ho-1 y hmgb1 en un modelo

Estudio de los efectos de

HO-1 y HMGB1 en un modelo

in vitro de inflamación sinovial

osteoartrítica

TTeessiiss DDooccttoorraall pprreesseennttaaddaa ppoorr::

Isabel García Arnandis

Valencia, diciembre 2010

Facultat de Farmàcia

Departament de Farmacologia

DEPARTAMENT DE FARMACOLOGIA

María José Alcaraz Tormo, Catedrática de la Universitat de València y María

Isabel Guillén Salazar, Profesora Adjunta de la Universidad Cardenal-Herrera-CEU

CERTIFICAN:

Que el trabajo presentado por la Licenciada Isabel García Arnandis, titulado

“Estudio de los efectos de HO-1 y HMGB1 en un modelo in vitro de inflamación

sinovial osteoartrítica”, ha sido realizado en el Departament de Farmacología de la

Universitat de València, bajo nuestra dirección y asesoramiento.

Concluido el trabajo experimental y bibliográfico, autorizamos la presentación de

esta Tesis Doctoral para que sea juzgada por el Tribunal correspondiente.

Valencia, a 17 de diciembre de 2010

María José Alcaraz Tormo María Isabel Guillén Salazar

La presente Tesis Doctoral ha sido financiada por las siguientes ayudas:

Proyecto ACOMP06/023 concedido por la Generalitat Valenciana:

“Mecanismos reguladores de la producción de lesión tisular en la inflamación crónica”

Proyecto ACOMP2007/066 concedido por la Generalitat Valenciana:

“Mecanismos reguladores de la producción de lesión tisular en la inflamación crónica”

Proyecto SAF2007-61769 concedido por el Ministerio de Educación y Ciencia-Fondo

Europeo de desarrollo Regional:

“Mecanismos moleculares de activación de

las células inflamatorias en la lesión articular”

Programa PROMETEO/2010/047 para grupos de investigación de excelencia, concedido

por la Generalitat Valenciana:

“Mecanismos reguladores en procesos inflamatorios”

Beca predoctoral de Formación de Personal Investigador (FPI) concedida por la

Generalitat Valenciana.

l recorrido de mi Tesis empezó hace ahora casi 6 años y hasta hace

relativamente poco tiempo, pensé que nunca llegaría el momento de terminar y

defender mi trabajo, y menos aún, que llegaría el momento en el que me

tendría que enfrentar a uno de los apartados de la Tesis que más “impone”, y

que no es otro que éste de los agradecimientos. Durante estos años ha ido

pasando mucha gente, que de una manera u otra, ha contribuido a que mi Tesis

llegara a buen puerto y a las que quiero mencionar.

En primer lugar quiero agradecer a mis directoras MªJosé Alcaraz e Isabel

Guillén el apoyo que me han dado durante todo este tiempo. María José te

estaré siempre agradecida por haberme permitido formar parte de tu grupo de

investigación, por estar siempre disponible, por tu paciencia y por ser un

referente en el trabajo. Isabel, una de las mejores jefas que hubiera podido tener,

muchísimas gracias por haberme enseñado a moverme en el laboratorio, por tu

dedicación y amistad y por todo lo que me has “soportado” durante este

tiempo, que no es poco.

Al resto de profesores del grupo. A Marisa, por haberse preocupado tanto por

mí, tuviera o no relación con la Tesis, y por haberme introducido en el mundo

de los ratoncitos. A MªCarmen Terencio, por estar siempre disponible para lo

que necesitara, y lo mejor de todo, con una sonrisa; a Miguel, por sus consejos; a

Amalia, por transmitirme el entusiasmo de la docencia y a Carmen Montesinos,

por hacer del laboratorio un lugar agradable.

A todos los compañeros que han pasado por el grupo de inflamación. A María

Valls y a Lidia, mil gracias por vuestra amistad y vuestro apoyo, una al principio

y la otra más hacia el final; a mis “hermanos científicos” Javier y Victoria, me

ha encantado teneros como “familia” en el laboratorio; a Nuria, con quién

empecé un día y con quién parece que voy a terminar; a las que pasaron antes,

Marieta, MªDolores y Aitana, y a los que han ido llegando después, Rosa, Anna,

Rita, Jorge, Carmen y en particular a Teresa, una pena que te quedaras tan

E

poco tiempo con nosotros y a Julia, la nueva adquisición de la “familia”, de gran

ayuda estos últimos meses en los que he estado más liada. A los demás becarios

del Departamento; a Nicla y a Diana, por la serenidad y la alegría que

transmitís; a Isabel Andújar, porque siempre me resultó agradable hablar

contigo cuando venías a ver a tu jefa; A Vanessa, y a los miembros de la ya

exitnta “CMV”, Fermí, Miguel y Edu (con permiso de Javier).

Un grande grazie a tutta la gente del Laboratorio di Immunologia e Genetica

dellÍstituto Ortopedico Rizzoli di Bologna, perchè tra tutti mi avete fatto sentire

come a casa. Grazie in particolare al Prof Andrea Facchini e alla Dr.ssa Gina

Lisignoli per avermi dato lóportunittà di venire da voi. Grazie Francesco per

aver accettato di formare parte degli evaluatori della Tesi e per léntusiasmo che

trasmetti quando ti si stà vicino. Grazie alle ragazze Valeria, Carola, Giovanna,

Eleonora, e al resto, Luciano, Luca, Patrizia, Graziella, Rossy, Brunella etc. ed un

grazie infinito alla mia amica Cri, perchè il mio stage a Bologna non sarebbe

stato uguale senza di lei.

A todo el personal de secretaria, Mamen, Raquel, Irene, Carlos y Ángel y a

Ana y MªJesús del servicio de Cultivos, por toda la ayuda que he recibido de su

parte, que no ha sido poca.

A mis amigas de siempre, a las de Alcúdia, a las de Farmacia y a las del cole,

que aunque no entienden de qué va esto, siempre se han preocupado por mí,

sobretodo en estos últimos meses en los que mis nervios han ido “in crescendo”.

En especial a María O. porque sin ella mi Tesis no hubiera tenido portada.

A Tommaso, que apareció un día “por casualidad” casi al principio de

empezar la Tesis, y con quién he podido compartir los momentos buenos y

también los no tan buenos de todos estos años. Gracias por estar siempre a mi

lado.

A Oreto

A mi abuela Pepita

(Q.e.p.d)

A mi tía Paloma

A mi abuela Trini

A mis padres

A mi hermano

XV

Abreviaturas

AA: Ácido araquidónico

AAS: Ácido acetil salicílico

abs: Absorbancia

ADAMTS: Desintegrina y metaloproteinasa con dominios de trombospondina

ADN: Ácido desoxiribonucleico

ADNc: Ácido desoxiribonucleico complementario

AGE: Productos finales de glicosilación

AIA: Artritis inducida por adyuvante

AINE: Anti-inflamatorio no esteroideo

AP-1: Proteina activadora 1

APMA: Acetato de para-aminofenilmercúrico

AR: Artritis Reumatoide

ARN : Ácido ribonucleico

ARNm: Ácido ribonucleico mensajero

5-ASA: Ácido 5-aminosalicílico

ATP: Adenosín trifosfato

BMP: Proteína morfogénica ósea

BR: Bilirrubina

BSA: Albúmina bovina sérica

BV: Biliverdina

C/EBP: Proteína de unión e intensificación-CCAAT

CC: Cisteína-cisteína

CIA: Artritis inducida por colágeno

cols: colaboradores

CoPP: Cobalto protoporfirina

CORM: Molécula liberadora de monóxido de carbono

CORM-2: Dímero de tricarbonildiclororrutenio (II)

Molécula liberadora de CO-2

XVI

CORM-3: Tricarbonilcloro(glicinato) de rutenio (III)

Molécula liberadora de CO-3

COX: Ciclo-oxigenasa

Ct: Ciclo umbral

CXC: Cisteína-aminoácido x-cisteína

DAB: 3,3´diaminobenzidina

DAMP: Patrón molecular asociado a patógenos

DAPI: 4´, 6-diamidino-2-fenilindol

DDR2: Receptor del dominio de discoidina 2

DEPC: Dietilpirocarbamato

DMEM: Medio Dulbecco modificado por Eagle

DMSO: Dimetilsulfóxido

dNTPs: Desoxinucleótidos trifosfato

DO: Densidad óptica

DTT: Ditiotreitol

ECACC: Colección europea de cultivos celulares

ECL: Sistema de quimioluminiscencia intensificado

EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético

EGR-1: Proteína de respuesta de crecimiento temprano-1

EGTA: Ácido etilenglicol-bis-(β-aminoetil éter)-N, N, N´, N´-tetraacético

ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay

Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas

EP: Receptor de prostaglandina E

ERK: Cinasa regulada por señales extracelulares

FLS: Sinoviocitos de fenotipo fibroblasto

FRET: Transferencia de energía de resonancia de fluorescencia

GAPDH: Gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa

GRO-α/CXCL1: Oncogen α relacionado con el crecimiento

H: Horas

HeBS: Tampón salino HEPES

HEK 293: Células humanas embrionarias de hígado 237

XVII

HEPES: Ácido N-2-hidroxietilpiperacina-N´-2´-etanesulfónico

HIF-1α: Factor inducible por hipoxia-1α

HMGB1: High mobility group box 1

Grupo proteico de alta movilidad

HO: Hemo oxigenasa

HPETE: Ácido hidroxiperoxieicosatetraenoico

HRP: Peroxidasa de rábano

ICAM-1: Molécula de adhesión intercelular-1

ICE: Enzima convertidora de IL-1β

IFN-γ: Interferón-γ

IGF: Factor de crecimiento semejante a la insulina

IgG: Inmunoglobulina G

IĸB: Proteína inhibidora de NF-ĸB

IKK: Cinasa de IĸB

IL: Interleucina

IL-1R: Receptor de IL-1β

IL-1Ra: Antagonista del receptor de inteleucina 1

JNK: Cinasa N-terminal de c-Jun

LIF: Factor inhibidor de leucemia

LOX: Lipo-oxigenasa

LPS: Lipopolisacárido bacteriano

LT: Leucotrieno

LV: Lentivirus

LV (-): Lentivirus vacío

MAPK: Proteína cinasa activada por mitógenos, MAP cinasa

MAPKK: Cinasa de la MAPK

MAPKKK: Cinasa de la cinasa de la MAPK

MCP-1/CCL2: Proteína quimiotáctica de monocitos 1

MIP: Proteína inflamatoria de macrófagos

MIP-3α/CCL20: Proteína inflamatoria de macrófagos 3α

min: Minutos

XVIII

MLS: Sinoviocitos de fenotipo macrófago

MMP: Metaloproteinasa de matriz

MMP-1: Colagenasa 1, colagenasa intersticial, metaloproteinasa-1

MMP-3: Estromelisina-1, metaloproteinasa-3

MMP-9: Gelatinasa B, metaloproteinasa-9

MMP-13: Colagenasa-3, metaloproteinasa-13

mPGES-1: Prostaglandina E sintasa microsomal-1

MT-MMP: Metaloproteasa asociada a la membrana

MTT: Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio

MyD88: Factor de diferenciación mieloide 88

NADPH: Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato reducido

NF-ĸB: Factor nuclear ĸB

NK: Asesina natural

NO: Óxido nítrico

NOS: Óxido nítrico sintasa

NOS-1/nNOS: Óxido nítrico sintasa neuronal

NOS-2/iNOS: Óxido nítrico sintasa inducible

NOS-3/eNOS: Óxido nítrico sintasa endotelial

Nrf2: Factor relacionado con el factor eritroide 2

OA: Osteoartritis, osteoartrítico

PAR-2: Receptor activado de la proteinasa 2

PBS: Tampón fosfato salino

PCNA: Antígeno nuclear de proliferación celular

PCR: Reacción en cadena de la polimerasa

PDGF: Factor de crecimiento derivado de plaquetas

PGE2: Prostaglandina E2

PGES: Prostaglandina E sintasa

PI3-K: Fosfatidil-inositol-3 cinasa

PLA2: Fosfolipasa A2

PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo

Pro-MMP-13: pro-metaloproteinasa-13, forma inactiva de la MMP-13

XIX

PVDF: Polivinildeno difluoruro

RAGE: Receptor para productos finales de glicosilación

RANKL: Ligando de unión al receptor activador de NF-ĸB

RAW 264.7 Línea celular de monocitos/macrófagos leucémicos de

ratón

RIA: Radioinmunoensayo

RISC: Complejo de silenciamiento inducido por ARN

RNS: Especies reactivas del nitrógeno

ROS: Especies reactivas del oxígeno

rpm: Revoluciones por minuto

RT-PCR: Reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa reversa

SAPK: Proteín cinasa activada por estrés

SBF: Suero bovino fetal

SDS: Sodio dodecilsulfato

SFE: Suero fisiológico estéril

siRNA: Pequeñas moléculas de ARN de interferencia

SOD: Superóxido dismutasa

SnPP: Estaño protoporfirina

sRAGE: Receptor soluble de RAGE

STAT: Transductor de señal y activador de transcripción

TACE: Enzima convertidora de TNF-α

TGF-β: Factor de crecimiento transformador-β

TIMP: Inhibidores tisulares de metaloproteinasas

TLR: Receptores tipo toll

Tm: Temperatura de fusión

TNF-α: Factor de necrosis tumoral-α

TNF-R: Receptor de TNF- α

UF: Unidades de fluorescencia

VCAM-1: Molécula de adhesión celular vascular

VEGF: Factor de crecimiento del endotelio vascular

XXI

Índice

ABREVIATURAS ......................................................................................................... XV

ÍNDICE………………. ..................................................................................................... XXI

1) RESUMEN (ABSTRACT) .............................................................................................. 29

2) REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 39

2.1) La osteoartritis .................................................................................................... 41

2.1.1) Fisiología de las articulaciones sinoviales................................................... 41

2.1.2) Principales características de la osteoartritis ............................................. 43

2.1.3) Fisiopatología de la OA ............................................................................... 44

2.1.4) Papel de la inflamación de la membrana sinovial o sinovitis en el

desarrollo de la OA ...................................................................................... 46

2.1.5) Factores implicados en la patogénesis de la OA ........................................ 48

2.1.5.1) Enzimas degenerativas del cartílago ............................................. 48

2.1.5.2) Citocinas ........................................................................................ 49

2.1.5.3) Quimiocinas ................................................................................... 51

2.1.5.4) Eicosanoides (Prostaglandinas y leucotrienos) ............................. 52

2.1.5.5) Estrés oxidativo y radicales libres .................................................. 53

2.1.5.6) Otros mediadores implicados en la OA ......................................... 54

2.1.6) Vías de señalización implicadas en la patogénesis de la OA ..................... 56

2.1.6.1) MAPK ............................................................................................. 56

2.1.6.2) PI3-K/Akt ........................................................................................ 58

2.1.6.3) NF-ĸB ............................................................................................. 59

2.1.6.4) Otras vías de señalización: AP-1, TLRs, Wnt-β-catenina ............... 61

XXII

2.1.7) Nuevas dianas moleculares en el tratamiento de la OA ........................... 62

2.2) La hemo oxigenasa-1 ......................................................................................... 64

2.2.1) Generalidades de la hemo oxigenasa-1 .................................................... 64

2.2.2) Principales efectos de los componentes de la vía de la HO-1 ................... 65

2.2.3) Moléculas inductoras de HO-1 .................................................................. 67

2.2.4) Papel de la HO-1 en enfermedades articulares ......................................... 68

2.3) High mobility group box 1 .................................................................................. 72

2.3.1) Generalidades y estructura de High mobility group box 1 ........................ 72

2.3.2) Localización nuclear de HMGB1. Efectos y consecuencias ....................... 73

2.3.3) Mecanismos de liberación extracelular de HMGB1 .................................. 73

2.3.4) Receptores implicados en los efectos de HMGB1 ..................................... 75

2.3.5) HMGB1, una citocina más en el medio extracelular: efectos y consecuencias .. 79

2.3.6) Papel de HMGB1 en distintas patologías. Estrategias terapéuticas utilizadas ... 81

2.3.7) Efectos anti-inflamatorios de HMGB1 ....................................................... 85

2.3.8) Relación entre HMGB1 y HO-1 .................................................................. 86

3) OBJETIVOS ................................................................................................................. 87

4) MATERIAL Y MÉTODOS ............................................................................................. 91

4.1) Obtención de muestras de membrana sinovial y cultivo de sinoviocitos OA ... 93

4.1.1) Obtención de muestras de membrana sinovial OA .................................. 93

4.1.2) Aislamiento de sinoviocitos OA ................................................................. 93

4.1.3) Mantenimiento de los cocultivos de sinoviocitos OA ............................... 94

4.1.4) Condiciones experimentales ..................................................................... 95

4.2) Tratamiento de los cocultivos de sinoviocitos .................................................. 97

4.2.1) Estímulos y productos ............................................................................... 97

XXIII

4.2.2) Silenciamiento de genes mediante siRNA ................................................. 99

4.2.3) Transducción de vectores virales ............................................................ 101

4.3) Técnicas experimentales .................................................................................. 104

4.3.1) Ensayo de viabilidad celular mediante la exclusión de azul tripán ......... 104

4.3.2) Ensayo de proliferación celular por el método del MTT ......................... 105

4.3.3) Ensayo de migración-quimiotaxis ............................................................ 106

4.3.4) Determinación del estrés oxidativo ......................................................... 107

4.3.5) Determinación de PGE2 por radioinmunoensayo ................................... 108

4.3.6) Determinación de proteínas por ELISA.................................................... 109

4.3.7) Determinación de la actividad MMP ....................................................... 111

4.3.8) Evaluación de la expresión de proteínas por Western Blot .................... 113

4.3.9) Evaluación de la expresión de proteínas por inmunocitoquímica .......... 117

4.3.9.1) Inmunofluorescencia ................................................................... 119

4.3.10) PCR cuantitativa a tiempo real .............................................................. 120

4.3.10.1) Extracción de ARN ..................................................................... 121

4.3.10.2) Reacción de la transcriptasa inversa ......................................... 122

4.3.10.3) Reacción de la PCR cuantitativa a tiempo real .......................... 123

4.3.11) Transfección transitoria de plásmidos. Ensayos de actividad luciferasa .. 125

4.4) Análisis estadístico y expresión de resultados ................................................. 128

5) RESULTADOS ........................................................................................................... 129

5.1) Caracterización de los cocultivos de sinoviocitos OA ....................................... 131

5.2) Evaluación de la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA .................................. 133

5.2.1) Evaluación de la expresión de HO-1 en condiciones basales .................. 133

5.2.2) Modulación de la expresión de HO-1 por citocinas en sinoviocitos OA . 134

XXIV

5.2.3) Efectos de las citocinas sobre parámetros implicados en la OA ............. 135

5.2.3.1) Efectos de las citocinas sobre la proliferación celular ................ 136

5.2.3.2) Efectos de las citocinas sobre la actividad MMP. ........................... 136

5.2.3.3) Efectos de las citocinas sobre la producción de otras citocinas . 137

5.2.3.4) Efectos de las citocinas sobre la expresión de COX-2 y PGE2 ...... 139

5.3) Efectos de HMGB1 en sinoviocitos OA y relación con HO-1 ............................ 141

5.3.1) Efectos de HMGB1 sobre la proliferación celular ................................... 144

5.3.2) Efectos de HMGB1 sobre el estrés oxidativo .......................................... 144

5.3.3) Efectos de HMGB1 sobre la producción de citocinas y quimiocinas ...... 145

5.3.4) Efectos de HMGB1 sobre la expresión de COX-2, mPGES-1 y PGE2 ............ 149

5.3.5) Efectos de HMGB1 sobre la actividad y expresión de distintas MMPs ... 149

5.3.6) Estudio de los receptores implicados en los efectos de HMGB1 ............ 152

5.3.7) Efectos de HMGB1 sobre la fosforilación de Akt y MAPK ....................... 153

5.3.8) Efectos de HMGB1 sobre la activación de NF-ĸB .................................... 155

5.3.9) Efectos de HMGB1 sobre la expresión de HO-1 ...................................... 156

5.3.10) Efectos de HMGB1 sobre el factor de transcripción Nrf2 ..................... 158

5.4) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP en sinoviocitos OA ........................... 159

5.4.1) Efectos de CoPP sobre la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA ........... 159

5.4.2) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la proliferación celular ... 162

5.4.3) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre el estrés oxidativo ..... 163

5.4.4) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la producción de citocinas ... 164

5.4.5) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la producción de

quimiocinas y la migración celular ............................................................. 165

5.4.6) Efectos de la inducción de HO-1 sobre la producción de PGE2 ............... 167

XXV

5.4.7) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la actividad y

expresión de enzimas degenerativas del cartílago .................................... 168

5.4.7.1) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre MMPs ............. 169

5.4.7.2) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre agrecanasas .... 171

5.4.8) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre HMGB1 ...................... 171

5.4.9) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la fosforilación de Akt y MAPK.. 176

5.4.10) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la activación de

factores de transcripción ........................................................................... 178

5.5) Efectos de la sobre-expresión de HO-1 mediante la transducción de vectores

lentivirales modificados con el gen de HO-1 en sinoviocitos OA................... 180

5.5.1) Evaluación del porcentaje de transducción de LV HO-1 en sinoviocitos OA .. 180

5.5.2) Efectos de LV HO-1 sobre la expresión de HO-1 ................................... 181

5.5.3) Efectos de la transducción de LV HO-1 sobre la producción de


5.5.4) Efectos de la transducción de LV HO-1 sobre la producción de MMPs 184

5.5.5) Efectos de la transducción de LV HO-1 sobre HMGB1 .......................... 186

5.6) Efectos del CO liberado por CORM-2 en sinoviocitos OA ................................ 187

5.6.1) Efecto del CO liberado por CORM-2 sobre la expresión de HO-1 ........... 187

5.6.2) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la proliferación celular ....... 189

5.6.3) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre el estrés oxidativo .............. 189

5.6.4) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la producción de citocinas . 191

5.6.5) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la producción de


XXVI

5.6.6) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la expresión de COX-2 y la

producción de PGE2 ................................................................................... 195

5.6.7) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la actividad y expresión de MMPs 195

5.6.8) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre HMGB1 ............................... 197

5.6.9) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la fosforilación de Akt y MAPK .... 197

5.6.10) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre factores de transcripción . 199

6) DISCUSIÓN ............................................................................................................... 201

7) CONCLUSIONES/CONCLUSIONS ............................................................................. 223

8) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 229

9) ANEXOS ................................................................................................................... 265

9.1) Artículos publicados durante el desarrollo de la presente Tesis Doctoral ..... 267

9.2) Informe del Comité Ético de Investigación Clínica .......................................... 268

1) R

esu

men

Resumen (abstract) _____________________________________________________________________________

31

La inducción de la vía de la hemo oxigenasa-1 (HO-1) ha demostrado poseer efectos

protectores a nivel del cartílago osteoartrítico (OA) (Guillén y cols, 2008a y b), (Megías

y cols, 2009). En la presente Tesis Doctoral nos propusimos evaluar los efectos de esta

vía sobre la inflamación sinovial OA, utilizando para ello un modelo de cocultivo de

sinoviocitos obtenidos de muestras de membrana sinovial de pacientes OA, sometidos

a cirugía de reemplazo de la articulación. Inicialmente comprobamos la modulación

ejercida por distintas citocinas sobre la expresión basal de HO-1: las citocinas pro-

inflamatorias interleucina(IL)-1β, el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) e IL-17, a la

vez que aumentaron la producción de distintos mediadores implicados en la OA,

disminuyeron marcadamente la expresión de HO-1, mientras que las citocinas anti-

inflamatorias IL-10 y IL-13, aumentaron su expresión sin modificar los valores basales

de los mediadores determinados.

Paralelamente, estudiamos la contribución de la proteína High Mobility Group Box 1

(HMGB1) a la inflamación sinovial o sinovitis, así como su relación con la vía de la HO-

1. Aunque HMGB1 fue descrita inicialmente como una proteína nuclear, su interés

aumentó cuando se describió que a nivel extracelular era capaz de comportarse como

una citocina pro-inflamatoria. Conociendo que HMGB1 se sobre-expresa en el sinovio

OA, en el que presenta una localización básicamente citosólica y extracelular,

estudiamos los efectos de la estimulación de las células con HMGB1, en presencia o

ausencia de IL-1β. Si bien no detectamos ningún efecto de HMGB1 solo, en presencia

de IL-1β produjo un marcado incremento en la proliferación celular y en el estrés

oxidativo, así como en la expresión génica y proteica de distintas citocinas, quimiocinas

y metaloproteinasas de matriz (MMPs), y en la expresión de la enzima ciclo-oxigenasa

2 (COX-2) y la consiguiente producción de prostaglandina E2 (PGE2), efectos que

podrían estar mediados por el incremento en la fosforilación de Akt y de las proteín

cinasas activadas por mitógenos (MAPK) ERK 1/2, p38, así como por el aumento en la

actividad transcripcional del factor nuclear ĸB (NF-ĸB). Al igual que las citocinas pro-

inflamatorias, también HMGB1 disminuyó la expresión basal de HO-1, efecto que

resultó mayor en las células co-incubadas con HMGB1 e IL-1β. Este efecto de HMGB1

sobre la expresión de HO-1 parece independiente del factor relacionado con el factor


32

eritroide 2 (Nrf2) y podría depender de mecanismos de regulación post-

transcripcionales.

Para determinar los efectos de la HO-1 en nuestro modelo de OA, las células fueron

tratadas con cobalto protoporfirina IX (CoPP), que induce potentemente la expresión

de HO-1, utilizando como estímulo pro-inflamatorio la IL-1β, una importante citocina

que participa en los efectos catabólicos de la OA. En estos experimentos se utilizó un

silenciador específico de HO-1 para confirmar que los efectos observados al CoPP eran

debidos a la HO-1 y no a otros efectos intrínsecos de la molécula. La inducción de HO-1

ejercida por CoPP resultó responsable de la disminución de la proliferación celular y

del estrés oxidativo, así como de la reducción en la expresión de distintas quimiocinas

y de los procesos migratorios asociados a éstas. También a nivel de MMPs se

observaron efectos beneficiosos de este tratamiento.

Una vez conocida la participación de HMGB1 en el mantenimiento de la respuesta

inflamatoria y degenerativa en el sinovio OA, determinamos los efectos de CoPP sobre

esta proteína. Así, este tratamiento disminuyó marcadamente la expresión génica y

proteica de HMGB1, impidiendo su translocación al citoplasma y la posterior secreción

al medio de cultivo, además de reducir la expresión del receptor de productos

avanzadosde glicosilación RAGE.

A nivel de las vías de señalización detectamos una marcada reducción en la

fosforilación de Akt y de las MAPK ERK 1/2, JNK 1/2, p38, que podría estar relacionada

con los efectos observados previamente por el tratamiento de los sinoviocitos con

CoPP. También se observó una reducción en la actividad transcripcional de NF-ĸB, que

podría deberse a la reducida fosforilación de IĸBα y a la reducida translocación nuclear

de p65.

Con el objetivo de evaluar las consecuencias de la sobre-expresión directa de HO-1,

sin la necesidad de utilizar moléculas químicas, transfectamos los sinoviocitos con

vectores virales modificados con el gen de la HO-1, en los que pudimos confirmar los

efectos del tratamiento con CoPP sobre la expresión de quimiocinas, MMPs y sobre

HMGB1.

Finalmente, se determinaron los efectos del CO, metabolito de la reacción

catalizada por HO-1, liberado por la molécula CORM-2. Al igual que CoPP, este

tratamiento redujo la proliferación celular y el estrés oxidativo, la expresión de


33

distintas quimiocinas y los procesos de migración asociados a éstas, así como la

actividad y expresión de MMPs, que podrían ser debidos a la reducida activación de las

MAPK ERK 1/2, JNK 1/2, p38, de NF-ĸB y de la proteína activadora 1 (AP-1). En cambio,

no detectamos efecto alguno del CO sobre los niveles de HMGB1, pero sí observamos

un aumento significativo del eje COX-2/PGE2. Por todo esto, el hecho de que CORM-2

no sea capaz de modificar los niveles de HMGB1 e induzca un aumento en la expresión

de COX-2/PGE2, podría indicar que la sobre-expresión de HO-1 supondría una

estrategia mejor frente a la sinovitis OA que la liberación de CO.

En conjunto, nuestros resultados demuestran el papel protector de la vía de la HO-

1, principalmente por inducción de la expresión de HO-1, en el control de la

inflamación sinovial OA, proceso en el que hemos descrito la participación de la

proteína HMGB1, que potencia los efectos catabólicos de IL-1β. Hemos demostrado

además la interacción negativa entre la vía de la HO-1 y el HMGB1. Así pues, tanto

HMGB1 como HO-1 representan nuevas dianas terapéuticas sobre las que poder

intervenir.

Palabras clave: osteoartritis, inflamación, sinoviocitos, citocinas, interleucina-1β,

hemo oxigenasa-1, high mobility group box 1, cobalto protoporfirina IX, lentivirus de

hemo oxigenasa-1, molécula liberadora de CO-2.


35

Induction of the heme-oxygenase-1 (HO-1) pathway has shown to elicit protective

effects in OA cartilage (Guillén & cols, 2008 a & b), (Megías & cols, 2009). In the

present Thesis we aimed to determine the effects of this pathway on the OA synovial

inflammation. For this purpose we used a model of co-cultures of synoviocytes

obtained from synovial membrane samples from OA patients undergoing total knee

joint replacement. First of all we determined the effects of different cytokines on HO-1

basal expression: pro-inflammatory cytokines interleukin(IL)-1β, tumoral necrosis

factor α (TNF-α) and IL-17, while increasing the production of several mediators

involved in OA pathogenesis, markedly decreased HO-1 expression whereas the anti-

inflammatory ones, IL-10 and IL-13, increased HO-1 expression without modifying

basal levels of the mediators analyzed.

Meanwhile, we studied the contribution of High Mobility Group Box 1 protein

(HMGB1) to OA synovitis, as well as its relationship with the HO-1 pathway. Despite

HMGB1 was initially described as a nuclear protein, its interest raised when it was

described that it could behave as a pro-inflammatory cytokine once released

extracellularly. Once we knew that HMGB1 was over-expressed in OA synovium, in

which it showed a cytosolic and extracellular localization, we next determined the

effects of stimulating cells with HMGB1, either in presence or absence of IL-1β.

Although we detected no effect of HMGB1 when added alone, in presence of IL-1β it

markedly increased cell proliferation rate and oxidative stress levels, as well as gene

and protein expression of pro-inflammatory cytokines, chemokines, matrix

metalloproteinases (MMPs) and cyclo-oxygenase-2 (COX-2), with the consequent

increase in prostaglandin E2 (PGE2) synthesis, effects that could depend on the

increased phosphorylation rate of Akt and mitogen activated protein kinases (MAPK)

ERK 1/2 and p38, as well as on the increased transcriptional activity of nuclear factor

ĸB (NF-ĸB). Similar to our previous data with pro-inflammatory cytokines, HMGB1

stimulation resulted in a decrease of HO-1 basal expression, that was more intense in

cells co-incubated with IL-1β. This effect of HMGB1 on HO-1 expression might be

independent of nuclear factor erythroid derived-2 (Nrf2) transcriptional activity and

consequence of post transcriptional regulatory mechanisms.


36

To determine the effects of HO-1 induction in our OA model, cells were first treated

with CoPP, which is a potent HO-1 inducer, using IL-1β as stimulus, an important

cytokine that participates in the catabolic features of OA. In these experiments we

used a specific HO-1 siRNA in order to confirm that the effects of CoPP depended on

HO-1 induction and not on other intrinsic effects of the molecule. Overexpression of

HO-1 by CoPP resulted in a decrease in the proliferation rate and in oxidative stress

levels, as well as in chemokine expression and the consequent cell migration. We also

detected beneficial effects of CoPP on MMPs expression and activity.

After having demonstrated the involvement of HMGB1 in the maintenance of

inflammatory and degenerative responses in OA synovium, we next tested the effects

of CoPP on this protein. CoPP markedly decreased gene and protein HMGB1

expression, avoiding its translocation into the cytoplasm and the consequent

extracellular release into the culture medium, besides from reducing the expression of

its receptor RAGE.

At the signaling pathway level, we detected a significant reduction in the

phosphorylation rate of Akt and MAPK ERK 1/2, JNK 1/2 and p38, that could be related

to the effects seen previously on the production of catabolic and inflammatory

mediators by CoPP. We also detected a marked reduction in NF-ĸB transcriptional

activity, probably due to the reduced phosphorylation of IĸBα and the consequent p65

translocation elicited by HO-1 induction with CoPP.

In order to assess the consequences of a direct over-expression of HO-1, without

using chemical molecules, synoviocytes were modified with viral vectors encoding HO-

1 gene. In this set of experiments we confirmed the effects of CoPP treatment on

chemokines, MMPs and HMGB1.

We finally determined the effects of CO, metabolite of the reaction catalized by

HO-1, released from CORM-2 molecule. As CoPP did, this treatment reduced cell

proliferation rate and oxidative stress, gene and protein expression of some

chemokines and their related migration effects, as well as the activity and expression

of some MMPs, effects that could depend on the reduced activation of MAPK ERK 1/2,

JNK 1/2, p38, NF-ĸB and activator protein 1 (AP-1). On the other hand, we detected no

effect of CO/CORM-2 on HMGB1 expression, but we detected a significant increase on

the COX-2/PGE2 axis. The fact that CORM-2 resulted unable to modify HMGB1


37

expression but induced COX-2/PGE2 expression could indicate that HO-1 over-

expression would be a better strategy against OA synovitis rather than CO release.

Overall, our data demonstrate the protective role of the HO-1 pathway, mainly

through HO-1 induction, in the control of OA synovitis, a process in which we have

described the participation of HMGB1, a protein that potentiates the catabolic

features of IL-1β. We have also demonstrated the negative interactions between HO-1

and HMGB1 pathways. Thus, both HMGB1 and HO-1 represent new therapeutic

targets in OA.

Keywords: osteoarthritis, inflammation, synoviocytes, cytokines, interleukin-1β, heme

oxygenase-1, high mobility group box 1, cobalt protoporfirin IX, heme oxygenase-1

lentivirus, CO releasing molecule-2.

2) R

evis

ión

bib

liog

ráfi

ca

Revisión bibliográfica _____________________________________________________________________________

41

2.1) La osteoartritis

2.1.1) Fisiología de las articulaciones sinoviales

Las articulaciones sinoviales o diartrósicas, como la rodilla, representan el tipo de

articulación más común en el cuerpo humano. Estructuralmente constan de al menos

dos huesos, cuyos extremos se encuentran recubiertos por el cartílago articular y

anclados por la presencia de ligamentos y tendones, que definen a su vez un espacio

conocido como cápsula, que delimita la articulación, constituida básicamente por un

tejido fibroso. La parte interior de la cápsula alberga la membrana sinovial, que

produce el fluido sinovial, capaz de actuar como lubrificante, además de facilitar el

movimiento y transportar nutrientes.

Cartílago articular: El cartílago articular presenta propiedades viscoelásticas

y compresivas debidas a la presencia de una matriz extracelular compuesta

fundamentalmente por agua, colágeno tipo II (aunque también de los tipos IX y X), un

proteoglicano denominado agrecano y un único tipo celular, los condrocitos,

careciendo de inervación y de vasos sanguíneos, de modo que los nutrientes son

transportados a los condrocitos por difusión desde el fluido sinovial que envuelve el

cartílago. A pesar de que estas células son metabólicamente muy activas, no se dividen

una vez pasada la adolescencia. Únicamente pequeños defectos asociados a pérdidas

mínimas de componentes de la matriz extracelular pueden ser reparados (Revisado

por Lorenz y Richter, 2006).

Hueso subcondral: El hueso subcondral es un tejido poco vascularizado que

comprende la zona entre el tidemark, considerado como el frente de mineralización o

zona de unión entre el cartílago calcificado y el no calcificado y el inicio de la médula

ósea. Sus principales funciones son las de dar soporte al cartílago, distribuir la carga

mecánica del mismo, absorber la tensión de los impactos mecánicos y nutrir las zonas

más profundas del cartílago, sobre todo durante el período de crecimiento (Revisado

por Castañeda y Herrero-Beaumont, 2005).


42

Membrana sinovial: La membrana sinovial está formada por una fina capa de

células conocida como “íntima”, constituida fundamentalmente por dos tipos

celulares. Los sinoviocitos de tipo macrófago (MLS, del inglés macrophage-like

synoviocytes o sinoviocitos de tipo A), poseen un fenotipo similar al de otras

poblaciones de macrófagos (CD11b, CD68, CD14 y CD163). También expresan

moléculas de histocompatibilidad de tipo II, lo que las relaciona con la presentación de

antígenos en los estadios iniciales de la respuesta inmune. Además, poseen vacuolas

en su interior, lo que indica su potencial capacidad fagocítica. El segundo tipo de

células son sinoviocitos de tipo fibroblasto (FLS, del inglés fibroblast-like synoviocytes o

sinoviocitos de tipo B), que son células mesenquimales que expresan un fenotipo

similar al de los fibroblastos (colágenos tipo IV y V, vimentina, CD90 etc.), siendo

además las células más abundantes en la membrana sinovial (Revisado por Bartok y

Firestein, 2010). Los FLS juegan un papel crítico en los procesos de embriogénesis y

maduración de la función articular. Así, durante las etapas de desarrollo, son los FLS los

que, en respuesta a ácido hialurónico y otras señales, empiezan a definir el espacio y la

cápsula articular. Son además responsables de la producción de colágeno y otras

moléculas que conforman y mantienen la cápsula articular. Además, son los mayores

productores de ácido hialurónico y de distintas glicoproteínas que son secretadas al

fluido sinovial con función lubrificante. Por otra parte, los FLS sanos secretan también

cantidades controladas de proteasas, principalmente metaloproteinasas de matriz

(MMPs), con capacidad de digerir la matriz extracelular, contribuyendo de esta manera

al mantenimiento de la estructura de la cápsula articular a través de los procesos de

remodelado (Revisado por Abeles y Pillinger, 2006). Por debajo de esta capa de células

se encuentra una red de capilares que promueven la transferencia de agua, glucosa,

electrolitos y otros solutos al fluido sinovial. A un nivel más profundo se encuentra el

tejido conectivo o “subíntima”, que contiene un plexo de vesículas linfáticas esenciales

para la regulación del fluido sinovial, drenando el exceso de fluido de la cavidad

articular y mantiendo la presión en la zona del cartílago articular (Iwanaga y cols,

2000).


43

2.1.2) Principales características de la osteoartritis

Según la Sociedad Americana de Reumatología, la osteoartritis (OA) o artrosis se

define como un grupo heterogéneo de patologías que conducen a la aparición de

signos y síntomas articulares asociados a daños en la integridad del cartílago, además

de cambios en el hueso subyacente y en los bordes articulares. Se trata de una de las

enfermedades de mayor prevalencia en nuestra sociedad, cuya incidencia después de

los 65 años es de alrededor del 60% en hombres y del 70% en mujeres. Además,

representa una de las primeras causas de discapacidad en edades tardías.

Aunque su etiología a día de hoy no está completamente definida, sabemos que se

trata de una enfermedad multifactorial, en

la que intervienen componentes

inflamatorios, metabólicos y mecánicos y

que afecta sobre todo a las articulaciones de

las manos, cadera, rodilla, pies y espina

dorsal (Figura 1). Su aparición puede estar

condicionada por diversos factores de

riesgo, entre ellos, herencia genética, sexo,

estado hormonal, nutricional, obesidad,

traumatismos, deformidad en las

articulaciones, discapacidades físicas,

debilidad muscular, etc. (Revisado por Sarzi-Puttini y cols, 2005). Las principales

consecuencias del proceso OA son la degeneración y pérdida progresiva de la

estructura y funcionalidad del cartílago articular, la formación de osteofitos, la

esclerosis del hueso subcondral y la hiperplasia sinovial (Figura 2). La aparición de los

síntomas de la OA es gradual, siendo el dolor el síntoma principal, aunque también son

comunes la rigidez y la deformación de las articulaciones, la sensación de dolor al tacto

y de crujido y la pérdida de movilidad en etapas avanzadas de la enfermedad

(Moskowitz y cols, 2007).

Figura 1: Principales articulaciones afectadas por la OA

(imagen obtenida de www.itendonitis.com)


44

Figura 2: Articulación sana vs articulación OA

2.1.3) Fisiopatología de la OA

El proceso fisiopatológico que conduce a la OA puede dividirse en tres fases. Parece

claro que la lesión inicial ocurre en el cartílago, produciéndose como consecuencia de

ésta cambios a nivel molecular en los componentes de la matriz. El agua aumenta el

tamaño de la matriz mientras que los proteoglicanos disminuyen. La estructura de la

red de colágeno se encuentra dañada, lo que conduce a una disminución de la dureza

del cartílago. En una segunda fase, los condrocitos tratan de compensar el daño

aumentando su proliferación y su metabolismo. En la última fase, los condrocitos ya no

son capaces de mantener su actividad reparadora, lo que termina provocando la

degradación de la matriz extracelular, la muerte de los condrocitos y la pérdida de la

integridad del cartílago (Revisado por Lorenz y Richter, 2006). Morfológicamente estos

cambios se traducen en la fibrilación del tejido, aparición de grietas, pérdida de

elasticidad y pérdida final del cartílago. Por otra parte, y aunque no se sabe si

precediendo a los cambios en el cartílago (hay quien incluso asegura que la OA es una

enfermedad más ósea que cartilaginosa), o como consecuencia de éstos, se producen

también numerosas alteraciones a nivel del hueso subcondral, y que incluyen el

Músculo

Ligamento/tendones

Sinovitis

Cartílago

Osteofitos Membrana sinovial

Músculo, ligamentos y tendones debilitados

Degeneración del cartílago

Esclerosis ósea Fluido sinovial

Cápsula

Hueso

Engrosamiento de la cápsula

(imagen adaptada de Wieland y cols, 2005)


45

engrosamiento (o esclerosis) del mismo, que avanza hacia la zona del cartílago hialino

promoviendo la osificación endocondral del mismo, la formación de osteofitos en los

márgenes de la articulación, el desarrollo de

quistes de hueso subcondral y la aparición de

microfracturas y de lesiones a nivel de la

médula ósea (Figura 3), (Revisado por

Henrotin y cols, 2009), (Revisado por Martel-

Pelletier y Pelletier, 2010). En este contexto,

los osteblastos presentan un fenotipo

alterado y son capaces de sintetizar distintos

mediadores (citocinas, eicosanoides, factores

de crecimiento y marcadores exclusivos del

hueso), capaces de migrar, a través de las

microfracturas y de los vasos sanguíneos neoformados, hacia el cartílago, induciendo

cambios en el metabolismo del mismo (Revisado por Kwan y cols, 2010).

