy opálüveg számára, blende; 6: tárgyasztal keresztasztallal; 7: keresztasztal

mozgató gombjai; 8: objektívek a revolverváltóban; 9: binokuláris tubus okulárokkal; 10:

mikroszkóp megvilágító rendszere (talpba épített transzformátor, izzó).

Gyakorlatok:

1,Táptalajok készítése

A mikroorganizmusokat különböző összetételű tápközegben tenyésztjük további

vizsgálatok céljából. Az anyag- és eszközismeretnél leírtak alapján különböző táptalajokat

állítunk össze, a pH-t 7-re állítjuk, vattadugózunk, sapkázunk majd sterilezünk. A táptalajok

felhasználása későbbi gyakorlato(ko)n történik.

Anyagok és eszközök:

T-1 recept szerinti táptalajkomponensek összemérve lombikban, 100 ml-re

300 ml-es Erlenmeyer-lombik (1 db)

100 ml-es főzőpohár (1 db)

A gyakorlat menete:

100 ml kiegészített hústáptalajt (T-1) készítünk 3 % agarral, 1 db 300 ml-es Erlenmeyer-

lombikban. A táptalajkoponenseket bemérjük, majd hozzáadjuk a desztillált vizet.

52

Kuktafazékban sterilezünk. A steril táptalajt laminár boxban Petri-csészébe illetve kémcsőbe

(ferde agar) töltjük.

Figyelem! A nyomás alatti sterilezés után meg kell várni, amíg az autoklávban, kuktafazékban a

túlnyomás megszűnik. A táptalajokat csak akkor szabad kiemelni, ha forrásuk már megszünt!

Feladat:

Számítsuk ki a recept alapján 100 ml táptalajra vonatkoztatva a bemért komponensek

mennyiségét!

2, Mikroorganizmusok izolálása a környezetből

A gyakorlat célja annak bemutatása, hogy a környezetünkben sok mikroorganizmus

fordul elő, nagy gyakoriságuk veszélyezteti a mikrobiológiai munkák tisztaságát. Ha a táptalajt

antibiotikumokkal szelektívvé tesszük, baktériumellenes antibiotikumokkal a gombák

kitenyésztését, gombaellenes antibiotikummal a baktériumok izolálását tesszük könnyebbé.

Anyagok és eszközök:

T-1+40 µg/ml nystatin-t tartalmazó Petri-csésze (4 db)

T-1+ 60 µg/ml tobramycin-t tartalmazó Petri-csésze (4 db)

Elkészítése:

� Kimérjük a megfelelő mennyiségű gátló anyagot.

� A nystatint oldjuk DMSO-ban, a tobramycint steril desztvízben.

� Hozzáadjuk a törzsoldatot a lesterilezett táptalajhoz. Kiöntjük Petri-csészébe. 100 ml

táptalajhoz 1 ml „gátlóanyagos” törzsoldatot pipettázunk. Törzsoldat cc.-ja: nystatin 4mg/ml ;

tobramycin 6 mg/ml.

• steril vatta

• talajminta

A gyakorlat menete:

A 40 µg/ml nystatin tartalmú csészéken baktériumokat, a 60 µg/ml tobramycint tartalmazó

csészéken gombákat izolálunk. Mindkét sorozattal az alábbi műveleteket végezzük el:

1) A csészéket fedetlenül hagyjuk 15 percig a laboratóriumban.

2) A csészéket fedetlenül a nyitott ablakba, huzatos helyre helyezzük 15 percig.

3) Steril vattával bútorfelületről levonatot veszünk és azt rávisszük a steril táptalajra.

4) Ajkunkról steril vattával mintát veszünk és azt a táptalaj felületére visszük.

53

5) Beosztjuk három részre a csészét, az alján filctollal jelölve, majd részenként (A) érintsük

mosatlan ujjunkkal a táptalajt; (B) érintsük ujjunkkal a táptalajt szappanos kézmosás és levegőn

való szárítás után; (C) érintsük ujjunkkal a táptalajt néhány perces sterogenolos kézmosás és

levegőn való szárítás után.

6) Helyezzünk hajszálat a táptalajra.

7) Porított talajmorzsákat hintsünk a táptalajra.

8) Érintetlenül hagyjuk a csészét kontrollnak.

30°C-on inkubálunk, megfigyelés 48 óra, illetve 5 nap után.

Feladat:

1. Írjuk le a látottakat, hasonlítsuk össze az azonos módon kezelt, de különböző antibiotikumokat

tartalmazó táptalajokon a tenyészeteket.

2. Hasonlítsuk össze a 48 órás, illetve az 5 napos inkubáció után látottakat.

4. Rajzoljuk le a különböző teleptípusokat sztereomikroszkópos megfigyelések alapján

felülnézetben. Írjuk le a telepek morfológiai jellemzőit (alak, szín, konzisztencia, perem, stb.).

3, Átoltások gyakorlása

Az elkészített táptalajokat (T-1—T-5a) különböző steril tenyészedényekbe szétosztjuk,

majd a táptalajokat hagyjuk lehűlni, illetve megdermedni. A kémcsöveket megdöntve helyezzük

el a ferdeagar, és függőlegesen a magas agar készítéséhez. A lehűlt tápoldatba, illetve a

megdermedt táptalajra oltunk.

a) Oltás ferde agarra

Mikroorganizmusok:

Escherichia coli, Serratia marcescens, Bacillus cereus var. mycoides, B. megaterium,

Micrococcus luteus, (T-1); Saccharomyces cerevisiae, Candida utilis, Rhodotorula rubra,

Syncephalastrum racemosum, Aspergillus niger 48 órás tenyészetei T-5 ferde agaron (a

baktériumok T-1, a gombák T-5 táptalajon növekednek jól).