Como consecuencia de la elevada actividad catabólica a nivel del cartílago, se

liberan al fluido sinovial distintos productos derivados de la degradación proteolítica

del mismo, tales como fragmentos de condroitina y sulfato de queratano, de

proteoglicanos, de colágeno tipo II, etc., que poseen todos ellos actividad antigénica

(Revisado por Ghosh, 1999). Tanto unos como otros son fagocitados por los MLS de la

capa íntima, provocando la activación de las células de la membrana sinovial, que

responden con una reacción inflamatoria caracterizada por el reclutamiento de células

circulantes (neutrófilos, macrófagos y linfocitos T básicamente) y por la liberación, de

nuevo al fluido sinovial, de distintos mediadores pro-inflamatorios y degenerativos

como citocinas, de las cuales, la interleucina-1β (IL-1β) ejerce un papel principal,

orquestando la producción de otras citocinas como el factor de necrosis tumoral α

(TNF-α), IL-6, IL-17, quimiocinas (IL-8, CCL2), enzimas degenerativas de la matriz del

cartílago (MMPs y agrecanasas), mediadores lipídicos (eicosanoides) y radicales libres

[superóxido y óxido nítrico (NO)], cuyas principales características se detallarán en

capítulos posteriores. Estos mediadores difunden del fluido sinovial al cartílago, donde

se crea un círculo vicioso, ya que, a la vez que favorecen la degradación del mismo por

Figura 3: Cambios a nivel de cartílago y hueso durante la OA

(imagen adaptada de www.eorthopod.com)

Microfracturas

Erosión del cartílago

Exposición del hueso


46

alteraciones en la síntesis de proteoglicanos, inducen la producción y liberación de

nuevos mediadores pro-inflamatorios y degenerativos, contribuyendo por tanto a la

perpetuación y cronicidad de la OA (Revisado por Ghosh y Smith, 2002), (Revisado por

Martel-Pelletier y Pelletier, 2010), (Revisado por Sellam y Berenbaum, 2010).

Pero la influencia negativa de la membrana sinovial OA no se centra únicamente a

nivel del cartílago sino que ésta es capaz de actuar también a nivel del hueso. Por una

parte, los MLS son capaces de promover la formación de osteofitos a través de la

síntesis de factores de crecimiento (factor de crecimiento transformante TGF-β y

proteínas morfogénicas del hueso BMPs) (Blom y cols, 2004), mientras que por otra

parte la membrana sinovial ejerce un importante papel en la osteoclastogénesis del

hueso subcondral OA ya que los MLS son capaces de diferenciarse espontáneamente

en osteoclastos activos y funcionales (Adamopoulos y cols, 2006).

2.1.4) Papel de la inflamación de la membrana sinovial o sinovitis en el

desarrollo de la OA

Tradicionalmente la OA ha sido descrita como una enfermedad articular “no

inflamatoria”, para distinguirla de otras enfermedades articulares claramente

inflamatorias como la artritis reumatoide (AR), básicamente por 2 motivos: por la

escasez de neutrófilos en el líquido sinovial y por la ausencia de manifestaciones

sistémicas de la inflamación. Además, las características del cartílago impiden cumplir

los signos clásicos de la inflamación (enrojecimiento, hinchazón, dolor y calor). Sin

embargo, son numerosas las evidencias que a día de hoy apoyan el componente

inflamatorio de la OA (Revisado por Pelletier y cols, 2001), (Revisado por López-

Armada y cols, 2007), (Revisado por Martel-Pelletier y Pelletier, 2010). De hecho,

aunque en principio se consideraba que la OA era una enfermedad degenerativa de

cartílago y hueso, en la que la inflamación de la membrana sinovial o sinovitis jugaba

un papel meramente secundario, hoy en día se sabe que estos procesos degenerativos

dependen en gran medida de cambios en la membrana sinovial (Shibakawa y cols,


47

2003), (Yuan y cols, 2004), (Revisado por Sutton y cols, 2009), (Revisado por Attur y

cols, 2010).

No sólo en las etapas finales de la OA aparece la inflamación de la membrana

sinovial, a niveles tales que incluso se asemejan bastante a la hiperplasia sinovial

artrítica (Shibakawa y cols, 2003), sino que se han descrito casos de sinovitis incluso en

pacientes en estadios iniciales de esta enfermedad, lo que sugiere la participación

directa del sinovio en la progresión de la OA (Benito y cols, 2005). Histológicamente, la

sinovitis OA se caracteriza por hipertrofia e hiperplasia, sobre todo de las células de la

capa íntima, y por la aparición de un infiltrado de células inflamatorias, principalmente

macrófagos, neutrófilos y linfocitos T, y en menor medida, linfocitos B activados, así

como de un aumento en la angiogénesis (Revisado por Haywood y cols, 2003) que,

junto con el proceso inflamatorio, es responsable, al menos en parte, del dolor

característico de la OA (Revisado por Bonnet y Walsh, 2005). Por otra parte, y a

diferencia de la sinovitis típica de la AR, la inflamación sinovial OA no se localiza

difusamente en la articulación, sino que se localiza en zonas concretas, normalmente

próxima a la zona en la que el cartílago se encuentra dañado (Ayral y cols, 2005).

Figura 4: Membrana sinovial sana vs membrana sinovial OA

a b

c d

↑ vascularidad

Hiperplasia

Fibrosis

Infiltrado inflamatorio

Microfotografías obtenidas de Scanzello y cols, 2008. Cortes de tejido sinovial fijados en formalina, incluidos en parafina y teñidos con hematoxilina-eosina. (a) tejido sinovial sano. (b-d) tejido sinovial procedente de 3 pacientes con diagnóstico de OA. Aumentos: x100.


48

2.1.5) Factores implicados en la patogénesis de la OA

Numerosos son los mediadores implicados en la patogénesis de la OA, tal y como se

ha visto en el apartado 2.1.3. Durante el desarrollo de esta patología, no sólo

participan mediadores de naturaleza catabólica y pro-inflamatoria, sino que se ha

descrito también la participación de otros mediadores de naturaleza anabólica y anti-

inflamatoria, cuya función es controlar los procesos degenerativos propios de esta

enfermedad. En este apartado resumiremos brevemente las principales características

de los distintos factores implicados en la OA.

2.1.5.1) Enzimas degenerativas del cartílago: Las MMP son una familia de

endopeptidasas dependientes de Zn2+, capaces de degradar distintos componentes de

la matriz extracelular (colágeno, fibronectina, proteoglicano, etc.). En la articulación

sana contribuyen al mantenimiento de la estructura de la cápsula articular a través de

los procesos de remodelado, aunque por un aumento excesivo en su síntesis y

actividad pueden conducir a situaciones patológicas, provocando la degradación del

cartílago característica de la AR y la OA. Las MMPs se clasifican en varios grupos en

función de la afinidad por su sustrato, su localización intracelular y su estructura,

distinguiéndose colagenasas (MMP-1, -8 y -13), gelatinasas (MMP-2 y -9),

estromelisinas (MMP-3 y -10), matrilisinas (MMP-7 y -26) y las metaloproteinasas de

membrana MT-MMPs (MMP-14, MMP-15, MMP-16, MMP-17, MMP-24 y MMP-25),

(Revisado por Murphy y cols, 2002). De éstas, se han detectado niveles elevados de las

MMP-1, -3, -9, -13 y -14 en el cartílago OA, mientras que la membrana sinovial OA

expresa MMP-3, y en menor medida, MMP-1 y MMP-13 (Yuan y cols, 2004).

Existe por otra parte un grupo de metaloproteinasas que reciben el nombre de

agrecanasas, capaces de degradar el agrecano, que como sabemos, es el proteoglicano

más abundante de la matriz extracelular. En el cartílago se ha descrito la presencia de

dos agrecanasas, la agrecanasa 1 o ADAMTS4, (del inglés a disintegrin and

metalloproteinase with thrombospondin motif) y la agrecanasa 2 o ADAMTS5, y

aunque ratones knock out en ADAMTS5 desarrollan una mayor protección frente a la

degeneración del cartílago (Glasson y cols, 2005), parece que ADAMTS4 podría tener

un papel más relevante en la OA humana (Revisado por Bondeson y cols, 2008).


49

Para intentar contrarrestar los efectos de las MMPs el tejido articular sintetiza

espontáneamente inhibidores tisulares de metaloproteinasas (TIMP), de los cuales se

han identificado TIMP-1, -2 y -3 en la articulación humana, aunque la expresión génica

de algunas de estas moléculas en el sinovio artrósico es similar a la del tejido no

artrósico (Davidson y cols, 2006), por lo que resultan incapaces para detener el avance

degenerativo.

A nivel farmacológico se han desarrollado moléculas sintéticas capaces de inhibir los

efectos de las MMPs, y aunque a priori el uso de estas moléculas podría resultar muy

interesante, éstas han demostrado poseer numerosos efectos secundarios, sobre todo

a nivel músculo-esquelético, impidiendo su empleo a nivel clínico (Murphy y Lee,

2005).

2.1.5.2) Citocinas: Por citocina se entiende una proteína soluble de bajo peso

molecular, liberada por numerosos tipos celulares, que posee una actividad reguladora

en el organismo. Estos mediadores ejercen un papel destacado en la fisiopatología de

la OA (Revisado por Westacott y Sharif, 1996), (Revisado por Fernandes y cols, 2002) y

aunque existe un poco de controversia al respecto, parece estar aceptado que la

citocina IL-1β ejerce un papel clave en el desarrollo de la OA tanto en etapas iniciales

como tardías, mientras que TNF-α posee un papel secundario, en tanto que parece

estar involucrado únicamente en las etapas iniciales (Revisado por Martel-Pelletier y

Pelletier, 2010). Además, durante el proceso inflamatorio de la OA se liberan

activamente otras citocinas de carácter pro-inflamatorio (IL-6, IL-17, oncostatina M,

factor inhibidor de leucemia LIF) o anti-inflamatorio/regulador (IL-4, IL-10, IL-13),

destinadas a contrarrestar los efectos de las citocinas catabólicas.

La IL-1β, sintetizada inicialmente como precursor inactivo, se convierte en su forma

activa por acción de la enzima convertidora de IL-1β (ICE, del inglés, IL-1β-converting

enzyme) o caspasa 1 (Kronheim y cols, 1992), y produce sus efectos por su unión con

los receptores IL-1R I y II (Receptores de IL-1β I y II), (Slack y cols, 1993). Tanto esta

citocina como sus receptores se encuentran sobre-expresados en la articulación OA

(Saha y cols, 1999), aunque parece que los efectos de la IL-1β en la OA dependen

mayoritariamente del IL-1R I (Sadouk y cols, 1995). El papel protagonista que se le ha

otorgado a la IL-1β durante la OA se debe a su capacidad de actúar a distintos niveles,


50

promoviendo como consecuencia última el incremento en el programa catabólico. Así,

favorece la síntesis y actividad de distintas MMPs y agrecanasas (Stove y cols, 2000),

de otras citocinas y quimiocinas (IL-6, IL-8), (Bender y cols, 1990), y de otros

mediadores pro-inflamatorios, como prostaglandinas (PGs) y leucotrienos (LTs) (Longo

y cols, 1998), mientras que disminuye la síntesis de enzimas inhibidoras de proteasas

(Li y cols, 2006). Por otra parte, es capaz de suprimir las vías anabólicas, por aumento

en la síntesis de colágeno I y por disminución en la síntesis de colágeno tipo II y IX, así

como por inhibición en la síntesis de proteoglicanos (Goldring y cols, 1988), (Gouze y

cols, 2001).

El TNF-α, sintetizado también como precursor inactivo, es convertido a su forma

activa por la enzima convertidora de TNF-α (TACE, del inglés TNF-α converting enzyme)

(Black y cols, 1997) y ejerce sus efectos por la unión a sus 2 receptores de membrana,

el receptor de TNF de 55kDa (TNF-R55) y el receptor de TNF de 75 kDa (TNF-R75)

(Loetscher y cols, 1990), siendo el primero el responsable de sus efectos en los tejidos

articulares (Alaaeddine y cols, 1997). Al igual que la IL-1β, el TNF-α es capaz de inducir

su propia síntesis y la de otros mediadores catabólicos, aunque parece que a igualdad

de concentraciones, la potencia de IL-1β es mucho mayor que la de TNF-α (Revisado

por Otero y Goldring, 2007). Es interesante señalar que los efectos de TNF-α resultan

incrementados considerablemente cuando se co-estimula con IL-1β (Goldring, 1999).

Las citocinas IL-6 e IL-17 también son importantes en el desarrollo del proceso OA

aunque su papel no es tan conocido como el de IL-1β o TNF-α. IL-6 es una citocina

multifuncional, ya que una vez unida a su receptor IL-6R, es capaz de promover efectos

anabólicos y catabólicos. Por una parte, es capaz de aumentar el infiltrado inflamatorio

sinovial (Guerne y cols, 1989), a la vez que amplifica los efectos de la IL-1β sobre la

síntesis de MMPs y la depleción de proteoglicanos (Nietfeld y cols, 1990). A nivel

clínico se ha observado que los niveles circulantes de IL-6 y TNF-α están asociados con

evidencias radiográficas de OA de rodilla y con la pérdida de cartílago en adultos

(Stannus y cols, 2010). En contraposición, IL-6 por sí misma es incapaz de inducir la

síntesis de MMPs mientras que induce activamente la de TIMPs (Lotz y Guerne, 1991),

por lo que algunos estudios le han otorgado un papel regulador en el proceso OA. Por

su parte, IL-17 es una citocina sintetizada inicialmente por células T, cuyo receptor IL-


51

17R se encuentra sobre-expresado en el cartílago OA (Honorati y cols, 2001), y que es

capaz de inducir la expresión de numerosos genes relacionados con la activación

celular. En cultivos de condrocitos humanos aumenta la producción de NO (Attur y

cols, 1997), (Revisado por Martel-Pelletier y cols, 1999), mientras que en sinoviocitos

aumenta la expresión del factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) y otros

factores de crecimiento (Honorati y cols, 2006). IL-17 induce además la producción de

IL-6 y IL-8 en FLS de AR (Hwang y cols, 2004).

Las citocinas anti-inflamatorias IL-4, IL-10 e IL-13 son sintetizadas por los tejidos

articulares, presentando niveles elevados en el fluido sinovial de pacientes OA

(Revisado por Martel-Pelletier y cols, 1999). En conjunto, los efectos protectores que

se les atribuyen se deben a la disminución en la producción de IL-1β, TNF-α, de

distintas MMPs y de PGE2 y al aumento en la expresión del antagonista del receptor de

IL-1β (IL-1Ra) y de TIMP-1 (Revisado por Fernandes y cols, 2002).

El empleo de estrategias anti-citocina, principalmente anti-1β o anti-TNF-α en

distintos ensayos in vitro, demostró poseer efectos, a priori, muy prometedores. En

cambio, las conclusiones extraídas de diversos ensayos clínicos no resultaron ser las

esperadas (Revisado por Calich y cols, 2010), lo que implica la necesidad de

profundizar en el conocimiento de estas moléculas y de otros potenciales agentes

neutralizadores de citocinas como nuevas estrategias de control del proceso OA.

2.1.5.3) Quimiocinas: Las quimiocinas son “citocinas quimiotácticas”, capaces de

inducir y promover procesos quimiotácticos en distintos tipos celulares, a través de la

unión con sus correspondientes receptores. Se han caracterizado más de 50 tipos de

quimiocinas, clasificadas en distintas familias (CXC, CC, C, CX3C) en función de su

estructura (Revisado por Vergunst y cols, 2005). Aunque en principio se creía que los

efectos de las quimiocinas en la OA eran debidos a su actividad quimiotáctica, hoy en

día se sabe que poseen además efectos pro-inflamatorios y pro-angiogénicos capaces

de influir negativamente en la homeostasis del cartílago articular (Revisado por Borzì y

cols, 2004). De hecho, quimiocinas como IL-8/CXCL8, el oncogen α relacionado con el

crecimiento (GROα/CXCL1), la proteína inflamatoria de macrófagos 1α (MIP-1α) y la

proteína quimiotáctica de monocitos 1 (MCP1/CCL2), cuyos niveles son muy elevados

en sinoviocitos, condrocitos y osteoblastos OA (Seitz y cols, 1994), (Pulsatelli y cols,


52

1999), (Lisignoli y cols, 1999), son capaces de inducir la expresión de MMP-3 en

condrocitos (Borzì y cols, 2000). GROα, por su parte, es capaz de inducir hipertrofia y

proliferación de condrocitos (Olivotto y cols, 2007), mientras que CCL2 inhibe la

síntesis de proteoglicano (Yuan y cols, 2001). En explantes de sinovio artrósico se han

detectado niveles (aunque reducidos en comparación con la AR), de otra quimiocina,

CCL20/MIP-3α (Chabaud y cols, 2001), cuya producción, al igual que la de IL-8 y CCL2,

se ve fuertemente incrementada en presencia de citocinas pro-inflamatorias. En

concreto, IL-1β ha demostrado inducir la expresión de CCL20 de manera mucho más

potente que TNF-α e IL-17 (Chabaud y cols, 2001).

2.1.5.4) Eicosanoides (Prostaglandinas y leucotrienos): Los datos que

encontramos en la literatura acerca de la relación entre los eicosanoides y las

enfermedades artríticas revelan un complejo entramado de efectos catabólicos y

anabólicos, debido a que los productos finales de estas vías, a través de su unión con

distintos receptores, son capaces de ejercer efectos divergentes en la articulación

(Revisado por Pelletier y cols, 2001), (Revisado por Martel-Pelletier y Pelletier, 2010),

aunque en algunos casos un mismo prostanoide sea capaz de ejercer efectos

aparentemente opuestos. La PGE2 es el prostanoide más abundante en la articulación

OA y se sintetiza a partir del ácido araquidónico (AA), proceso en el que intervienen

secuencialmente, las enzimas fosfolipasa A2 (PLA2), ciclooxigenasa (COX) y la

prostaglandina-E sintasa (PGES), de las cuales, en un contexto inflamatorio se inducen

potentemente las isoformas COX-2 y prostaglandina-

E-sintasa microsomal 1 (mPGES-1), (Figura 5). La

expresión de COX-2 está incrementada en explantes

de cartílago OA que liberan espontáneamente PGE2

(Amin y cols, 1997), niveles que se correlacionan

también con los de mPGES-1 (Masuko-Hongo y cols,

2004). Entre los principales efectos catabólicos de la

PGE2 destaca la degradación de proteoglicano (Hardy

y cols, 2002) y el aumento en la apoptosis de los

condrocitos (Miwa y cols, 2000). Además, se la asocia

con los cambios estructurales propios de la OA

Figura 5: Esquema de la ruta sintética de PGs y LTs

PLA2

LTs

mPGES-1

Fosfolípidos de membrana

AA

PGH2 HPETE

COX-2 5-LOX

PGE2 LTs


53

(Revisado por Laufer, 2003), siendo capaz de potenciar los efectos pro-inflamatorios de

IL-1β sobre la producción de IL-6 y NO (Li y cols, 2009). En cambio, otros autores

sugieren la contribución de los efectos de PGE2 a la resolución de los procesos

artríticos. En esta línea, la PGE2 derivada de COX-2 disminuye la expresión de distintas

MMPs, proceso mediado por la unión de ésta al receptor de prostaglandina EP4 y por

la inhibición de la activación de distintas vías de señalización, como las MAPK ERK 1/2 y

JNK 1/2, tanto en sinoviocitos artríticos (Pillinger y cols, 2003), como en condrocitos y

explantes de cartílago OA (Fushimi y cols, 2007), (Nishitani y cols, 2010). Además,

Largo y cols comprobaron que la PGE2, a través de la activación de los receptores

EP2/EP4, inhibe la expresión y la síntesis de CCL2 en FLS OA estimulados con IL-1β

(Largo y cols, 2004).

Los leucotrienos son también productos del metabolismo del ácido araquidónico,

sintetizados en este caso por la vía de la enzima 5-lipoxigenasa (5-LOX), existiendo

evidencias directas de la implicación de LTB4 y LTC4 en el proceso OA. Tanto uno como

otro presentan niveles aumentados en los tejidos articulares OA, conociéndose que

LTB4 induce potentemente la expresión de IL-1β y TNF-α (Revisado por Martel-Pelletier

y Pelletier, 2010).

2.1.5.5) Estrés oxidativo y radicales libres: A niveles reducidos, como se dan

en las articulaciones sanas, las especies oxigenadas y

nitrogenadas reactivas (ROS y RNS) ejercen funciones

fisiológicas a través de su participación en los

procesos de señalización intracelular. Como

consecuencia de un estrés mecánico exagerado o de

un contexto inflamatorio, como ocurre en OA y AR, se

producen niveles elevados que van en detrimento de

la homeostasis de la articulación (Revisado por

Afonso y cols, 2007). Los principales radicales

producidos en la articulación son el NO (NO·) y el

anión superóxido (O2.-), que generan a su vez otras

especies reactivas como peroxinitrito (ONOO-) y

peróxido de hidrógeno (H202), (Figura 6). Por su parte,

Figura 6: Esquema de la formación de ROS y RNS

Reacción de Fenton Catalasa

ONOO-

NO·

NADPH

SOD

O2

O2·-

H2O2

H2O O2 OH-


54

el NO se sintetiza por la enzima óxido nítrico sintasa (NOS), que posee 2 isoformas

constitutivas, NOS-1/nNOS localizada a nivel neuronal y NOS-3/eNOS a nivel endotelial

y NOS-2/iNOS, isoforma inducible en condiciones inflamatorias, de estrés, etc. En

líneas generales, la implicación, tanto de ROS como de RNS en la degeneración del

cartílago se debe a numerosos mecanismos, que incluyen la inhibición de la síntesis de

macromoléculas de la matriz extracelular, la migración celular y el aumento de la

actividad MMP, además de mediar en la expresión de citocinas pro-inflamatorias e

inducir procesos apoptóticos (Revisado por Henrotin y cols, 2003), (Revisado por

Abramson, 2008), lo que ha motivado el ensayo/utilización de terapias antioxidantes

en el tratamiento de las enfermedades articulares, aunque a día de hoy aún no están

claras las consecuencias de estos tratamientos. En esta línea, en un trabajo reciente se

demostró que el tratamiento con el compuesto anti oxidante N-acetilcisteína

disminuye numerosos efectos dependientes del estrés oxidativo, como la síntesis de

PGE2, COX-2 y MMP-13 en sinoviocitos OA, aunque es incapaz de mimetizar estos

efectos en condrocitos (Román-Blas y cols, 2009).

2.1.5.6) Otros mediadores implicados en la OA: Durante la OA se produce

una sobre-expresión de distintos factores de crecimiento, tanto del cartílago como del

hueso, que participan activamente en la homeostasis de los mismos y que,

teóricamente, deberían contrarrestar el daño producido, aunque en ocasiones resulten

insuficientes. Los factores de crecimiento más conocidos son el TGF-β, las BMPs y las

proteínas de la familia del factor de crecimiento semejante a la insulina (IGF). Otro

factor de crecimiento, en este caso, del endotelio vascular, también parece estar

asociado con la OA. Se trata de VEGF, cuya expresión se ve incrementada durante la

OA, y que parece contribuir a la patogénesis de la OA a través de distintos mecanismos

(Murata y cols, 2008). Por otra parte se ha descrito la presencia de varios

neuropéptidos en la membrana sinovial OA, que podrían contribuir indirectamente a la

aparición de hiperalgesia o dolor asociado a la sinovitis OA, como la sustancia P,

relacionada con la expresión de PGEs y varias colagenasas. También se ha propuesto la

participación de la bradicinina, péptido con actividad vasodilatadora e inflamatoria.

Tanto uno como otro representan interesantes dianas sobre la que poder actuar a

nivel terapéutico. De hecho, la administración intraarticular del antagonista del


55

receptor de la bradikinina produce un efecto analgésico de larga duración en pacientes

con OA de rodilla (Revisado por Sellam y Berenbaum, 2010).

Figura 7: Esquema de los mediadores implicados en la progresión de la OA

citocinas PGE2 NO quimiocinas

MMPs BMPs

CCAARRTTÍÍLLAAGGOO CCAALLCCIIFFIICCAADDOO

(↑ zona tidemark)

FFOORRMMAACCIIÓÓNN DDEE OOSSTTEEOOFFIITTOOSS

HHUUEESSOO SSUUBBCCOONNDDRRAALL Microfracturas

Angiogénesis

(imagen adaptada de Goldring & Goldring, 2007)

MMEEMMBBRRAANNAA SSIINNOOVVIIAALL

CCAARRTTÍÍLLAAGGOO

CCAARRTTÍÍLLAAGGOO CCAALLCCIIFFIICCAADDOO

Estrés mecánico repetitivo

Señales inducidas por estrés

Condrocitos quiescentes

PPRROOGGRREESSIIÓÓNN DDEE LLAA EENNFFEERRMMEEDDAADD

ROS

Productos de degradación del cartílago

ADAMTS TGF-β

Hipertrofia condrocitos

Inflamación sinovial

EESSTTAADDÍÍOOSS IINNIICCIIAALLEESS

EESSTTAADDIIOOSS FFIINNAALLEESS


56

2.1.6) Vías de señalización implicadas en la patogénesis de la OA

Tanto en las células de la membrana sinovial como en los condrocitos del cartílago

OA se produce la activación de un buen número de vías de señalización que regulan los

procesos inflamatorios y degenerativos ejercidos por los mediadores anteriores, y que

representan por tanto interesantes dianas terapéuticas sobre las que actuar a nivel

terapéutico.

2.1.6.1) MAPK: Las proteín-cinasas activadas por mitógenos (MAPK) son una

familia de proteínas altamente conservadas, capaces de controlar distintas funciones

celulares como metabolismo, proliferación, apoptosis, diferenciación celular, etc., en

respuesta a una gran variedad de estímulos. Se conocen 3 grandes familias de MAPK:

la cinasa regulada por señales extracelulares ERK, que posee 2 isoformas ERK 1 y ERK 2,

la cinasa N-terminal de c-Jun o JNK, también conocida como proteín-cinasa activada

por estrés SAPK, que posee 3 isoformas JNK (o SAPK) -1, -2 y -3, y la cinasa p38, con 4

isoformas (α,β,γ,δ). La unión de distintos estímulos (citocinas, factores de crecimiento,

proteínas de matriz), a sus correspondientes receptores (de tirosín cinasas, receptores

acoplados a proteínas G, receptores de citocinas etc.), promueve la fosforilación de las

cinasas de cinasas de las MAPK (MAPKKK o MAP3K), que también pueden ser activadas

en condiciones de estrés o en presencia de

radiaciones UV. Estas MAPKKK activan a su vez las

cinasas de las MAPK (MAPKK, MAPK2 o MKK), de las

que se conocen varias isoformas, cada una de las

cuales actúa sobre una MAPK en concreto. Tras la

fosforilación de residuos específicos de las MAPKK se

produce la activación de las MAPK, que a su vez,

activan otras protein-cinasas y otras proteínas

reguladoras de distintos procesos transcripcionales,

como c-Jun, p53 etc. Cada MAPK posee efectos

propios y otros que se solapan con las otras. De este

modo, ERK ejerce un efecto predominante sobre la

Figura 8: Esquema de la activación de MAPK

Citocinas, factores de crecimiento

MAPKKK

MAPKK

MAPK

Factores de transcripción


57

regulación mitótica y el crecimiento celular, mientras que p38 y JNK actúan en

respuesta a señales de estrés tipo inflamación, calor, efectos genotóxicos, etc.

(Revisado por Johnson y Lapadat, 2002).

La implicación de las MAPK en el desarrollo de la OA se ha documentado

ampliamente. Existen evidencias de la expresión (y también de la activación, aunque a

niveles menores que en la AR) de los 3 tipos de MAPK a nivel de cartílago y de la

membrana sinovial OA, aunque el papel de éstas en el sinovio es mucho menos

conocido que en el cartílago (Revisado por Beier y Loeser, 2010), (Revisado por Bartok

y Firestein, 2010). En el cartílago OA, la activación de las MAPK se ha relacionado

mayoritariamente con un aumento en la expresión de MMPs y agrecanasas. De hecho,

la activación de las MAPK es necesaria para la inducción de la síntesis de MMPs por

parte de fragmentos derivados de la degradación del cartílago (Xu y cols, 2007) y por

parte de citocinas como TNF-α+oncostatina M (Sondergaard y cols, 2010). Estos

últimos autores comprobaron, mediante el empleo de inhibidores específicos, que

tanto p38 como ERK son esenciales para la expresión y actividad de las MMPs mientras

que únicamente ERK es necesaria para la degradación mediada por agrecanasas. La

fosforilación de p38 regula la producción de IL-6 e IL-8 en sinoviocitos AR estimulados

con IL-1β o TNF-α (Suzuki y cols, 2000), a la vez que resulta necesaria para la síntesis de

MMP-1 en sinoviocitos OA estimulados con adiponectina (Ehling y cols, 2006). A su

vez, la activación de p38 participa en otros procesos que conducen a la sinovitis, ya

que es capaz de inducir la enzima NOS-2, activar neutrófilos y participar en el control

del ciclo celular y de la apoptosis (Revisado por Schett y cols, 2008). De hecho, la

administración de un inhibidor específico de p38 disminuye la inflamación del sinovio y

la pérdida ósea en un modelo animal de AR (Zwerina y cols, 2006). Por su parte, la

activación de ERK y NF-ĸB por citocinas regula la expresión de algunas MMPs (MMP-1,

-3 y -9, pero no MMP-13) en FLS de AR (Pillinger y cols, 2003). El papel de JNK en las

enfermedades artríticas es menos conocido porque hasta hace poco no se disponía de

inhibidores específicos de esta MAPK. Mediante la utilización de estos inhibidores y en

células procedentes de ratones knock out en JNK, se observó que la producción de

MMP-1 por parte de citocinas depende, en mayor medida de JNK (Han y cols, 2001).


58

El empleo de inhibidores de MAPK en modelos animales de distintas enfermedades

ha demostrado poseer efectos beneficiosos. De hecho, son muchos los inhibidores que

se están testando en ensayos clínicos actualmente, aunque en líneas generales estos

compuestos presentan bastantes efectos adversos, ya que estas vías, no sólo están

implicadas en la promoción de procesos inflamatorios y degenerativos, sino que

regulan a su vez otros procesos que contribuyen al mantenimiento de la homeostasis.

Lo ideal sería utilizar inhibidores de MAPK que fueran capaces de actuar únicamente a

nivel de la sobre-activación de estas vías en la inflamación, o desarrollar inhibidores

que no compitieran con el sitio de unión del ATP, ya que los inhibidores actuales

interfieren con el ATP, lo que les confiere parte de la toxicidad que poseen (Revisado

por Thalhamer y cols, 2008).

2.1.6.2) PI3-K/Akt: La vía fosfatidilinositol 3 cinasa-Akt controla distintas

funciones celulares que incluyen proliferación, diferenciación, supervivencia y

migración, siendo activada por fosforilación por factores de crecimiento, mediadores

pro-inflamatorios, hormonas, neurotransmisores, inmunoglobulinas y antígenos

(Revisado por Marone y cols, 2008). Una estimulación desmesurada puede conducir a

un descontrol en la proliferación y migración celular, y está relacionada con distintas

patologías como el cáncer y algunos trastornos inflamatorios crónicos, como la AR. La

activación de esta vía induce a su vez otras vías de señalización, como las MAPK,

también activadas por citocinas pro-inflamatorias. La

vía PI3-K de clase 1, en particular las isoformas γ y δ,

está implicada en la patogénesis de distintas

enfermedades inflamatorias articulares tal y como lo

demuestra el hecho de que ratones knock out en

PI3-Kγ estén protegidos frente a la AR, ya que

presentan defectos en la migración neutrofílica.

Además, el tratamiento con un inhibidor específico

de PI3-Kγ suprime la progresión de la inflamación y

degeneración articular en dos modelos de AR

(Camps y cols, 2005). Poco se sabe acerca de la

implicación de la vía PI3-K-Akt a nivel del

Figura 9: Esquema de la activación de la vía PI3-K/Akt

Citocinas, factores de crecimiento

Receptor tirosin cinasa

PI3-K

Akt



59

metabolismo del cartílago OA. Recientemente se ha visto que varias citocinas de la

familia de IL-6, entre ellas la oncostatina M, sola o en combinación con IL-1β, median

distintos procesos catabólicos del cartílago, como la inducción de MMP-1 y MMP-13 a

través de la activación de Akt, efectos que desaparecen cuando los condrocitos se

incuban con un inhibidor específico de Akt (Litherland y cols, 2008). En FLS de AR se ha

visto que Akt media los procesos apoptóticos inducidos por TNF-α (Zhang y cols, 2001)

y TGF-β (Kim y cols, 2002a), así como la inducción de IL-6 e IL-8 por parte de IL-17

(Hwang y cols, 2004), y la de IL-6, MMP-1, MMP-3 y CCL2, por parte de la estimulación

concomitante del factor de crecimiento derivado de plaquetas PDGF y de TGF-β

(Rosengren y cols, 2010).

A día de hoy, se desconocen los efectos de los inhibidores de la vía PI3-K en la OA a

nivel clínico, aunque algunas de estas moléculas se están testando en otras patologías

como el cáncer o algunas enfermedades coronarias, obteniendo niveles aceptables de

toxicidad, aún cuando, como hemos visto previamente, esta vía interacciona con

múltiples vías de señalización (Revisado por Marone y cols, 2008).

2.1.6.3) NF-ĸB: Los miembros de la familia del factor de transcripción nuclear ĸB

dirigen una amplia gama de respuestas inflamatorias y de supervivencia, proliferación

y diferenciación celular. La activación inapropiada de esta vía se ha relacionado con

numerosos procesos patológicos, entre los que se encuentra la OA (Revisado por

Marcu y cols, 2010). El NF-ĸB comprende una familia de 5 proteínas: RelA (p65), RelB,

c-Rel, p50/p105 (NF-ĸB1) y p52/p100 (NF-ĸB2), que forman una serie de

homo/heterodímeros, de los cuales la pareja formada por p65 y p50 es la más

prevalente y activa la que se conoce como la “vía canónica” del NF-ĸB. En condiciones

normales el heterodímero p65/p50 reside en el citoplasma formando complejos con la

familia de proteínas inhibidoras de ĸB (IĸB). Distintas citocinas, quimiocinas y radicales

libres inducen la activación de esta vía a través de la fosforilación, ubiquitinación y

posterior degradación de IĸB, efectos mediados por el complejo de cinasas de IĸB

(IKK). De este modo, la liberación de p65/p50 de sus proteínas inhibidoras facilita su

migración al núcleo, donde se une a las regiones promotoras de sus genes diana e

inicia el proceso de transcripción de dichos genes (Figura 10).


60

Figura 10: Esquema de la activación de NF-ĸB

Centrándonos en la articulación OA, las citocinas pro-inflamatorias IL-1β y TNF-α

activan potentemente esta vía, activación que resulta aún mayor con el estímulo

concomitante de ambas, lo que promueve la expresión de genes relacionados tanto

con el proceso inflamatorio como con el degenerativo de la OA (MMP-1, MMP-3,

MMP-13, COX-2, NOS-2, IL-β, TNF-α, IL-6, IL-8, CCL2, etc) (Revisado por Román-Blas y

Jiménez 2006) y (Revisado por Marcu y cols, 2010). Además, NF-ĸB no sólo participa en

la activación del condrocito por citocinas pro-inflamatorias, sino también frente a la

presencia de productos de degradación del cartílago, como fragmentos de fibronectina

(Pulai y cols, 2005) y ante una situación de estrés mecánico exagerado, promoviendo la

síntesis de los mediadores anteriores. Aunque normalmente esta vía ejerce efectos

proliferativos y anti-apoptóticos, por aumento en la expresión de genes

antiapoptóticos y proliferativos como FLIP, Bcl-2 o distintas ciclinas (Revisado por

Román-Blas y Jiménez, 2006), también se ha visto la capacidad de la misma de

promover procesos apoptóticos, ya que NF-ĸB participa en la apoptosis de condrocitos

inducida por NO, proceso en el que también interviene la cinasa p38 (Kim y cols,

2002b).

(1) Citocinas, quimiocinas, radicales libres

(NF-ĸB latente) (3) Fosforilación y ubiquitinación de IĸB

(2) Activación del complejo IKK

(4) Degradación de IĸB

(5) Translocación nuclear de p65/p50

(6) Transcripción de genes NF-ĸB dependientes

IĸB

IĸB

IĸB

p65 p65 p65

p65

p50 p50 p50

p50

Ub Ub Ub Ub

Ub Ub Ub Ub

IKK

P P

P

P

P P P

P


61

Las células de la membrana sinovial OA, aunque en cantidades menores que la

artrítica, expresan también las distintas subunidades de NF-ĸB (Handel y cols, 1995). En

FLS obtenidos de tejido sinovial de pacientes con AR, la transfección adenoviral de

IĸBα, una de las subunidades del complejo represor IĸB, ejerce un potente efecto

inhibidor de la respuesta inflamatoria inducida por IL-1β (Lee y cols, 2009), mientras

que un estudio similar en FLS de pacientes OA demostró que la producción de las

citocinas IL-6, IL-8, CCL2, TNF-α, GM-CSF, oncostatina M y de las MMPs -1, -3, -9 y -13

es NF-ĸB dependiente, mientras que las anti-inflamatorias IL-10 e IL-1Ra son NF-ĸB

independientes (Amos y cols, 2006).

La inhibición de la activación de NF-ĸB a través de distintos mecanismos (por

inhibición en la fosforilación de IĸBα, por bloqueo de la unión de NF-ĸB al ADN, etc.)

supone una interesante estrategia para controlar la progresión de las enfermedades

articulares. Algunos fármacos como los anti-inflamatorios no esteroideos (AINEs), los

glucocorticoides o algunos fármacos modificadores de la enfermedad aprobados para

el tratamiento de la OA, han demostrado ser efectivos en la disminución de la

activación de NF-ĸB (Revisado por Román-Blas y Jiménez, 2006), aunque la importancia

de esta vía a nivel sistémico imposibilita el uso de estrategias encaminadas a bloquear

“indiscriminadamente” su activación. Por este motivo, la investigación en la actualidad

se centra en el desarrollo de mecanismos destinados a contrarrestar “selectivamente”

la activación de NF-ĸB en el tejido afectado, como por ejemplo, mediante estrategias

de terapia génica basadas en el uso de silenciadores de p65 o en la administración

directa de inhibidores de IKK en el cartílago OA (Revisado por Marcu y cols, 2010).

2.1.6.4) Otras vías de señalización: AP-1, TLRs, Wnt-β-catenina. Distintos

estudios han relacionado la proteína activadora-1 (AP-1), compuesta por miembros de

las famílias de proteínas fos y jun, con la patogénesis de las enfermedades articulares.

En la membrana sinovial OA se detecta activación de AP-1, aunque en menor medida

que en la AR (Asahara y cols, 1997), mientras que su sobre-expresión en FLS de AR se

relaciona con la severidad de la patología por su participación en la regulación de la

proliferación celular y de la síntesis de MMPs, entre otros efectos (Revisado por Mor y

cols, 2005). Además, algunos fármacos utilizados en el tratamiento de la OA, como los


62

glucocorticoides y la diacereína, ejercen sus efectos, al menos en parte, por la

inhibición de AP-1 (Adcock y cols, 1994), (Domagala y cols, 2006).

Por otra parte, se ha comprobado que en la articulación OA se sobre-expresan

receptores tipo toll (TLR) (Radstake y cols, 2004), componentes clave del sistema

inmunitario, cuyas principales características veremos en el capítulo 2.3. Aunque la

participación de éstos en la OA de momento no está del todo clara, el hecho de que se

encuentren sobre-expresados sugiere que puedan ejercer algún papel. De hecho, se ha

comprobado que algunos productos de degradación del cartílago como la fibronectina

son ligando de estos receptores (Su y cols, 2005). Además, la vía de los TLRs se solapa

con otras vías de señalización implicadas en la OA, ya que la consecuencia final de la

activación de estos receptores es el aumento en la actividad transcripcional de NF-ĸB y

también de AP-1, lo que apoyaría su potencial implicación en la fisiopatología de la OA

(Revisado por Scanzello y cols, 2008).

El estudio de la vía de señalización Wnt/β-catenina ha suscitado un interés

creciente en los últimos años. Esta vía está implicada en el desarrollo embrionario de

hueso y cartílago, y también en la fisiopatología de la OA: distintos componentes de

esta vía se sobre-expresan en el cartílago y el sinovio artrósico (Blom y cols, 2009), y

existen evidencias de que la activación de esta vía conduce a un incremento en los

proceso de remodelado y degeneración del cartílago propios de la OA (Revisado por

Corr, 2008).

2.1.7) Nuevas dianas moleculares en el tratamiento de la OA

Las estrategias terapéuticas disponibles en la actualidad para el tratamiento de la

OA (paracetamol, AINEs, derivados opiáceos) están dirigidas a aliviar la sintomatología,

sobre todo a nivel del dolor y de la inflamación. Pocos o ninguno de los fármacos

comercializados son capaces de actuar a nivel de la destrucción articular. En nuestro

país, los únicos fármacos comercializados que ejercen efectos a este nivel son la

glucosamina, el condroitín sulfato y la diacereína, aunque la eficacia de éstos en los

ensayos clínicos resulta más bien moderada. Este hecho ha motivado el estudio en


63

profundidad de los mecanismos genéticos y moleculares implicados en la fisiopatología

de la enfermedad para con ello, intentar establecer dianas sobre las que poder actuar.

Teniendo en cuenta los distintos mediadores implicados en la patogénesis de la OA

(ver apartado 2.1.5), es fácil entender que numerosos estudios se hayan centrado en el

desarrollo de inhibidores de MMPs, de agrecanasas, en terapias anti-citocinas y en

terapias dirigidas a contrarrestar el exceso en los procesos de estrés oxidativo,

mediadores que podríamos considerar como “clásicos” de la OA, aunque de momento

no se hayan obtenido resultados concluyentes en la práctica clínica. A todas estas

estrategias habría que añadir además el estudio de nuevas dianas postuladas

recientemente, como el desarrollo de terapias dirigidas a contrarrestar las vías de

señalización implicadas en el proceso OA, como las MAPK, NF-ĸB, Wnt/β-catenina, etc,

así como terapias para neutralizar distintas moléculas como el sindecano, un

proteoglicano que controla la activación ADAMTS y MMPs; el receptor del dominio de

discoidina-2 (DDR2), que media la síntesis de citocinas y MMPs en condrocitos

primarios y el receptor activado por la proteinasa 2 (PAR-2), que induce la síntesis de

las MMPs 1 y 13, y de COX-2 (Revisado por Alcaraz y cols, 2010). Otra nueva estrategia

que ha demostrado poseer efectos protectores in vitro a nivel del cartílago OA es la

activación de la vía de la HO-1, objeto de estudio de la presente Tesis Doctoral.


64

2.2) La hemo oxigenasa-1

2.2.1) Generalidades de la hemo oxigenasa-1

La hemo oxigenasa (HO) es la enzima que

cataliza la degradación oxidativa del grupo

hemo, con liberación de hierro y formación

de monóxido de carbono (CO) y biliverdina

(BV), que se reduce rápidamente a bilirrubina

(BR) por acción de la enzima biliverdina

reductasa (Tenhunen y cols, 1968). Se

conocen 2 isoformas de la hemo oxigenasa:

La primera en ser descrita fue la HO-1

(conocida también como HSP-32), proteína

microsomal de 32 kDa, de carácter inducible,

que se localiza principalmente en

tejidos/órganos relacionados directamente

con el metabolismo de la hemoglobina y/o de los eritrocitos, tales como hígado, bazo y

médula ósea. Por el contrario, la HO-2, de aproximadamente 34 kDa de peso

molecular, es de carácter constitutivo y se ha descrito su presencia en hígado, bazo,

cerebro y testículos.

Distintos estímulos son capaces de inducir la expresión de HO-1 en una gran

variedad de tipos celulares (células endoteliales, de músculo liso, basófilos,

monocitos/macrófagos, neutrófilos y fibroblastos), en las que los niveles basales de

esta proteína son prácticamente indetectables. Entre los principales estímulos

desencadenantes de la inducción de HO-1 cabe destacar el estrés oxidativo y

nitrosativo (ROS y RNS), las condiciones de hipoxia e hiperoxia, determinadas

sustancias tiol-reactivas, sales de metales pesados, hormonas, factores de crecimiento,

endotoxinas, citocinas y otros mediadores producidos durante la respuesta

inflamatoria (Revisado por Ryter y cols, 2006). La inducción de HO-1 está mediada por

Figura 11: La vía de la HO-1 Imagen adaptada de Gozzelino y cols, 2010

Hemo

Fe2+ BV

BR

Biliverdin reductasa

Ferritina

CO

HHOO--11

(imagen adaptada de Gozzelino y cols, 2010)


65

distintos factores, como el factor relacionado con el factor nuclear eritroide 2p45

(Nrf2), la proteína AP-1 o el factor NF-ĸB, así como las vías de señalización MAPK, PI3-

K/Akt y las protein cinasas A, C y G (Revisado por Ryter y cols, 2006), (Revisado por

Alam y Cook, 2007).

Dado que la mayor parte de los estímulos mencionados anteriormente están

relacionados con estados pro-oxidantes e inflamatorios, la inducción de HO-1 ha sido

considerada tradicionalmente como una respuesta adaptativa de las células para

protegerse frente a estos procesos, atribuyéndole por tanto un papel protector frente

a estas situaciones.

2.2.2) Principales efectos de los componentes de la vía de HO-1

Las propiedades protectoras que se le atribuyen a la HO-1 están mediadas por los

productos derivados de la reacción de degradación del grupo hemo

(biliverdina/bilirrubina o CO), además de por la reducción en la disponibilidad del

grupo hemo. Por esta razón, en este apartado resumimos brevemente los principales

efectos ejercidos por los distintos componentes de esta vía.

Grupo Hemo: El grupo hemo es una molécula de carácter altamente pro-

oxidante, liberado principalmente de la hemoglobina en condiciones de hemorragia,

hemólisis o daño celular y que conduce a un aumento en la generación de ROS y a la

oxidación de componentes celulares, dando lugar a la muerte celular. Se han descrito

efectos pro-inflamatorios del grupo hemo, en tanto que es capaz de aumentar el flujo

del leucocitos hacia el foco inflamatorio en un modelo in vivo, además de inducir la

expresión de distintas moléculas de adhesión, tales como E-selectina, la molécula de

adhesión intercelular-1 (ICAM-1) y la molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-

1) en células endoteliales (Revisado por Wagener y cols, 2001). Sin embargo, la

actividad y la sobre-expresión de HO-1 resultan protectoras frente a la toxicidad

producida por esta molécula en numerosos tipos celulares y situaciones patológicas:

por ejemplo, la inducción de HO-1 en un contexto pro-inflamatorio puede tener como

consecuencia una reducción en la síntesis de hemoproteínas, tales como COX-2 o NOS-


66

2, con la consiguiente reducción en la producción de PGE2 y NO, por la disminución en

la biodisponibilidad del grupo hemo, pudiendo controlar así el proceso inflamatorio

(Vicente y cols, 2003).

Hierro (Fe2+): La actividad protectora y antioxidante que se le atribuye a la HO-

1 no puede asociarse únicamente a la degradación del grupo hemo, ya que el Fe2+

liberado durante su degradación es potencialmente tóxico, por encontrarse disponible

para procesos celulares dependientes del mismo, como la producción de ROS. Sin

embargo, el Fe2+ plasmático se encuentra acoplado a distintas moléculas, como la

ferritina, capaces de disminuir los niveles circulantes del mismo. Varios estudios han

demostrado la asociación entre la inducción de HO-1 y el aumento en la síntesis de

ferritina, molécula a la que se le atribuyen efectos citoprotectores frente al estrés

oxidativo inducido por hierro, por radiación UVA y por proteínas LDL oxidadas

(Revisado por Abraham y Kappas, 2008).

Biliverdina/Bilirrubina: A pesar de que concentraciones elevadas de BR

pueden resultar tóxicas en el recién nacido, numerosos estudios han demostrado

efectos antioxidantes de ésta a bajas concentraciones, frente a la citotoxicidad

inducida por H2O2 y frente a la generación de ROS en miocardiocitos, células

endoteliales y de músculo liso (Clark y cols, 2000), siendo capaz de inhibir además la

expresión de la enzima NADPH oxidasa, implicada en el daño vascular inducido por

angiotensina II (Datla y cols, 2007). También se han demostrado efectos anti-

inflamatorios en el transplante alogénico y anti-proliferativos en células de músculo

liso (Wang y cols, 2006), (Ollinger y cols, 2005).

Monóxido de carbono: Tradicionalmente este gas ha sido considerado un

contaminante altamente tóxico por su elevada afinidad con la hemoglobina. Sin

embargo, son muchos los estudios que demuestran la participación del mismo en

distintos procesos de señalización intracelular que culminan en acciones

antiproliferativas, antiapoptóticas y anti-inflamatorias (Revisado por Ryter y cols,

2006). En esta línea, la administración exógena de moléculas liberadoras de CO (CO-

RMs, del inglés CO-releasing molecules), desarrolladas por el grupo del Dr. Motterlini,

ha conseguido mimetizar estos efectos en numerosos modelos de enfermedad. En

estudios recientes de nuestro laboratorio se comprobó que las moléculas CORM-2 y


67

CORM-3, insoluble y soluble en agua respectivamente, ejercieron efectos anti-

inflamatorios en sendos modelo de enfermedad inflamatoria intestinal, de artritis

reumatoide y de osteoartritis (Megías y cols, 2007), (Ferrándiz y cols, 2008), (Guillén y

cols, 2008b), (Megías y cols, 2008). Además, estas moléculas han demostrado inducir

la expresión de HO-1 en algunos tipos celulares, como en la línea de macrófagos

peritoneales de ratón RAW 264.7 (Sawle y cols, 2005).

2.2.3) Moléculas inductoras de HO-1

El interés por la vía de la HO-1 ha motivado la aparición de distintas estrategias

encaminadas a conseguir la inducción/sobre-expresión de esta vía, a través de

distintos mecanismos. Numerosas moléculas, tanto de carácter exógeno (curcumina,

resveratrol, flavonoides, etc.), como endógeno (15-Deoxi-Δ12,14-PGJ2, lipoxina A4,

adrenomedulina, péptido natriurético, etc.), han demostrado su capacidad de inducir

la expresión de HO-1 a través de las vías de señalización comentadas en el capítulo 2.1,

siendo utilizadas por estos efectos en numerosos modelos de enfermedad (Revisado

por Ferrándiz y Devesa, 2008). De entre estas moléculas, destacamos las porfirinas, en

concreto, cobalto protoporfirina IX (CoPP), ampliamente utilizada durante el desarrollo

de esta Tesis, ya que induce potentemente la expresión de HO-1.

Otra interesante estrategia para conseguir una sobre-expresión directa de HO-1 a

nivel experimental consiste en la transfección, mediante vectores de distintos tipos,

del gen de la HO-1 (Abraham y cols, 2007). De este modo, desaparecen los efectos

intrínsecos de cualquier compuesto que no estuvieran relacionados con la HO-1, y que

nos pudieran conducir a errores en la interpretación de resultados. En la presente

Tesis, y tal y como se detallará en la sección de Material y Métodos, hemos trasfectado

el gen de HO-1 utilizando vectores de tipo lentiviral obtenidos en células HEK 293T.

Además, ciertos fármacos disponibles en el mercado son capaces de modular la

expresión y/o actividad HO-1, pudiendo controlar por tanto el desarrollo de procesos

patológicos relacionados con el estrés oxidativo y la inflamación. Tal es el caso del

ácido acetil salicílico (AAS), el ácido 5-aminosalicílico (5-ASA), el losartán, algunas


68

estatinas, fármacos inmunosupresores, anticancerosos y algunos fármacos

antiartríticos como veremos a continuación (Revisado por Abraham y Kappas, 2008).

Figura 12: Consecuencias de la inducción de HO-1

2.2.4) Papel de la HO-1 en enfermedades articulares

Son muchos los estudios que han atribuido propiedades protectoras a la vía de la

HO-1 en distintas patologías, que van desde la hipertensión al daño hepático, pasando

por el cáncer e incluso la enfermedad de Alzheimer (Revisado por Abraham y Kappas,

2008). Una de las líneas de investigación de nuestro grupo se centra en el estudio de

los mecanismos moleculares implicados en el desarrollo de enfermedades articulares,

tales como la AR y la OA. Así pues, en este apartado, revisaremos los datos disponibles

acerca de los efectos de la HO-1 y estas enfermedades.

Artritis reumatoide: La HO-1 se induce durante el desarrollo de la artritis

inducida por adyuvante en rata (AIA), resultando activa en la inducción de VEFG, factor

de crecimiento con clara actividad pro-angiogénica. Tanto en este modelo (AIA), como

en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA), la administración de estaño

protoporfirina (SnPP), molécula inhibidora de HO-1, disminuye los signos clínicos de

ROS RNS Citocinas Hipoxia Hiperoxia Endotoxinas CoPP CORMs Cumarinas Flavonoides Chalconas AAS 5-ASA Estatinas etc..

HO-1

Biliverdina

CO

Hemo

Fe2+

+

+

Anti-inflamatorio Antiproliferativo Antiapoptótico

Anti-inflamatoria Antiproliferativa Antioxidante

Bilirrubina

Ferritina: Anti oxidante

PROTECCIÓN

TISULAR


69

esta enfermedad, así como la destrucción del cartílago (por reducción en la expresión

de NOS-2, TNF-α, VEGF, etc.), mientras que el tratamiento con CoPP, aún demostrando

una ligera mejoría inicial, resulta incapaz de detener el desarrollo de la misma (Devesa

y cols, 2005a y 2005b). En vista de estos datos cabría pensar que la HO-1 podría

contribuir activamente al desarrollo del proceso artrítico. Sin embargo, en este

contexto conviene añadir que los inhibidores de HO-1, como las metaloporfirinas en

este caso, resultan muy inespecíficos, ya que son capaces de actuar a través de

distintos mecanismos independientes de la HO-1, por lo que habría que profundizar en

el mecanismo de acción implicado en los efectos observados a estas moléculas

(Grundemar y Ny, 1997).

Por otra parte, Kobayashi y cols comprobaron que la inducción de HO-1 por hemina

o la transfección de cDNA de HO-1 a sinoviocitos artríticos humanos reduce

significativamente la producción de las citocinas pro-inflamatorias IL-6 e IL-8

(Kobayashi y cols, 2006). En esta línea, en el modelo K/BxN de transferencia de suero,

la inducción farmacológica de HO-1 por CoPP atenúa la destrucción articular así como

la producción de mediadores inflamatorios y degenerativos (IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2 y

la actividad MMP-9), efectos que no se observan en los animales que reciben un

silenciador específico de HO-1, indicando por tanto que los efectos de CoPP son

debidos a la inducción de HO-1. Quizás, la conclusión puede ser que la sobreexpresión

de HO-1 puede resultar útil durante la fase aguda del proceso artrítico, mientras que

durante la cronicidad de ésta puede que no sea beneficioso, en tanto que aumenta,

por ejemplo, la producción de VEGF, relacionado con la progresión de la enfermedad

(Benallaoua y cols, 2007).

En estudios realizados por nuestro grupo de investigación comprobamos los efectos

antiartríticos de la molécula liberadora de CO, CORM-3, inicialmente en el modelo de

CIA y posteriormente en el de K/BxN, efectos mediados por la liberación de CO por

parte de esta molécula, así como por la inducción de HO-1, sugiriendo por tanto, el

papel protector o beneficioso de esta vía en esta enfermedad (Ferrándiz y cols, 2008),

(Maicas y cols, 2010). Por otra parte, se ha comprobado que la presencia de un

polimorfismo en el promotor de la HO-1 puede conferir una mayor susceptibilidad a la

AR, lo que apoya el desarrollo de terapias dirigidas a inducir HO-1 en esta patología


70

(Rueda y cols, 2007). Además, fármacos antiartríticos ampliamente utilizados en la

práctica diaria como la sal de oro auranofina, ejercen sus efectos, al menos en parte, a

través de la inducción de HO-1 (Kobayashi y cols, 2006). También el cilostazol, agente

anti-inflamatorio inhibidor de fosfodiesterasas, y la taurina en forma cloramina,

confieren protección articular a través de la inducción de HO-1 dependiente de Nrf2

(Park y cols, 2010), (Muz y cols, 2008).

Osteoartritis: La mayor parte de los datos de los que se dispone acerca del

papel de la HO-1 en la OA, pertenecientes a estudios realizados por nuestro grupo de

investigación, se centran exclusivamente a nivel del cartílago articular, para lo que se

han utilizado cultivos primarios de condrocitos y explantes de cartílago humano.

Fernández y cols comprobaron inicialmente la expresión de esta enzima en

condiciones basales o de ausencia de estímulos, demostrando además que esta

expresión es susceptible de ser modulada por distintas citocinas implicadas en el

desarrollo de esta enfermedad: las citocinas pro-inflamatorias IL-1β, TNF-α e IL-17

disminuyen la expresión basal de HO-1, a la vez que aumentan la expresión de enzimas

inducibles como COX-2 o NOS-2, así como de sus metabolitos PGE2 y nitrito, mientras

que la citocina anti-inflamatoria IL-10 aumenta la expresión de HO-1 sin modificar los

niveles basales de COX-2 y nitritos (Fernández y cols, 2003). Estos datos abrieron la

posibilidad de que la HO-1 pudiera ejercer efectos protectores en esta patología, lo

que motivó el estudio en profundidad de esta vía, utilizando para ello CoPP, como

inductor de HO-1 y CORM-2, para mimetizar los efectos del CO, metabolito de la

reacción. En ambos casos se observaron efectos protectores a través de distintas vías:

aumento en la síntesis y reducción en la degradación de distintos componentes de la

matriz extracelular del cartílago, disminución en la expresión de enzimas inducibles

responsables de la síntesis de mediadores pro-inflamatorios y disminución en la

actividad y en la expresión de enzimas degenerativas de matriz, como MMPs,

agrecanasas, etc., procesos que parecen depender de la reducción en la activación de

enzimas MAPK así como de distintos factores de transcripción [NF-ĸB, AP-1, factor

inducible por hipoxia-1α (HIF-1α), proteína de respuesta de crecimiento temprano-1

(EGR-1)] (Megías y cols, 2008 y 2009), (Guillén y cols, 2008a y 2008b), (ver esquema

resumen Figura 13).


71

En cambio, se dispone de pocos datos acerca del papel de la HO-1 a nivel de la

sinovitis OA. Sabemos que la HO-1 se expresa en la membrana sinovial OA, sobre todo

en células CD68 positivas pero también en fibroblastos, aunque a niveles menores que

los observados en el tejido artrítico (Kobayashi y cols, 2006), (Muz y cols, 2008). Sin

embargo, poco o nada se sabe acerca de los efectos de la inducción o el silenciamiento

de esta proteína en sinoviocitos OA y la consecuencia que ello pueda tener sobre la

fisiopatología de esta enfermedad.

Figura 13: Esquema de los efectos de la activación de la HO-1 en condrocitos OA

Hh

HO-1

CORM-2

MAPK FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN FACTORES ANABÓLICOS

↓ ERK 1/2 ↓ NF-ĸB ↑ IGF-1

↓ p-38 ↓ EGR-1 ↑ IGFBP-3

↓ MMPs

↓ ERK 1/2 ↓ NF-ĸB ↓P-IĸBα

↓ p38 ↓ HIF-1α

ANABOLISMO

INFLAMACIÓN

APOPTOSIS

CATABOLISMO

Condrocito OA


72

2.3) High mobility group box 1

2.3.1) Generalidades y estructura de High mobility group box 1

Conocida como anfoterina, HMG-1 (High Mobility Group protein 1) o HMGB1 (High

Mobility Group Box 1), fue aislada por primera vez del timo de ternero hace 3 décadas

y recibió éste nombre por su elevada tasa de migración durante procesos de

electroforesis (Goodwin y cols, 1973). Se trata de una proteína altamente conservada

durante el proceso evolutivo, de un tamaño “relativamente pequeño”, 215

aminoácidos, y con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa. La familia de

proteínas HMGB consta de 3 isoformas: HMGB1, HMGB2 y HMGB3, que comparten

una estructura común, ya que constan de dos motivos plegados de unión al ADN,

conocidos como dominios A y B (en inglés, Box A and B), formados por 75 aminoácidos

cada uno, con una carga netamente positiva y organizados como 3 hélices α en forma

de “L”. Además, poseen un tercer dominio de 30 aminoácidos cargados negativamente

en el extremo C-terminal, que es el que marca las diferencias entre las 3 isoformas,

que comparten aproximadamente el 80% de su estructura. En cuanto a su localización,

hay que destacar que HMGB1 se encuentra prácticamente en casi todos los tipos

celulares, siendo además bastante abundante (más de 1 millón de moléculas/célula),

aunque en algunos tipos celulares los niveles resulten muy reducidos (Müller y cols,

2004). Por su parte, HMGB2 y HMGB3 se expresan mayoritariamente en estadios

embrionarios, presentando una expresión mucho menor en adultos, encontrándose en

este caso en células de la médula ósea, tejidos linfoides y testículos (Revisado por

Bianchi y Manfredi, 2007).

Figura 14: Estructura de HMGB1

Dominio A Dominio B

NN

CC 2 79 89 163 186 215

Fragmento antagonista de RAGE Fragmento de unión a RAGE

2 (A) Estructura de HMGB1. (B) Representación en forma de “lazo” de la estructura de HMGB1. Imagen adaptada de Bianchi&Manfredi (2007).

A

B

B

Dominio A

Dominio B


73

2.3.2) Localización nuclear de HMGB1. Efectos y consecuencias

HMGB1 fue descrito originariamente como una proteína nuclear, de naturaleza no-

histona, capaz de participar en múltiples procesos mediante su unión a la hélice menor

del ADN, a través de los dominios A y B. Así, una vez unido al ADN, HMGB1

interacciona con numerosos factores de transcripción, entre ellos, NF-ĸB, con la

consiguiente regulación en la trascripción de múltiples genes. Además, contribuye al

mantenimiento de nucleosomas, y a la modulación de la actividad de los receptores de

hormonas esteroideas (Revisado por Ulloa y Messmer, 2006).

Calogero y cols demostraron en 1999, que, si bien los efectos de HMGB1 sobre la

organización de la cromatina no resultan esenciales, el papel del mismo sobre el

control de procesos transcripcionales resulta esencial para la supervivencia. Ratones

knock-out en HMGB1 (HMGB1-/-), aún cuando nacen con vida, mueren durante las 24

horas posteriores al parto por hipoglucemia debida a la imposibilidad de utilizar las

reservas de glucógeno hepático por ausencia del receptor glucocorticoide. Las

características fenotípicas de estos animales incluyen pequeño tamaño, pelaje

alborotado y desorganizado, extremidades traseras alargadas y ausencia de tejido

graso. En este sentido, líneas celulares carentes del gen de HMGB1 crecen

normalmente, pero con un déficit en la activación de la expresión de numerosos

genes, entre ellos, el receptor glucocorticoide (Calogero y cols, 1999).

2.3.3) Mecanismos de liberación extracelular de HMGB1

El interés por HMGB1 aumentó cuando se describió que era capaz de ejercer otras

funciones, más allá de las descritas a nivel nuclear. En 1999, Wang y cols demostraron

por primera vez que HMGB1 era secretado al medio extracelular en células RAW 264.7

estimuladas con lipopolisacárido bacteriano (LPS), mediando procesos de sepsis.

Posteriormente, el grupo de Bianchi describió la liberación de HMGB1 al medio

extracelular por parte de células necróticas, con el consiguiente incremento en la


74

respuesta inflamatoria (Scaffidi y cols, 2002). Por todo esto se distinguen dos

mecanismos de liberación de HMGB1 al medio extracelular:

El primer mecanismo consiste en una “liberación pasiva” por parte de células

dañadas o en proceso de necrosis por daños físicos o químicos. En estas condiciones,

HMGB1 actúa como señal o marcador de necrosis para el sistema inmunitario,

reconociendo la extensión del tejido dañado e iniciando una respuesta reparativa. Esta

proteína, que no presenta modificaciones en su estructura, promueve el reclutamiento

de células mononucleadas con objeto de eliminar detritus celulares que pueda haber,

protegiendo además frente a una posible infección que pudiera aparecer como

consecuencia del daño o trauma inicial (Revisado por Ulloa y Messmer, 2006). Esta

hipótesis se apoya en el hecho de que fibroblastos murinos procedentes de ratones

HMGB1-/- son incapaces de inducir respuestas inflamatorias en condiciones en las que

fibroblastos wild-type sí que lo hacen.

Aunque inicialmente se propuso que las células que se encontraban en apoptosis

eran incapaces de secretar HMGB1 por la fuerte unión de esta molécula con el ADN

(Scaffidi y cols, 2002), estudios más recientes han demostrado que HMGB1 también

puede ser secretada por células apoptóticas. En células Jurkat y HeLa tratadas con

agentes químicos inductores de apoptosis (estaurosporina, etopósido, etc.), se detecta

la presencia de HMGB1 en el medio extracelular, por lo que tanto las células en

proceso de necrosis como las que se encuentran en apoptosis son capaces de liberar

HMGB1 extracelularmente, proceso que parece depender del tipo celular (Bell y cols,

2006).

El segundo mecanismo está basado en la “liberación activa” de HMGB1 por parte de

células del sistema inmunitario, en respuesta a diversos estímulos como LPS o TNF-α,

en una gran variedad de tipos celulares, como monocitos, macrófagos, células

dendríticas, células NK, osteoblastos, osteoclastos, hepatocitos, enterocitos, etc. Este

proceso requiere la translocación desde el núcleo al citoplasma y la imposibilidad de

que moléculas de HMGB1 neo-sintetizadas puedan volver al núcleo. Numerosas

modificaciones post-trascripcionales, como reacciones de fosforilación, metilación y

acetilación, modifican la carga neta de HMGB1, provocando la disminución en su

interacción con la cromatina, lo que favorece la translocación y posterior acumulación


75

citosólica de la proteina (Revisado por Sims y cols, 2010). La secreción extracelular de

este HMGB1 modificado se produce mediante un mecanismo “no convencional”, que

incluye la participación de vesículas especializadas del compartimento endolisosómico,

que terminan fusionándose con la membrana plasmática celular, con la consiguiente

liberación extracelular de HMGB1 (Revisado por Ulloa y Messmer, 2006).

Figura 15: Mecanismos de liberación del HMGB1

2.3.4) Receptores implicados en los efectos de HMGB1

Una vez liberado al medio extracelular, HMGB1 se une a receptores de la superficie

celular, de forma que la interacción con éstos determina sus respuestas celulares.

Muchos receptores han sido propuestos como candidatos para participar en la

señalización de HMGB1, entre los que destacan el receptor de productos finales de

glicosilación avanzados (RAGE), y los receptores TLR-2 y TLR-4, aunque más

recientemente se han propuesto además los receptores TLR-9 y Mac-1.

Necrosis

Monocitos Macrófagos Células dendríticas Fibroblastos etc.

TNF-α, IL-1β, IFN-γ, LPS, etc.

HMGB1 extracelular HMGB1 extracelular acetilado, metilado, etc.

Apoptosis

LIBERACIÓN PASIVA LIBERACIÓN ACTIVA

RESPUESTA INFLAMATORIA


76

RAGE: Este receptor es una proteína transmembrana perteneciente a la

superfamilia de las inmunoglobulinas, que se encuentra expresada en células

endoteliales, monocitos-macrófagos, neuronas, así como en una gran variedad de

células tumorales (Revisado por van Beijnum y cols, 2008). Como su nombre indica, fue

descrito originariamente como receptor para productos de glicosilación, aunque en la

actualidad se le conocen una gran variedad de ligandos, entre otros, proteínas de la

familia S100, cadenas ligeras de inmunoglobulinas, proteínas amiloides y HMGB1

(Revisado por Sims y cols, 2010).

La interacción de HMGB1 con RAGE conduce a la activación de dos grandes vías de

señalización: la vía CDC42/Rac, que da lugar a cambios en la organización del

citoesqueleto y a la activación del crecimiento de las neuritas y por otra, a la vía de las

MAPK, que conduce a un incremento en la actividad transcripcional del factor nuclear

NF-ĸB, con el consiguiente aumento en la producción de citocinas, quimiocinas y

moléculas de adhesión (Revisado por van Beijnum y cols, 2008). Sin embargo, la

participación de RAGE en los efectos de HMGB1 no resulta suficiente para explicar los

efectos observados al mismo. El hecho de que en ratones knock out en RAGE y en

células endoteliales tratadas con anticuerpos frente a RAGE, la liberación de citocinas y

quimiocinas inducida por HMGB1 resulte parcial, abre la posibilidad a la participación

de otros receptores en los efectos mediados por HMGB1 (Fiuza y cols, 2003), (Kokkola

y cols, 2005).

TLRs: Los receptores TLR son una familia de glicoproteínas transmembrana

altamente conservadas, presentes en células endoteliales y otros tipos celulares que

promueven la respuesta de las células del sistema inmune ante una gran variedad de

estímulos patógenos, tanto endógenos (moléculas DAMP, del inglés damage

associated pattern molecules, entre ellas, HMGB1) como exógenos (estructuras

microbianas). Se han descrito más de 10 tipos de receptores TLRs, existiendo

evidencias directas de la intervención de los TLR-2, -4 y -9 en los efectos de HMGB1.

La unión de HMGB1 a TLR-2 induce la activación de varias vías de señalización (Rac1

PI3-K, MyD88 e IRAK1), que tienen como consecuencia final la activación de NF-ĸB. Se

ha sugerido que el papel de los TLR-2 y -4 en poblaciones celulares de origen mieloide

es más relevante que el del receptor RAGE. Así, la adición de una forma soluble de


77

RAGE (sRAGE) a células endoteliales microvasculares disminuye únicamente en un 14%

la producción de IL-8 inducida por HMGB1, indicando pues que la mayor parte de la

activación de HMGB1 en estas células es independiente de RAGE (Park y cols, 2004).

Además, el tratamiento con anticuerpos anti-TLR-2 es capaz de atenuar la producción

de IL-8 y TNF-α inducida por HMGB1 en células HEK 293 (Yu y cols, 2006).

La cascada de señalización de TLR-4 se solapa con la de TLR-2, compartiendo por

tanto el efecto último: inducir la expresión de genes dependientes de la vía del NF-ĸB.

Quizá la principal diferencia radique en el hecho de que en función del tipo celular en

que se encuentren, una vía de señalización u otra será de mayor importancia. Por

ejemplo, en sangre humana, el empleo de anticuerpos neutralizantes de TLR-4 (y no

los de TLR-2 o RAGE), disminuye, de un modo concentración dependiente, la liberación

de IL-8 inducida por HMGB1. En macrófagos de origen humano, la liberación de TNF-α

inducida por HMGB1 disminuye significativamente en presencia de anticuerpos anti-

TLR-4. Además, en macrófagos aislados de ratones MyD88-/- y TLR-4-/-, la producción

de TNF-α mediada por HMGB1 es mucho menor que la observada en macrófagos TLR-

2-/- y en macrófagos normales (Yu y cols, 2006).

Figura 16: Receptores implicados en los efectos de HMGB1

CDC42 Rac1

RAC PI3-ĸ IRAK1

Akt

HMGB1 TLRs RAGE

MAPK

MyD88

Expresión de genes

NF-ĸB dependientes


78

Estudios recientes han demostrado la unión de HMGB1 a ADN CpG, ligando

característico de TLR-9 en macrófagos, células dendríticas y linfocitos B, provocando en

última instancia un incremento en la respuesta generada por estos ligandos solos,

como la secreción de las citocinas IL-6, IL-12, IFN-α y TNF-α, proceso que, a diferencia

de los TLR-2 y -4, parece depender exclusivamente de la vía MyD88 (Revisado por

Bianchi y Manfredi, 2007).

Tabla 1: Efectos de HMGB1 en sus células diana

TTIIPPOO CCEELLUULLAARR EEFFEECCTTOOSS DDEE HHMMGGBB11

Células dendríticas Maduración

Monocitos/Macrófagos Síntesis de citocinas pro-inflamatorias, inducción de MMPs y migración

Neutrófilos Quimiotaxis y prevención de apoptosis

Linfocitos T Proliferación y polarización hacia TH1

Linfocitos B Potenciación de la activación de complejos ADN-IgG

Células epiteliales Aumento de la permeabilidad de enterocitos y efectos bactericidas

Plaquetas Expresado en la superficie celular

Osteoclastos Formación de osteoclastos y liberación de TNF-α

Células endoteliales Angiogénesis, síntesis moléculas de adhesión

Células de músculo liso Migración y proliferación

Neuronas Crecimiento de las neuritas

Astrocitos Actividad pro-inflamatoria, quimiotáctica y síntesis de MMPs

Miocitos cardíacos Efecto inotrópico negativo y procesos de reparación

Células madre Quimiotaxis y diferenciación

Células tumorales Invasividad, síntesis de MMPs. Expresión fuertemente inducida


79

2.3.5) HMGB1, una citocina más en el medio extracelular: efectos y

consecuencias

Los efectos de HMGB1 cuando presenta una localización extracelular son

numerosos y variados. El hecho de que se trate de una proteína presente

prácticamente en cualquier tipo celular, de que su liberación dependa de una gran

variedad de estímulos y de que a su vez sea capaz de actuar a través de distintos

receptores hace que estos efectos, así como sus consecuencias, sean extensos y

variados: se han demostrado efectos, tanto in vivo como in vitro, a nivel de células del

sistema inmune y de otros tipos celulares, como astrocitos, neuronas, células de

músculo liso, células madre, etc., que quedan resumidos en Tabla 1 (obtenida de

Pisetsky y cols, 2008).

La descripción de estos efectos condujo a que HMGB1 fuera considerado como una

citocina pro-inflamatoria más. Sin embargo, la capacidad del HMGB1 de comportarse

como tal se encuentra actualmente en entredicho, ya que son muchos los laboratorios

que no han sido capaces de reproducir estos efectos. De hecho, estudios

independientes demostraron que HMGB1 altamente purificado es incapaz de inducir

procesos de activación celular (Rouhiainen y cols, 2007), por lo que se duda de la

actividad de HMGB1 cuando actúa solo. Parece ser que la procedencia de la fuente de

HMGB1 utilizada puede tener una gran influencia en los resultados. Muchos de los

estudios disponibles en la literatura han utilizado una fuente de HMGB1 obtenida por

técnicas de recombinación en Escherichia Coli, de modo que ésta contiene trazas de

endotoxinas o de cualquier material microbiano que puede influenciar los efectos de

HMGB1, conduciendo a la aparición de “falsos positivos”. En esta línea, un estudio

reciente analizó los efectos de HMGB1 de distinta procedencia en cuanto a la

capacidad de inducir la síntesis de mediadores inflamatorios tradicionalmente

asociados al HMGB1 (TNF-α, IL-6 y CCL2), a la vez que analizaban el contenido en

endotoxinas de los mismos. Estos experimentos demostraron claramente la

correlación entre los niveles de endotoxinas presentes en HMGB1 y la producción de

los mediadores anteriores. Por tanto, una fuente de HMGB1 con un alto contenido en

endotoxinas es capaz de inducir considerablemente la producción de mediadores pro-


80

inflamatorios, efectos que no se dan en HMGB1 recombinante humana, que carece de

endotoxinas (Qin y cols, 2009).

Otro aspecto a considerar es el hecho de que HMGB1 sea capaz de formar

complejos con distintas moléculas, potenciando los efectos de éstas. Numerosos

estudios han demostrado la capacidad de HMGB1 de formar complejos con distintas

moléculas, como ligandos de TLRs (LPS, CpG-ODN, Pam3CSK4), citocinas (IL-1β y en

menor medida, con TNF-α e IFN-γ), e incluso nucleosomas, en numerosos tipos

celulares, entre ellos, células endoteliales, macrófagos, células mononucleares de

sangre periférica, fibroblastos sinoviales, etc. (Liu y cols, 2006), (Sha y cols, 2008),

(Urbonaviciute y cols, 2008), (Qin y cols, 2009), (Hreggvidsdottir y cols, 2009). Es

interesante señalar que la unión de HMGB1 con estas moléculas no es indiscriminada.

De hecho, su unión con TNF-α e IFN-γ incrementa los efectos de éstas en menor

medida que los provocados por HMGB1 e IL-1β (Sha y cols, 2008), mientras que no se

observan cambios significativos con respecto a los controles solos, cuando se estimula

con HMGB1 y RANKL, IL-8 o el ligando de TLR-3 poli I:C (Hreggvidsdottir y cols, 2009).

Por tanto, el hecho de que la combinación de HMGB1 con otras moléculas incremente

la actividad de éstas estaría en concordancia con el éxito que han demostrado las

terapias anti-HMGB1 a nivel experimental, ya que bloqueando los efectos de HMGB1

se consigue disminuir la activación celular inducida por HMGB1 y la molécula a la que

se encuentre unido (Sha y cols, 2008). Para explicar los receptores mediados en los

efectos producidos por estos complejos, cabría pensar en la participación, por una

parte de los receptores que median los efectos de HMGB1 y por otra, de los receptores

propios de las moléculas a las que se une. De hecho, se ha demostrado que la

traslocación de HMGB1 en neutrófilos depende de la activación dual de RAGE y Mac-1

(Orlova y cols, 2007).

A pesar de todo, cabe la posibilidad de que la forma endógena de HMGB1 sea capaz

de comportarse como una citocina a nivel fisiológico. En este contexto debemos

considerar que desde que sale del núcleo hasta que llega al citoplasma sufre una serie

de modificaciones post-transcripcionales, que tienen como consecuencia una serie de

cambios en la molécula, algunos de los cuales aún hoy resultan desconocidos, lo que


81

dificulta en gran medida el desarrollo de formas de HMGB1 con las que poder trabajar

en el laboratorio.

2.3.6) Papel de HMGB1 en distintas patologías. Estrategias terapéuticas

utilizadas

HMGB1 fue descrito inicialmente como una proteína implicada en el desarrollo de

procesos sépticos. De hecho, HMGB1 se detecta en cantidades elevadas en suero de

pacientes con sepsis, asociándose su presencia con el mal pronóstico de este proceso.

Además, la administración de la forma recombinante de HMGB1 provoca la aparición

de signos característicos de sepsis y fallo multiorgánico en ratones, mientras que el

empleo de anticuerpos anti-HMGB1, al igual que el dominio A, han demostrado

efectos protectores frente a la endotoxemia en varios modelos animales, como la

inducción de procesos sépticos mediante inyección de LPS (Wang y cols, 1999) o la

ligación y perforación cecal (Yang y cols, 2004). Estos datos promovieron el estudio del

papel de HMGB1 en otros modelos de enfermedad. A día de hoy, numerosas

evidencias apoyan el papel de esta proteína en enfermedades que comparten un

componente pro-inflamatorio y/o séptico, como ciertos trastornos gastrointestinales

(Revisado por Ulloa y Messmer, 2006), (Revisado por Yang y Tracey, 2010), pulmonares

(Revisado por Yang y Tracey, 2010), así como el cáncer (Revisado por Sims y cols, 2010)

y el lupus eritematoso (Urbonaviciute y cols, 2008). Sobre estas patologías, se han

ensayado, tanto in vitro como in vivo, diferentes terapias dirigidas a bloquear los

efectos del HMGB1, mediante el empleo de anticuerpos neutralizantes de HMGB1 o

RAGE, de formas solubles de estas proteínas, o de moléculas que impiden la

translocación de HMGB1, como etilpiruvato o polimixina.

Al igual que hemos hecho en el capítulo de la HO-1, en este caso nos centraremos

en los datos conocidos acerca del papel de HMGB1 en enfermedades articulares, tales

como la AR y la OA.

Artritis reumatoide: HMGB1 se encuentra sobre-expresado en el tejido

sinovial de ratas y ratones con modelos experimentales de AIA y CIA, así como en


82

pacientes con AR, presentando una localización básicamente citoplasmática y

extracelular. También en muestras de fluido sinovial de pacientes artríticos se detectan

cantidades considerables de HMGB1, lo que justifica el hecho de la elevada presencia

extracelular de esta proteína (Kokkola y cols, 2002), (Taniguchi y cols, 2003). La

administración sistémica de anticuerpos anti-HMGB1 o de la forma recombinante del

dominio A del mismo, a ratas y ratones con CIA es capaz de mejorar la puntuación de

la artritis y la patología articular así como la pérdida de peso asociada a la progresión

de la enfermedad (Kokkola y cols, 2003). Todos estos resultados han sido confirmados

recientemente en otro modelo de AR, el modelo de artritis espontánea en ratones

DNasa II-/-xIFN-IR (Ostberg y cols, 2010).

Pero HMGB1 no sólo se encuentra sobre-expresado durante la AR, sino que él

mismo es capaz de contribuir negativamente al desarrollo de esta enfermedad, al

inducir un considerable aumento en la producción de otras citocinas implicadas en la

AR, como IL-1β, TNF-α e IL-6 (Taniguchi y cols, 2003). Por otro lado, la administración

intra-articular de HMGB1 es capaz de desarrollar procesos artríticos en animales

inicialmente sanos, proceso mediado básicamente por dos tipos celulares, monocitos y

granulocitos y que parece ser que depende en gran medida de la cepa de ratón

utilizada (Pullerits y cols, 2003). Además, HMGB1 contribuye al desarrollo de la AR a

través de otras vías, ya que se ha comprobado que es capaz de incrementar la

invasividad de sinoviocitos reumatoides hasta en un 125% en comparación con sus

controles, efectos que disminuyen hasta valores normales cuando las células se

incuban además en presencia de anticuerpos anti-RAGE (Steenvoorden y cols, 2007).

En la búsqueda de nuevos mecanismos implicados en el desarrollo de

enfermedades inflamatorias crónicas, se ha propuesto la relación entre hipoxia y

HMGB1 en la AR. Los niveles de HMGB1 en muestras de fluido sinovial artrítico se

correlacionan con los de ácido láctico, marcador característico de hipoxia, condición

que a su vez es capaz de producir niveles elevados de HMGB1, con lo que se puede

pensar que HMGB1 representa el nexo de unión entre los procesos de hipoxia y de

inflamación en el contexto de estas enfermedades. La hipoxia podría representar un

estímulo más para liberar HMGB1, que a su vez incrementaría la producción de

mediadores pro-inflamatorios (Hamada y cols, 2008).


83

El hecho de que aún no exista una terapia anti-HMGB1 en el mercado ha motivado

el estudio de fármacos ampliamente utilizados en el tratamiento de la AR en relación

con HMGB1. Schierbeck y cols comprobaron recientemente que el tratamiento de

células mononucleadas aisladas de sangre humana periférica con concentraciones

farmacológicas de dexametasona, aurotiomalato y cloroquina (pero no de cortisona,

metotrexato, colchicina, etanercept y anakinra), resultan capaces de disminuir la

secreción extracelular de HMGB1, aunque el mecanismo de acción aún resulte

desconocido (Schierbeck y cols, 2010). En esta línea, se ha sugerido recientemente que

la activación de la vía anti-inflamatoria colinérgica, mediante la administración de

nicotina, a la vez que reduce la erosión ósea, puede disminuir la expresión y la

translocación de HMGB1 en células de la membrana sinovial artrítica de ratones con

CIA (Li y cols, 2010).

Osteoartritis: En el momento de redactar esta tesis, los datos de los que

disponemos acerca del papel de HMGB1 en la OA son escasos. En principio, algunos

autores utilizaron tejidos de animales o pacientes con OA como controles negativos de

la AR. Así, en el estudio en el que Kokkola y cols demostraron la sobre-expresión y la

localización extracelular de HMGB1 en el sinovio artrítico, se describió que esta

proteína se localizaba en el núcleo de las células de la membrana sinovial OA, aunque,

lógicamente este dato carece de relevancia al tratarse de un único paciente (Kokkola y

cols, 2002). En contraposición, un estudio posterior en membrana sinovial equina

comprobó que, a pesar de que HMGB1 se encontraba mayoritariamente en el núcleo,

también aparecía una tinción abundante (y no ocasional), a nivel citosólico (Ley y cols,

2009). Es más, durante el proceso de redacción de esta revisión, un nuevo artículo ha

confirmado que conforme avanza el proceso OA, HMGB1 pasa de una localización

nuclear a una básicamente extra y pericelular en condrocitos. Además, la presencia de

tinción positiva al HMGB1 en la zona de contacto entre cartílago y hueso, sugiere

también la implicación del mismo en los procesos de esclerosis del hueso subcondral

característicos del avance del proceso OA (Heinola y cols, 2010).