Anyagok és eszközök:

T-1 ferde agar (4 db)

T-5 ferde agar (4 db)

A leoltás menete:

1) Bal kézbe fogjuk a leoltandó tenyészetet tartalmazó és az "üres " kémcsövet (11. ábra). A

csövek helyzete közel vízszintes legyen. Hüvelykujjunkkal a tenyerünkhöz szorítjuk a csöveket.

54

(Rögzíthetjük a csöveket az ujjak közé szorítással is.) Az agar oltandó felülete mindig felénk

legyen fordítva.

2) Az üres cső vattadugóját megforgatjuk, hogy könnyen kiemelhető legyen, ha a belefejtett

táptalajtól beragadt volna.

3) Az oltóeszközt úgy fogjuk jobb kézzel, mintha íróeszközt fognánk. Közel függőleges

helyzetben a gázlángba tartva, felizzítjuk az oltókacsot, majd a nyél fém részét lángoljuk le.

4) Jobb kezünk gyűrűs- és kisujjával kiemeljük a tenyészetes cső dugóját úgy, hogy a kiemelés

után a dugó szabad része ne érintkezzen semmivel. Lángoljuk le a kémcső száját.

5) A kaccsal benyúlunk a kémcsőbe, lehűtjük üres agarfelületen. A tenyészetből inokulumot

veszünk ki. (Inokulum = az a mikrobamennyiség, amellyel be/le/oltjuk az új táptalajt.) A kacs

nem érhet a cső oldalához. Lelángoljuk a kémcső száját, a dugót visszahelyezzük a tenyészetes

csőbe.

6) A beoltandó kémcső dugóját kivesszük, lelángoljuk a kémcső száját (vigyázzunk, az inokulum

ne érjen a lángba!). Beoltjuk a táptalaj felületét zegzugos vonal mentén.

7) Lelángoljuk a frissen leoltott cső száját, visszahelyezzük a vattadugót. Leégetjük az

oltókacsot (először szárítva, majd izzítva), állványba állítjuk, majd állványba helyezzük a

kémcsöveket is.

Ferde agarra történő oltás egy lehetséges módja

55

Figyelem! Az egész műveletet a gázláng közvetlen közelében végezzük, ügyelve arra, hogy a

beoltás folyamata kellő ütemű legyen, ugyanakkor nagy levegőmozgást széles mozdulatokkal,

kapkodással ne keltsünk. A tenyészedényeket oltás előtt lássuk el jelöléssel.

Átoltunk 4 baktérium, 2 élesztőgomba és 2 fonalasgomba törzset.

b) Oltás magas agarba (szúrt tenyészet)

Mikroorganizmusok:

Serratia marcescens, Bacillus cereus var. mycoides, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae,

Rhodotorula rubra 48 órás tenyészetei T-1 illetve T-5 ferde agaron.

Anyagok és eszközök:

T-1 magas agar (2 db)

T-5 magas agar (2 db)

A gyakorlat menete:

Oltás menete ugyanaz mint előbb, csak tűvel és zegzugos vonalhúzás helyett egyetlen szúró

mozdulattal oltunk be 2 baktérium és 2 élesztőgomba törzset.

A B

Ferde- illetve magas agar leoltása

56

c) Oltás kémcsőből folyékony táptalajba

Mikroorganizmusok:

Serratia marcescens, Escherichia coli, Bacillus megaterium, Micrococcus luteus,

Saccharomyces cerevisiae, Syncephalastrum racemosum, Aspergillus niger 48 órás tenyészetei

T-1 illetve T-5 ferde agaron

Anyagok és eszközök:

15 ml T-1a tápoldat kémcsőben (4 db)

A beoltás menete: az a) gyakorlatnál leírtak szerint történik. A kémcsöveket egyenként beoltjuk

2 baktérium, 1 élesztőgomgba és 1 fonalasgomba törzzsel A mikroorganizmusokat

szuszpendáljuk a folyadékban.

Feladat:

l. Ellenőrizzük az átoltás eredményességét.

2. Figyeljük meg az átoltott mikroorganizmusok színét, telepmorfológiai (fénye-matt felszín)

tulajdonságait. Ábrázoljuk megjelenési formájukat.

3. Rajzoljuk és írjuk le, hogyan szaporodnak a különböző mikrobák a szúrt tenyészetekben

(gázterelés, milyen mélyen nő).

4. Rögzítsük hogy folyadéktenyészetben milyen a különböző mikrobák tenyészete (egyformán

zavarosít, felületen úszik, kiülepszik, milyen a színük)?

57

Felhasznált irodalom: Ajtai Katalin – Szilágyi László: Biokémiai gyakorlatok. Tk kiadó, Budapest, 1983.

Kevei Ferenc, Kucsera Judit, Manczinger László, Pfeifer I., Varga J., Vágvölgyi Csaba:

Mikrobiológiai Gyakorlatok I. JATE-Press, 2004

Lénárd László: Összehasonlító élettani gyakorlatok. JPTE jegyzet 1998

Dr. Teichman Farkas: Biokémiai gyakorlatok. DOTE jegyzet. Debrecen 1999.