HMGB1 se expresa en el cartílago OA, con unos niveles mayores que en el cartílago

sano. Además, en explantes de cartílago OA estimulados con concentraciones

crecientes de HMGB1, aumenta significativamente la producción de distintos


84

mediadores implicados en el desarrollo de la OA, como NO, PGE2, IL-6 e IL-8, efectos

que no se observan en los explantes tratados con el dominio A del HMGB1 (Attur y

cols, 2003).

En cuanto a la expresión del receptor RAGE, a pesar de que un estudio sugirió que

su expresión era similar en la membrana sinovial de pacientes artríticos y artrósicos

(Drinda y cols, 2005), la mayoría de los datos sugieren que, una vez más, la expresión

de este receptor es mayor en la AR, ya que en ésta la reacción inflamatoria es mayor

(Taniguchi y cols, 2003). También se ha detectado la expresión de este receptor a nivel

del cartílago, tanto en cortes histológicos como en condrocitos humanos frescos y

cultivados. En estas células, diversos ligandos de RAGE, como SB100 y HMGB1, son

capaces de aumentar la expresión de la MMP-13, a través de un mecanismo que

incluye la fosforilación de ERK 1/2 y la activación de NF-ĸB (Loeser y cols, 2005). Por

otra parte, la activación de dicho receptor por productos finales de glicosilación

avanzados (AGEs), conduce a un aumento en la actividad catabólica de condrocitos y

sinoviocitos OA, que contribuye a la degeneración articular (Steenvoorden y cols,

2007).

Figura 17: Estrategias terapéuticas utilizadas

en modelos de enfermedad relacionados con HMGB1

sRAGE Anticuerpos anti-RAGE

Dominio A Anticuerpos anti-HMGB1

Nicotina

Etilpiruvato Polimixina B

Dexametasona Tiomalato Cloroquina

RESPUESTA INFLAMATORIA Sepsis, AR, cancer, trastornos respiratorios, etc.

LPS IL-1β TNF-α

HMGB1 nuclear HMGB1

extracelular

HMGB1 citosólico

NF-ĸB


85

Independientemente de estos efectos, se ha descrito que la isoforma HMGB2 está

implicada en los procesos de envejecimiento y de OA. En condiciones normales,

HMGB2, que se expresa en la zona superficial del cartílago, actúa como regulador

transcripcional de distintos procesos, además de favorecer la supervivencia de los

condrocitos. Sin embargo, con el envejecimiento, pierde estos efectos, lo que podría

favorecer al desarrollo del proceso OA (Taniguchi y cols, 2009).

2.3.7) Efectos anti-inflamatorios de HMGB1

Mención aparte merece el hecho de que, aún cuando el balance general de los

efectos de HMGB1, ya sea solo o en combinación con otras moléculas, sea netamente

pro-inflamatorio, algunos autores hayan señalado la posibilidad de que HMGB1 sea

capaz de ejercer efectos beneficiosos y protectores. Por una parte, y a pesar de que la

forma recombinante de HMGB1 resulta incapaz de promover la inducción de otros

mediadores inflamatorios, se ha demostrado que es capaz de atraer células del

sistema inmune y otros tipos celulares promoviendo tanto la proliferación como la

migración de éstas a la zona dañada, contribuyendo en última instancia a la resolución

del proceso inflamatorio y a la regeneración tisular, procesos que parecen estar

mediados por su unión al receptor RAGE (Revisado por Bianchi y Manfredi, 2007). Por

otra parte, se ha postulado la posibilidad de que HMGB1 sea capaz de ejercer efectos

anti-inflamatorios a través de la vía CD24-Siglec-10 en humanos y CD24-Siglec-G en

roedores, proceso mediado en última instancia por la inhibición de la activación de NF-

ĸB y que podría representar por tanto una diana de interés en el tratamiento de

patologías caracterizadas por un aumento en la expresión y en la localización

extracelular de HMGB1 (Chen y cols, 2009).

En vista de estos datos aparentemente beneficiosos, M.Bianchi planteó en un

reciente artículo de opinión, la hipótesis de que las acciones ejercidas por el HMGB1

en solitario y mediadas por RAGE tienen como fin último la resolución del proceso

inflamatorio y la regeneración tisular, mientras que los efectos de éste en combinación

con otras moléculas, actuando a través de los receptores de las mismas o de los TLRs,

están relacionados con el incremento de la respuesta inflamatoria (Bianchi, 2009).


86

2.3.8) Relación entre HMGB1 y HO-1

Durante el desarrollo de todo proceso séptico, además de la liberación exagerada

de HMGB1, se induce la expresión de HO-1 para que, a través de sus efectos anti

inflamatorios y anti oxidantes, sea capaz de proteger frente al daño inducido por este

proceso. La inducción exógena de HO-1 aumenta la supervivencia en un modelo

animal de shock séptico (Otterbein y cols, 1995), mientras que ratones deficientes en

HO-1 que reciben LPS como estímulo desencadenante de sepsis, presentan niveles

elevados de estrés oxidativo, fallo renal y hepático y muerte (Wiesel y cols, 2000).

Todos estos antecedentes han motivado la aparición de varios estudios que analizan la

posible relación entre HMGB1 y HO-1 en condiciones de sepsis: Ratones HO-1(-/-)

presentan mayores signos de daño pulmonar y mayores niveles de HMGB1 que los

ratones wild type, mientras que el tratamiento de éstos con CORM-2 y biliverdina

disminuye los niveles de HMGB1, a la vez que aumenta la supervivencia, tal y como

ocurre con las terapias anti-HMGB1 (Takamiya y cols, 2009). También la inducción de

la expresión de HO-1 por CoPP, y no la inhibición de la misma por SnPP, disminuye la

expresión de HMGB1, a la par que mejora los signos clásicos de un proceso séptico a

nivel pulmonar (Gong y cols, 2008).

En la búsqueda de nuevas moléculas efectivas en el tratamiento de estos procesos

se ha postulado que tanto el extracto de Prunus mume Sieb. et Zucc, en un modelo in

vitro en células RAW 264.7, como el agente anti-inflamatorio etilpiruvato, en un

modelo animal de enfermedad inflamatoria intestinal, pueden disminuir los niveles de

HMGB1 por un mecanismo dependiente de la inducción de HO-1 (Kawahara y cols,

2009), (Davé y cols, 2009).

Sin embargo, se disponen pocos datos acerca de la relación entre el HMGB1 y la

HO-1 en modelos de inflamación “estériles”, como la AR, el cáncer o el síndrome de

isquemia-reperfusión. En un estudio reciente de nuestro laboratorio, sin concretar el

mecanismo de acción implicado, se observó que el tratamiento de ratones artríticos

con CORM-3 disminuía significativamente la expresión de HMGB1 en células de la

membrana sinovial y del infiltrado inflamatorio y en menor medida, en condrocitos

(Maicas y cols, 2010).

3) O

bje

tivo

s

Objetivos _____________________________________________________________________________

89

En el capítulo anterior se han puesto de manifiesto las evidencias que apoyan los

efectos beneficiosos de la inducción de HO-1 en el cartílago OA, así como el papel de

HMGB1 en el desarrollo y la progresión de distintas enfermedades inflamatorias. En

cambio, poco o nada se sabe acerca de los efectos y consecuencias de la inducción de

HO-1 y de la participación de HMGB1 durante la inflamación sinovial OA. Por este

motivo, y en el contexto de estos antecedentes, la presente Tesis Doctoral tiene 4

objetivos, que se detallan a continuación:

1) Caracterizar la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA y su

modulación por citocinas implicadas en el proceso OA.

2) Estudiar la posible contribución de HMGB1 a la sinovitis OA,

mediante la determinación de sus efectos sobre distintos mediadores

pro-inflamatorios y catabólicos característicos de este proceso, así como

sobre las vías de señalización implicadas.

3) Determinar los efectos de la activación de la vía de la HO-1 en

sinoviocitos OA, a través la evaluación de las consecuencias de la sobre-

expresión de HO-1 y de la liberación de CO, metabolito de la reacción

catalizada por HO-1, sobre distintos parámetros implicados en la sinovitis

OA.

4) Establecer la interrelación entre HO-1 y HMGB1 en sinoviocitos

OA.

4

) Mat

eria

l y m

éto

do

s

Material y métodos _____________________________________________________________________________

93

4.1) Obtención de muestras de membrana sinovial

y cultivo de sinoviocitos OA

4.1.1) Obtención de muestras de membrana sinovial OA

Las muestras de tejido sinovial han sido obtenidas de 120 pacientes con diagnóstico

de OA en estadío avanzado (83 mujeres, 37 hombres, de edad 70±1, media ± error),

con reemplazo de la articulación en cirugía por prótesis. El diagnóstico se basó en

evidencias clínicas y de laboratorio, así como en evaluaciones radiológicas. Las

muestras han sido proporcionadas por el Servicio de Traumatología del Hospital Clínico

Universitario de Valencia, de acuerdo con su correspondiente Comité Ético de

Investigación Clínica.

4.1.2) Aislamiento de sinoviocitos OA

Una vez seleccionada la muestra

sinovial, después de separar las

partes grasas y vascularizadas, se

corta y se disgrega en pequeños

trozos con la ayuda de pinzas y

bisturí y se procede a la digestión

enzimática con 1 mg/mL de colagenasa IA (SIGMA-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) en

medio de cultivo Dulbecco modificado por Eagle, DMEM/HAM F12 (SIGMA-Aldrich, St

Louis, MO, EE.UU.), suplementado con antibiótico al 1% (100 U/mL penicilina, 100

µg/mL estreptomicina), (SIGMA-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). El tejido sinovial se

incuba con la colagenasa durante 12-16 horas en un incubador a 37ºC, con atmósfera

controlada al 5% de CO2 y 95% de humedad.

Una vez digerida la muestra, se filtra a través de membranas de nylon de 70 µm de

tamaño de poro para retener las partes no digeridas. La suspensión celular resultante

se lava por centrifugación a 500 x g durante 5 minutos y a continuación, el pellet

obtenido se resuspende en DMEM HAM/F12 suplementado con 10% de suero bovino

Figura 18: Muestras de tejido sinovial Imágenes de muestras de tejido sinovial procedente de

pacientes con diagnóstico de OA en estadío avanzado.


94

fetal (SBF), 1% de antibiótico, glutamina 2mM y HEPES 10Mm (en adelante,

DMEM/HAM F12 completo) y se siembra en frascos de cultivo de 25 cm2 en DMEM

HAM/F12 completo. A partir de este momento, los sinoviocitos, de fenotipo

fibroblasto (FLS) y de fenotipo macrófago (MLS), se adherirán a los frascos e iniciarán

su proliferación, obteniéndose así cocultivos de sinoviocitos en Pase 0. Los eritrocitos,

linfocitos o algún otro resto de tejido que no se haya disgregado permanecerán en el

sobrenadante y podrán ser eliminados con los sucesivos cambios de medio, que se

realizan en días alternos con DMEM HAM/F12 completo, hasta que los sinoviocitos

alcancen la total confluencia.

4.1.3) Mantenimiento de los cocultivos de sinoviocitos OA

Con objeto de aumentar el número de células con las que poder realizar nuestros

experimentos, el mantenimiento de los cocultivos de sinoviocitos se realiza mediante

pases o subcultivos. Cuando los sinoviocitos presentan una confluencia superior al

90%, y después de realizar varios lavados con tampón fosfato salino (PBS) estéril, se

procede a despegarlos del frasco al que se encuentran adheridos con una solución de

tripsina/EDTA al 0,25% (SIGMA-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). Tras varios lavados con

DMEM/HAM F12 completo, se realiza una estimación del número y la viabilidad de los

sinoviocitos obtenidos, mediante el contaje de los mismos en la cámara de Neubauer.

Para ello utilizamos la tinción de exclusión con azul tripán, basada en la capacidad de

las células vivas de expulsar este colorante, impidiendo que entre en el interior de las

mismas. Las células muertas, por el contrario, quedan

teñidas de azul. En nuestros experimentos, después de

resuspender el pellet obtenido en 2-3 mL de

DMEM/HAM F12 completo, se toma una alícuota y se

le añade, en relación 1:1 (v:v), una solución de azul

tripán al 0,4% en suero fisiológico, tras lo cual se

realiza el contaje en la cámara de Neubauer. En

general, los cultivos de sinoviocitos presentaban una

Figura 19: Cocultivos de sinoviocitos


95

viabilidad superior al 90%. Todos aquellos con una viabilidad inferior fueron

descartados.

Las células obtenidas se siembran en uno o varios frascos de cultivo de 75 cm2 en

función del número de células obtenido (aproximadamente 1x106 células/frasco). De

esta manera se obtiene el primer pase o subcultivo y así sucesivamente hasta llegar al

tercer pase, en el que se siembran las células en diferentes placas y a diferentes

densidades en función del experimento que se vaya a realizar, como se verá en el

siguiente apartado.

Es importante remarcar que todos nuestros experimentos se han llevado a cabo en

el tercer pase. En estudios previos existentes en bibliografía se han observado cambios

en el fenotipo de los sinoviocitos de pases posteriores al cuarto en comparación con

los sinoviocitos de pases iniciales debido, básicamente, a los procesos de

desdiferenciación celular (Zimmermann y cols, 2001). Además, los MLS apenas

sobreviven en cultivo más de unas semanas. De hecho, a partir del tercer-cuarto pase,

los cultivos de sinoviocitos son en realidad una población homogénea de FLS (Revisado

por Bartok y Firestein, 2010). Trabajando con sinoviocitos de tipo fibroblasto y también

de tipo macrófago conseguimos que nuestros cultivos de reproduzcan al máximo las

condiciones fisiológicas.

4.1.4) Condiciones experimentales

Generalmente, una vez alcanzada una confluencia superior al 90%, se cambia el

medio por DMEM HAM/F12 completo y se procede a tratarlas con los

correspondientes estímulos, que veremos en el apartado 4.2. En función del

experimento a realizar, los sinoviocitos se siembran en diferentes placas de cultivo, a

diferentes densidades, y a diferentes tiempos tal y como queda recogido en la Tabla 2.


96

Tabla 2: Resumen de las condiciones de experimentación

en los distintos experimentos realizados en sinoviocitos OA

EXPERIMENTO TÉCNICA TIPO Nº TIEMPO de

ESTÍMULO de PLACA CÉLULAS

Toxicidad Azul tripán 24 pocillos 40.000 24 horas

Quimiotaxis Transwell 12 pocillos 30.000 24 horas

Estrés oxidativo Rodamina 123

Microcámaras 8 pocillos 20.000 30 min

Actividad MMP FRET 6 pocillos 200.000

24 horas Petri 10 cm 800.000

Mediadores solubles ELISA 6 pocillos 200.000

24 horas 24 pocillos 40.000

6 pocillos 200.000 5 min

Western Blot Petri 3 cm 400.000 1 h

Petri 10 cm 800.000 24 h

Expresión de proteínas Inmunocitoquímica

10.000 24 horas Microcámaras 8 pocillos

Inmunofluorescencia

20.000

1hora

24 horas

Microcámaras 4 pocillos

Expresión ARNm PCR a tiempo real Petri 10 cm 800.000 16 horas

Transfección transitoria plásmidos

Actividad luciferasa 6 pocillos 150.000 24 horas


Unión al ADN Petri 10 cm 800.000 1 hora


97

4.2) Tratamiento de los cocultivos de sinoviocitos

4.2.1) Estímulos y productos

Citocinas pro- y anti-inflamatorias: En una primera etapa, los sinoviocitos

han sido estimulados con una serie de citocinas recombinantes humanas (procedentes

de Peprotech EC Ltd, Londres, Reino Unido), tanto de carácter pro-inflamatorio (IL-1β,

TNF-α, IL-17) como anti-inflamatorio (IL-10, IL-13), implicadas directa o indirectamente

en el desarrollo de la OA. Todas ellas han sido testadas a las concentraciones de 2, 10 y

15 ng/mL, a partir de una madre 1ng/μL en DMEM/HAM F12.

HMGB1: Considerada también como una citocina pro-inflamatoria, la forma

recombinante humana de HMGB1, procedente de HMGBiotech (Milán, Italia), se testó

a las concentraciones finales de 15 y 25 ng/mL, utilizando para ello una madre 1 ng/µL

en DMEM/HAM F12. Se evaluaron además los efectos de HMGB1 en presencia del

estímulo pro-inflamatorio IL-1β a la concentración final de 10 ng/mL. En este caso,

ambas citocinas fueron añadidas a la vez a los cultivos celulares.

Antes de empezar esta serie experimental, se comprobó la ausencia de

endotoxinas en la solución madre de HMGB1 mediante el test Lymulus Amebocyte

Lysate (SIGMA-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) para la detección y cuantificación de

endotoxinas. Una elevada presencia de éstas podrían haber aumentado los efectos de

HMGB1, hecho que podría haber conducido a errores en la interpretación de los

resultados. En cualquier caso, en ninguna de las diluciones analizadas se detectaron

endotoxinas (datos no mostrados).

Por otra parte, y con objeto de estudiar la participación de los receptores TLR-2,

TLR-4 y RAGE en los efectos de HMGB1, las células fueron incubadas con anticuerpos

específicos de bloqueo de estos receptores: anti-TLR-2 y TLR-4 (eBioscience, San Diego,

CA, EE.UU.) y anti-RAGE (R&D systems Inc, Minneapolis, MN, EE.UU.), utilizados a las

concentraciones finales de 20 µg/mL (anti-TLR-2 y anti TLR-4) y 10 µg/mL (anti-RAGE),

y que fueron añadidos a las células 2 horas antes de añadir los estímulos HMGB1 e IL-

1β durante 24 horas.


98

Cobalto protoporfirina IX (CoPP): Molécula con estructura porfirínica que

contiene un átomo de cobalto, que actúa como potente inductor de la expresión de

HO-1. Inicialmente se testaron 3 concentraciones de CoPP (5, 10 y 15 μM), aunque

posteriormente se decidió trabajar

únicamente con CoPP 10 μM,

concentración ampliamente utilizada en

nuestro laboratorio, a la que se observa

una fuerte inducción de HO-1 sin

efectos tóxicos relevantes. Para ello, el

CoPP, procedente de Frontier-Scientific

Europe Ltd (Carnforth, Reino Unido), se

disolvió en dimetilsulfóxido (DMSO) tras

lo cual se preparó una dilución de

trabajo 10-3 M en metanol, que se

añadió a las células en cultivo

aproximadamente 30 minutos antes de

añadir el estímulo pro-inflamatorio IL-1β a una concentración final de 10 ng/mL. La

concentración final de metanol fue del 1% (v/v) y la de DMSO del 0,1% (v/v)

aproximadamente.

Tricarbonildiclororrutenio (II), dímero (CORM-2): Complejo que contiene

un átomo de rutenio coordinado con grupos carbonilo, con la capacidad de liberar CO

a los tejidos biológicos. En nuestro estudio testamos 3 concentraciones de CORM-2

(50, 100 y 200 μM), para lo cual se preparó una

dilución de trabajo de CORM-2 (SIGMA-Aldrich,

St Louis, MO, EE.UU.) 20 mM en suero fisiológico

estéril (SFE) a partir de una madre 10-1 M en

etanol, que se añadió a las células en cultivo

aproximadamente 30 minutos antes de añadir el

estímulo pro-inflamatorio IL-1β a la

concentración final de 10 ng/mL. A la máxima

Figura 21: Estructura química de CORM-2 Tricarbonildiclororutenio II,

potente liberador de CO a los tejidos biológicos.

Ru

COCl

Cl

Ru

Cl

CO

COCOCl

OC

OC

Figura 20: Estructura química de CoPP Cobalto protoporfirina IX, potente inductor de la expresión de HO-1.

H3C

H3C

CH2

CH3

Cl-

O

CH2

OOH

HO

.NN

N N

Co

CH3


99

concentración empleada, la concentración final de etanol fue del 0,2% (v/v).

Cloruro de Rutenio III (RuCl3): Control negativo del CORM-2. Procedente de

SIGMA-Aldrich (St Louis, MO, EE.UU.), se ha utilizado a la concentración final de 200

µM, para lo cual se preparó una dilución de trabajo 20 mM en medio de cultivo a partir

de una madre 10-1 M en DMSO, que se añadió a las células en cultivo

aproximadamente 30 minutos antes de añadir el estímulo pro-inflamatorio IL-1β (10

ng/mL). La concentración final de DMSO fue del 0,2% (v/v).

4.2.2) Silenciamiento de genes mediante siRNA

El silenciamiento específico de la expresión de determinados genes mediante la

introducción de pequeños fragmentos de ARN de doble cadena (small interfering RNA,

siRNA) se basa en la transfección de dichas moléculas de siRNA a las células, de modo

que, mediante la interacción con distintos componentes proteicos, formen un

complejo de silenciamiento inducido por ARN (RNA-induced silencing complex, RISC),

que se une a la hebra complementaria del ARNm diana, provocando la degradación de

la misma y el consiguiente silenciamiento del gen (Figura 22).

Figura 22: Esquema del silenciamiento de genes mediante siRNA

(2) Formación del complejo RISC

(3) Activación del complejo

RISC

(4) Reconocimiento de la hebra complementaria

de ARNm

(5) Degradación del ARNm

(6) Silenciamiento del gen

(1) Transfección de siRNA

(7) Reciclaje del RISC


100

CONDICIONES EXPERIMENTALES Y PROTOCOLO DE ACTUACIÓN

Se siembran los sinoviocitos en placas de 6 ó 24 pocillos o en placas Petri de 10 cm

de diámetro y se empieza el proceso cuando las células presentan una confluencia de

aproximadamente el 70-80%. Se preparan diluciones apropiadas del vehículo

siPORTamine, del siRNA específico para HO-1 y de un siRNA inespecífico que sirve de

control, sintetizados todos ellos por Ambion (Austin, TX, EE.UU.). A continuación se

mezclan siPORTTMamine y siRNA y se incuban a temperatura ambiente durante 10

minutos, tiempo necesario para la formación del complejo siRNA-siPORTTMamine.

Mientras, se procede a cambiar el medio de las células por DMEM/HAM F12 sin

suplementar y una vez formado el complejo, se añade gota a gota sobre las células, de

manera que los siRNA tengan una concentración final de 100 nM. Las células se

incuban en presencia de los siRNA durante 24 horas en un incubador a 37ºC, con

atmósfera controlada al 5% de CO2 y 95% de humedad. Trascurrido este período se

sustituye el medio por DMEM/HAM F12 completo durante 24 horas, tras lo cual se

estimulan las células con CoPP en presencia/ausencia de IL-1β de acuerdo con lo

descrito en el apartado 4.2.1 (Figura 23).

Figura 23: Esquema del protocolo de silenciamiento génico

0 horas 24 horas 48 horas 72 horas

Adición siRNA Cambio medio Estímulos Recoger células

(DMEM/HAM F12) (DMEM/HAM F12 completo) (CoPP±IL-1β) y sobrenadantes


101

4.2.3) Transducción de vectores virales

Dada la elevada eficiencia que presentan, los vectores virales son ampliamente

utilizados en el campo de la terapia génica. Por vector viral se entiende un virus

modificado genéticamente para introducir en las células un gen de interés al que se le

han eliminado los componentes víricos que le confieren la capacidad replicativa,

evitando así sus efectos infecciosos y patógenos. De entre los varios tipos de vectores

virales de los que se dispone en la actualidad, en nuestro caso hemos trabajado con

vectores de tipo lentivírico modificados con el gen de la HO-1, de manera que

podamos conseguir una sobre-expresión directa de esta enzima en nuestros cultivos

de sinoviocitos OA. Estos vectores fueron proporcionados por el Dr. Antonio Cuadrado,

de la Universidad Autónoma de Madrid.


Los componentes necesarios para la formación del lentivirus modificado con el ADN

de HO-1 se transfectan en la línea de células embrionarias de riñón humano HEK-293T

(Colección Europea de Cultivos Celulares ECACC 85120602, Porton Down, Reino

Unido). Para ello se siembran 1x106 células en placas Petri de 10 cm de diámetro y se

mantienen en cultivo con DMEM/HAM F12 completo en un incubador a 37ºC, con

atmósfera controlada al 5% de CO2 y 95% de humedad, durante aproximadamente 24

horas, tras lo cual, se procede a la transfección transitoria mediada por fosfato cálcico

de los siguientes plásmidos, proporcionados por el Dr. D. Trono (School of Life

Sciences, Ecole Polytechnique Fédérale de Lausanne, Lausanne, Suiza):

pWXL-Flag-hHO-1, plásmido del vector de transferencia.

psPAX2, plásmido del vector de empaquetamiento para lentivirus.

pMD2G, correspondiente a la proteína que codifica para la envoltura del

virus.

Para llevar a cabo esta transfección se prepara una mezcla de los plásmidos

anteriores en HEPES 2,5 mM, a la que se le añade una solución de CaCl2 0,5 M en

relación 1:1 (v:v). A su vez, esta mezcla se combina con un tampón HeBS 2x (NaCl 0,28


102

M, HEPES 0,05 M, Na2HPO4 1,5 mM a pH 7), en relación 1:1 (v:v). La mezcla final se

añade a las células en cultivo y se mantiene en un incubador celular a 37ºC, con

atmósfera controlada al 5% CO2 y 95% de humedad durante la noche. Trascurridas 12

horas se cambia el medio por DMEM/HAM F12 completo para eliminar los

precipitados de fosfato cálcico que se hayan formado. Las células HEK 293-T

transfectadas con los tres plásmidos anteriores producen los correspondientes virus,

que son liberados al medio de cultivo. Así, durante las 24 y 48 horas siguientes se

recogen los sobrenadantes celulares que contendrán los lentivirus de HO-1 (LV-HO-1),

se centrifugan a 700 x g durante 10 minutos a 4ºC, se filtran a través de membranas

con un tamaño de poro de 45 μM y se congelan a -80ºC. En paralelo, y por el mismo

procedimiento se produjeron lentivirus con los plásmidos psPAX2 y pMD2G, sin el gen

de HO-1, los cuales reciben el nombre de lentivirus vacíos (LV-) y que se utilizan como

controles negativos (Figura 24).

Figura 24: Esquema del protocolo de transfección

de los componentes del LV en células HEK 293T

Una vez obtenido el stock viral, y para llevar a cabo estas infecciones en nuestras

células, se siembran los sinoviocitos en placas Petri de 10 cm de diámetro o bien en

microcámaras de tipo Chamber SlideTM de 4 pocillos. Una vez alcanzada una

confluencia de alrededor del 70% se procede a infectarlos con las alícuotas de LV HO-1

y LV (-) durante 24 horas en un incubador a 37ºC, con atmósfera controlada al 5% CO2

+ ADN plásmidos + CaCl2 +HeBS

24 h

Eliminar precipitados

fosfato cálcico

Producción LV HO-1 o LV (-)

Stock LV HO-1 o LV (-)

HEK 293T 24 h 24 h


103

y 95% de humedad. Transcurrido este período, se realiza un cambio de medio con

DMEM/HAM F12 completo y se mantienen en reposo durante 48 horas, tras lo cual se

procede a la estimulación con IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas, como se

esquematiza en la Figura 25.

Figura 25: Esquema del protocolo de transducción de LV en sinoviocitos OA

0 horas 24 horas 48 horas 72 horas

Infección Cambio medio Estímulo Recoger células

LV HO-1 y LV (-) (DMEM/HAM F12 completo) (IL-1β) y sobrenadantes


104

4.3) Técnicas experimentales

4.3.1) Ensayo de viabilidad celular mediante la exclusión de azul tripán

Uno de los métodos más utilizados para determinar la viabilidad de los cultivos o la

toxicidad de los compuestos ensayados es el basado en la exclusión del azul tripán. En

éste, se determina la capacidad de las células vivas de expulsar dicho colorante, de

modo que no adquieren tinción alguna. En cambio, las células con una viabilidad

reducida quedan teñidas de azul al ser incapaces de expulsarlo.


Los sinoviocitos OA se siembran en placas de 24 pocillos y se incuban con los

correspondientes estímulos y productos (ver apartado 4.2.1) durante 24 horas. Tras

descartar los sobrenadantes y realizar varios lavados con PBS, procedemos a despegar

las células de las placas con una solución de tripsina, tal y como se ha indicado en el

apartado 4.1.2. La suspensión de células obtenida para cada tratamiento, después de

lavarla varias veces por centrifugación a 500 x g durante 5-6 minutos, se resuspende en

DMEM completo. A continuación se toma una pequeña alícuota de ésta y se le añade,

en relación 1:1 (v/v), una solución de azul tripán al 4% en suero fisiológico, que se lleva

a la cámara de Neubauer, donde se realiza el contaje de las células viables. La

viabilidad de las células no tratadas se considera del 100%, y a partir de ésta se

calculan los % de viabilidad o toxicidad de los distintos compuestos ensayados,

considerando unos niveles de toxicidad aceptables siempre que no superen el 15% (ver

datos recogidos en la Tabla 3).

Tabla 3: Relación del % viabilidad de los estímulos/productos

ESTÍMULOVIABILIDAD

(%) ESTÍMULO

VIABILIDAD

(%) ESTÍMULO

VIABILIDAD

(%)

(-) 100 CoPP (5 µM) 92,8±1,3 LV HO-1 98,8±0,5

IL-1β (10 ng/ml) 116,8±1,7 CoPP (10 µM) 93,5±2,8 LV HO-1+IL-1β 107,8±5,0

TNF-α (15ng/ml) 106,2±2,5 CoPP (15 µM) 86,5±2,3 LV (-) 100,8±0,1

IL-17 (15 ng/ml) 103,2±1,5 CoPP (5 µM)+IL-1β 104,2±11,6 LV (-)+IL-1β 108,2±4,8

IL-10 (15 ng/ml) 102,4±1,4 CoPP (10 µM)+IL-1β 101,5±6,1 CORM-2 (50 µM) 91,9±2,0

IL-13 (15 ng/ml) 102,3±4,8 CoPP (15 µM)+IL-1β 103,5±8,3 CORM-2 (100 µM) 92,9±2,5

HMGB1 (15 ng/ml) 102,6±0,9 siRNA HO-1 83,6±4,6 CORM-2 (200 µM) 91,7±1,2

HMGB1 (25 ng/ml) 96,9±3,2 siRNA HO-1+IL-1β 97,9±4,5 CORM-2 (50 µM)+IL-1β 115,5±14,2

HMGB1 (15 ng/ml)+IL-1β 104±3,1 siRNA HO-1+CoPP(10 µM)+IL-1β 99,8±12,3 CORM-2 (100 µM)+IL-1β 105,3±11,3

HMGB1 (25 ng/ml)+IL-1β 101±2,9 siRNA control+CoPP(10 µM)+IL-1β 91,8±0,6 CORM-2 (200 µM)+IL-1β 103,5±8,3

RuCl3(200 µM) 87,8±1,0

RuCl3(200 µM)+IL-1β 88,9±4,1


105

4.3.2) Ensayo de proliferación celular por el método del MTT

Para determinar la capacidad proliferativa de los sinoviocitos OA en función de los

tratamientos aplicados, hemos llevado a cabo el test colorimétrico del MTT, cuya base

es la rotura del bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazol (MTT), que es

una sal de tetrazolio de color amarillo que al ser reducida por la enzima mitocondrial

succinato-tetrazolio reductasa, da lugar a formazán, de color púrpura. La cantidad de

formazán se correlaciona directamente con el número de células metabólicamente

activas del cultivo (Gross y Levi, 1992).


Se siembran los sinoviocitos en placas de 24 pocillos y una vez alcanzada la

confluencia se estimulan con los estímulos/productos descritos en el apartado 4.2.1

durante 24 horas. Trascurrido este tiempo, y tras descartar el sobrenadante, se añade

la solución de trabajo de MTT (dilución 1/11 a partir de una madre de 5mg/mL de MTT

en PBS) durante 1 hora. Tras retirar el MTT se añade DMSO, que contribuye a

solubilizar los cristales de formazán previamente formados y se determina la

absorbancia a 490 nm en el fluorímetro Víctor 3TM V1420 Multilabel Counter a 490 nm.

El valor promedio de la absorbancia de las células no tratadas se considera una

proliferación basal (100%), a partir del cual se calculan los efectos de los distintos

compuestos/estímulos sobre la proliferación celular.

Figura 26: Esquema de la reacción de rotura del MTT

CH3

N-N+

NN

NCH3

S

Br-

CH3

N-N+

NN

NCH3

S

Br-

MMTTTT FFOORRMMAAZZÁÁNN

N

N

CH3

HN

N

N

CH3


106

4.3.3) Ensayo de migración-quimiotaxis

Con el objetivo de determinar los cambios en la capacidad quimiotáctica de los

sinoviocitos en función de los diferentes estímulos y productos utilizados, llevamos a

cabo un ensayo de migración-quimiotaxis, cuyo fundamento reside en la capacidad de

migración de las células de un compartimento a otro, a través de una membrana con

un tamaño de poro adecuado.


El ensayo de quimiotaxis se lleva a cabo en placas de cultivo de 12 pocillos a las que

se les añade los insertos, de un tamaño de poro de 8 μm (BD Biosciences,

Erembodegem, Bélgica), de modo que se crean dos compartimentos por cada pocillo,

el superior y el inferior. Se siembran 30.000 sinoviocitos en 200 μL de DMEM/HAM F12

completo en la parte superior de cada inserto, mientras que en la parte inferior se

añade medio acondicionado con CoPP (10 μM), CORM-2 (50-200 μM) o LV HO-1, en

presencia o ausencia del estímulo IL-1β (10 ng/mL), procedente de placas de 6 pocillos

estimuladas con dichos productos durante 24 horas. Las células se mantienen en

cultivo en un incubador a 37ºC, con atmósfera controlada al 5% de CO2 y 95% de

humedad durante 24 horas, período en el cual se producirá la migración de las células

desde el compartimento superior hacia el inferior. Trascurrido este período, se

separan los insertos y después de varios lavados con PBS, las células que han migrado

al compartimento inferior se fijan con formalina al 4% y se tiñen con hematoxilina-

eosina durante aproximadamente 30 segundos. Finalmente, se toman imágenes de 6-8

campos por pocillo con el microscopio Nikon Eclipse TE200-S (Nikon Instruments

Europe, Amstelveen, Países Bajos), en los que se realiza un contaje de las células

presentes.

Figura 27: Esquema del protocolo de migración

30.000 Sinoviocitos

Membrana

8µm poro

Medio acondicionado CoPP/CORM-2/LV HO-1±IL-1β

24 horas Formalina 4%

Hematoxilina-eosina

Contaje de

células


107

4.3.4) Determinación del estrés oxidativo

La medida del estrés oxidativo se ha llevado a cabo utilizando la molécula no

fluorescente dihidrorrodamina 123, la cual, en presencia de especies reactivas del

oxígeno, se oxida dando lugar al compuesto fluorescente rodamina 123 (485 nm de

longitud de onda de excitación y 534 nm de emisión). De este modo, la cantidad de

fluorescencia que se detecte en las células será proporcional a la cantidad de especies

reactivas del oxígeno y, por consiguiente, al estrés oxidativo.

Figura 28: Esquema de la reacción de oxidación de la dihidrorrodamina 123


Sembramos 20.000 sinoviocitos por pocillo en microcámaras de tipo Chamber

SlideTM de 8 pocillos, que mantenemos en cultivo hasta que alcancen una confluencia

de alrededor del 80%. Llegado este momento, se sustituye el medio de las células por

DMEM completo sin rojo fenol (SIGMA-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.), para evitar

posteriores interferencias con la rodamina. Tras varios lavados con este medio, se

añade una solución 5 μM de dihidrorrodamina 123 (SIGMA-Aldrich, St. Louis, MO,

EE.UU.) durante 15 minutos a 37ºC. A continuación, después de lavar las células varias

veces se añaden los estímulos y productos (apartado 4.2.1), que se mantienen en

cultivo durante 30 minutos. Trascurrido este tiempo, se monta la preparación en

O NH2

COOCH3

H2N

O NH2

COOCH3

H2N+Cl-

DDIIHHIIDDRROORRRROODDAAMMIINNAA 112233 RROODDAAMMIINNAA 112233

RROODDAAMMIINNAA

ROS

O NH2

COOCH3

H2N+Cl-


108

medio de montaje fluorescente (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.). Para la

determinación de la fluorescencia se lleva la placa al citómetro de barrido láser Laser

Scanning Cytometer (LSC) Bx50 Compucyte Olympus (Compucyte, Cambridge, MA,

EE.UU.), que realiza un contaje de los eventos fluorescentes presentes en cada pocillo.

El análisis estadístico se lleva a cabo mediante el programa Win Cyte 2.1 (Compucyte,

Cambridge, MA, EE.UU.). Otra opción consiste en visualizar las células en el

microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E600FN (Nikon Instruments Europe,

Amstelveen, Países Bajos), utilizando el sistema Nikon ACT1 para la captura,

almacenamiento y procesamiento de las imágenes, con las que poder realizar un

contaje de las células positivas a la tinción con rodamina 123.

4.3.5) Determinación de PGE2 por radioinmunoensayo

Para determinar la producción de PGE2 se realiza un radioinmunoensayo (RIA) de

tipo competitivo en el que se utiliza PGE2 marcada con tritio [3H]. El principio básico de

este RIA es la competencia entre la PGE2 presente en la muestra a ensayar y una

cantidad fija de la misma marcada radiactivamente, por un número limitado de sitios

de unión al anticuerpo anti-PGE2. De esta forma, cuanto mayor sea la concentración de

PGE2 en la muestra, menor será la cantidad de PGE2 radiactiva que se unirá al

anticuerpo, lo que se traducirá en menores niveles de radiactividad en la muestra. La

PGE2 que no se haya unido al anticuerpo se separa de la que se ha unido gracias al

dextrano recubierto de carbón activo por centrifugación. El complejo formado entre la

PGE2 radiactiva y el anticuerpo se cuantifica mediante un contador de centelleo beta

(Moroney y cols, 1988).


Para realizar este experimento se siembran los sinoviocitos en placas de 6 pocillos y

una vez alcanzada la confluencia se estimulan con los estímulos o productos descritos

en el apartado 4.2.1 durante 24 horas, tras lo cual, se recogen los sobrenadantes y se

centrifugan para eliminar cualquier célula que pudiera quedar. Las muestras a analizar


109

y la curva patrón de PGE2 se diluyen convenientemente en unos tampones específicos

de RIA de PGE2, tampón A1 [NaH2PO3 x 2H20 1,19 g/L, Na2HPO4 4,6 g/L, albúmina

sérica bovina (BSA) y azida sódica 0,1%)] y tampón B1 (tampón A1 con 9 g/L de NaCl).

A continuación se añade el anticuerpo anti-PGE2 (SIGMA-Aldrich, St. Louis, MO,

EE.UU.) y la [3H]PGE2 (GE Healthcare Life Sciences, Barcelona, España) y se incuba

durante 16-24 horas a 4ºC, tiempo necesario para favorecer la unión de la PGE2

presente en las muestras al anticuerpo. Transcurrido este tiempo se añade una

suspensión de carbón activo-dextrano, se agitan los tubos, se dejan reposar durante 10

minutos a 4ºC y se centrifugan a 1000 x g durante 15 minutos a 4ºC de manera que la

PGE2 no unida al anticuerpo precipitará. Finalmente, se recogen los sobrenadantes, se

les añaden 3 mL de líquido de centelleo Optiphase Supermix (Perkin Elmer, Waltham,

MA, EE.UU.) y se determina la concentración de PGE2 radiactiva utilizando el contador

de centelleo Microbeta Trilux (Wallac, Turku, Finlandia).

4.3.6) Determinación de proteínas por ELISA

Del inglés Enzyme Linked Immunosorbent Assay, esta técnica se basa en la detección

de un antígeno inmovilizado en una fase sólida mediante el empleo de anticuerpos,

que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto puede ser

cuantificado espectrofotométricamente.


En la mayor parte de los ELISAs utilizados la muestra de partida han sido los

sobrenadantes celulares. Para ello, se recogen los sobrenadantes procedentes de

placas de 6 pocillos, convenientemente estimulados con los estímulos/productos

descritos en el apartado 4.2.1 durante 24 horas, se centrifugan a 10.000 x g durante 5

minutos para eliminar cualquier resto celular que pudiera interferir y se procede a la

determinación de la proteína de interés siguiendo las instrucciones proporcionadas por


110

los correspondientes fabricantes. En cualquier caso, la densidad óptica se leyó en el

espectrofotómetro Víctor 3TM V1420 multilabel counter.

La cuantificación de la actividad agrecanasa se llevó a cabo con el Sensitive

Aggrecanase Activity ELISA, que consta de 2 partes. En primer lugar, se incuban los

sobrenadantes con una solución que contiene agrecano, de manera que las

agrecanasas (ADAMTS-1, -4 y -5) presentes en las muestras escindirán las moléculas

agrecano, dando lugar a péptidos ARGSVIL, cuantificables en la segunda parte del

ELISA mediante una reacción colorimétrica como las descritas anteriormente. Las

muestras de partida de este ELISA fueron sobrenadantes tratados con CoPP y

estimulados en presencia o ausencia de IL-1β durante 24 horas.

Para la determinación de la fosforilación de la proteína inhibidora IĸBα utilizamos el

kit K-LISATM IKKβ Inhibitor screening kit (Calbiochem EMD Bioscience, Darmstadt,

Alemania), en el que en una primera etapa, a través de una reacción enzimática se

produce la fosforilación de IĸBα, que será cuantificado en una etapa posterior

mediante un ELISA colorimétrico. En este caso, como muestras de partida se utilizaron

extractos citoplasmáticos de células estimuladas con CoPP o CORM-2, en presencia o

ausencia de IL-1β durante 30 minutos (ver apartado 4.3.8 para la obtención de la

fracción citosólica).

Finalmente, con objeto de estudiar la unión al ADN de los factores de transcripción

NF-ĸB, Nrf2 y AP-1 utilizamos los kits Trans AMTM para NF-ĸB, Nrf2 y AP-1

respectivamente (Active Motif, Rixensart, Bélgica), en los que las muestras de partida

fueron los extractos nucleares (ver apartado 4.3.8 para la obtención de estos

extractos), convenientemente estimulados con los estímulos/productos detallados en

el capítulo 4.2.1 durante 1 hora.

Los ELISAs utilizados, así como su grado de sensibilidad y el fabricante se recogen en

la siguiente tabla:


111

Tabla 4: Relación de sistemas ELISA utilizados

ELISA SENSIBILIDAD FABRICANTE

Actividad Agrecanasa 2 pM MD Bioscience (Zurich, Suiza)

AP-1 - Active Motif Europe (Rixensart, Bélgica)

CCL2 7 pg/mL eBioscience (San Diego, CA, EE.UU.)

CCL20 0,47 pg/mL R&D Biosystems (Abingdon, Reino Unido)

Fosforilación IĸBα - Calbiochem EMD Bioscience (Darmstadt, Alemania)

HMGB1 0,2 ng/mL Ibl Hamburg (Hamburg, Alemania)

IL-6 2 pg/mL eBioscience (San Diego, CA, EE.UU.)



MMP-1 8 pg/mL Anaspec Inc. (San José, CA, EE.UU.)

MMP-3 0,3 ng/ml RayBiotech (Norcross, GA, EE.UU.)

MMP-9 10 pg/mL RayBiotech (Norcross, GA, EE.UU.)

MMP-13 6 pg/mL Anaspec Inc. (San José, CA, EE.UU.)

NF-ĸB - Active Motif Europe (Rixensart, Bélgica)

Nrf2 - Active Motif Europe (Rixensart, Bélgica)

Pro-MMP-13 7,7 pg/mL R&D Systems Inc. (Minneapolis, MN, EE.UU.)

TNF-α 4 pg/mL eBioscience (San Diego, CA, EE.UU.)

4.3.7) Determinación de la actividad MMP

La actividad de distintas MMPs (MMP-1,-2,-3,-7,-9,-12 y -13) producidas por los

sinoviocitos se ha determinado según el método descrito por Guillén y cols, basado en

la utilización del péptido QXL520TM-γ-Abu-Pro-Cha-Abu-Smc-His-Ala-Dab (5-FAM)-Ala-

Lys-NH2 (FRET 5-FAM/QXLTM520), (Guillén y cols, 2008a). Cuando este péptido está

intacto, la fluorescencia proporcionada por la molécula 5-FAM está contrarrestada por

el inhibidor de fluorescencia QXLTM520 por medio de una reacción de transferencia de

energía mediante resonancia de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés


112

fluorescence resonance energy transfer). En presencia de MMPs, este complejo se

disocia en dos fragmentos, con lo que la molécula 5-FAM es capaz de emitir

fluorescencia, que será proporcional a la actividad MMP de las muestras a ensayar.

Figura 29: Esquema de la proteolisis del péptido FRET 5-FAM/QXLTM52


Para llevar a cabo esta técnica, se siembran los sinoviocitos en placas de 6 pocillos o

bien en placas Petri de 10 cm de diámetro. Una vez alcanzada la confluencia se

estimulan con los productos/estímulos descritos en el apartado 4.2.1 durante 24

horas, tras lo cual, se recogen los sobrenadantes y se centrifugan. La activación de las

MMPs presentes en los mismos se induce por tratamiento con acetato de p-

aminofenilmercurio (APMA) a la concentración final 1mM durante 6,5 horas a 37 ºC.

Pasado este tiempo se toman alícuotas de los sobrenadantes y se llevan a una placa de

fluorescencia de 96 pocillos, donde se les añade el sustrato FRET 5-FAM/QXLTM520

(Anaspec Inc, San José, CA, EE.UU.). Las MMPs activas presentes en las muestras a

ensayar separan a 5-FAM de su inhibidor, emitiendo así fluorescencia que se

determina en el espectrofotómetro Víctor 3TM V1420 multilabel counter a 490 nm de

excitación y 520 nm de emisión.

PÉPTIDO FRET

MMPs

+

5-FAM 5-FAM

QXLTM520

QXLTM520


113

4.3.8) Evaluación de la expresión de proteínas por Western Blot

El principio básico del Western Blot consiste, como sabemos, en la separación

electroforética de proteínas en función de su tamaño molecular sobre un gel de

poliacrilamida después de establecer una diferencia de potencial y en su posterior

transferencia a una membrana mediante la aplicación de un campo eléctrico, tras lo

cual, empleando anticuerpos específicos, se puede detectar la proteína de interés

mediante una reacción de quimioluminiscencia.


Para realizar este experimento se siembran los sinoviocitos en placas de 6 pocillos o

bien en placas Petri de 6 ó 10 cm de diámetro. Una vez alcanzada la confluencia se

estimulan con los estímulos/productos descritos en el apartado 4.2.1. En la mayor

parte de nuestros experimentos se trabaja con estímulos de 24 horas, aunque en

algunos casos es necesario trabajar a tiempos más reducidos si la proteína que

pretendemos analizar presenta una cinética de aparición más rápida, como ocurre en

el caso de las MAPK y de la translocación de p65, en las que se trabaja con estímulos

más reducidos (5 minutos y 1 hora respectivamente).

Una vez trascurrido el tiempo de estímulo, se recogen los sobrenadantes celulares,

se centrifugan y se conservan a -80ºC hasta su posterior utilización para la

determinación de mediadores solubles, mientras que las células se lavan varias veces

con PBS frío y se tratan con un tampón de lisis (20 mM NaCl, 25 mM Tris, 1% Tritón X-

100 y 1% ácido deoxicólico a pH 7,4) durante 10 minutos a 37ºC, tras lo cual, se

recogen los lisados celulares obtenidos, se centrifugan a 10.000 x g durante 15 minutos

a 4ºC y se valora la cantidad de proteína en cada lisado de acuerdo con el método

descrito por Bradford (Bradford, 1976), utilizando el kit comercial de determinación de

proteínas Bio-Rad Dc Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, CA, EE.UU.), método

adaptado para muestras solubilizadas en tampones que contienen altas

concentraciones de detergentes.


114

Con el objetivo de estudiar proteínas de localización nuclear y citoplasmática, se ha

llevado a cabo la extracción de las células utilizando el kit comercial Nuclear Extract Kit

Active Motif, siguiendo las instrucciones del fabricante (Active Motif Europe, Rixensart,

Bélgica). Brevemente, las células se recogen en 1,5 mL de PBS-frío suplementado con

inhibidores de fosfatasas para evitar ulteriores modificaciones en las proteínas y se

centrifugan a 500 rpm durante 5 minutos a 4ºC. El pellet obtenido se resuspende en un

tampón hipotónico que debilitará las membranas, tras lo cual se añade un detergente

y se centrifuga a 14.000 x g durante 30 segundos a 4ºC, lo que provocará la liberación

de las proteínas citosólicas al sobrenadante. Una vez separada esta fracción, se

resuspende el pellet obtenido en un tampón de lisis suplementado con inhibidores de

proteasas y se mantiene durante 30 minutos en agitación constante a 4ºC, proceso

que favorecerá el lisado de los núcleos y la solubilización de las proteínas nucleares.

Tras centrifugar estos lisados a 14.000 x g durante 10 minutos a 4ºC, se cuantificarán

las proteínas nucleares presentes en el sobrenadante y también las proteínas

citosólicas obtenidas previamente con el kit comercial descrito anteriormente.

Dada su localización microsomal, para determinar la expresión de la enzima mPGES-

1 resulta necesario extraer dicha fracción, para lo cual, una vez lavadas las células con

PBS frío, se rascan con 300 µL por pocillo de tampón A [Tris-HCl 20 mM ph 7,8, KCl 10

mM, EGTA 1mM, ditiotreitol (DTT) 1mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 1mM,

NaF 5mM, Na3V04 1mM, Na2Mo4 10 mM, aprotinina 4 µg/mL y leupeptina 10 µM] y se

sonican con un sonicador Vibra Cell (Sonics and Materials Inc., Newtown, CT, EE.UU.)

con el objetivo de lisarlas. Los lisados obtenidos se centrifugan a 10.000 x g durante 15

minutos a 4ºC, tras lo cual se recogen los sobrenadantes y se llevan a la ultracentrífuga

OptimaTM MAX Ultracentrifuge (Beckman Coulter, Fullerton, CA, EE.UU.) a 55.000 x g

durante 70 minutos. El pellet obtenido, que representa la fracción microsomal, se

resuspende en tampón A y se cuantifican las proteínas con el kit descrito previamente.

A los lisados obtenidos (totales, nucleares, citosólicos y microsomales) se les añade

tampón de carga de LaemmLi, compuesto por ditiotreitol (DTT) al 10%, sodio

dodecilsulfato (SDS) al 4%, Tris-HCl 125mM a pH 6,8, glicerol al 20% y azul de

bromofenol al 0,004%, en relación 1:1 (v:v), tras lo cual se hierven durante 5 minutos.


115

Idénticas cantidades de proteínas (12,5-20 µg según la proteína de estudio) se

separan en función de su peso molecular, aplicando una diferencia de potencial

constante de 100-120V durante aproximadamente 2 horas. Posteriormente, las

proteínas se transfieren electroforéticamente a una membrana de polivinilideno

difluoruro (PVDF, GE Healthcare Life Sciencies, Barcelona, España), utilizando para ello

el sistema de transferencia semi-seco Trans-Blot Semi-dry Cell (Bio-Rad Laboratories,

CA, EE.UU.), con intensidad corriente de 125 mA constante durante 2 horas. A

continuación se trata la membrana con leche desnatada al 3% en tampón PBS-Tween-

20 0,1% durante 1 hora a temperatura ambiente con suave agitación para bloquear

posibles sitios de unión inespecíficos. Posteriormente se incuba con los

correspondientes anticuerpos específicos (ver condiciones de utilización en la tabla 5)

durante el tiempo necesario. A modo de control interno, y para normalizar las posibles

diferencias entre la cantidad de proteína de las muestras, se ha evaluado la expresión

de la proteína β-actina en el citosol y el antígeno nuclear de células en proliferación

(PCNA) en el núcleo, cuya expresión no debería verse modificada por los diferentes

tratamientos. Tras los correspondientes lavados, se incuba la membrana con la

inmunoglobulina IgG de cabra anti-conejo acoplada a peroxidasa de rábano (IgG

Polyclonal Goat anti-Rabbit immunoglobulin HRP, DAKO, Copenhagen, Dinamarca),

durante 45 minutos en dilución 1:5000. Finalmente, las bandas se visualizan mediante

un sistema de quimioluminiscencia ECL (GE Healthcare Life Sciences, Barcelona,

España) basado en la oxidación del luminol, reacción catalizada por la peroxidasa en

presencia de H2O2, lo que provoca la excitación del mismo con la consiguiente emisión

de luz. La digitalización de la imagen se realiza con el sistema computerizado de

revelado AutochemiTM System, que utiliza el programa LabworksTM 4.6 para la

adquisición y análisis de imágenes.


116

Figura 30: Esquema del protocolo de obtención de

extractos totales, nucleares, citosólicos y microsomales

Sinoviocitos + Citocinas/HMGB1/CoPP/CORM-2

100 µL tampón lisis 10.000 x g/15 min/ 4ºC

1,5 mL PBS/ inhibidores fosfatasas 500 rpm/5 min/ 4ºC

50 µL tampón isotónico/ 15 min/ hielo 5 µL detergente/ Vórtex 10 s

14.000 x g / 30 s / 4ºC

50 µL tampón lisis/ Vórtex 10s 30 min/ 4ºC / agitación

14.000 x g / 10 min / 4ºC

300 µL tampón A Sonicar 3 ciclos

10.000 x g/15 min/ 4ºC

55.000 x g /70 min/ 4ºC

10.000 x g /5 min/ 4ºC

EXTRACTO NUCLEAR

t

e

EXTRACTO CITOSÓLICO

te

EXTRACTO MICROSOMAL

te

EXTRACTO TOTAL

te

CÉLULAS

t

e

DETERMINACIÓN MEDIADORES

SOLUBLES

te

SOBRENADANTE

te

DETERMINACIÓN PROTEÍNAS BRADFORD

te


117

Tabla 5: Relación de anticuerpos primarios y condiciones de utilización

ANTICUERPO DILUCIÓN TIEMPO/TEMPERATURA FABRICANTE

β-ACTINA 1/1000 2h

Temperatura ambiente SIGMA-Aldrich

(St Louis, MO, EE.UU)

Akt 1/500 16h / 4ºC Cell Signaling

(Beverly, MA, EE.UU.)

Akt fosforilado 1/500 16h / 4ºC Cell Signaling


COX-2 1/1000 2h

Temperatura ambiente Cayman Chemical Company

(Ann Arbor, MI, EE.UU.)

ERK 1/2 1/500 16h / 4ºC Cell Signaling


ERK 1/2 fosforilado 1/500 16h / 4ºC Promega

(Madison, WI, EE.UU.)

HMGB-1 1/500 16h / 4ºC Upstate Cell Signaling

(Lake Placid, NY, EE.UU.)

HO-1 1/1000 2h

Temperatura ambiente Stressgen

(Ann Harbor, MI, EE.UU.)

JNK 1/2 1/500 16h / 4ºC Cell Signaling


JNK 1/2 fosforilado 1500 16h / 4ºC Promega


mPGES-1 1/200 16h / 4ºC Cayman Chemical Company

(Ann Arbor, MI, EE.UU.)

p-38 1/500 16h / 4ºC Promega


p-38 fosforilado 1/500 16h / 4ºC Promega


p65 1/200 16h / 4ºC Santa Cruz Biotechnology Inc.

(Santa Cruz, CA, EE.UU)

PCNA 1/500 2h

Temperatura ambiente Serotec

(Dusseldorf, Alemania)

RAGE 1/500 2h

Temperatura ambiente Anaspec

(San José, CA, EE.UU.)

4.3.9) Evaluación de la expresión de proteínas por inmunocitoquímica

El fundamento de la inmunocitoquímica se basa en la detección de antígenos

presentes en células mediante una reacción antígeno-anticuerpo y ha sido utilizada


118

tanto para la caracterización fenotípica de los sinoviocitos utilizados en los diferentes

pases, como para la evaluación de la expresión de diferentes proteínas a lo largo de los

distintos pases o subcultivos.


Se siembran los sinoviocitos en microcámaras de 8 pocillos de tipo Chamber SlideTM

y se mantienen en cultivo con DMEM/HAM F12 completo durante 48 horas. A

continuación, tras descartar el sobrenadante y lavar las células con PBS frío, se fijan

con paraformaldehido al 4% durante 15 minutos. Tras realizar varios lavados, se

incuban durante 5 minutos con una solución bloqueante de peroxidasas (DAKO,

Copenhagen, Dinamarca) para inactivar la actividad peroxidasa endógena de nuestras

células. Trascurrido este tiempo, se bloquean las uniones inespecíficas con suero de

cabra (SIGMA Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) en dilución 1:5 en PBS, durante 30

minutos.

Para la caracterización de los sinoviocitos se han utilizado anticuerpos dirigidos a

marcadores específicos de este tipo de células, como colágeno tipo I, marcador de

fibroblastos y CD68, marcador exclusivo macrófagos. También se ha evaluado la

presencia/ausencia de células CD31+ como marcador de células endoteliales y

neutrófilos, así como de PCNA, marcador de proliferación celular. Finalmente se ha

evaluado la expresión de la enzima HO-1 en estas células (ver condiciones de

utilización de los anticuerpos en la Tabla 6). En paralelo se han realizado controles

negativos a los que no se les añade anticuerpo primario. A continuación se incuban las

células durante 1 hora con los correspondientes anticuerpos secundarios acoplados a

peroxidasa, IgG de cabra anti-conejo acoplada a peroxidasa de rábano (IgG Polyclonal

Goat anti-Rabbit immunoglobulin HRP, DAKO, Copenhagen, Dinamarca), para los

anticuerpos primarios policlonales o con la inmunoglobulina IgG de cabra anti-ratón

acoplada a peroxidasa de rábano (Anti-mouse IgG-peroxidase produced in goat,

procedente de SIGMA-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) en el caso de los anticuerpos

monoclonales. Tras ello se añade el sustrato cromógeno para la peroxidasa

diaminobencidina (DAB), procedente de DAKO, Copenhagen, Dinamarca, que produce

un precipitado de color marrón. Finalmente se contrastan las células con una solución


119

de hematoxilina/eosina, se montan en medio de montaje acuoso (DAKO, Copenhagen,

Dinamarca) y se observan las imágenes con un microscopio Nikon Eclipse E600FN

(Nikon Instruments Europe, Amstelveen, Países Bajos), utilizando el programa Nikon

ACT1 para la captura, almacenamiento y procesamiento de las imágenes.



CD-68 1:20 2h/temperatura ambiente Master Diagnostica (Granada, España)

CD-31 1:20 2h/temperatura ambiente DAKO (Copenhagen, Dinamarca)

COLÁGENO I 1:20 2h/temperatura ambiente Chemicon (Millipore Iberica, Madrid, Spain)

HO-1 1:20 2h/temperatura ambiente Stressgen (Ann Harbor, MI, EE.UU.)

PCNA 1:20 2h/temperatura ambiente Serotec (Dusseldorf, Alemania)

4.3.9.1) Inmunofluorescencia

Una variante de la inmunocitoquímica es la inmunofluorescencia, en la que, en

lugar de utilizar anticuerpos acoplados a sistemas enzimáticos de detección, se

emplean anticuerpos conjugados a fluorocromos, moléculas que al ser excitadas con

energía de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energía de una

longitud de onda mayor.


Para realizar esta técnica se siembran los sinoviocitos en microcámaras de 4 u 8

pocillos de tipo Chamber SlideTM y se mantienen en DMEM/HAM F12 completo

durante 48 horas, tras lo cual se tratan con CoPP/CORM en presencia de IL-1β (10

ng/mL) a distintos tiempos en función de la proteína a analizar o bien se procede a

infectarlos con LV, en presencia o ausencia de IL-1β, de acuerdo con lo descrito en el

apartado 4.2.3 durante 24 horas. Trascurrido el período de estimulación, y tras varios


120

lavados con PBS frío, se fijan las células con formalina al 4% durante 15 minutos. En los

experimentos de translocación de proteínas, permeabilizamos las células con una

solución de nonidet p40 al 0,25% durante 10 minutos. A continuación, tras varios

lavados se incuban las células con los anticuerpos primarios (ver condiciones de

utilización en la Tabla 7) y sus correspondientes anticuerpos secundarios fluorescentes,

Alexa Fluor 488 de cabra frente a IgG de ratón y R-ficoeritrina de cabra frente a IgG de

conejo (ambos de Invitrogen, Barcelona,España) y a continuación se añade una

solución 4´, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS (dilución 1/1000) durante 10

minutos en oscuridad, que provocará el contraste de los núcleos por la unión de las

moléculas de DAPI al ADN de las células. Finalmente se monta en medio de montaje

fluorescente (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) y se observa en el

microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E600FN (Nikon Instruments Europe,

Amstelveen, Países Bajos), utilizando el sistema Nikon ACT1 para la captura,

almacenamiento y procesamiento de las imágenes.



FLAG 1.400 2h/temperatura ambiente Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE.UU.)

HMGB1 1:50 2h/temperatura ambiente Upstate (Lake-Placid, NY, EE.UU.)

HO-1 1:20 2 h/temperatura ambiente Stressgen (Ann Harbor, MI, EE.UU.)

p65 1:50 2 h/37ºC Santa Cruz Biotechnology Inc.

(Santa Cruz, CA, EE.UU.)

4.3.10) PCR cuantitativa a tiempo real

La reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés

(Polymerase Chain Reaction), es una técnica basada en la obtención de múltiples

copias de un fragmento de ADN específico partiendo de una mínima cantidad de éste,


121

por acción de la ADN-polimerasa, enzima capaz de sintetizar una cadena de ADN

complementaria a otra ya existente. En nuestros experimentos llevamos a cabo una

RT-PCR, en la que, en una primera etapa se retrotranscribe el ARN de partida en ADNc,

que es el sometido en una segunda etapa al proceso de PCR.

4.3.10.1) Extracción de ARN


El ARN de los sinoviocitos se ha extraído con el reactivo Tripure de acuerdo con las

instrucciones del fabricante (Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Para ello

se siembran los sinoviocitos en placas Petri de 10 cm de diámetro. Una vez alcanzada

la confluencia se estimulan con CoPP, CORM-2 o HMGB1, en presencia o ausencia del

estímulo IL-1β, según descrito en el apartado 4.2.1 o bien se procede a infectarlos con

LV (apartado 4.2.3), durante 16 horas. Trascurrido este período, y tras varios lavados

con PBS estéril frío, se añade 1 mL de Tripure por placa y con la ayuda de unos

rascadores estériles planos se lisan las células. El lisado obtenido se trasvasa a tubos

eppendorf de 2 mL libres de ARN-asas y se le añaden 200 μL de cloroformo por tubo,

que se dejan reposar 5 minutos a temperatura ambiente y a continuación se

centrifugan a 12.000 x g durante 15 minutos a 4ºC, de manera que la mezcla se separa

en tres fases: una acuosa, que contiene el ARN, una interfase que contiene el ADN y

una fase orgánica con proteínas. La fase acuosa se trasvasa a otro tubo y se le añade

isopropanol, en relación 1:1 (v:v), se deja 10 minutos a temperatura ambiente y se

centrifuga a 12.000 x g durante 15 minutos a 4ºC, lo que provocará la precipitación del

ARN. Tras descartar el sobrenadante, el precipitado obtenido se lava con una mezcla

de EtOH/H20 DEPC en relación 75:25 (v:v) por centrifugación a 12.000 x g durante 10

minutos a 4ºC, tras lo cual se deja secar el pellet a temperatura ambiente, se

resuspende en 30 µL de H20 DEPC y se determina la densidad óptica a 260 nm en el

espectrofotómetro GeneQuant (GE Healthcare Life Sciencies, Barcelona, España),

utilizando capilares de cuarzo y teniendo en cuenta que 1 unidad de densidad óptica a

260 nm se corresponde con 40 μg/mL de ARN. Para cada muestra se comprueba que la

relación entre la densidad óptica a 260 nm y a 280 nm sea cercana a 2, lo que indica la

javascript:glosario(2);

javascript:glosario(2);


122

ausencia de contaminación proteica. El ARN obtenido se almacena a -80ºC hasta su

posterior utilización.

Figura 31: Esquema del protocolo de extracción de ARN

4.3.10.2) Reacción de la transcriptasa inversa

La transcriptasa inversa es una enzima de tipo ADN-polimerasa que tiene la

capacidad de sintetizar ADN complementario (ADNc) a partir de ARN, reacción que se

consigue mediante una serie de ciclos termales a distintas temperaturas, que provocan

la activación de la enzima y la consiguiente obtención del ADNc.


La reacción de la transcriptasa inversa se ha llevado a cabo con el kit comercial

Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit, siguiendo las instrucciones del fabricante

(Roche Applied Science, Manheim, Alemania). Básicamente, a tubos eppendorfs de 0,2

mL libres de ARNasas, se añaden, secuencialmente, 1 μg del ARN obtenido

previamente, un tampón específico de RT con una concentración final 8 mM de MgCl2,

una mezcla de Random Hexamers (concentración final 60 μM), 20 U de un inhibidor de

+ 1 mL Tripure

200 µL cloroformo/ 5 min/ TA 12.000 x g/ 15 min/ 4ºC

Isopropanol/10 min/TA

12.000 x g/15 min/4ºC

EtOH/H2O (75:25)

12.000 x g/10 min/4ºC

30 µL H2O DEPC


123

ARNasas, 1 mM de una mezcla de dNTPs, y 10 U de la enzima transcriptasa inversa,

completando con H20 libre de nucleasas hasta obtener un volumen final de 20 μL. A

continuación, y utilizando el termociclador iCycler Real-Time PCR Detection System

(Bio-Rad Laboratories, Madrid, España), se inicia la retrotranscripción mediante la

aplicación de un ciclo de 10 minutos a 25ºC seguido de un ciclo de 30 minutos a 55ºC.

El ADNc obtenido se almacena a -80ºC hasta su posterior utilización.

4.3.10.3) Reacción de la PCR cuantitativa a tiempo real

La reacción en cadena de la polimerasa tiene lugar por una serie de ciclos, siendo el

primero de ellos el de inicialización, en el que se produce la activación de la ADN-

polimerasa mediante un ciclo de 10 minutos a 95ºC, seguido de 36 ciclos en los que,

cada uno de ellos, consta de las siguientes etapas:

Desnaturalización, en la que se calienta el ADN que se pretende replicar a

elevadas temperaturas (15 segundos a 95ºC), con el objetivo de separar las dos

cadenas que lo conforman, de manera que cada una de estas actuará como

molde para sintetizar su cadena complementaria.

Alineamiento, en la que, por disminución de la temperatura (56ºC durante 45

segundos), se consigue la hibridación del cebador con su secuencia

complementaria del ADN.

Extensión o elongación, en la que, por acción de la ADN polimerasa, tomando el

ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador

como soporte inicial, se produce la síntesis de nuevo ADN. Las condiciones de

este ciclo son 72ºC a 45 segundos.


La PCR cuantitativa se ha llevado a cabo en placas de 96 pocillos específicas para

PCR realizándose las determinaciones por duplicado. Para cada pocillo se prepara una

mezcla de SYBR Green 2x Supermix [100 mM KCl, 40 mM Tris-HCl, pH 8,4, 0,4mM de

cada dNTP (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), 50 U/mL iTaqDNA polimerasa, 6 mM MgCl2, 20

nM SYBR green, fluoresceína y agentes estabilizadores, procedente de Bio-Rad

Laboratories, CA, EE.UU.] y de los cebadores sentido y antisentido del gen que se


124

pretende estudiar completando con H20 libre de nucleasas hasta 24 μL.

Posteriormente se pipetea 1 µL de ADNc en cada pocillo y se lleva al termociclador

iCycler Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad Laboratories, Madrid, España), donde

se somete a los ciclos descritos anteriormente.

Las secuencias de los cebadores sentido y antisentido utilizados durante la presente

Tesis Doctoral están descritas en bibliografía y se obtuvieron de Eurofins MWG Operon

(Ebersberg, Alemania). Se trata de los cebadores de HO-1 (Kasai y cols, 2000), COX-2

(Daouti y cols, 2005), IL-6 (www.realtime-primers.org), IL-8 (Muhlbauer y cols, 2004),

MMP-1, MMP-3 (Mietz y cols, 2003), MMP-13 (Boileau y cols, 2005), CCL2, CCL20

(Kwon y cols, 2002) y GAPDH (Qiagen, Madrid, España).

Para el análisis cuantitativo del producto se analiza la curva de amplificación que

consta de tres fases bien diferenciadas:

Fase de latencia, con un fondo inespecífico más o menos estable y que se

refiere a los ciclos iniciales en los que no hay cambios detectables en la

cantidad de fluorescencia, con lo que únicamente se detecta la fluorescencia

basal.

Fase exponencial, en la que la fluorescencia empieza a crecer por encima del

fondo.

Fase de saturación, en la que finaliza la reacción, lo que se traduce en la

estabilización de la fluorescencia.

Se determina inicialmente una cantidad fija de fluorescencia o threshold, que debe

ser significativamente diferente del fondo de los primeros ciclos y debe estar en la

zona de crecimiento exponencial. Una vez determinado este threshold, se determina el

ciclo en el que las muestras lo alcanzan. Este ciclo recibe el nombre de threshold cycle

o ciclo umbral (Ct) y es inversamente proporcional al ADN de partida, de modo que,

cuanto más ADN tenga la muestra, antes se alcanzará este valor, pues será menor el

número de ciclos necesarios para ello (Ct menor). Para cuantificar el resultado de la

PCR se utiliza el método ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001), basado en la comparación

directa del Ct de la diana de interés y el Ct de un gen que nos sirve de referencia, el

gen de GAPDH en concreto, cuya expresión no debería verse modificada por los

diferentes tratamientos, obteniéndose así el ΔCt de la muestra. Posteriormente se

http://www.realtime-primers.org/


125

comparan el ΔCt de la muestra analizada con el ΔCt de la muestra control, que se

corresponde con células no estimuladas en las series experimental de

HMGB1/CoPP/CORM-2 o con LV (-) en las transfecciones víricas, obteniéndose de esta

manera el ΔΔCt.

Otro resultado a analizar es la curva de fusión del producto, que se obtiene tras la

amplificación y que consiste en monitorizar la fluorescencia de las muestras a medida

que se aumenta progresivamente la temperatura en el termociclador (de 55ºC a 95ºC).

Cuando se alcanza la temperatura de fusión (Tm), es decir, cuando la doble cadena de

ADNc formada durante la PCR se separa por acción de la temperatura, se produce una

disminución en la fluorescencia porque el SYBR Green deja de estar unido al producto

de la PCR dado que presenta una mayor afinidad por dobles cadenas de ADN que por

cadenas simples del mismo. Así pues, gracias a la curva de fusión se puede discriminar

la presencia de los productos específicos de la PCR de otros productos inespecíficos o

dímeros de los cebadores, dado que los primeros presentan una Tm mayor. De esta

manera, se puede confirmar la especificidad de la reacción para cada gen estudiado.

4.3.11) Transfección transitoria de plásmidos. Ensayos de actividad

luciferasa

Los sistemas de transfección de genes son ampliamente utilizados para el estudio

de la expresión de genes y de la fisiología de células eucariotas, en concreto, para

estudiar la actividad de receptores, la activación de factores de transcripción o las vías

de señalización intracelular implicadas en un determinado proceso. En nuestro caso, se

ha transfectado el factor de transcripción NF-ĸB siguiendo las instrucciones del kit

comercial Magnetofection (OZ Biosciences, Marsella, Francia), basado en la formación

de un complejo entre el plásmido de NF-ĸB y otro plásmido que sirve como control

interno, con un vehículo que contiene partículas magnéticas que favorecen la

incorporación de ácidos nucleicos y que, en presencia de un campo magnético, facilita

la incorporación del plásmido al interior de las células.


126

Tanto el plásmido de NF-ĸB como el plásmido control se encuentran acoplados a

sendos sistemas de actividad luciferasa, la actividad luciferasa de luciérnaga (Photinus

pyralis) en el caso del plásmido de NF-ĸB y la actividad luciferasa de un coral marino, el

pensamiento de mar (Renilla reniformis), en el caso del plásmido de control. Para

medir los resultados se ha utilizado el kit comercial Dual Luciferase Reporter (Promega,

Madison, WI, EE.UU.), en el que se determinan secuencialmente la actividad luciferasa

de luciérnaga y la actividad luciferasa del coral marino. Normalizando la actividad de la

luciferasa de luciérnaga con la actividad de la luciferasa de renilla se minimiza la

variabilidad experimental ocasionada por diferencias en la viabilidad de las células o en

la eficiencia de la transfección.


Para llevar a cabo este protocolo sembramos las células en placas de 6 pocillos y

cuando presentan una confluencia de aproximadamente 70-80% se procede a iniciar el

proceso. En un tubo de polipropileno se añaden 2 μg del plásmido de NF-ĸB, (NF-ĸB)-

Luc (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), 1 μg del plásmido control pRL-TK (Promega

Corporation, Madison, WI, EE.UU.), y el vehículo Polymag (OZ Biosciences, Marsella,

Francia), convenientemente diluido en DMEM/HAM F12 sin suplementar. En otro tubo

se añaden 2 μg del control positivo MEKK (Stratagene, La Jolla, CA, EE.UU.), 2 μg del

plásmido de NF-ĸB y el vehículo Polymag diluido también en DMEM/HAM F12 sin

suplementar. Se incuban durante 35 minutos para dar lugar a la formación del

complejo entre los plásmidos y el vehículo, tras lo cual se incorpora gota a gota a las

células, previamente dispuestas sobre una placa magnética que posibilitará la

transfección. Transcurridos 40 minutos, se retiran tanto la placa como el medio en el

que se han diluido los plásmidos y se procede a estimular las células con HMGB1 en

presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas, según se ha descrito en el

apartado 4.2.1.


127

Una vez concluido el estímulo, tras descartar el sobrenadante y realizar varios

lavados con PBS frío, se lisan las células con tampón Passive Lysis Buffer (Promega,

Madison, WI, EE.UU.). A continuación, se disponen 20 μL de cada lisado en placas de

fluorescencia de 96 pocillos. La luciferasa de luciérnaga y por consiguiente, la

activación de NF-ĸB, se mide inicialmente por la adición del sustrato LARII (Promega,

Madison, WI, EE.UU.), que dará lugar a una señal luminiscente estable. Una vez

cuantificada, se interrumpe la reacción y se mide la luciferasa de la renilla y el

plásmido RL-TK por adición del sustrato Stop&Glo (Promega, Madison, WI, EE.UU.),

que produce a su vez una señal estable. Los resultados se expresan mediante la

relación de luminiscencia entre NF-ĸB y el control interno.

Figura 32: Esquema del protocolo de transfección de NF-ĸB

+ pNF-ĸB-luc

+ pRL-TK

+ Polymag

+ MEKK

+ pNF-ĸB-luc

+ pRL-TK

+ Polymag

NF-ĸB

+ 100 µL LARII

+ 100 µL STOP&GLO

Análisis de resultados Evaluación de la eficiencia de la transfección

CONTROL POSITIVO

TRANSFECCIÓN MAGNÉTICA

te

ADICIÓN DE ESTÍMULOS

te

DETERMINACIÓN pNF-ĸB

DETERMINACIÓN pRL-TK


128

4.4) Análisis estadístico y expresión de resultados

Los resultados se han expresado como media aritmética de los valores ± error

estándar de la media (ε). Los resultados obtenidos se sometieron al tratamiento

estadístico empleando el método ANOVA simple de una vía y la t de Dunnettt para

comparaciones múltiples. El método de Dunnett (Dunnett, 1964) permite comparar los

valores medios de los grupos problema respecto a un grupo control, teniendo en

cuenta el error asociado a las comparaciones múltiples. Se considera que la diferencia

entre los grupos tratados y el control es significativa cuando el valor de t obtenido es

mayor que el tabulado para un margen de confianza del 95% (p<0,05), y muy

significativa cuando es mayor del 99% (p<0,01). El símbolo (+) representa la

significatividad estadística respecto a células no estímuladas o blancos del

experimento (+ p<0,05 y ++ p<0,01), el símbolo (*) se utiliza para representar la

significatividad estadística respecto del control (* p<0,05 y ** p<0,01), mientras que el

símbolo (#) representa la significatividad estadística de células tratadas con

anticuerpos de bloqueo de los receptores de HMGB1, de células transfectadas con

siRNA HO-1 o de células tratadas con RuCl3 frente a sus controles HMGB1+IL-1β,

CoPP+IL-1β y CORM-2+IL-1β respectivamente (# p<0,05 y ## p<0,01). La ausencia de

símbolo indica que no hay diferencias significativas frente al grupo control.

5) R

esu

ltad

os

Resultados _____________________________________________________________________________

131

5.1) Caracterización de los cocultivos de sinoviocitos OA

Antes de empezar la serie experimental, caracterizamos las células objeto de

estudio en los diferentes pases, desde su obtención (suspensión inicial o Pase 0), hasta

el pase de trabajo (Pase 3), en el que hemos llevado a cabo todos nuestros

experimentos.

Está demostrado que los sinoviocitos poseen fenotipo fibroblasto y macrófago

(Revisado por Bartok y Firestein, 2010). Por ello, utilizando marcadores específicos de

fenotipo fibroblasto (colágeno I) y fenotipo macrófago (CD68), se pudo establecer la

existencia de ambos tipos celulares desde la suspensión inicial y su mantenimiento

hasta el pase de trabajo. Por tanto, nuestros cultivos son en realidad cocultivos de

sinoviocitos de fenotipo fibroblasto y fenotipo macrófago. La proporción de los

mismos, 10:1, fue similar a la habitual en condiciones fisiológicas, tal y como se

observa en la Figura 33.

Otro marcador evaluado fue CD31, marcador no específico presente en células

endoteliales y neutrófilos. Una elevada presencia de células CD31+ en los cocultivos de

sinoviocitos OA podría asociarse con una contaminación de células del infiltrado y que

se podrían arrastrar en nuestros cultivos. Nuestras imágenes indicaron sin embargo

una muy escasa presencia de células CD31+ únicamente en la suspensión inicial y no

en el Pase 3 ya que al tratarse de células no adherentes se eliminan con los sucesivos

cambios de medio.

Finalmente se determinó el grado de proliferación de los sinoviocitos en cultivo

mediante el marcador PCNA, antígeno nuclear de proliferación celular. De acuerdo con

las imágenes mostradas en la Figura 33, se observó que los niveles de PCNA fueron

similares en ambos pases, lo que indicaría que la capacidad de proliferación de los

sinoviocitos OA se mantiene en el pase de trabajo (Pase 3).

Resultados _____________________________________________________________________________

132

Figura 33: Caracterización fenotípica de los cultivos de sinoviocitos OA

Los sinoviocitos OA, procedentes de la suspensión inicial (Pase 0) y del pase de trabajo (Pase 3) se fijaron con formalina y posteriormente se trataron con anticuerpos específicos frente a Colágeno I, CD68, CD31 y PCNA tal y como se indica en la sección de Material y Métodos. Imágenes representativas de tres experimentos diferentes.

x200 x400 x200 x400 x1000

100x

Pase 0 Pase 3

PCN

A

C

D31

CD

68

Col I

Resultados _____________________________________________________________________________

133

5.2) Evaluación de la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA

5.2.1) Evaluación de la expresión de HO-1 en condiciones basales

Tras caracterizar el fenotipo de los sinoviocitos OA comprobamos la expresión de

HO-1 en estas células en condiciones basales, ya que Kobayashi y cols demostraron

previamente la presencia de esta enzima en cortes histológicos de membrana sinovial

artrítica y osteoartrítica (Kobayashi y cols, 2006). Para ello realizamos un análisis

inmunocitoquímico en sinoviocitos OA procedentes de la suspensión inicial (Pase 0),

que comparamos posteriormente con sinoviocitos OA del pase de trabajo (Pase 3).

Nuestros resultados indicaron la existencia basal de HO-1 en la suspensión inicial de

sinoviocitos OA, expresión que se mantuvo con la misma intensidad de inmunotinción

hasta el Pase 3 de trabajo en sinoviocitos no tratados. Por otra parte, la HO-1 presentó

una distribución principalmente citoplasmática, tal y como se puede observar en la

Figura 34, aunque algunas células presentaran además una localización nuclear.

Figura 34: Inmunotinción de HO-1 en ausencia de estímulos en sinoviocitos OA

Los sinoviocitos OA, procedentes de la suspensión inicial (Pase 0) y del pase de trabajo (Pase 3) se fijaron con formalina al 4% y se incubaron posteriormente con un anticuerpo específico frente a HO-1 (ver sección de Material y Métodos). Imágenes representativas de 3 experimentos diferentes.

Pase

3

Pase

0

x200 x400 x1000

Resultados _____________________________________________________________________________

134

5.2.2) Modulación de la expresión de HO-1 por citocinas en sinoviocitos OA

A continuación determinamos si la expresión de HO-1 determinada previamente era

susceptible de ser modulada por distintas citocinas implicadas directa o

indirectamente en el proceso OA. Por este motivo seleccionamos una serie de

citocinas, tanto de carácter pro-inflamatorio (IL-1β, TNF-α e IL-17) como anti-

inflamatorio (IL-10 e IL-13) implicadas en la OA. Se evaluó por Western Blot el efecto

de las mismas sobre la expresión de HO-1 a tres concentraciones durante 24 horas.

De acuerdo con las imágenes de Western Blot y sus correspondientes

densitometrías (Figura 35), las citocinas pro-inflamatorias IL-1β, TNF-α e IL-17

disminuyeron significativamente la expresión de HO-1 de manera concentración-

dependiente, siendo la IL-1β la que mayor potencia demostró inhibiendo la expresión

de HO-1 desde la concentración más baja empleada.

Figura 35: Efectos de las citocinas pro-inflamatorias IL-β (A), TNF-α (B) e IL-17 (C) sobre la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA

0

25

50

75

100

125

++++ ++

HO

-1/-A

ctin

a

(Unid

ades a

rbit

raria

s)

0

25

50

75

100

125

++ ++

HO

-1/-A

ctin

a

(Unid

ades a

rbit

raria

s)

0

25

50

75

100

125

+++

HO

-1/-A

ctin

a

(Unid

ades a

rbit

raria

s)

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con IL-1β (A), TNF-α (B) e IL-17 (C), a las concentraciones 2, 10 y 15 ng/mL durante 24 horas. Las imágenes de Western Blot son representativas de tres experimentos diferentes. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de HO-1 y su actina; t de Dunnett, ++ p<0,01, + p<0,05 respecto a células no estimuladas.

ng/mL - 2 10 15 - 2 10 15 - 2 10 15

HO-1 HO-1 HO-1

β-ACTINA

A B C

β-ACTINA β-ACTINA

IL-1β TNF-α IL-17

Resultados _____________________________________________________________________________

135

En cambio, en las células estimuladas con las citocinas anti-inflamatorias IL-10 e

IL-13 se detectó un marcado incremento, concentración dependiente, de la expresión

de HO-1, tal y como se observa en las imágenes de Western Blot y en sus

correspondientes análisis densitométricos (Figura 36).

Figura 36: Efectos de las citocinas anti-inflamatorias IL-10 (A) e IL-13 (B) sobre la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con IL-10 (A) e IL-13 (B) a las concentraciones 2, 10 y 15 ng/mL durante 24 horas. Las imágenes de Western Blot son representativas de tres experimentos diferentes. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de HO-1 y su actina; t de Dunnett, ++ p<0,01, + p<0,05 respecto a células no estimuladas.

5.2.3) Efectos de las citocinas sobre parámetros inflamatorios y

degenerativos implicados en la OA

Conocida la capacidad de estas citocinas de modular la expresión de HO-1 en

sinoviocitos OA, estudiamos a continuación la influencia de éstas sobre distintos

parámetros relacionados con los procesos inflamatorios y degenerativos

característicos de la OA. En esta serie de experimentos seleccionamos la concentración

de 10 ng/mL para la IL-1β y la de 15 ng/mL para el resto de citocinas.

HO-1 HO-1

β-ACTINA β-ACTINA

ng/mL - 2 10 15 - 2 10 15

A B

IL-10 IL-13

0

100

200

+ +

HO

-1/-A

cti

na

(Unid

ades

arb

itra

rias)

0

100

200

+ ++

HO

-1/-A

cti

na

(Unid

ades

arb

itra

rias)

Resultados _____________________________________________________________________________

136

5.2.3.1) Efectos de las citocinas sobre la proliferación celular

La capacidad proliferativa de los sinoviocitos estimulados con las citocinas

anteriores se determinó mediante la técnica del MTT. En la Figura 37 se puede

observar como únicamente las citocinas pro-inflamatorias IL-1β, TNF-α e IL-17 fueron

capaces de aumentar significativamente la proliferación de los sinoviocitos OA, siendo

la IL-1β la que mayor incremento indujo. En las células tratadas con las citocinas anti-

inflamatorias IL-10 e IL-13 no se observaron cambios significativos.

Figura 37: Efecto de las citocinas sobre la proliferación celular en sinoviocitos OA

0

50

100

150

++ + +

% p

rolife

ració

n

5.2.3.2) Efectos de las citocinas sobre la actividad MMP

Durante la OA se produce un aumento en la síntesis de MMPs y otras enzimas

degenerativas por parte de las células de la membrana sinovial, que junto con las

producidas por condrocitos activados, terminan provocando la degradación del

cartílago (Revisado por Murphy y cols, 2002). Así, como parámetro característico del

proceso degenerativo de la OA determinamos la actividad MMP por métodos

fluorimétricos, tal y como se ha detallado en el capítulo de Material y Métodos.

Citocinas - IL-1β TNF-α IL-17 IL-10 IL-13

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con las citocinas pro-inflamatorias IL-1β (10 ng/mL), TNF-α e IL-17 (15 ng/mL) y anti-inflamatorias IL-10 e IL-13 (15 ng/mL) durante 24 horas, tras lo cual se determinó la proliferación celular mediante la técnica del MTT. Resultados expresados como porcentaje respecto a la proliferación de células no estimuladas, que se considera del 100%. Resultados expresados como media ± error (n=4). t de Dunnett, + p<0,05, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas.

Resultados _____________________________________________________________________________

137

De acuerdo con la Figura 38, las citocinas pro-inflamatorias IL-1β, TNF-α e IL-17

indujeron un importante aumento en la actividad MMP con respecto a los niveles

basales, siendo la IL-1β la que mayor potencia demostró. Por el contrario, la

estimulación de los sinoviocitos con las citocinas anti-inflamatorias IL-10 e IL-13 no

produjo cambios significativos.

Figura 38: Efecto de las citocinas sobre la actividad MMP en sinoviocitos OA

0

100

200

300 ++

+

+

Acti

vid

ad M

MP

(UFx10

3/m

g p

rote

ína)

5.2.3.3) Efectos de las citocinas sobre la producción de otras citocinas

La importancia de las citocinas inflamatorias en la OA radica en el hecho de que son

capaces de promover considerablemente la síntesis de enzimas degenerativas de

matriz, quimiocinas, otras citocinas, etc. aunque hay que tener en cuenta que además

existe una producción espontánea de citocinas anti-inflamatorias, destinadas a

contrarrestar la producción excesiva de mediadores catabólicos (Revisado por

Fernandes y cols, 2002). Por este motivo, decidimos estudiar los efectos de la

estimulación de los sinoviocitos OA con las citocinas descritas anteriormente sobre la

producción de otras citocinas pro-inflamatorias y anti-inflamatorias, seleccionando

como más relevantes las citocinas pro-inflamatorias IL-6 y TNF-α y la citocina anti-

inflamatoria IL-10.


Los sinoviocitos OA fueron estimulados con las citocinas pro-inflamatorias IL-1β (10 ng/mL), TNF-α e IL-17 (15 ng/mL) y anti-inflamatorias IL-10 e IL-13 (15 ng/mL) durante 24 horas. La actividad de distintas MMPs se cuantificó en los sobrenadantes mediante un ensayo fluorimétrico. Resultados expresados como media ± error (n=4). t de Dunnett, ++ p<0,01, + p<0,05 respecto a células no estimuladas.

Resultados _____________________________________________________________________________

138

El tratamiento con las citocinas pro-inflamatorias IL-1β, TNF-α e IL-17 indujo un

aumento muy significativo, del orden de nanogramos/mg proteína, en la producción

de IL-6 (Figura 39A). En cuanto a la producción de TNF-α, únicamente IL-1β fue capaz

de incrementar la producción de este mediador (Figura 39B), que presentó unos

niveles mucho menores en comparación con los niveles de IL-6. IL-1β fue además la

única citocina capaz de incrementar la producción de la citocina anti-inflamatoria IL-10

(Figura 39C). Al igual que ocurrió con la actividad MMP, el estímulo con las citocinas

anti-inflamatorias IL-10 e IL-13 no modificó la producción de ninguna de las citocinas

determinadas.

Figura 39: Efecto de las citocinas sobre la producción de otras citocinas en sinoviocitos OA

0

10

20

30

40

50

60

70 ++

++++IL

-6

(ng/m

g p

rote

ína)

0

1

2

3

4

5

6

7 +

TN

F-

(pg/m

g p

rote

ína)

0

10

20

30

40

50

60 +

IL-1

0

(pg/m

g p

rote

ína)

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con las citocinas pro-inflamatorias IL-1β (10 ng/mL), TNF-α e IL-17 (15 ng/mL) y anti-inflamatorias IL-10 e IL-13 (15 ng/mL) durante 24 horas. La producción de IL-6, TNF-α e IL-10 se determinó por ELISA. Resultados expresados como media ± error (n=4). t de Dunnett, ++ p<0,01, + p<0,05 respecto a células no estimuladas.

A B

C

Citocinas - IL-1β TNF-α IL-17 IL-10 IL-13 Citocinas - IL-1β IL-17 IL-10 IL-13

Citocinas - IL-1β TNF-α IL-17 IL-13

C

Resultados _____________________________________________________________________________

139

5.2.3.4) Efectos de las citocinas sobre la expresión de COX-2 y PGE2

Otro mediador de carácter pro-inflamatorio implicado en el proceso OA es la PGE2,

cuya síntesis se ve incrementada por la enzima COX-2 durante el desarrollo de

procesos inflamatorios. De acuerdo con la Figura 40, IL-1β fue el único estímulo capaz

de aumentar significativamente la producción de este mediador, aumento que se

correlacionó con un incremento en la expresión de la enzima COX-2. Ninguna de las

demás citocinas modificó la expresión de COX-2 ni la producción de PGE2.

Figura 40: Efecto de las citocinas sobre la expresión proteica de COX-2 (A) y la producción de PGE2 (B) en sinoviocitos OA

En este sistema experimental hemos observado que las citocinas pro-inflamatorias

IL-1β, TNF-α e IL-17 redujeron marcadamente la expresión de HO-1, a la vez que

favorecieron tanto la proliferación celular como la producción de mediadores

degenerativos y pro-inflamatorios, lo que podría sugerir que la HO-1 represente una

nueva diana farmacológica para el control de la sinovitis OA.

COX-2

β-ACTINA

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con las citocinas pro-inflamatorias IL-1β (10 ng/mL), TNF-α, IL-17 y anti-inflamatorias IL-10 e IL-13 (15 ng/mL) durante 24 horas. La expresión de COX-2 se determinó por Western Blot (A) y la producción de PGE2 se determinó mediante RIA. La imagen es representativa de tres experimentos diferentes. Resultados expresados como media ± error (n=4). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas.

0

50

100

150

++

PG

E2

(ng/m

g p

rote

ína)

A

B


A

B

Resultados _____________________________________________________________________________

140

De acuerdo con nuestros resultados, se observa que IL-1β fue la citocina que mayor

eficacia demostró, tanto por su potente inhibición de la expresión de HO-1 desde la

concentración más baja, como por el incremento significativo en la actividad de

distintas MMPs y en la producción de diferentes mediadores implicados en el proceso

inflamatorio de la OA. Por este motivo, seleccionamos la IL-β, a la concentración de 10

ng/mL, como estímulo pro-inflamatorio para el resto de series experimentales.

Resultados _____________________________________________________________________________

141

5.3) Efectos de HMGB1 en sinoviocitos OA y relación con HO-1

Estudios recientes han demostrado la participación de la proteína High Mobility

Group Box 1 (HMGB1) en el desarrollo de procesos inflamatorios articulares,

fundamentalmente en la artritis reumatoide (Kokkola y cols, 2002), (Taniguchi y cols,

2003). En estos estudios se sugiere que esta proteína puede ser una nueva citocina

pro-inflamatoria a nivel articular (Revisado por Ulloa y cols, 2003). Sin embargo, los

datos de los que se dispone sobre el papel de la misma en la OA son escasos. Por

tanto, el objetivo de este apartado consistió en determinar el papel de HMGB1

durante la inflamación de la membrana sinovial OA.

Conociendo que HMGB1 se encuentra sobre-expresado en las células de la

membrana sinovial OA (en las capas íntima y subíntima, así como en las células del

infiltrado inflamatorio y de la pared vascular), (Figura 41), y sabiendo que presenta una

localización básicamente extracelular (Figura 42) (García-Arnandis y cols, 2010), que le

permitiría a priori comportarse como una citocina pro-inflamatoria, decidimos evaluar

los efectos de esta proteína, tanto en presencia como en ausencia del estímulo

inflamatorio IL-1β, sobre una serie de parámetros característicos del proceso

inflamatorio y degenerativo dirigido por la membrana sinovial OA, así como su relación

con la vía de la HO-1 en cultivos de sinoviocitos OA.

Figura 41: Análisis inmunohistoquímico de la expresión de HMGB1 en membrana sinovial sana y OA

(Imágenes obtenidas de García-Arnandis y cols, 2010)

MEMBRANA SINOVIAL SANA MEMBRANA SINOVIAL OA

Resultados _____________________________________________________________________________

142

Figura 42: Análisis inmunohistoquímico por microscopía confocal de la expresión de HMGB1 en membrana sinovial sana (A,C) y OA (B,D)

Las concentraciones de 15 y 25 ng/mL de HMGB1 utilizadas en este estudio fueron

seleccionadas en base a un experimento previo en el que comprobamos que la

liberación de HMGB1 al medio extracelular por parte de células no estimuladas y de

células estimuladas con IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas oscilaba en el rango de 1-20

ng/mL (datos no mostrados).

Antes de empezar esta serie experimental estudiamos cuáles eran los tiempos de

estimulación con HMGB1±IL-1β más adecuados para la liberación de mediadores al

medio de cultivo y seleccionamos el estímulo de 24 horas tras comprobar que, tanto

los niveles como el incremento en los efectos de IL-1β por parte de HMGB1 fueron

mucho mayores a este tiempo que a tiempos menores (Tabla 8).

Para descartar el efecto del SBF y otros factores de crecimiento presentes en el

medio de cultivo y que pudieran influir en los efectos de HMGB1±IL-1β, en otra serie

experimental comprobamos los efectos entre células incubadas con DMEM/HAM F12

0

20

40

60

*

% c

élu

las

posi

tivas

NÚ

CLEO

0

20

40

60

% c

élu

las

posi

tivas

CIT

OPLASM

A

A

B

MEMBRANA SINOVIAL SANA MEMBRANA SINOVIAL OA % CÉLULAS

POSITIVAS

NORMAL OA

NORMAL OA

A B

C D

(Imágenes obtenidas de García-Arnandis y cols, 2010)

MEMBRANA SINOVIAL SANA MEMBRANA SINOVIAL OA

Resultados _____________________________________________________________________________

143

suplementado con SBF al 1 ó al 10%, observando en ambas condiciones el mismo

patrón de incremento en los niveles proteicos y de actividad (Tabla 9).

Tabla 8: Análisis comparativo de los efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la producción de mediadores a distintos tiempos de estímulo en sinoviocitos OA

TIEMPO (-) HMGB1

(15ng/ml) HMGB1

(25ng/ml) IL-1β

HMGB1(15ng/ml) +IL-1β

HMGB1 (25ng/ml) +IL-1β

PGE2 5h 0,50±0,25 0,48±0,19 0,48±0,22 12,72±0,05 + 11,17±0,87 13,22±4,77

(ng/mg prot) 12h 1,06±0,38 0,64±0,5 0,63±0,32 31,86±10,13 ++ 31,94±2,41 26,57±3,94

24h 1,23±0,22 1,07±0,04 1,16±0,24 43,92±1,22 ++ 60,54±15,55 60,13±0,27 *

Act MMP 5h 10031±674 10087±600 10134±1606 10710±575 11159±420 10341±1512

(UF/mg prot) 12h 9213±662 9990±1120 9572±1017 12595±495 14741±4536 10257±1503

24h 24420±6928 23730±5883 18086±6706 97741±2566 ++ 101252±9959 110202±17142 *

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15,25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL), durante 5, 12 ó 24 horas. La producción de PGE2 se determinó por RIA mientras y la actividad MMP mediante un ensayo fluorimétrico. Resultados expresados como media ± error, n=3. t de Dunnett, + p<0,05 y ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

Tabla 9: Análisis comparativo de la influencia del SBF sobre la producción de mediadores por parte de HMGB1 e IL-1β en sinoviocitos OA

% SBF (-) IL-1β HMGB1 (15ng/ml)

+IL-1β HMGB1 (25ng/ml)

+IL-1β

1,11±0,01 22,43±4,45 ++ 28,25±0,5 34,47±5,65 * IL-6 1

(ng/mg prot) 10 2,84±1,28 86,82±2,83 ++ 91,5±5,32 122,71±1,07 *

Act MMP 1 3690±18 4658±142 4780±88 5169±123

(UF/mg prot) 10 5098±96 9316±332 + 11219±1010 14573±494 *

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15,25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas en medio DMEM completo suplementado con SBF al 1 ó 10%. La expresión proteica de IL-6 se determinó por ELISA y la actividad MMP mediante un ensayo fluorimétrico. Resultados expresados como media ± error, n=3. t de Dunnett, + p<0,05 y ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

Resultados _____________________________________________________________________________

144

5.3.1) Efectos de HMGB1 sobre la proliferación celular

Como se ha comprobado en el apartado 5.2.3.1, las citocinas pro-inflamatorias, y

en particular la IL-1β, han demostrado inducir muy significativamente la proliferación

de los sinoviocitos en nuestras condiciones experimentales. Por este motivo,

decidimos testar si HMGB1 (15, 25 ng/mL), sólo o en presencia de IL-1β, era también

capaz de inducir este proceso. Tal y como podemos ver en la Figura 43, la proliferación

de las células tratadas con HMGB1 fue prácticamente similar a la basal, mientras que

en presencia de IL-1β, HMGB1, a la concentración más alta testada (25 ng/mL), indujo

la proliferación muy significativamente con respecto a la inducida por IL-1β.

Figura 43: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la proliferación celular en sinoviocitos OA

0

100

200

++ **

% p

rolife

ració

n

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas, tras lo cual se determinó la proliferación celular mediante la técnica del MTT. Resultados expresados como porcentaje respecto a la proliferación de células no estimuladas, que se considera del 100%. Resultados expresados como media ± error (n=4). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

5.3.2) Efecto de HMGB1 sobre el estrés oxidativo

La participación del estrés oxidativo en el desarrollo de procesos inflamatorios y

degenerativos característicos de la OA es claramente conocida (Revisado por Henrotin

y cols, 2003). También HMGB1 ha sido relacionado con estos procesos (Revisado por

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - + + + + HMGB1 (ng/ml) - 15 25 - 15

25 IL-1β - - - + +

Resultados _____________________________________________________________________________

145

Tang y cols, 2010). Es por esto que decidimos comprobar los efectos de HMGB1 e IL-1β

sobre este parámetro mediante la cuantificación del estrés oxidativo a través de la

oxidación de la dihidrorrodamina 123 (ver sección de Material y Métodos). Como la

generación de radicales libres es una respuesta temprana, mantuvimos los sinoviocitos

en contacto con HMGB1 y/o IL-1β durante 30 minutos.

Nuestros resultados demostraron que la estimulación de los sinoviocitos con

concentraciones crecientes de HMGB1 indujo un ligero incremento en los niveles

basales de estrés oxidativo, que resultó similar al producido por IL-1β. En cambio, el

tratamiento concomitante de ambos estímulos, produjo un potente incremento, dosis-

dependiente, en la generación de este estrés, tal y como se muestra en la Figura 44.

Figura 44: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre el estrés oxidativo en sinoviocitos OA

0

100

200

300

*

**

+

Est

rés

oxid

ati

vo

(UFx10

3)

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 30 minutos. La determinación del estrés oxidativo se realizó por la oxidación de la dihidrorrodamina 123 como se ha indicado en el apartado de Material y Métodos. Resultados expresados como media ± error, n=3. t de Dunnett, + p<0,05 respecto a células no estimuladas; * p<0,05, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

5.3.3) Efectos de HMGB1 sobre la producción de citocinas y quimiocinas

Las células de la membrana sinovial activada son una fuente de citocinas pro-

inflamatorias, como IL-1β, IL-6, etc. que, junto con las sintetizadas por condrocitos

activados, contribuyen al desarrollo del proceso OA (Bondeson y cols, 2006). Pero

además del incremento en la síntesis de estas citocinas, durante la OA las quimiocinas

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - + + + +

Resultados _____________________________________________________________________________

146

ejercen un importante papel por su efecto atrayente de distintas células al foco

inflamatorio. Quimiocinas como IL-8, CCL2 o CCL20 son sintetizadas por sinoviocitos

OA y pueden servir como indicadores de la sinovitis o inflamación de la membrana

sinovial durante la progresión de la enfermedad (Revisado por Vergunst y cols, 2005).

Para determinar si el HMGB1 liberado al medio extracelular durante la OA era capaz de

modular la síntesis de citocinas y quimiocinas en sinoviocitos OA, se incubaron las

células con HMGB1 (15, 25 ng/mL), en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL)

durante 24 horas, tras lo cual se determinó la expresión de las mismas, a nivel de

mensajero mediante PCR a tiempo real y a nivel de proteína por ELISA.

Al igual que vimos en el apartado 5.2.3.3, IL-1β indujo muy significativamente la

producción de IL-6. Por el contrario, el estímulo con HMGB1, tanto a 15 como a 25

ng/mL, no modificó los valores basales de esta citocina. En cambio, el tratamiento

concomitante con HMGB1 e IL-1β indujo muy significativamente, y de un modo

concentración dependiente, la expresión génica y proteica de IL-6 (Figura 45). La

producción de TNF-α resultó mucho menor y no se observaron cambios significativos

en las células tratadas con HMGB1+IL-1β con respecto al control IL-1β (3,46±0,32

pg/mg en células estimuladas con IL-1β; 3,47±0,16 pg/mg en HMGB1 15 ng/mL +IL-1β

y 3,68±0,81 pg/mg en HMGB1 25 ng/mL +IL-1β).

Figura 45: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la expresión, a nivel de ARNm (A) y proteína (B), de IL-6 en sinoviocitos OA

0

10

20

30

40

50

60

70

++

**

**

IL-6

(ng/m

g p

rote

ína)

0

1

2

3

4

5

6

7

8

++* *

ARN

m IL-6

(Expre

sión r

ela

tiva)

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

A B

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15,25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A) o 24 horas (B). Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A) y la expresión proteica por ELISA en los sobrenadantes celulares (B). Resultados expresados como media ± error, n=4 (A) y n=6 (B). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

Resultados _____________________________________________________________________________

147

En cuanto a la producción de quimiocinas cabe destacar que, aún cuando el

tratamiento con HMGB1 apenas modificó los valores basales de IL-8, CCL2 y CCL20, el

co-estímulo de los sinoviocitos OA con HMGB1 e IL-1β indujo muy significativamente la

expresión de ARNm y proteína de Ias tres quimiocinas testadas (Figura 46).

Figura 46: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la expresión, a nivel de ARNm (A, C, E) y proteína (B, D, F), de IL-8, CCL2 y CCL20 en sinoviocitos OA

0

1

2

3

4

5

6

7

8

++

*

++

*

ARN

m IL-8

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

50

100

150

200

++

**

*

IL-8

(ng/m

g p

rote

ína)

0

1

2

3

4

5

6

++

*

ARN

m C

CL2

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

20

40

60

80

100

++

** **

CCL2

(ng/m

g p

rote

ína)

0

1

2

3

4

5

6

++

*

ARN

m C

CL20

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

5

10

15

20

25

30

35

++

*

CCL20

(ng/m

g p

rote

ína)

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

A B

C D

E F

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A,C,E) o 24 horas (B,D,F). Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A,C,E) y la expresión proteica por ELISA (B,D,F). Resultados expresados como media ± error, n=4 (A,C,E) y n=6 (B,D,F). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, *p<0,05, **p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

Resultados _____________________________________________________________________________

148

Figura 47: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la expresión de ARNm y proteína, de COX-2 (A,B) y mPGES-1 (C,D) y sobre la producción de PGE2 (E) en sinoviocitos OA

0

25

50

75

++

**

PG

E2

(ng/m

g p

rote

ína)

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25

IL-1β - - - + + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + + HMGB1 (ng/ml) - 15 25 - 15

25 IL-1β - - - + +

A B

C D

mPGES-1

β-ACTINA

COX-2

β-ACTINA

E

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - + + + + HMGB1 (ng/ml) - 15 25 - 15

25 IL-1β - - - + +

0

50

100

150

+

mPG

ES-1

/-A

cti

na

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

5

10

++

*

ARN

m m

PG

ES-1

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

50

100

150

+

mPG

ES-1

/-A

cti

na

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

5

10

++

*

ARN

m m

PG

ES-1

(Expre

sión r

ela

tiva)

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A y C) y 24 horas (B, D y E). Los niveles de ARNm se determinaron mediante PCR (A y C), la expresión proteica de COX-2 (B) y mPGES-1 (C) se determinó por Western Blot en los lisados microsomales y totales respectivamente y la producción de PGE2 (E) mediante RIA. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de COX-2, mPGES-1 y sus correspondientes actinas. Las imágenes son representativa de tres experimentos diferentes (B y D). n=4 (A-D) y n=8 (E). t de Dunnett, + p<0,05, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05, y ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

0.0

2.5

5.0

7.5 *

++

ARN

m C

OX-2

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

100

200

300

*

+

*

CO

X-2

/-A

cti

na

(unid

ades

arb

itra

rias)


25 IL-1β - - - + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25

IL-1β - - - + + +

Resultados _____________________________________________________________________________

149

5.3.4) Efectos de HMGB1 sobre la expresión de COX-2, mPGES-1 y la síntesis

de PGE2

Por el interés de la vía de la COX-2 en el desarrollo de los procesos pro-

inflamatorios, entre los que se encuentra la OA, decidimos evaluar los efectos de

HMGB1, sólo o en presencia de IL-1β, sobre la expresión, a nivel de ARNm y de

proteína, de las enzimas mPGES-1, COX-2 y del prostanoide PGE2. A nivel de ARNm

observamos que la adición de HMGB1 e IL-1β, a la concentración más alta de HMGB1,

indujo significativamente la expresión de los genes de mPGES-1 y COX-2 (Figura 74 A y

C). En cambio, a nivel proteico, este incremento se detectó únicamente para COX-2

(Figura 74B). Cabe señalar además que estos efectos se tradujeron en un marcado

incremento en los niveles de su metabolito PGE2 (Figura 47E).

5.3.5) Efectos de HMGB1 sobre la actividad y expresión de distintas MMPs

Determinamos además los efectos de HMGB1 sobre parámetros degenerativos

implicados en la OA, en concreto, sobre la vía de las MMPs. En principio evaluamos la

actividad MMP en el sobrenadante de los sinoviocitos OA estimulados con HMGB1 (15,

25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) mediante un ensayo

fluorimétrico, para después determinar los niveles de ARNm y proteína de distintas

MMPs mediante PCR y ELISA. Así, vimos que el tratamiento de los sinoviocitos OA con

HMGB1 (15,25 ng/mL), no produjo cambios significativos en la actividad MMP. Por el

contrario, y tal y como se había observado previamente, IL-1β indujo muy

potentemente esta actividad, efectos que se potenciaron cuando los sinoviocitos se

incubaron en presencia de HMGB1 (Figura 48).

Resultados _____________________________________________________________________________

150

Figura 48: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la actividad MMP en sinoviocitos OA

0

100

200

300

400

++

*

*

Acti

vid

ad M

MP

(UFx10

3/m

g p

rote

ína)

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL), en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. La actividad de distintas MMPs se cuantificó en los sobrenadantes mediante un ensayo fluorimétrico. Resultados expresados como media ± error (n=6). t de Dunnett, ++ p<0,0 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 respecto a células estimuladas con IL-1β.

Para determinar qué MMPs participan en el incremento en la actividad observado

previamente, cuantificamos la expresión de las colagenasas 1 y 3 (MMP-1 y MMP-13

respectivamente), implicadas en la degradación de las fibras de colágeno de la matriz

extracelular, así como de MMP-3, cuya activación conduce a un incremento en la

activación de distintas colagenasas. Según se observa en la Figura 49, el tratamiento

concomitante de HMGB1 (15, 25 ng/mL) e IL-1β indujo un incremento significativo en

la expresión de MMP-1 y de MMP-3. En el caso de MMP-13 se obtuvieron niveles

proteicos muy inferiores e incluso los niveles de ARNm de dicha MMP fueron

prácticamente indetectables mediante PCR. Además, el incremento provocado por

HMGB1 sobre los efectos de IL-1β no resultó significativo. También determinamos la

expresión de MMP-9, de la que obtuvimos niveles muy reducidos, inferiores al límite

de sensibilidad del ELISA (datos no mostrados).

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - + - + + +

Resultados _____________________________________________________________________________

151

Figura 49: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la expresión de distintas MMPs, a nivel de ARNm (A, C) y proteína (B, D,E), en sinoviocitos OA

0

1

2

3

4

5

6

7

++

****

ARN

m M

MP-1

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

100

200

300

400

++**

**

MM

P-1

(ng/m

g p

rote

ína)

0

1

2

3

4

5

6

7

++**

**

ARN

m M

MP-3

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

150

300

450 * *

++M

MP-3

(ng/m

g p

rote

ína)

0

100

200

300

400

500

600

700

++

MM

P-1

3

(pg/m

g p

rote

ína)

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A,C) o 24 horas (B,D,E). Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A,C) mientras que la expresión proteica se determinó por ELISA en los sobrenadantes celulares (B,D,E). Resultados expresados como media ± error, n=4 (A,C) y n=6 (B,D,E). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.


25 IL-1β - - - + +

A B

C D

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +


25 IL-1β - - - + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

E

Resultados _____________________________________________________________________________

152

5.3.6) Estudio de los receptores implicados en los efectos de HMGB1 en

sinoviocitos OA

Con objeto de determinar los receptores celulares que pudieran estar implicados en

los efectos observados con el tratamiento concomitante de HMGB1 e IL-1β, llevamos a

cabo una serie de experimentos en los que bloqueamos los receptores TLR-2, TLR-4 y

RAGE, responsables de la mayor parte de los efectos atribuidos al HMGB1 en otros

tejidos y modelos de enfermedad (Revisado por Yang y Tracey, 2010). Una vez

trascurrido el período de estímulo, y tomando como referencia el incremento de

HMGB1 e IL-1β sobre la producción del prostanoide PGE2 y de la citocina IL-6,

determinamos los niveles de éstos en células tratadas en presencia de IL-1β y HMGB1

y de anticuerpos específicos de bloqueo anti-TLR-2, TLR-4 y RAGE.

Figura 50: Efectos del bloqueo de los receptores TLR-2, TLR-4 y RAGE sobre la producción PGE2 (A) e IL-6 (B) en sinoviocitos OA estimulados con HMGB1 e IL-1β

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

++ #

**

PG

E2

(ng/m

g p

rote

ína)

0

50

100

++

**

##IL

-6

(ng/m

g p

rote

ína)

Los receptores TLR-2, TLR-4 y RAGE fueron bloqueados mediante el empleo de anticuerpos específicos (ver sección de Material y Métodos) 2 horas antes de añadir los estimulos HMGB1 (25 ng/mL) e IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. La producción de PGE2 se determinó mediante RIA (A) y la de IL-6 mediante ELISA en los sobrenadantes celulares (B). Resultados expresados como media ± error, n=3. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β, # p<0,05 respecto a células tratadas con HMGB1 (25 ng/mL) e IL-1β.

HMGB1 (25 ng/mL) - - + + + + IL-1β - + + + + + anti-TLR-2 - - - + - - anti-TLR-4 - - - - + - anti-RAGE - - - - - +

A B

HMGB1 (25 ng/mL) - - + + + + IL-1β - + + + + + anti-TLR-2 - - - + - - anti-TLR-4 - - - - + - anti-RAGE - - - - - +

Resultados _____________________________________________________________________________

153

Los resultados incluidos en la Figura 50 muestran cómo el bloqueo de los tres

receptores disminuyó, al menos en parte, la producción de los mediadores analizados.

Esta disminución resultó significativa en la producción de PGE2 al bloquear el receptor

RAGE y en la de IL-6 al bloquear los receptores TLR-2 y RAGE. Sin embargo,

bloqueando el receptor TLR-4 no obtuvimos resultados significativos, a pesar de que

en el caso de IL-6 apreciamos una tendencia a reducir sus niveles.

5.3.7) Efectos de HMGB1 sobre la fosforilación de Akt y MAPK

Para conocer el mecanismo de acción implicado en los efectos de HMGB1,

evaluamos su participación en la fosforilación de la enzima Akt y de las enzimas de la

familia de las MAPK (ERK 1/2, JNK 1/2 y p38), implicadas en la proliferación celular y en

la transcripción de múltiples genes relevantes en el proceso OA (Revisado por Beier y

Loeser, 2010).

Figura 51: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la fosforilación de las enzimas AKT (A), ERK 1/2 (B), JNK 1/2 (C) y p-38 (D), a distintos tiempos de estímulo, en sinoviocitos OA

5 min 30 min

HMGB1 (ng/mL) - 25 - 25 25 - 25 IL-1β - - + + - + + HMGB1 (ng/ml) - 15 25 - 15

25 IL-1β - - - + +

P-Akt

Akt

P-ERK 1/2

ERK 1/2

P-JNK 1/2

JNK 1/2

P-p38

p38

A

C

D

5 min 30 min

HMGB1 (ng/mL) - 25 - 25 25 - 25 IL-1β - - + + - + +


25 IL-1β - - - + +


25 IL-1β - - - + +

C

C

D

B D

C

D

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 5 ó 30 minutos. Las formas fosforiladas y totales de AKT (A), ERK 1/2 (B), JNK 1/2 (C) y p38 (D) se determinaron por Western Blot en los lisados celulares. Las imágenes son representativas de dos experimentos diferentes.

Resultados _____________________________________________________________________________

154

En primer lugar realizamos un análisis por Western Blot a diferentes tiempos de

estímulo (5 y 30 minutos), utilizando únicamente la concentración más alta de HMGB1

(25 ng/mL), en presencia o ausencia de IL-1β, con el objetivo de determinar a qué

tiempo se observaba una mayor fosforilación de las enzimas anteriores, resultados

que, como se muestran en la Figura 51, indicaron que la fosforilación de estas enzimas

era mayor a 5 minutos.

Figura 52: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la fosforilación de las enzimas Akt (A), ERK 1/2 (B), p38 (C) y JNK 1/2 (D) en sinoviocitos OA

0

25

50

75

100

125

++*

p-A

kt/

Akt

(Unid

ades

arb

itra

rias)

0

100

200

++

*p-E

RK 1

/2/ERK 1

/2

(Unid

ades

arb

itra

rias)

0

50

100

150

++

**

P-p

38/p38

(Unid

ades

arb

itra

rias)

0

25

50

75

100

125

++

P-J

NK 1

/2/JN

K 1

/2

(Unid

ades

arb

itra

rias)

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

A B

C D

P-Akt

Akt

P-ERK 1/2

ERK 1/2

P-JNK 1/2

JNK 1/2

P-p38

p38

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 5 min. Las formas fosforiladas y totales de Akt (B), ERK 1/2 (B), p-38 (C) y JNK 1/2 (D) se determinaron por Western Blot en los lisados celulares. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de las formas fosforiladas y sus correspondientes formas totales. Imágenes representativas de tres experimentos diferentes. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05, respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

Resultados _____________________________________________________________________________

155

Una vez comprobado que el máximo efecto de HMGB1 e IL-1β se producía a los 5

minutos de estimulación, realizamos un experimento completo con HMGB1 (15 y 25

ng/mL), en presencia o ausencia de IL-1β. De acuerdo con la Figura 52, las

concentraciones 15 y 25 ng/mL de HMGB1, indujeron por sí solas la fosforilación de

Akt y ERK 1/2 aunque su análisis densitométrico no resultó significativo. En presencia

de IL-1β, HMGB1 incrementó además la fosforilación de ERK 1/2 y de p38,

observándose un ligero incremento sobre la fosforilación de Akt. Por el contrario, la

fosforilación de JNK 1/2 no se vio modificada por el tratamiento con HMGB1 ni en

presencia ni en ausencia de IL-1β.

5.3.8) Efectos de HMGB1 sobre la activación de NF-ĸB

El factor de transcripción NF-ĸB ejerce un papel clave en la regulación de la

expresión de numerosos genes pro-inflamatorios y degenerativos en la articulación

(Revisado por Román-Blas y Jiménez, 2006), motivo por el cual nos propusimos evaluar

la participación del mismo en los efectos observados a HMGB1 e IL-1β, mediante la

técnica de transfección transitoria de plásmidos descrita en el capítulo de Material y

Métodos. Así, la estimulación de los sinoviocitos OA con HMGB1 resultó en un

incremento en la activación de NF-ĸB, aunque no se alcanzaron resultados

significativos. Sin embargo, se observó un incremento significativo en la activación de

NF-ĸB inducida por IL-1β en sinoviocitos incubados a la vez con HMGB1 (Figura 53).

Figura 53: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la activación de NF-ĸB en sinoviocitos OA

0

5

10

15

20

25

++

*

Acti

vid

ad L

ucif

era

sa

(unid

ades

arb

itra

rias)

HMGB1 (ng/mL) - - 25 - 25 IL-1β - - - + + NF-ĸB - + + + +

La transfección transitoria del plásmido NF-ĸB-luc se llevó a cabo durante 45 minutos en una placa magnética, como se detalla en Material y Métodos. Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas, tras lo cual se determinó la actividad luciferasa de NF-ĸB, normalizando los resultados con la actividad luciferasa del plásmido control. Resultados expresados como media media ± error. t de Dunnett, n=6, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

Resultados _____________________________________________________________________________

156

5.3.9) Efectos de HMGB1 sobre la expresión de HO-1

En el apartado 5.2.2 vimos cómo las citocinas pro-inflamatorias IL-1β, TNF-α e IL-17

fueron capaces de disminuir la expresión de HO-1. Siguiendo con este esquema, y en

vista de los resultados anteriores, si HMGB1 se comporta como una citocina pro-

inflamatoria, debería comportarse como éstas en cuanto a su relación con la HO-1.

Para ello, en primer lugar evaluamos los efectos de HMGB1 (15-25 ng/mL), solo o en

presencia de IL-1β, sobre la expresión de HO-1 mediante una cinética a distintos

tiempos (5, 12 y 24 horas). En ambas condiciones comprobamos que la expresión de

HO-1 apenas se veía modificada por HMGB1 tras 5 horas de estímulo, mientras que a

partir de las 12 horas dicha expresión comenzó a reducirse, siendo este efecto mayor

tras 24 horas de estímulo (Figura 54).

Figura 54: Cinética de los efectos de HMGB1, en ausencia (A) o presencia de IL-1β (B), sobre la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL) en ausencia (A) o presencia de IL-1β (10 ng/mL) (B), durante 5, 12 y 24 horas. La expresión de HO-1 se determinó por Western Blot en los lisados celulares recogidos a los distintos tiempos de estímulo. Las imágenes son representativas de 3 experimentos diferentes.

5 h 12 h 24 h

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 - 15 25

HMGB1 (25ng/mL) - - + - - + - - + IL-1β - + + - + + - + +

A

HO-1

β-ACTINA

HO-1

β-ACTINA

B

Resultados _____________________________________________________________________________

157

En vista de estos datos, y siguiendo el esquema de los experimentos anteriores, que

se llevaron a cabo tras 24 horas de estímulo con HMGB1 e IL-1β, realizamos un estudio

completo de los efectos de HMGB1 sobre la expresión de HO-1 tras 24 horas, tanto a

nivel de ARNm como de proteína, determinando en este caso su análisis

densitométrico. A nivel proteico pudimos apreciar que el tratamiento con HMGB1,

tanto a 15 como a 25 ng/mL, disminuyó ligeramente la expresión de HO-1 aunque sin

llegar a ser significativo, mientras que dicho estimulo potenció significativamente la

disminución en la expresión de HO-1 inducida por IL-1β (Figura 55). En cambio, a nivel

de ARNm no detectamos efecto alguno de HMGB1 sobre la expresión basal de HO-1 ni

sobre la reducción en la expresión de HO-1 inducida por IL-1β *ΔΔCt HMGB1 15 ng/mL:

-0,295; HMGB1 25 ng/mL=-0,384; IL-1β: -1,303; HMGB1 15 ng/mL+IL-1β: -1,072;

HMGB1 25 ng/mL: -1,330].

Figura 55: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA

0

25

50

75

100

125

++

*

HO

-1/-A

ctin

a

(Uni

dade

s ar

bitr

aria

s)

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL) en presencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. La expresión de HO-1 se determinó por Western Blot en los lisados celulares. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de HO-1 y su actina. La imagen es representativa de 3 experimentos diferentes. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

HO-1

β-ACTINA

Resultados _____________________________________________________________________________

158

5.3.10) Efectos de HMGB1 sobre el factor de transcripción Nrf2

El factor de transcripción Nrf2 ejerce un importante papel en la transcripción de

HO-1 inducida por distintos estímulos (Revisado por Kim y cols, 2010). Por ello, tras

haber comprobado la reducción en la expresión de HO-1 por parte de HMGB1 e IL-1β,

decidimos explorar cuáles eran los efectos de estos estímulos sobre este factor,

mediante un ensayo ELISA en extractos nucleares, tal y como describimos en el

capítulo de Material y Métodos. Por un parte, detectamos que la estimulación con IL-

1β redujo la activación de dicho factor, lo que justificaría la inhibición de la expresión

de HO-1 provocada por esta citocina. En cambio, la estimulación con HMGB1 resultó

incapaz de modificar la unión al ADN de Nrf2 ni sobre los valores basales ni sobre los

valores reducidos por parte de IL-1β (Figura 56). En líneas generales, el hecho de que

HMGB1 reduzca la expresión proteica de HO-1 sin modificar sus valores basales de

ARNm y sin modificar la activación de Nrf2 sugiere que HMGB1 no ejerce efecto alguno

sobre la HO-1 a nivel transcripcional.

Figura 56: Efectos de HMGB1 e IL-1β sobre la activación de Nrf2 en sinoviocitos OA

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

+

Unió

n N

rf-2

-AD

N

(abs/

mg p

rote

ína)

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con HMGB1 (15, 25 ng/mL) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 1 hora. La unión de Nrf2 al ADN se determinó en los extractos nucleares mediante el kit Trans AMTM Nrf2, tal y como se ha descrito en Material y Métodos. Resultados expresados como media ± error (n=4). t de Dunnett, + p<0,05 respecto a células no estimuladas.

HMGB1 (ng/mL) - 15 25 - 15 25 IL-1β - - - + + +

Resultados _____________________________________________________________________________

159

5.4) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP en sinoviocitos OA

Una vez determinada la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA y su posterior

modulación por citocinas, el paso siguiente consistió en establecer las consecuencias

de la inducción de HO-1 por la molécula CoPP, que, según se ha detallado en la sección

de Material y Métodos, actúa como potente inductor de la expresión de HO-1. Por ello,

en este capítulo evaluamos los efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre una

serie de parámetros implicados en los procesos degenerativos e inflamatorios de la

OA.

5.4.1) Efectos de CoPP sobre la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA

En primer lugar determinamos los efectos de CoPP, a 3 concentraciones (5, 10 y 15

μM), sobre la expresión de HO-1, en presencia o ausencia del estímulo IL-1β durante

24 horas, observando un marcado incremento en la expresión de HO-1 en las células

tratadas con CoPP en ausencia de estímulos (Figura 57A).

Figura 57: Efectos de CoPP sobre la expresión de HO-1 en ausencia (A) o presencia (B) de IL-1β en sinoviocitos OA

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (5, 10 y 15 μM) durante 24 horas, en ausencia (A) o en presencia de IL-1β (10 ng/mL), (B). La expresión de HO-1 se determinó por Western Blot en los lisados celulares. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de HO-1 y su actina. n=3. t de Dunnett, + p<0,05, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas; ** p<0,01 respecto a células estimuladas con IL-1β.

as; * p<0,01 respecto a células estimuladas con IL-1β.

HO-1

β-ACTINA

CoPP(μM) - 5 10 15

0

50

100

150

****

**

+

HO

-1/-A

cti

na

(Unid

ades

arb

itra

rias)

IL-1β - + + + + CoPP(μM) - - 5 10 15

HO-1

β-ACTINA

A B

0

100

200

+ ++++

HO

-1/-A

cti

na

(Unid

ades

arb

itra

rias)

Resultados _____________________________________________________________________________

160

La estimulación con IL-1β, como habíamos visto previamente (apartado 5.2.2),

disminuyó la expresión basal de HO-1, mientras que CoPP fue capaz de contrarrestar

significativamente y de un modo concentración dependiente, los efectos inhibidores

de IL-1β sobre HO-1, ya desde la concentración más baja ensayada (Figura 57B).

En adelante se decidió trabajar con CoPP a la concentración de 10 μM,

concentración ampliamente utilizada en nuestro laboratorio en otros tipos celulares, a

la que no se observaron efectos tóxicos relevantes en nuestras condiciones

experimentales (ver apartado 4.3.1).

A continuación decidimos confirmar los efectos de la inducción de HO-1 por CoPP

(10 μM) en sinoviocitos OA mediante otra técnica, la técnica de inmunofluorescencia.

Los resultados obtenidos confirmaron la potente inducción de HO-1 por CoPP, llegando

a contrarrestar los efectos inhibitorios producidos por la IL-1β (Figura 58). % de células

positivas, (-): 53,2±9,4; IL-1β: 19,1±7,2 +; CoPP: 58,5±5,1; CoPP+IL-1β: 67,5±6,0 **

Figura 58: Inducción de HO-1 por CoPP en sinoviocitos OA

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas, tras lo cual se realizó una inmunofluorescencia con un anticuerpo anti HO-1 y un anticuerpo secundario fluorescente (ver capítulo de Material y Métodos). Los núcleos se tiñeron con DAPI. Imágenes superpuestas HO-1+DAPI con el programa SIGMA Scan Pro. Imágenes representativas de tres experimentos diferentes. Resultados expresados como % de células positivas para HO-1 en 7 campos diferentes. t de Dunnett, + p<0,05 respecto a células no estimuladas; ** p<0,01 con respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β. Aumentos x200.

(-)

HO-1 DAPI HO-1+DAPI

CoPP+IL

-1β

C

oPP

IL-1

β

(

-)

Resultados _____________________________________________________________________________

161

Para confirmar que los efectos observados con CoPP eran debidos a la inducción de

la expresión de HO-1 y no a otros efectos intrínsecos de la propia molécula,

transfectamos las células con un silenciador específico de HO-1 (siRNA HO-1) y con un

silenciador inespecífico utilizado como control (siRNA control). Con estos experimentos

comprobamos que en las células transfectadas con el siRNA de HO-1 desapareció la

inducción de HO-1, tanto a nivel de ARNm como de proteína, mientras que en las

células transfectadas con el siRNA control la inducción de HO-1 se mantuvo (Figura 59).

Figura 59: Efectos de siRNA HO-1 sobre la inducción de HO-1 por CoPP a nivel de ARNm (A) y de proteína (B) en sinoviocitos OA

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6 ++

**

#

ARN

m H

O-1

(Expre

sión r

ela

tiva

)

++0

25

50

75

100

125

##

**

+

++

HO

-1/-A

cti

na

(Unid

ades

arb

itra

rias)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A) o 24 horas (B). La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A) mientras que la expresión proteica se determinó por Western Blot en los lisados celulares (B). Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de HO-1 y su actina. La imagen es representativa de 3 (A) y 8 (B) experimentos diferentes. t de Dunnett, + p<0,05 y ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β, # p<0,05, ## p<0,01 respecto a células tratadas con CoPP+IL-1β.

IL-1β - + - + + + CoPP(10 μM) - - + + + + siRNA(HO-1) - - - - + - siRNA control - - - - - +

IL- 1β - + - + - + + + CoPP (10 μM) - - + + - - + + siRNA(HO-1) - - - - + + + - siRNA control - - - - - - - +

A B

HO-1

β-ACTINA

Resultados _____________________________________________________________________________

162

5.4.2) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la proliferación celular

En las fases tardías de la OA se produce un engrosamiento de la membrana sinovial,

sobre todo a nivel de las células que componen la capa íntima, aunque también a nivel

de otras células presentes en el infiltrado inflamatorio (Revisado por Bartok y Firestein,

2010). Una interesante estrategia terapéutica supondría por tanto el contrarrestar el

crecimiento desmesurado de este tejido, motivo que nos llevó a examinar los efectos

de la HO-1 sobre la proliferación de células sinoviales. Según la Figura 60, observamos

que el estímulo pro-inflamatorio IL-1β produjo un incremento significativo en la

proliferación, efecto que quedó contrarrestado en las células incubadas en presencia

del inductor de HO-1.

Figura 60: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la proliferación celular en sinoviocitos OA

0

50

100

150

**+

% p

rolife

ració

n

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. La proliferación se determinó mediante la técnica del MTT. Resultados expresados como porcentaje de proliferación de los distintos tratamientos considerando la proliferación basal (células no estimuladas) del 100%, (n=8). t de Dunnett, + p<0,05 respecto a células no estimuladas; ** p<0,01 respecto a células estimuladas con L-1β.

IL-1β - + - + + + CoPP(10μM) - - + + + + siRNA(HO-1) - - - - + - siRNA control - - - - - + +

Resultados _____________________________________________________________________________

163

5.4.3) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre el estrés oxidativo

Parte de los efectos ejercidos por IL-1β dependen de la generación de radicales

libres y del consiguiente aumento en los procesos de estrés oxidativo. Por ello

quisimos conocer las consecuencias de la inducción de HO-1 sobre estos procesos,

utilizando la técnica de la oxidación de la molécula dihidrorrodamina 123 (ver capítulo

de Material y Métodos). Las imágenes de fluorescencia y el posterior análisis de las

células positivas para la tinción con rodamina (Figura 61), demostraron la capacidad

antioxidante de la HO-1 en nuestras condiciones experimentales, por disminuir

significativamente la generación de ROS inducida por estimulación con IL-1β durante

30 minutos. % células positivas para la tinción con rodamina, (-): 36,05±4,16; IL-1β:

55,19±3,13 +; CoPP: 27,83±2,81; CoPP+IL-1β: 39,89±5,77 *

Figura 61: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre el estrés oxidativo en sinoviocitos OA

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 30 min. La determinación del estrés oxidativo se realizó por la oxidación de la dihidrorrodamina 123 (ver capítulo de Material y Métodos). Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes son representativas de tres experimentos diferentes. Resultados expresados como media±error (n=3) del porcentaje de células positivas a la tinción con rodamina. t de Dunnett, + p<0,05 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β; Aumentos: x200.

RODAMINA DAPI

CoPP+IL

-1β

C

oPP

IL

-1β

(

-)

Resultados _____________________________________________________________________________

164


citocinas

Conocido el papel de las citocinas en la OA, evaluamos los efectos de la inducción

de HO-1 por CoPP sobre la producción de las citocinas pro-inflamatorias IL-6 y TNF-α y

de la citocina anti-inflamatoria IL-10 en el sobrenadante de sinoviocitos estimulados

durante 24 horas con CoPP, en presencia o ausencia de IL-1β, mediante la técnica de

ELISA.

Figura 62: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre

la producción de las citocinas IL-6 (A), TNF-α (B) e IL-10 (C) en sinoviocitos OA

0

10

20

30

40

50

60

++

IL-6

(ng/m

g p

rote

ína)

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

++

TN

F-

(pg/m

g p

rote

ína)

010

20

3040

50

60

70

80

90

+

*

#IL-1

0

(pg/m

g p

rote

ína)

IL-1β - + - + - + + + CoPP(10μM) - - + + - - + + siRNA(HO-1) - - - - + + + - siRNA control - - - - - - - +

A

B


C


Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β durante 24 horas. La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. La producción de IL-6 (A), TNF-α (B) e IL-10 (C) se determinó por ELISA en los sobrenadantes celulares. Resultados expresados como media ± error (n=6). t de Dunnett, + p<0,05 y ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 respecto a células estimuladas con IL-1β; # p<0,05 respecto a células tratadas con CoPP+IL-1β.

Resultados _____________________________________________________________________________

165

De acuerdo con la Figura 62A, en los sinoviocitos estimulados con IL-1β en presencia

de CoPP no se observó cambio alguno en la producción de IL-6 respecto a la producida

por el estímulo IL-1β. Resultados similares se observaron en la determinación de TNF-

α, aunque en este caso se obtuvieron niveles considerablemente inferiores (Figura

62B). En cuanto a la producción de IL-10, observamos que, si bien el estímulo con IL-1β

produjo un ligero incremento en la producción de IL-10, en los sinoviocitos tratados

con la combinación de CoPP e IL-1β se produjo un incremento significativo en la

producción de la misma, efectos que quedaron revertidos en las células transfectadas

con el siRNA específico para HO-1, tratándose por tanto de un efecto específico de la

HO-1 (Figura 62C).


quimiocinas y la migración celular

Para determinar si la HO-1 podría interferir con los procesos de migración de células

inflamatorias a la membrana sinovial OA, estudiamos los efectos de la inducción de

HO-1 por CoPP sobre la expresión de las quimiocinas IL-8, CCL2 y CCL20, tanto a nivel

de mensajero por PCR cuantitativa como a nivel de proteína mediante ELISA.

El estímulo pro-inflamatorio IL-1β indujo marcadamente la expresión de ARNm y de

proteína de las tres quimiocinas estudiadas mientras que la inducción de HO-1 por

CoPP en presencia de IL-1β disminuyó la expresión de CCL2 y CCL20, efectos que

desaparecieron en las células transfectadas con el siRNA HO-1, tratándose por tanto de

un efecto específico de la HO-1. En cuanto a la IL-8, no se obtuvieron resultados

significativos de CoPP ni a nivel de ARNm ni a nivel de proteína (Figura 63).

Resultados _____________________________________________________________________________

166

Figura 63: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la expresión, a nivel de ARNm (A,C,E) y proteína (B,D,F), de IL-8, CCL2 y CCL20 en sinoviocitos OA

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5++

ARN

m IL-8

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

50

100

150

200

250

++

IL-8

(ng/m

g p

rote

ína)

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5 ++

ARN

m C

CL2

(Expre

sión r

ela

tiva)

*

#

0

25

50

75

++

*

#

CCL2

(ng/m

g p

rote

ína)

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5 ++

ARN

m C

CL20

(Expre

sión r

ela

tiva)

*

#

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

++

**

##

CCL20

(ng/m

g p

rote

ína)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A,C,E) o 24 horas (B,D,F). La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A,C,E) mientras que la expresión proteica se determinó por ELISA en los sobrenadantes celulares (B,D,F). Resultados expresados como media ± error, n=4 (A,C,E) y n=6 (B,D,F). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β, # p<0,05, ## p<0,01 respecto a células tratadas con CoPP+IL-1β.

IL-1β - + - + + + CoPP(10μM) - - + + + + siRNA(HO-1) - - - - + - siRNA control - - - - - +


A B

C D

E F





Resultados _____________________________________________________________________________

167

A continuación, y para corroborar los efectos de la disminución en la expresión de

las quimiocinas a nivel de la migración de células al infiltrado sinovial, realizamos un

ensayo quimiotáctico en placas transwell, utilizando sobrenadantes procedentes de

células incubadas con CoPP en presencia o ausencia de IL-1β durante 24 horas, tal y

como se ha indicado en el capítulo de Material y Métodos. En nuestras condiciones

experimentales, el estímulo con IL-1β incrementó muy significativamente la migración

de los sinoviocitos con respecto al de las células no estimuladas, mientras que dicha

migración se vio considerablemente reducida en las células tratadas con CoPP. Es

interesante destacar que la migración de células transfectadas con el siRNA de HO-1

fue similar a la inducida por estimulación con IL-1β, indicando por tanto un efecto

directo de la HO-1 en el control de las quimiocinas y la migración celular (Figura 64).

Figura 64: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la migración de sinoviocitos OA

0

100

200

**

++

##

% m

igra

ció

n

5.4.6) Efectos de la inducción de HO-1 sobre la producción de PGE2

Siguiendo con el estudio de los efectos de CoPP sobre distintos parámetros de

carácter pro-inflamatorio, estudiamos los efectos de éste sobre la producción de PGE2.

De acuerdo con nuestros resultados, el tratamiento de las células con CoPP en

Se sembraron 30.000 células en la parte superior del inserto. En el compartimento inferior se añadió sobrenadante procedente de células incubadas con CoPP (10 μM), en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) y del siRNA específico de HO-1 o del siRNA control (ambos a 100 nM) durante 24 horas, manteniéndolos en cultivo durante 24 horas, tras lo cual se fijaron las células que migraron al compartimento inferior y se realizó el contaje de las mismas en 4 campos. Resultados expresados como % del incremento en la migración, considerando del 100% la migración de IL-1β. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β; ## p<0,01 respecto a células tratadas con CoPP e IL-1β.

IL-1β - + - + + + CoPP(10μM) - - - + + + siRNA (HO-1) - - - - + - siRNA (control) - - - - - +

Resultados _____________________________________________________________________________

168

presencia de IL-1β indujo un ligero incremento en la producción de PGE2 con respecto

al control IL-1β, aunque dicho incremento no resultó significativo por lo que habría que

descartar el efecto de CoPP sobre la síntesis de PGE2 en nuestras condiciones

experimentales (Figura 65).

Figura 65: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la producción de PGE2 en sinoviocitos OA

0

25

50

75

100

125

++

PG

E2

(ng/m

g p

rote

ina)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β durante 24 horas. La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. La producción de PGE2 se determinó mediante RIA en el sobrenadante celular. Resultados expresados como media ± error, n=8. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas.

5.4.7) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la actividad y

expresión de enzimas degenerativas del cartílago

Numerosos estudios han demostrado que las células de la membrana sinovial OA

ejercen un importante papel en el desarrollo de la lesión articular por el incremento en

la síntesis de mediadores pro-inflamatorios y enzimas degenerativas (Revisado por

Sellam y Berenbaum, 2010). En particular, se ha demostrado que IL-1β es capaz de

estimular la síntesis de MMPs, agrecanasas y otras proteasas (Stove y cols, 2000). Por

este motivo decidimos evaluar los efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la

actividad y expresión de distintas enzimas implicadas en el proceso degenerativo OA.


Resultados _____________________________________________________________________________

169

5.4.7.1) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre MMPs

La actividad MMP en el sobrenadante de los sinoviocitos se determinó mediante un

ensayo fluorimétrico utilizando el sustrato 5-FAM. De acuerdo con lo previsto, IL-1β

indujo muy significativamente la actividad MMP mientras que el tratamiento con CoPP

en presencia de IL-1β la redujo muy significativamente. Estos efectos quedaron

contrarrestados en las células transfectadas con el siRNA específico de HO-1 y no en

las transfectadas con el siRNA inespecífico (Figura 66). A continuación, y a fin de

determinar qué MMPs resultaron modificadas por el tratamiento con CoPP,

evaluamos los efectos de esta molécula sobre la expresión de las MMP-1 y -3 y de la

pro MMP-13. En cuanto a la producción de MMP-1 y MMP-3, detectamos que CoPP

contrarrestó el incremento provocado por el estímulo pro-inflamatorio IL-1β, efectos

que desaparecieron en presencia del siRNA específico de HO-1, tanto a nivel de mRNA

como de proteína, destacando además la elevada producción de ambas MMPs por

parte de los sinoviocitos OA (Figura 67 A-D). Resultados similares, pero con niveles

muy inferiores, se obtuvieron con la pro-MMP-13, de la que, al igual que en el capítulo

5.3.5, no detectamos niveles de ARNm mediante PCR (Figura 67E).

Figura 66: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la actividad MMP en sinoviocitos OA

0

100

200

300 ++

**

#

Acti

vid

ad M

MP

(UFx10

3/ m

g p

rote

ína)

IL-1β - + - + - + + + CoPP(10μM) - - + + - - + + siRNA(HO-1) - - - - + + + -

siRNA control - - - - - - - +

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. La actividad MMP se determinó mediante un ensayo fluorimétrico. Resultados expresados como media ± error (n=10). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas; ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β, # p<0,05 respecto a células tratadas con CoPP+IL-1β.

Resultados _____________________________________________________________________________

170

Figura 67: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la expresión de MMPs a nivel de ARNm (A,C) y de proteína (B,D,E), en sinoviocitos OA

0

1

2

3

4

5

++

**

##

ARN

m M

MP-1

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

200

400

600

800 ++

**

#

MM

P-1

(ng/m

g p

rote

ína)

0

2

4

6

8 ++

*

#

ARN

m M

MP-3

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900 ++

**

pro

-MM

P-1

3

(pg/m

g p

rote

ína)

0

200

400

600

800

++

**

##

MM

P-3

(ng/m

g p

rote

ína)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A,C) o 24 horas (B,D,E). La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. Los niveles de ARNm se determinaron por PCR tiempo real (A,C) mientras que la expresión proteica se determinó mediante ELISA (B,D,E). Resultados expresados como media ± error, n=4 (A,C) y n=8 (B,D,E). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05 y ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β, # p<0,05, ## p<0,01 respecto a células tratadas con CoPP+IL-1β.

A B


C D

E





Resultados _____________________________________________________________________________

171

5.4.7.2) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre agrecanasas

En paralelo determinamos los efectos de CoPP sobre la actividad agrecanasa,

medida mediante un ensayo ELISA basado en la formación del péptido ARGSVIL (ver

sección de Material y Métodos). En nuestras condiciones experimentales, la actividad

agrecanasa fue muy reducida y la estimulación de los sinoviocitos con IL-1β apenas la

indujo, mientras que el tratamiento con CoPP apenas modificó estos valores (Tabla

10). Tampoco se observaron resultados de interés en la determinación del ARNm de

las agrecanasas 1 y 2 (datos no mostrados), por lo que podríamos descartar los efectos

directos de la HO-1 sobre esta familia proteasas.

Tabla 10: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la actividad agrecanasa en sinoviocitos OA

ESTÍMULO

ACTIVIDAD AGRECANASA (pM péptido ARGSVIL)

(-) 0,15±0,06

IL-1β 0,22±0,01

CoPP 0,19±0,04

CoPP+IL-1β 0,20±0,01

siRNA+CoPP+IL-1β 0,17±0,04

siRNAcontrol+CoPP+IL-1β 0,25±0,01

5.4.8) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre HMGB1

Una vez demostrada la sobre-expresión de HMGB1 en cortes histológicos de tejido

sinovial OA, su efecto potenciador de la actividad de IL-1β en sinoviocitos OA y su

efecto inhibitorio de la expresión proteica de HO-1 (ver capítulo 5.3), decidimos

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. La actividad agrecanasa se determinó con el kit Sensitive Aggrecanase ELISA kit, tal y como se ha descrito en Material y Métodos. Resultados expresados como media ± error, n=3, t de Dunnett.

Resultados _____________________________________________________________________________

172

evaluar los efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre el HMGB1 a varios niveles:

expresión total intracelular de HMGB1, translocación del núcleo al citoplasma y

posterior secreción al medio de cultivo. Finalmente determinamos también los efectos

de la HO-1 sobre la expresión del receptor RAGE.

La estimulación de los sinoviocitos OA con IL-1β (10 ng/mL) resultó en un

incremento de la expresión intracelular de HMGB1, tanto a nivel de ARNm como de

proteína. Por el contrario, en células tratadas con CoPP en presencia de IL-1β, se

observó una marcada reducción en los niveles de ARNm y proteína de HMGB1, efectos

que quedaron contrarrestados en los sinoviocitos transfectados con el siRNA específico

de HO-1 (Figura 68).

Figura 68: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la expresión total intracelular de HMGB1 a nivel de ARNm (A) y proteína (B) en sinoviocitos OA

0.0

2.5

5.0 ++

**

#

ARN

m H

MG

B1

(Expre

sión r

ela

tiva

)

0

50

100 ++

**

##

HM

GB1/-A

ctin

a

(Unid

ades

arb

itra

rias)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A) o 24 horas (B). La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A) mientras que la expresión proteica se determinó por Western Blot en los lisados celulares (B). Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de HMGB1 y su actina. La imagen es representativa de 3 experimentos diferentes. t de Dunnett, n=8 (B); ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β, # p<0,05, ## p<0,01 respecto a células tratadas con CoPP+IL-1β.

A B

bb

IL-1β + - + + + CoPP(10 μM) - + + + + siRNA(HO-1) - - - + - siRNA control - - - - +


HMGB1

β-ACTINA

Resultados _____________________________________________________________________________

173

La translocación citoplasmática de HMGB1 y su posterior liberación extracelular

suponen las etapas fundamentales para que HMGB1 pueda actuar extracelularmente

como una citocina. Para determinar los efectos de CoPP sobre la translocación de

HMGB1, realizamos un análisis comparativo por Western Blot de los extractos

nucleares y citoplasmáticos de células estimuladas con CoPP en presencia o ausencia

de IL-1β. En el extracto nuclear, se detectó expresión de HMGB1 en células no

tratadas, expresión que se vió disminuida en presencia de IL-1β, lo que indicaría que

este estímulo favorece la translocación citoplasmática de HMGB1. Por el contrario, en

las células tratadas con CoPP en presencia de L-1β, observamos una acumulación

mayor de HMGB1 en el núcleo (Figura 69A). En cambio, en el extracto citoplasmático

apreciamos cómo IL-1β produjo un incremento en la expresión de HMGB1 con

respecto a las células no estimuladas, que fue reducido en presencia de CoPP (Figura

69B).

Figura 69: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre

la translocación citoplasmática de HMGB1 en sinoviocitos OA por Western Blot

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β durante 24 horas. La translocación de HMGB1 se determinó por Western Blot en las fracciones nuclear (A) y citoplasmática (B), obtenidas según se ha descrito en el apartado de Material y Métodos. Las imágenes son representativas de 3 experimentos diferentes.

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

HMGB1

PCNA

HMGB1

β-ACTINA

B

A

FRACCIÓN NUCLEAR FRACCIÓN CITOPLASMÁTICA

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

A B

bb

Resultados _____________________________________________________________________________

174

Se obtuvieron resultados similares mediante inmunofluorescencia (Figura 70). En

células no tratadas, HMGB1 permaneció en parte en el núcleo, si bien, en algunas

células apareció también en el citoplasma. El estímulo pro-inflamatorio IL-1β condujo a

un aumento en la translocación citoplasmática del mismo en comparación con las

células no tratadas, mientras que el tratamiento con CoPP disminuyó dicha

translocación. En conjunto, nuestros datos demuestran que CoPP reduce la

translocación citoplasmática inducida por IL-1β. % HMGB1 citoplasmático: (-):

37,0±7,8; IL-1β: 54,0±2,3 +; CoPP: 32,2±6,2; CoPP+IL-1β: 36,8±4,4 *

Figura 70: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la translocación citoplasmática de HMGB1 en sinoviocitos OA por inmunofluorescencia

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas, tras lo cual se realizó una inmunofluorescencia con un anticuerpo anti HMGB1 y un anticuerpo secundario fluorescente tal y como se describe en la sección de Material y Métodos. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Imágenes superpuestas HMGB1+DAPI con el programa SIGMA Scan Pro. Resultados expresados como media del % de la tinción positiva de HMGB1 en el citoplasma en 7 campos diferentes, t de Dunnett, n=3. + p<0,05 con respecto a células no estimuladas, * p<0,05 con respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β. Aumentos: x400.

HMGB1 DAPI HMGB1 + DAPI

CoPP+IL

-1β

C

oPP

IL-1

β

(-

)

Resultados _____________________________________________________________________________

175

Finalmente determinamos los efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la

liberación extracelular de HMGB1 mediante ELISA. De acuerdo con la Figura 71, la

estimulación de los sinoviocitos OA con IL-1β (10 ng/mL) incrementó

significativamente la secreción extracelular de HMGB1, mientras que en las células

tratadas con CoPP (10 μM) en presencia de IL-1β se observó una marcada reducción en

la liberación extracelular del mismo. Este efecto quedó contrarrestado en los

sinoviocitos transfectados con el siRNA específico de HO-1, y no en los transfectados

con el siRNA inespecífico, lo que indica el efecto específico de la inducción de HO-1 por

CoPP sobre la reducción de este parámetro.

Figura 71: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la secreción extracelular de HMGB1 en sinoviocitos OA

0

1

2

3

4

5

+

*

#

Lib

era

ció

n H

MG

B1

(ng/m

g p

rote

ína)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. La secreción extracelular de HMGB1 se determinó por ELISA. Resultados expresados como media ± error (n=6). t de Dunnett, + p<0,05 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β, # p<0,05 respecto a células tratadas con CoPP+IL-1β.

Se cree que los efectos catabólicos atribuidos al HMGB1 son debidos, en parte, a su

unión al receptor celular RAGE. De hecho, Kokkola y cols, comprobaron en 2005 que la

actividad pro-inflamatoria de HMGB1 en macrófagos de rata era debida

fundamentalmente, a su unión con dicho receptor, y en menor medida, a los

receptores TLR-2 y TLR-4. Por este motivo, conociendo que las células de la membrana

sinovial OA expresan este receptor (Drinda y cols, 2005), y teniendo en cuenta los


Resultados _____________________________________________________________________________

176

efectos de la inducción de HO-1 sobre HMGB1, determinamos los efectos de CoPP

sobre la expresión de RAGE, de la que observamos una marcada disminución en su

expresión en los sinoviocitos tratados con CoPP en presencia de IL-1β, efectos que

desaparecieron en las células incubadas con el siRNA específico de HO-1 (Figura 72).

Figura 72: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la expresión de RAGE en sinoviocitos OA

0

25

50

75

100

125

*

##

RAG

E/-A

cti

na

(Unid

ades

arb

itra

rias)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/ml) durante 24 horas. La concentración final del siRNA específico de HO-1 y del siRNA control fue de 100 nM. La expresión de RAGE se determinó por Western Blot en los lisados celulares. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de RAGE y su actina. La imagen es representativa de 5 experimentos diferentes. t de Dunnett, * p<0,05 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β, ## p<0,01 respecto a células tratadas con CoPP+IL-1β.

5.4.9) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la fosforilación de Akt

y MAPK

A fin de dilucidar el potencial mecanismo de acción implicado en los efectos

observados a CoPP, estudiamos la influencia de esta molécula sobre la fosforilación de

las enzimas Akt y MAPK, cuya activación conduce a un incremento de la respuesta

inflamatoria y degenerativa en la articulación (Revisado por Beier y Loeser, 2010). La

RAGE

β-ACTINA


Resultados _____________________________________________________________________________

177

expresión de las formas fosforiladas y sus correspondientes formas totales se analizó

por Western Blot, representando mediante un análisis densitométrico la relación entre

ambas.

Figura 73: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la fosforilación de las enzimas Akt (A) y MAPK ERK 1/2 (B), JNK 1/2 (C) y p38 (D) en sinoviocitos OA

0

50

100

*

P-A

kt/

Akt

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

25

50

75

100

125++

*P-E

RK 1

/2/ E

RK 1

/2

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

25

50

75

100

125 ++

**

P-J

NK 1

/2/ J

NK 1

/2

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

25

50

75

100

125++

**

P-p

38/ p

38

(unid

ades

arb

itra

rias)

Los sinoviocitos OA fueron tratados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 5 minutos. Las formas fosforiladas y totales de Akt (A), ERK 1/2 (B), JNK (C) y p38 (D) se determinaron por Western Blot en los lisados celulares. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de las formas fosforiladas y sus correspondientes formas totales. La imagen es representativa de tres experimentos diferentes. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05, ** p<0,01, respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

A B

P-Akt

Akt

P-ERK 1/2

ERK 1/2

C D

P-JNK 1/2

JNK 1/2

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

P-p38

p38

Resultados _____________________________________________________________________________

178

En la Figura 73 se muestra como el estímulo con IL-1β durante 5 minutos condujo a

un marcado incremento en la fosforilación de las MAPK ERK 1/2, JNK y p38, siendo

menor el incremento provocado en la fosforilación de Akt. Por el contrario, el

tratamiento con CoPP disminuyó significativamente la fosforilación de Akt, ERK 1/2,

JNK 1/2 y p38.

5.4.10) Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la activación de

factores de transcripción

Para completar el estudio de los efectos de la inducción de HO-1 por CoPP en

sinoviocitos OA, profundizamos en una última etapa en los efectos de dicho

tratamiento a nivel transcripcional. Para ello determinamos los efectos de CoPP sobre

la activación de NF-ĸB, ya que está descrito que la mayor parte de los mediadores

determinados en nuestro estudio dependen de la activación de este factor (Amos y

cols, 2006), (Bondeson y cols, 2007) y también sobre AP-1, del que dependen algunos

parámetros como la proliferación o la producción de MMPs en FLS estimulados con IL-

1β (Morita y cols, 1998), (Revisado por Vincenti y Brinckerhoff, 2002). Los efectos de

CoPP sobre NF-ĸB se estudiaron a varios niveles: sobre la fosforilación de IĸBα, sobre la

traslocación de p65 del citoplasma al núcleo y sobre la unión de NF-ĸB a su secuencia

consenso del ADN, mientras que la activación de AP-1 se determinó por su unión al

ADN. Para llevar a cabo estos análisis, se incubaron las células con CoPP en presencia o

ausencia del estímulo IL-1β, que se mantuvo en cultivo durante 30 minutos o 1 hora,

tras lo cual determinamos la translocación de p65 por Western Blot, y la fosforilación

de IĸBα y la unión de NF-ĸB/AP-1 a su secuencia consenso del ADN mediante un

ensayo ELISA.

A nivel de NF-ĸB, nuestros resultados demostraron el efecto inhibitorio de CoPP

sobre esta vía, ya que fue capaz de disminuir la fosforilación de IĸBα (Figura 74C) y la

consiguiente translocación nuclear de p65 (Figura 74 A y B), reduciendo por tanto su

unión a su secuencia consenso del ADN (Figura 74D). A nivel de la unión de AP-1 al

Resultados _____________________________________________________________________________

179

ADN, detectamos un efecto reducido por parte de células tratadas con CoPP en

presencia de IL-1β, que no resultó significativo (Figura 74E).

Figura 74: Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP sobre la activación de NF-ĸB (A-D) y AP-1 (E) en sinoviocitos OA

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

C D

0

10

20

30

40

50

60

70

80

*

+

p65 c

itopla

sma/-a

cti

na

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

**

++

p65 n

úcle

o/-a

cti

na

(unid

ades

arb

itra

rias)

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 +

*

Fosf

ori

lació

n IB

(abs/

mg p

rote

ína)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9 ++

*

Unió

n N

F-

B-A

DN

(abs/

mg p

rote

ína)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6 +

*

Fosf

ori

lació

n IB

(abs/

mg p

rote

ina)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9 ++

*

Unió

n N

F-

B-A

DN

(abs/

mg p

rote

ina)

p65

ACTINA

p65

ACTINA

A B

E

IL-1β - + - + CoPP (10μM) - - + +

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CoPP (10 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 30 min (C) o 1 hora (A,B,D,E). La translocación de p65 se determinó por Western Blot, mientras que la fosforilación de IĸBα y la unión de NF-ĸB/AP-1 a su secuencia consenso del ADN se determinaron por ELISA. Las imágenes de Western Blot son representativas de 3 experimentos diferentes. Resultados (A-B) expresados como media ± error de la relación entre la DO de p65 y su actina. n=3 (A-B), n= 5 (C-E), t de Dunnett, +p<0,05, ++ p<0,01 con respecto a células no estimuladas; * p<0,05, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

Unió

n A

P-1

-AD

N

(abs/

mg

pro

teín

a)

FRACCIÓN NUCLEAR FRACCIÓN CITOPLASMÁTICA

Resultados _____________________________________________________________________________

180

5.5) Efectos de la sobre-expresión de HO-1

mediante la transducción de vectores lentivirales

modificados con el gen de HO-1 en sinoviocitos OA

Con objeto de comprobar las consecuencias de la sobre-expresión directa de HO-1

en sinoviocitos OA, llevamos a cabo una serie de experimentos adicionales en los que

se transdujeron las células con vectores lentivirales modificados con el gen de HO-1,

consiguiendo de esta manera, una sobre-expresión directa de dicha proteína. Así,

determinamos los efectos de la transducción de lentivirus modificados con el gen de

HO-1 (LV HO-1) sobre aquellos parámetros o mediadores que habían resultado

modificados por el tratamiento con CoPP. Como control negativo se utilizaron células

transfectadas con LV no modificados con el gen de HO-1 [LV (-)].

5.5.1) Evaluación del porcentaje de transducción de LV HO-1 en sinoviocitos

OA

En primer lugar se valoró el porcentaje de células transfectadas adecuadamente

con LV HO-1, para lo cual realizamos un análisis por inmunofluorescencia de la

expresión de FLAG, marcador que se encuentra acoplado al ADNc de HO-1 en los

lentivirus, que permite discriminar la HO-1 transfectada mediante el vector lentiviral

de la HO-1 basal de los sinoviocitos, pudiendo así conocer el porcentaje de células

transfectadas satisfactoriamente, ya que el número de células positivas para FLAG se

corresponde con el número de células transfectadas con LV HO-1. De este modo, y de

acuerdo con la Figura 75, pudimos determinar que el porcentaje de infección de los

sinoviocitos fue de aproximadamente 50% del total de células, rendimiento bastante

alto considerando la dificultad de la transfección de vectores virales en células

primarias.

Resultados _____________________________________________________________________________

181

Figura 75: Expresión de FLAG en sinoviocitos OA transfectados con LV HO-1

5.5.2) Efectos de LV HO-1 sobre la expresión de HO-1

Para confirmar la modulación de la expresión de HO-1 en función de los diferentes

tratamientos, evaluamos la expresión de la misma tanto a nivel de ARNm como de

proteína. En ambos casos, como se muestra en la Figura 76, en sinoviocitos

transfectados con LV HO-1 la inducción de HO-1 fue mayor que en los transfectados

con el control negativo LV (-), tanto en presencia como en ausencia de IL-1β. % células

positivas a la tinción con HO-1. LV (-): 45,5±6,5; LV(-)+IL-1β: 31,7±6,7; LV HO-1:

57,2±8,9; LV HO-1+IL-1β: 51,8±3,9 *

FLAG DAPI FLAG+DAPI

LV H

O-1

(

-)

Los sinoviocitos OA fueron transfectados con LV HO-1, tras lo cual se realizó una inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-FLAG y un anticuerpo secundario fluorescente tal y como se describe en la sección de Material y Métodos. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Imágenes combinadas FLAG+DAPI con el programa SIGMAScan Pro. Las imágenes son representativas de tres experimentos diferentes. Aumentos: x400.

Resultados _____________________________________________________________________________

182

Figura 76: Modulación de la expresión de HO-1, a nivel de ARNm (A) y proteína (B), en sinoviocitos OA transfectados con LV HO-1 y LV(-)

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5*

ARN

m H

O-1

(Expre

sión r

ela

tiva)

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

A

B

B

HO-1 DAPI HO-1 + DAPI

Los sinoviocitos OA fueron transducidos con LV HO-1 o LV(-) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 (A) o 24 horas (B), tras lo cual se determinaron los niveles de ARNm de HO-1 por PCR a tiempo real (A) o se realizó una inmunofluorescencia con un anticuerpo anti-HO-1 (ver sección de Material y Métodos), (B). Los núcleos se tiñeron con DAPI. Imágenes combinadas HO-1+DAPI con el programa SIGMAScan Pro. Las imágenes son representativas de tres experimentos diferentes. Resultados de la cuantificación expresados como media ± error del % de células positivas para HO-1 en 7 campos diferentes. t de Dunnett, * p<0,05 con respecto a células transfectadas con LV (-) en presencia del estímulo IL-1β. Aumentos: x 200.

LV H

O-1

+IL

-1β L

V H

O-1

LV(-

)+IL

-1β

L

V(-

)

Resultados _____________________________________________________________________________

183

5.5.3) Efectos de la transducción de LV HO-1 sobre la producción de


En vista de los resultados obtenidos por CoPP sobre la expresión de quimiocinas y la

consiguiente migración celular, decidimos comprobar si éstos se reproducían mediante

la sobre-expresión directa de HO-1.

Figura 77: Efectos de transducción de LV HO-1 sobre la expresión, a nivel de ARNm (A,C,D) y proteína (B,D,E), de IL-8, CCL2 y CCL20 en sinoviocitos OA

0

1

2

3

4

5

6 ++

*

ARN

m IL-8

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

100

200

++

*IL-8

(ng/m

g p

rote

ína)

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5 +

*

ARN

m C

CL2

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

25

50

75 ++

*

CCL2

(ng/m

g p

rote

ína)

0

1

2

3

4

5

6

7 ++*

ARN

m C

CL20

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

5

10

15

20

25

30

35+

*

CCL20

(ng/m

g p

rote

ína)

A B

C D

E F

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

Los sinoviocitos OA fueron trasducidos con LV HO-1 o LV(-) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A,C,E) o 24 horas (B,D,F). Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A,C,E) y los de proteína por ELISA (B,D,F). Resultados expresados como media ± error, n=3 (A,C,E) y n=4 (B,D,F). t de Dunnett, + p<0,05, ++ p<0,01 respecto a células transfectadas con LV(-), * p<0,05 respecto a células transfectadas con LV(-) en presencia de IL-1β.

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

Resultados _____________________________________________________________________________

184

En sinoviocitos transfectados con LV (-) en presencia de IL-1β, que sería el

equivalente de IL-1β en el resto de series experimentales, detectamos un marcado

incremento en la expresión génica y proteica de las 3 quimiocinas testadas. A nivel de

mensajero, en sinoviocitos transfectados con LV HO-1 en presencia de IL-1β se produjo

una reducción significativa en la expresión de IL-8, CCL2 y también de CCL20 (Figura

77A, C, D). Estos efectos de LV HO-1 fueron confirmados posteriormente a nivel de

proteína (Figura 77B, D, F), lo que justificaría la modulación ejercida por CoPP sobre

estos mediadores. En el análisis de migración con sinoviocitos tratados con LV HO-1 en

presencia de IL-1β observamos una marcada reducción en dicho proceso, en

comparación con los tratados con LV (-)+IL-1β, confirmando así la relación negativa

entre la inducción de HO-1 y la producción de quimiocinas y la consiguiente migración

celular (Figura 78).

Figura 78: Efectos de la transducción de LV HO-1 sobre la migración de sinoviocitos OA

0

25

50

75

100++

**

% m

igra

ción

5.5.4) Efecto de la transducción de LV HO-1 sobre MMPs

La transfección de LV (-) y la estimulación con IL-1β produjo un aumento

significativo, tanto en la actividad como en la expresión de ARNm y proteína de MMP-1

y MMP-3, mientras que por la transducción de LV HO-1 en presencia de IL-1β

Se sembraron 30.000 células en la parte superior del inserto. En el compartimento inferior se añadió sobrenadante procedente de células transfectadas con LV (-) o LV HO-1 en presencia o ausencia de IL-1β durante 24 horas, manteniéndolos en cultivo durante 24 horas, tras lo cual se fijaron las células que migraron al compartimento inferior y se realizó el contaje de las mismas en 4 campos. Resultados expresados como % del incremento en la migración, considerando del 100% la migración de IL-1β. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células transfectadas con LV (-), ** p<0,01 respecto a células transfectadas con LV(-)+IL-1β.

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

Resultados _____________________________________________________________________________

185

detectamos una disminución significativa en la actividad y expresión de ambas MMPs

(Figuras 79 y 80), de manera similar a la ejercida por la inducción de HO-1 por CoPP.

Figura 79: Efectos de la transducción de LV HO-1 sobre la actividad MMP en sinoviocitos OA

0

50

100

150

200

250

*

Acti

vid

idad M

MP

(UFx10

3/m

g p

rote

ína)

Figura 80: Efectos de la transducción de LV HO-1 sobre la expresión de ARNm (A, B) y proteína (C, D) de las MMPs 1 y -3 en sinoviocitos OA

-1

0

1

2

3

*

++

ARN

m M

MP-1

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

25

50

75

100 +

*

MM

P-1

(ng/m

g p

rote

ína)

0

1

2

3

4

5

*

++

ARN

m M

MP-3

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

100

200

+

*MM

P-3

(ng/m

g p

rote

ína)

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

A B

C D

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

Los sinoviocitos OA fueron trasducidos con LV HO-1 o LV(-) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. La actividad d MMPs se cuantificó en los sobrenadantes celulares mediante un ensayo fluorimétrico. Resultados expresados como media ± error, n=4. t de Dunnett, + p<0,05 respecto a células transfectadas con LV(-); ** p<0,01 respecto a células trasducidas con LV(-) en presencia de IL-1β.

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

LV(-) + + - - LV HO-1 - - + + IL-1β - + - +

Los sinoviocitos OA fueron trasducidos con LV HO-1 o LV(-) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A,C) o 24 horas (B,D). Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A,B) y la expresión proteica por ELISA (C,D). Resultados expresados como media ± error, n=3 (A,C) y n=4 (B,D). t de Dunnett, + p<0,05 y ++ p<0,01 respecto a células trasducidas con LV (-), * p<0,05 respecto a células trasducidas con LV(-) en presencia de IL-1β.

Resultados _____________________________________________________________________________

186

5.5.5) Efectos de la transducción de LV HO-1 sobre el HMGB1

Para confirmar la participación de la inducción de HO-1 en la reducción de la

activación HMGB1, se estudiaron los efectos de la transducción de LV HO-1 a nivel de

la translocación citoplasmática de HMGB1, etapa clave para éste pueda ejercer o

potenciar los efectos pro-inflamatorios mencionados anteriormente.

De acuerdo con nuestras imágenes y sus correspondientes contajes de células

positivas (Figura 81), la translocación inducida por LV(-)+IL-1β se vio disminuida en las

células transfectadas con LV HO-1+IL-1β, lo que confirmaría el efecto de la HO-1 sobre

el HMGB1. % HMGB1 citoplasmático. LV(-): 41,8±4,3; LV(-)+IL-1β: 63,9±2,8 +; LV HO-1:

45,6±12,5; LV HO-1+IL-1β: 38,9±4,4 *

Figura 81: Efectos de la transducción de LV HO-1 sobre la translocación citoplasmática de HMGB1 en sinoviocitos OA

HMGB1 DAPI HO-1 + DAPI

LV H

O-1

+IL

-1β

LV H

O-1

L

V(-

)+IL

-1β

LV(-

)

Los sinoviocitos OA fueron transducidos con LV HO-1 o LV(-) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL), tras lo cual se realizó una inmunofluorescencia tal y como se describe en la sección de Material y Métodos. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Imágenes superpuestas HMGB1+DAPI con el programa SIGMA Scan Pro. Imágenes representativas de tres experimentos diferentes. Resultados de la cuantificación expresados como media ± error del % de células positivas para HO-1 en 7 campos diferentes. t de Dunnett, + p<0,05 con respecto a células transfectadas con LV (-), * p<0,05 con respecto a células transfectadas con LV (-) en presencia del estímulo IL-1β. Aumentos: x 400.

Resultados _____________________________________________________________________________

187

5.6) Efectos del CO liberado por CORM-2 en sinoviocitos OA

Conocidos los efectos de la HO-1 en sinoviocitos OA, bien por la inducción de HO-1

por CoPP, bien por la transducción de vectores virales modificados con el gen de HO-1,

estudiamos a continuación los efectos del CO, metabolito de la reacción catalizada por

HO-1, para lo que utilizamos la molécula liberadora de CO, CORM-2. Siguiendo el

esquema de los apartados anteriores, determinamos los efectos de esta molécula, en

presencia o ausencia de IL-1β, sobre una serie de mediadores pro-inflamatorios y

degenerativos implicados en el desarrollo de la OA. Como control negativo de los

efectos del CORM-2 utilizamos la molécula RuCl3.

5.6.1) Efecto del CO liberado por CORM-2 sobre la expresión de HO-1

En primer lugar evaluamos los efectos de CORM-2 sobre la expresión de HO-1, ya

que está descrito que el CO es capaz de inducir la expresión de HO-1 en otros tipos

celulares (Sawle y cols, 2005). Realizamos un análisis por Western Blot de los efectos

de CORM-2 a tres concentraciones (50, 100 y 200 μM), solo o en presencia de IL-1β,

durante 24 horas. Como mostramos en la Figura 82, el tratamiento de los sinoviocitos

OA con concentraciones crecientes de CORM-2 en ausencia de IL-1β, fue capaz de

inducir de manera significativa, y de un modo concentración dependiente, la expresión

proteica de HO-1.

Figura 82: Efectos de CORM-2 sobre la expresión de HO-1 en sinoviocitos OA

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (50, 100 y 200 μM) durante 24 horas. La expresión de HO-1 se determinó por Western Blot en los lisados celulares. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de HO-1 y su actina. La imagen es representativa de tres experimentos diferentes. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas.

CORM-2 (μM) - 50 100 200

HO-1

β-ACTINA

0

100

200

++ ++

HO

-1/-A

ctin

a

(Unid

ades

arb

itra

rias)

Resultados _____________________________________________________________________________

188

En presencia de IL-1β detectamos que el tratamiento con CORM-2 a las

concentraciones 100 y 200 μM contrarrestó significativamente la disminución en la

expresión génica de HO-1 inducida por esta citocina. Sin embargo, estos resultados no

se tradujeron a nivel proteico, ya que únicamente detectamos un ligero incremento no

significativo en la expresión de HO-1 por parte de concentraciones crecientes de

CORM-2. Como cabía esperar, en las células que recibieron RuCl3 no se observó

incremento alguno en la expresión de HO-1 (Figura 83).

Figura 83: Efectos de CORM-2 sobre la expresión de HO-1, a nivel de ARNm (A) y proteína (B), en sinoviocitos OA estimulados con IL-1β

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (50,100 y 200 μM) en presencia de IL-1β durante 16 (A) o 24 (B) horas. RuCl3 (200 μM) se utilizó como control negativo de los efectos de CORM-2. Los niveles de ARNm de HO-1 se determinaron por PCR a tiempo real (A) mientras que la expresión proteica se determinó por Western Blot en los lisados celulares (B). Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de HO-1 y su actina (B). La imagen es representativa de tres experimentos diferentes. Resultados de PCR expresados como media ± error (n=3). t de Dunnett, + p<0,05 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 y ** p<0,01 respecto a células estimuladas con IL-1β; ## p<0,01 respecto a células tratadas con CORM-2 (200 μM) en presencia de IL-1β.

IL-1β - - + + + + + CORM-2 (μM) - 200 - 50 100 200 - RuCl3 (μM) - - - - - - 200

HO-1

β-ACTINA

IL-1β - + + + + + CORM-2(μM) - - 50 100 200 - RuCl3 (μM) - - - - - 200

A B

B

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*

**

+##

ARN

HO

-1

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

10

20

30

40

50

60

+

HO

-1/-A

cti

na

(Unid

ades

arb

itra

rias)

Resultados _____________________________________________________________________________

189

5.6.2) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la proliferación celular

Siguiendo con el esquema de los apartados anteriores, en primer lugar estudiamos

los efectos de CORM-2 sobre la proliferación celular y observamos que el tratamiento

durante 24 horas con CORM-2 disminuyó significativamente el porcentaje de

proliferación con respecto al inducido por el estímulo IL-1β, como se muestra en la

Figura 84.

Figura 84: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la proliferación celular en sinoviocitos OA

0

50

100

150

** **

+

%

pro

life

raci

ón

Los sinoviocitos OA fueron estimulados con CORM-2 (50, 100 y 200 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. RuCl3 (200 μM) se utilizó como control negativo de los efectos de CORM-2. La proliferación se determinó mediante la técnica del MTT. Resultados expresados como porcentaje de proliferación de los distintos tratamientos considerando la proliferación basal (células no estimuladas) del 100%, (n=6). t de Dunnet, + p<0,05 respecto a células no estimuladas; ** p<0,01 respecto a células estimuladas con IL-1β.

5.6.3) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre el estrés oxidativo

La generación de ROS y los efectos del tratamiento con concentraciones crecientes

de CORM-2 sobre estos radicales fue determinada por la oxidación de la

dihidrorrodamina 123 (ver capítulo de Material y Métodos). Las imágenes de

fluorescencia y sus correspondientes contajes de células positivas (Figura 85 A y B)

IL-1β - + - + + + + CORM-2 (μM) - - 200 50 100 200 - RuCl3 (μM) - - - - - - 200

Resultados _____________________________________________________________________________

190

demuestran por una parte, la elevada generación de ROS, con el consiguiente aumento

del estrés oxidativo, por parte de IL-1β, mientras que por otra parte se observa una

marcada reducción en la generación de ROS en las células tratatadas con CORM-2 a la

concentración más elevada, resultados que no aparecen en las células tratadas con el

control inactivo de CORM-2, lo que indica el potencial efecto anti oxidante de la

liberación de CO en nuestro modelo experimental.

Figura 85: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre el estrés oxidativo en sinoviocitos OA

0

10

20

30

40

50

60

70++

*

#

% c

élu

las

posi

tivas

B

B

IL-1β - + - + + + CORM-2 (μM) - - 200 100 200 - RuCl3 (μM) - - - - - 200

A

B

RODAMINA RODAMINA DAPI DAPI

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (100 y 200 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 30 min. RuCl3 (200 μM) se utilizó como control negativo de los efectos de CORM-2. El estrés oxidativo se determinó por la oxidación de la dihidrorrodamina 123. Los núcleos se tiñeron con DAPI. Las imágenes son representativas de tres experimentos diferentes. Resultados expresados como media ± error (n=3) del porcentaje de células positivas a la tinción con rodamina. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β; # p<0,05 respecto a células tratadas con CORM-2 (200 μM) en presencia de IL-1β. Aumentos: x200.

CO

RM

-2

IL

-1β

(-)

(200µM

)

(

200µM

)

RuCl 3

+IL

-1β

C

ORM

-2+IL

-1β

CO

RM

-2+IL

-1β

(

200µM

) (2

00µM

) (1

00µM

)

RODAMINA DAPI

Resultados _____________________________________________________________________________

191

5.6.4) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la producción de citocinas

En el sobrenadante de células estimuladas durante 24 horas con CORM-2,

determinamos también la producción de diferentes citocinas pro- y anti-inflamatorias,

tal y como hemos venido haciendo previamente.

Figura 86: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la producción de IL-6 (A), TNF-α (B) e IL-10 (C) en sinoviocitos OA

0

10

20

30

40

50

60

++

IL-6

(ng/m

g p

rote

ína)

0

1

2

3

4

5

6

7

+

**

*

#

TN

F-

(pg/m

g p

rote

ína)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

++

IL-!

0

(pg/m

g p

rote

ina)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (50, 100 y 200 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas. RuCl3 (200 μM) se utilizó como control negativo de los efectos de CORM-2. La producción de IL-6 (A), TNF-α (B) e IL-10 (C) se determinó por ELISA en los sobrenadantes de los sinoviocitos. Resultados expresados como media ± error (n=6). t de Dunnett, + p<0,05, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 y ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β; # p<0,05 respecto a células tratadas con CORM-2 (200 μM) en presencia de IL-1β.

A B


C



Resultados _____________________________________________________________________________

192

El tratamiento con CORM-2 apenas modificó la producción de IL-6 a ninguna de las

concentraciones testadas (Figura 86A). Por el contrario, en la producción de TNF-α se

observó un descenso significativo y concentración dependiente por parte de este

tratamiento, descenso que no fue detectado en las células que se incubaron con el

control negativo RuCl3 (Figura 86B). Por su parte, no observamos efecto alguno del CO

sobre la producción de la citocina anti-inflamatoria IL-10 (Figura 86C).

5.6.5) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la producción de


Dados los interesantes resultados obtenidos con la inducción de HO-1 sobre la

producción de quimiocinas y la consiguiente migración celular, decidimos valorar si el

CO, como metabolito de la reacción catalizada de HO-1, era capaz de reproducir estos

efectos.

La estimulación con IL-1β indujo muy potentemente la expresión, tanto a nivel de

ARNm como de proteína, de las tres quimiocinas testadas (IL-8, CCL2 y CCL20),

mientras que el tratamiento con CORM-2, a la concentración más alta, redujo la

expresión génica de CCL2 y CCL20, sin obtener resultados significativos para el ARNm

de IL-8 (Figura 87A, C, E). En cambio, a nivel proteico se observó una marcada

disminución en la expresión de las tres quimiocinas en las células tratadas con

concentraciones crecientes de CORM-2, efectos que no se observaron en las células

incubadas en presencia de RuCl3, demostrando por tanto un efecto específico de

CORM-2 sobre la expresión de estas quimiocinas (Figura 87B, D, F).

Además, la migración celular de un compartimento a otro resultó significativamente

disminuida en las células tratadas con CORM-2 a las tres concentraciones testadas, con

respecto a las estimuladas con IL-1β (Figura 88), mientras que en las células que

recibieron RuCl3, el porcentaje de migración resultó similar al inducido por IL-1β, lo

que confirmaría por tanto el papel del CO en el control de la expresión y actividad de

las quimiocinas IL-8, CCL2 y CCL20 en sinoviocitos OA.

Resultados _____________________________________________________________________________

193

Figura 87: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la expresión, a nivel de ARNm (A, C, E) y proteína (B, D, F), de IL-8, CCL2 y CCL20 en sinoviocitos OA

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5 ++

ARN

m IL-8

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

50

100

150

++*

**

##

IL-8

(ng/m

g p

rote

ína)

-2.5

0.0

2.5

5.0

+*

#

ARN

m C

CL2

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

++

*

##

*

CCL2

(ng/m

g p

rote

ína)

0

5

10

15

++*

ARN

m C

CL20

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

10

20

30

40

++*

*

##

CCL20

(ng/m

g p

rote

ína)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (50, 100 y 200 μM), en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A,C,E) o 24 horas (B,D,F). RuCl3 (200 μM) se utilizó como control negativo de los efectos de CORM-2. Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A,C,E) mientras que la expresión proteica se determinó por ELISA en los sobrenadantes celulares (B,D,F). Resultados expresados como media ± error, n=4 (A,C,E) y n=6 (B,D,F). t de Dunnett, + p<0,05, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β; ## p<0,01 respecto a células tratadas con CORM-2 (200 μM) en presencia de IL-1β.

A B

C D

E F







Resultados _____________________________________________________________________________

194

Figura 88: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la migración de sinoviocitos OA

0

25

50

75

100

125

++

**

##

****

% m

igra

ció

n

Figura 89: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la expresión de COX-2 (A) y sobre la producción de PGE2 (B) en sinoviocitos OA

Se sembraron 30.000 células en la parte superior del inserto. En el compartimento inferior se añadió sobrenadante procedente de células incubadas con CORM-2 (50, 100 y 200 μM) o RuCl3 (200 μM), en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 24 horas, manteniéndolos en cultivo durante 24 horas, tras lo cual se fijaron las células que migraron al compartimento inferior y se realizó el contaje de las mismas en 4 campos. Resultados expresados como media ± error (n=3) del incremento en la migración, considerando del 100% la migración del estímulo IL-1β. t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas; ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β; ## p<0,01 respecto a células tratadas con CORM-2 (200 μM) en presencia de IL-1β.



COX-2

β-ACTINA

A B

0

50

100

++

**

#

CO

X-2

/-A

cti

na

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

100

200

+

**

PG

E2

(ng/m

g p

rote

ina)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (50, 100 y 200 μM), en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A) o 24 horas (B). RuCl3 (200 μM) se utilizó como control negativo de los efectos de CORM-2. La expresión proteica de COX-2 se determinó por Western Blot en los lisados celulares (A) y la producción de PGE2 mediante RIA (B). Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de COX-2 y su actina. Resultados expresados como media ± error, n=3 (A) y n=6 (B). t de Dunnett, + p<0,05 y ++ p<0,01, respecto a células no estimuladas, * p<0,05 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β; # p<0,05 respecto a células tratadas con CORM-2 (200 μM) en presencia de IL-1β.


Resultados _____________________________________________________________________________

195

5.6.6) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la expresión de COX-2 y la

producción de PGE2

Los efectos de CoPP sobre la producción de PGE2 no resultaron significativos

(capítulo 5.4.6). En cambio, en el caso de CORM-2 observamos un incremento en la

producción de este prostanoide, acompañado a su vez de un marcado aumento en la

expresión de COX-2. Por el contrario, en las células incubadas con RuCl3 los niveles de

COX-2 y PGE2 resultaron similares a los basales, lo que indica que probablemente el

incremento de COX-2/PGE2 sea un efecto directo del CO (Figura 89).

5.6.7) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la actividad y expresión de

MMPs

Estudios recientes de nuestro laboratorio demostraron el efecto del CO sobre la

actividad y expresión de distintas MMPs en condrocitos procedentes de cartílago

humano osteoartrítico (Megías y cols, 2008). Por este motivo, y también ante los

resultados obtenidos mediante la inducción de HO-1, determinamos la actividad MMP

en sinoviocitos OA tratados con CORM-2 en presencia o ausencia de IL-1β durante 24

horas. Así, comprobamos que este tratamiento disminuyó significativamente la

actividad MMP en el sobrenadante de las células, efectos que no se observaron en las

élulas tratadas con el control negativo RuCl3 (Figura 90).

Figura 90: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la actividad MMP en sinoviocitos OA


Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (50, 100 y 200 μM) en presencia o ausencia de IL-1β durante 24 horas. RuCl3 (200 μM) fue utilizado como control negativo del CORM-2. La actividad MMP se determinó mediante un ensayo fluorimétrico. Resultados expresados como media ± error (n=8). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas; * p<0,05 y ** p<0,01 prespecto a células tratadas con el estímulo IL-1β; # p<0,05 respecto a células tratadas con CORM-2 (200 μM) en presencia de IL-1β.

0

50

100

150

200

250

300

350

++

**

#

*

Act

ivid

ad M

MP

(UFx1

03/m

g pro

teín

a)

Resultados _____________________________________________________________________________

196

A continuación, tal y como se hizo en las series experimentales de CoPP y de LV HO-

1, estudiamos la participación de las MMPs -1 y -3 en la disminución de la actividad

observada previamente. En la Figura 91A-B se aprecia que el tratamiento con CORM-2

en presencia de IL-1β disminuyó significativamente, tanto el ARNm como la proteína

de MMP-1. También en el caso de MMP-3 obtuvimos resultados similares (Figura 91 C-

D).

Figura 91: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la expresión, a nivel de ARNm (A, C) y de proteína (B, D), de las MMPs -1 y -3, en sinoviocitos OA

0.0

2.5

5.0

7.5++

* *

#

ARN

m M

MP-1

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

100

200

300++

* *M

MP-1

(ng/m

g p

rote

ína)

0.0

2.5

5.0

7.5

10.0

12.5

++

**

#

ARN

m M

MP-3

(Expre

sión r

ela

tiva)

0

100

200

300

++

* *

#

MM

P-3

(ng/m

g p

rote

ína)

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (50, 100 y 200 μM), en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 16 horas (A,C) o 24 horas (B,D) RuCl3 (200 μM) se utilizó como control negativo de los efectos de CORM-2. Los niveles de ARNm se determinaron por PCR a tiempo real (A,C) mientras que la expresión proteica se determinó por ELISA en los sobrenadantes celulares (B,D). Resultados expresados como media ± error, n=3 (A,C,E) y n=4 (B,D,F). t de Dunnett, ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05 y ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β; # p<0,05 respecto a células tratadas con CORM-2 (200 μM) en presencia de IL-1β.


A B

C D




Resultados _____________________________________________________________________________

197

5.6.8) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre HMGB1

Varios autores han señalado el efecto inhibidor de las moléculas liberadoras de CO

sobre la expresión de HMGB1 en distintos modelos animales de artritis reumatoide

(Maicas y cols, 2010) y de shock séptico (Tsoyi y cols, 2009). Sin embargo, en nuestro

modelo de sinoviocitos OA no hemos detectado efecto alguno de CORM-2 sobre

HMGB1, ni a nivel de expresión total intracelular y de su receptor RAGE (Figura 92A), ni

sobre la liberación extracelular del mismo (Figura 92B), etapa clave para que esta

proteina sea capaz de ejercer los efectos que se le atribuyen.

Figura 92: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la expresión de HMGB1 y RAGE (A) y la liberación de HMGB1 al medio extracelular (C)

5.6.9) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la fosforilación de Akt y

MAPK

Finalmente, determinamos los efectos de CORM-2 nivel de vías de señalización y

observamos que el tratamiento de los sinoviocitos con CORM-2 provocó un descenso

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (50-200 μM) en presencia o ausencia de IL-1β durante 24 horas. La expresión proteica de HMGB1 y RAGE (A) se determinó por Western Blot en los lisados celulares mientras que la liberación extracelular de HMGB1 (B) se analizó por ELISA. Imágenes representativas de 3 experimentos (A). Resultados expresados como media±error, n=3 (B). Resultados expresados como media ± error, n=3. t de Dunnett, + p<0,05 respecto a células no estimuladas.

HMGB1

RAGE

ACTINA

A

IL-1β - + - + CORM-2 (100 μM) - + + +

B

ESTÍMULO ng HMGB1/mg proteina

(-) 1,98±0,09

IL-1β 2,99±0,12 +

CORM-2 (100 μM) 2,49±0,3

CORM-2 (50 μM) +IL-1β 2,62±0,19

CORM-2 (100 μM) +IL-1β 2,68±0,09

CORM-2 (200 μM) + IL-1β 2,74±0,12

Resultados _____________________________________________________________________________

198

muy significativo en la fosforilación de las MAPK ERK 1/2, JNK y p38, inducidas

fuertemente tras 5 minutos de estimulación con IL-1β. En cuanto a la fosforilación de

Akt, apenas observamos efectos por parte de CORM-2, por lo que cabría descartar la

participación de Akt en los efectos observados a CORM-2 (Figura 93).

Figura 93: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la fosforilación de las enzimas Akt (A) y MAPK ERK 1/2 (B), JNK 1/2 (C) y p38 (D) en sinoviocitos OA

0

50

100

P-A

kt/

Akt

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

25

50

75

100

125++

****

P-E

RK 1

/2/ E

RK 1

/2

(unid

ades

arb

itra

rias)

A B

P-JNK 1/2

JNK 1/2

P-p38

p38

C D

P-Akt

Akt

P-ERK 1/2

ERK 1/2

0

25

50

75

100

125+

** *

P-J

NK 1

/2/ J

NK 1

/2

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

50

100 ++

*

P-p

38/ p

38

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

25

50

75

100

125

+

***

P-J

NK 1

/2/ J

NK 1

/2

(unid

ades

arb

itra

rias)

0

25

50

75

100 ++

*

P-p

38/ p

38

(unid

ades

arb

itra

rias)

IL-1β - + - + + CORM-2 (μM) - - 200 100 200

IL-1β - + - + + CORM-2 (μM) - - 200 100 200

IL-1β - + - + + CORM-2 (μM) - - 200 100 200

IL-1β - + - + + CORM-2 (μM) - - 200 100 200

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (100 μM) en presencia o ausencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 5 minutos. Las formas fosforiladas y totales de Akt (A), ERK 1/2 (B), JNK 1/2 (C) y p38 (D) se determinaron por Western Blot en los lisados celulares. Resultados expresados como media ± error de la relación entre la DO de las formas fosforiladas y sus correspondientes formas totales. Las imágenes son representativas de tres experimentos diferentes. t de Dunnett, + p<0,05 y ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05 y ** p<0,01, respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β.

Resultados _____________________________________________________________________________

199

5.6.10) Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la activación de factores

de transcripción

En una última etapa, determinamos los posibles efectos de CORM-2 sobre NF-ĸB y

AP-1, factores implicados en la regulación de numerosos genes implicados en la

inflamación sinovial OA (Revisado por Firestein y Manning, 1999). Los efectos de

CORM-2 sobre NF-ĸB se determinaron mediante la cuantificación de la fosforilación de

IĸBα, que en condiciones normales mantiene retenidas en el citoplasma a las

subunidades p50 y p65 de NF-ĸB, mediante la posterior translocación de p65 del

citoplasma al núcleo y mediante la unión de NF-ĸB a su secuencia consenso en el ADN,

mientras que los efectos de CO sobre AP-1 se estudiaron por su unión al ADN.

El CO liberado por CORM-2 disminuyó significativamente, a las dos concentraciones

testadas, la unión de NF-ĸB al ADN en comparación con la inducida por IL-1β (Figura

94C). Profundizando en este efecto, observamos a continuación que el tratamiento

con concentraciones crecientes de CORM-2 fue capaz de disminuir a su vez la

translocación de p65 del citoplasma al núcleo (Figura 94A). No hay que olvidar que la

fosforilación de IB es una de las etapas más importantes para la activación de NF-ĸB,

ya que induce la degradación de la misma y posibilita la liberación de p65 y su

posterior translocación al núcleo. Por este motivo, determinamos a continuación la

influencia de CORM-2 a este nivel. Los resultados incluidos en la Figura 94B

demuestran que el tratamiento con CORM-2 fue capaz de reducir la fosforilación de

IBα, inducida previamente por estimulación con IL-1β durante 30 minutos.

A nivel de AP-1 detectamos que, si bien el incremento inducido por estimulación

con IL-1β fue menor que el inducido sobre NF-ĸB, de acuerdo con la Figura 94D, el

tratamiento de los sinoviocitos con concentraciones crecientes de CORM-2, redujo

significativamente la unión de este factor a su secuencia consenso del ADN, impiendo

por tanto, la transcripción de sus genes diana.

Resultados _____________________________________________________________________________

200

Figura 94: Efectos del CO liberado por CORM-2 sobre la activación de NF-ĸB (A-C) y AP-1 (D) en sinoviocitos OA

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9 ++

* *

Unió

n N

F-

B-D

NA

(abs/

mg p

rote

ina)

IL-1β - + - + + CORM-2 (μM) - - 200 100 200

A B

Los sinoviocitos OA fueron incubados con CORM-2 (100 y 200 μM) en presencia de IL-1β (10 ng/mL) durante 30 min (B) o 1 hora (A, C, D). La fosforilación de IĸBα se determinó mediante ELISA en los extractos citosólicos (B), la translocación nuclear de p65 se analizó por inmunofluorescencia (A-B) y la unión de NF-ĸB/AP-1 al ADN se determinó por ELISA en los extractos nucleares (C). Resultados expresados como media ± error (n=4). t de Dunnett, + p<0,05 y ++ p<0,01 respecto a células no estimuladas, * p<0,05, ** p<0,01 respecto a células tratadas con el estímulo IL-1β. Aumentos x400.

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6+

* *

Fosf

ori

lació

n IB

(abs/

mg p

rote

ína)

p65 DAPI

C

IL-1β - + - + + CORM-2 (μM) - - 200 100 200

IL-1β - + - + + CORM-2 (μM) - - 200 100 200

C

D

CO

RM

-2+IL

-1β C

ORM

-2+IL

-1β C

ORM

-2

IL-1

β

(-)

(

200µM

) (

100µM

) (

200µM

)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

** *

Unió

n A

P-1

-AD

N

(abs/

mg p

rote

ína)

6) D

iscu

sió

n

Discusión _____________________________________________________________________________

203

La OA, considerada por muchos como la enfermedad más antigua del mundo, es la

patología articular de mayor prevalencia en la sociedad actual, y sigue siendo una de

las pocas enfermedades crónicas relacionadas con la edad para la que existen pocos o

ningún tratamiento efectivo. Las terapias disponibles en la actualidad se centran en

aliviar la sintomatología, con escasos efectos destinados a mantener la integridad del

cartílago, debido en parte, a que la etiología de la OA, a día de hoy, no es del todo

conocida. Por tanto, es absolutamente necesario conocer, y también comprender los

mecanismos implicados en la patogénesis de la OA para poder desarrollar estrategias

terapéuticas capaces de contrarrestarlos.

Aunque en principio se consideraba que la OA afectaba únicamente a la integridad

del cartílago, hoy en día sabemos que afecta a la articulación de una manera global. La

participación de la membrana sinovial en el desarrollo del proceso patogénico que

conduce a la OA ha adquirido un interés creciente con el tiempo (Revisado por

Pelletier y cols, 2001), (Revisado por Martel-Pelletier y Pelletier, 2010). De hecho, a

pesar de que la teoría más aceptada es que el daño inicial se produce en el cartílago,

numerosas líneas de evidencia apoyan la importante contribución de los sinoviocitos al

daño del cartílago durante la OA, a través de la producción excesiva de numerosos

mediadores inflamatorios y catabólicos (Revisado por Sellam y Berenbaum, 2010).

Además, el engrosamiento de la membrana sinovial, y con ello la intensidad de la

sinovitis, determinado por distintas variantes de resonancia magnética, se correlaciona

con la aparición y severidad del dolor que se manifiesta durante la OA (Hill y cols,

2001), (Baker y cols, 2010).

La vía de la HO-1 ha demostrado poseer efectos beneficiosos en un gran número de

patologías (Revisado por Ryter y cols, 2006). El estudio del papel anti-inflamatorio de la

HO-1 representa una de las líneas prioritarias de investigación en nuestro laboratorio.

En la actualidad se está evaluando el papel de esta enzima en el contexto de

enfermedades inflamatorias crónicas, como la AR y también la OA. En esta última, los

trabajos previos llevados a cabo en cultivos celulares de condrocitos y en explantes de

cartílago han puesto de manifiesto el papel protector de la HO-1, bien por la inducción

de su expresión con la molécula CoPP, bien por el CO, metabolito de la reacción

Discusión _____________________________________________________________________________

204

catalizada por la HO-1 y liberado por la molécula CORM-2, sobre los procesos

inflamatorios y degenerativos que ocurren en el cartílago OA (Guillén y cols, 2008 a y

b), (Megías y cols, 2008 y 2009). Algunos autores han puesto de manifiesto que la HO-1

podría suponer también un mecanismo de control de la sinovitis en la AR (Kobayashi y

cols, 2006). Sin embargo, poco o nada se sabe acerca del papel de esta enzima en la

inflamación sinovial o sinovitis OA.

Modulación de la expresión de HO-1

por citocinas pro- y anti-inflamatorias implicadas en el proceso OA

Es por esto que uno de los objetivos de nuestro trabajo consistió en dilucidar el

papel de la HO-1 en este tejido. Kobayashi y cols demostraron en 2006 que las células

de la membrana sinovial artrítica y osteartrítica sobre-expresaban HO-1 con respecto a

los controles sanos (Kobayashi y cols, 2006). Por este motivo, y después de comprobar

la expresión de HO-1 en nuestro modelo in vitro de OA, nuestro primer propósito

consistió en determinar si distintas citocinas pro- y anti-inflamatorias implicadas en la

patogénesis de la OA, eran capaces de modular la expresión basal de HO-1 en

sinoviocitos OA. El estímulo de 24 horas con formas recombinantes de las citocinas

pro-inflamatorias IL-1β, TNF-α e IL-17 disminuyó significativamente y de un modo

concentración-dependiente la expresión basal de HO-1. Estos datos aportan nuevas

evidencias al hecho de que las citocinas pro-inflamatorias disminuyan la expresión de

HO-1 en la articulación OA, de forma similar a los resultados obtenidos por Fernández

y cols en condrocitos OA (Fernández y cols, 2003), Muz y cols en FLS artríticos

estimulados con IL-1β (Muz y cols, 2008) y Kirino y cols en monocitos humanos

estimulados con TNF-α (Kirino y cols, 2007). Por su parte, las citocinas anti-

inflamatorias IL-10 e IL-13, indujeron un aumento significativo de la expresión de HO-1,

en línea también con el estudio de Fernández y cols en condrocitos OA y con otros

trabajos que sugieren que ambas citocinas median sus efectos a través de esta vía: la

inducción de HO-1 por parte de IL-13 disminuye el efecto pro-apoptótico de TNF-α en

Discusión _____________________________________________________________________________

205

distintos modelos in vivo e in vitro de transplante cardíago homólogo (Ke y cols, 2002),

mientras que los efectos anti-inflamatorios de IL-10 en un modelo murino de shock

séptico dependen de la inducción de HO-1 (Lee y Chau, 2002).

En nuestro modelo experimental comprobamos que, en líneas generales, las

citocinas pro-inflamatorias, a la par que disminuyeron la expresión de HO-1,

aumentaron los niveles de distintas mediadores pro-inflamatorios y degenerativos,

como IL-6 y TNF-α y la actividad de distintas MMPs, cuyo papel es de sobra conocido

en el contexto de la OA (Revisado por Fernandes y cols, 2002), (Revisado por Murphy y

cols, 2002). De estas citocinas, únicamente IL-1β resultó capaz de incrementar también

la expresión de COX-2 y PGE2. Las citocinas anti-inflamatorias, por su parte, no

indujeron cambio alguno sobre la producción de ninguno de los mediadores testados.

Según estos datos, sin profundizar en el mecanismo de acción, parece que podría

existir una relación inversa entre la modulación de la expresión de HO-1 y el proceso

inflamatorio en sinoviocitos OA. De entre estas citocinas, y tal y como se ha

comentado en el capítulo de Revisión bibliográfica, es la IL-1β quien ejerce un papel

protagonista en la patogénesis de la OA, dirigiendo la producción de otros mediadores

catabólicos (Revisado por Jacques y cols, 2006), como hemos podido comprobar en

nuestros experimentos. Por este motivo, y también porque ha resultado la citocina

más potente en cuanto a la reducción de la expresión de HO-1 la seleccionamos como

estímulo pro-inflamatorio para el resto de series experimentales.

Papel de HMGB1 en la inflamación sinovial OA

En la búsqueda de nuevos mecanismos que pudieran estar implicados en la

fisiopatología de la OA, decidimos determinar los efectos de HMGB1 sobre la sinovitis

OA. Esta proteína fue descrita inicialmente a nivel nuclear (Goodwin y cols, 1973), pero

su interés aumentó considerablemente cuando se describió su liberación extracelular

durante procesos sépticos (Wang y cols, 1999). Posteriormente, y siempre en el medio

extracelular, se describió su capacidad de comportarse como una citocina pro-

Discusión _____________________________________________________________________________

206

inflamatoria más, ya que su presencia parecía suficiente para promover la síntesis de

TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, CCL2 y NO en cultivos de monocitos obtenidos de sangre

periférica humana (Andersson y cols, 2000), (Rouhianen y cols, 2007). Estos y otros

efectos que se le atribuyeron a nivel extracelular determinarían su participación en

numerosos procesos patológicos con un componente inflamatorio, como el cáncer, la

enfermedad inflamatoria intestinal, algunos trastornos respiratorios o la AR (Revisado

por Yang y Tracey, 2010), (Revisado por Sims y cols, 2010).

Se dispone de pocos datos acerca de la implicación de HMGB1 en la patogénesis de

la OA. La información acerca del papel de HMGB1 en esta enfermedad proviene de

estudios en los que se utilizaron muestras de membrana sinovial OA como controles

negativos de sus experimentos con muestras de AR. En éstas, casi siempre se describió

que la expresión de HMGB1 en la OA era menor que en AR, y que presentaba una

localización nuclear, lo que a priori, le impediría comportarse como una citocina pro-

inflamatoria en la OA (Kokkola y cols, 2002), (Taniguchi y cols, 2003). En cambio, en un

trabajo reciente con muestras de cartílago bovino, se ha puesto de manifiesto que

conforme avanza el proceso OA, la localización de HMGB1 en el cartílago pasa de ser

predominantemente nuclear a citosólica (Heinola y cols, 2010).

En un estudio en colaboración con los doctores JP Pelletier y J Martel-Pelletier

comprobamos que HMGB1 presenta un patrón de distribución similar en la membrana

sinovial sana y en la OA, ya que en ambos casos aparece tinción positiva al HMGB1 en

células de las capas íntima y subíntima, así como en las células del infiltrado

inflamatorio. Sin embargo, HMGB1 se encuentra sobre-expresado en el sinovio OA por

el engrosamiento de la capa íntima y por la elevada presencia de infiltrado de células

inflamatorias. En cuanto a su localización celular, en el tejido sano la tinción positiva

para HMGB1 se da sobre todo a nivel nuclear, mientras que en el tejido OA HMGB1 se

encuentra principalmente a nivel citosólico y también a nivel extracelular (García-

Arnandis y cols, 2010b).

En vista de estos datos nos planteamos la posibilidad de que HMGB1 pudiera

ejercer algún papel durante el desarrollo de la sinovitis OA. Para ello, los sinoviocitos

fueron estimulados con HMGB1, tanto en presencia como en ausencia del estímulo

pro-inflamatorio IL-1β. Desde hace unos años parece estar aceptado que HMGB1 por sí

Discusión _____________________________________________________________________________

207

mismo es incapaz de ejercer los efectos pro-inflamatorios que se le atribuyeron

inicialmente (Rouhianen y cols, 2007). En línea con estos datos, nuestros

experimentos, realizados con una forma recombinante humana, altamente purificada,

de HMGB1, revelaron que esta proteína fue incapaz de modificar por sí misma, a

ninguna de las concentraciones testadas, los niveles de expresión de los distintos

mediadores catabólicos analizados. Sin embargo, en presencia de IL-1β, HMGB1 indujo

un potente incremento, de un modo concentración dependiente, de la expresión de

dichos mediadores, como la citocina pro-inflamatoria IL-6. Es interesante señalar que

un estudio reciente llevado a cabo también en sinoviocitos, ha demostrado el

incremento en la expresión de IL-6 por parte de complejos pre-formados de HMGB1

(100 ng/mL) e IL-1β (0,05 ng/mL), ésta última utilizada a una concentración incapaz de

inducir, por sí misma, la liberación de IL-6. Estos autores comprobaron además que la

respuesta de los sinoviocitos procedentes de AR y de OA era similar (Hreggvidsdottir y

cols, 2009).

La importancia de las quimiocinas en la OA radica en el hecho de que no sólo

promueven procesos de migración celular, sino que contribuyen activamente a la

degeneración del cartílago a través de la síntesis de proteasas (Borzì y cols, 2000), de la

inducción de hipertrofia (Cecil y cols, 2005) y de procesos apoptóticos en condrocitos,

(Borzì y cols, 2002), (Wei y cols, 2006) entre otros. En nuestro estudio hemos

comprobado los efectos de HMGB1 potenciando la producción de las quimiocinas IL-8,

CCL2 y CCL20 en sinoviocitos OA estimulados con IL-1β. IL-8 es la quimiocina de la

familia CXC más conocida, y es sintetizada tanto por fibroblastos como por macrófagos

del tejido sinovial (Koch y cols, 1991). Por su parte, CCL2 ha demostrado su habilidad

para inducir procesos quimiotácticos de fibroblastos y macrófagos sinoviales (Akahoshi

y cols, 1993), (García-Vicuña y cols, 2004), mientras que CCL20 promueve la migración

de monocitos y linfocitos de memoria desde la sangre periférica hacia la articulación

artrítica (Ruth y cols, 2003). Por todo esto, el aumento en la expresión de estos

mediadores por parte de HMGB1 apoya el papel de esta proteína en la amplificación

de la respuesta inflamatoria inducida por IL-1β en sinoviocitos OA.

Los mediadores lipídicos, entre ellos la PGE2, ejercen un papel importante en el

desarrollo de procesos inflamatorios. Los niveles de este prostanoide, así como los de

Discusión _____________________________________________________________________________

208

las enzimas PLA2, COX-2 y mPGES-1 aumentan considerablemente en presencia de IL-

1β en las células de la membrana sinovial (Gilman y cols, 1988), (Crofford y cols, 1994),

(Stichtenoth y cols, 2001) y han sido asociados con la patogénesis de la OA (Revisado

por Park y cols, 2006). Por su parte, HMGB1 ha demostrado su capacidad de potenciar

estos efectos de la IL-1β en células del músculo liso (Jaulmes y cols, 2006), resultados

que son similares a los nuestros, ya que en nuestros cultivos de sinoviocitos OA,

HMGB1 ha demostrado potenciar los efectos de IL-1β sobre la expresión de COX-2 y en

menor medida de mPGES-1, así como sobre los niveles de PGE2.

Las MMPs ejercen un papel destacado en la degeneración articular OA por su

capacidad de degradar distintos componentes de la matriz extracelular del cartílago

(Revisado por Murphy y cols, 2002). En nuestro estudio hemos demostrado la

capacidad de HMGB1 de potenciar los efectos de IL-1β a nivel de la actividad y de la

expresión de MMP-1 y MMP-3. MMP-1 degrada las fibras de colágeno de la matriz

(Poole y cols, 2003), (Wu y cols, 2002), mientras que la importancia de la MMP-3,

radica en que no sólo es capaz de degradar distintos componentes de la matriz

extracelular sino que, a su vez, es capaz de inducir la activación de distintas

colagenasas (Okada y cols, 1992). También hemos determinado los niveles de la MMP-

13, en la que HMGB1 no potenció los efectos de IL-1β, y cuyos niveles fueron muy

reducidos en comparación con los anteriores, lo que podría sugerir que la relevancia

de ésta en el sinovio OA sea menor que a nivel del cartílago (Yoshihara y cols, 2000). En

vista de estos datos podemos sugerir que HMGB1 no sólo potencia los efectos pro-

inflamatorios de la IL-1β sino que es capaz de actuar también a nivel de los efectos

degenerativos promovidos por ésta durante la OA.

Se ha descrito que HMGB1 posee efectos proliferativos y anti-apoptóticos que

podrían resultar beneficiosos en el contexto de la regeneración tisular (Revisado por

Germani y cols, 2007), pero que podrían contribuir a intensificar el daño en procesos

inflamatorios. En esta línea, los efectos catabólicos de HMGB1 durante la progresión

de la AR han sido ampliados recientemente por un estudio que demuestra la inducción

en la proliferación de sinoviocitos por parte de esta proteína, a través de un

mecanismo que incluye la activación del transductor de señal y activador de

transcripción STAT (Guo y cols, 2010). En nuestras condiciones experimentales

Discusión _____________________________________________________________________________

209

detectamos que, si bien la proliferación de las células tratadas con HMGB1 fue similar

a la basal, el estímulo concomitante de HMGB1 e IL-1β potenció significativamente la

tasa de proliferación celular.

Recientemente se ha relacionado el HMGB1 con el estrés oxidativo (Revisado por

Tang y cols, 2010), cuyos niveles contribuyen activamente a la degeneración del

cartílago durante la OA (Revisado por Henrotin y cols, 2003). Al igual que ocurrió con la

proliferación y el resto de mediadores determinados, también los niveles de ROS se

vieron considerablemente inducidos en las células estimuladas con HMGB1 e IL-1β.

En conjunto, la potenciación de los efectos de la IL-1β por parte del HMGB1 en

sinoviocitos OA está en concordancia con estudios previos que pusieron de manifiesto

la interacción entre HMGB1 e IL-1β en otros tipos celulares (Sha y cols, 2008), (Qin y

cols, 2009), (Hreggvidsdottir y cols, 2009). Además, no observamos efecto alguno

cuando estimulamos los sinoviocitos simultáneamente con HMGB1 y TNF-α (datos no

mostrados), lo que estaría en línea con trabajos previos que comprobaron que la unión

de HMGB1 con IL-1β o LPS es mucho más potente que con TNF-α, IFN-γ y otros

ligandos (Sha y cols, 2008), (Hreggvidsdottir y cols, 2009).

Los efectos de HMGB1 en el medio extracelular dependen de su unión a receptores

de membrana. Las células de la membrana sinovial OA expresan los receptores TLR-2 y

TLR-4 (Radstake y cols, 2004) y también RAGE (Drinda y cols, 2005), que median los

efectos de HMGB1 en numerosos tipos celulares (Revisado por Yang y Tracey, 2010).

Con el propósito de conocer en qué medida están implicados estos receptores en los

efectos de HMGB1 en nuestro modelo de sinoviocitos OA, llevamos a cabo una serie

de experimentos de bloqueo de dichos receptores mediante el empleo de anticuerpos

neutralizantes. Nuestros datos sugieren que es el receptor RAGE quien posee un papel

más relevante en los efectos de HMGB1 en nuestro modelo experimental. Aunque a

priori pueda resultar complicado determinar la participación de varios receptores en

reacciones de sinergia o potenciación, sería interesante profundizar en el estudio de

los receptores implicados en los efectos de HMGB1+IL-1β, utilizando otras estrategias

como el silenciamiento génico.

Para completar este estudio, determinamos los efectos de HMGB1 sobre la

activación de distintas vías de señalización y factores de transcripción. La vía de las

Discusión _____________________________________________________________________________

210

MAPK regula la transcripción de numerosos genes que participan en el desarrollo de

procesos inflamatorios. Nuestros resultados demuestran que HMGB1 aumenta

significativamente la fosforilación de p38, que participa activamente en la inducción de

los genes de IL-6 e IL-8 en sinoviocitos humanos de tipo fibroblasto estimulados con IL-

1β (Miyazawa y cols, 1998), (Suzuki y cols, 2000). También actúa sobre la fosforilación

de ERK 1/2, de la que depende la producción de MMP-1 en sinoviocitos estimulados

con IL-1β (Pillinger y cols, 2003). En contraposición, no detectamos efecto alguno de

HMGB1 sobre la fosforilación de la tercera MAPK, JNK 1/2, inducida potentemente por

IL-1β, y que regula la activación de AP-1 y otros factores de transcripción (O´Hagan y

cols, 1996). Además, se detectó que HMGB1 potenciaba también la fosforilación de

Akt, una vía estrechamente relacionada con los procesos proliferativos y de

supervivencia en fibroblastos de membrana sinovial artrítica (Zhang y cols, 2001) y que

contribuye activamente a la degeneración del cartílago, ya que se ha visto que la

inducción de distintas proteasas tras estimular los condrocitos con oncostatina M, sola

o en presencia de IL-1β, depende de su activación (El Mabrouk y cols, 2007),

(Litherland y cols, 2008). A nivel del estrés oxidativo, un estudio previo demostró que

la estimulación de células polimorfonucleares con HMGB1 induce la activación de la

NADPH oxidasa, a la vez que incrementa la producción de ROS, a través de

mecanismos dependientes de las cascadas de señalización de TLR-4, en concreto de

MyD88-IRAK4-p38 y MyD88-IRAK4-Akt (Fan y cols, 2007b). También en nuestro

estudio, si bien parece que la participación de TLR-4 en los efectos de HMGB1 sea

reducida, hemos detectado un incremento en la fosforilación de p38 y Akt, que podría

ser responsable del incremento en la generación de ROS en sinoviocitos OA

estimulados con HMGB1 e IL-1β.

Numerosos estudios sugieren que la producción, espontánea o inducida, de

distintos mediadores inflamatorios y degenerativos por parte de las células de la

membrana sinovial OA depende de la activación de NF-ĸB (Amos y cols, 2006),

(Bondeson y cols, 2007). En concreto, los niveles de IL-6 (Miyazawa y cols, 1998), IL-8

(Stein y Baldwin, 1993), CCL2, CCL20 (Schutyser y cols, 2003), (Xing y cols, 2007), COX-2

(Crofford y cols, 1997) y también de las MMPs (Vincenti y cols, 1999), (Barchovsky y

cols, 2000), dependen de NF-ĸB, cuya actividad transcripcional resultó incrementada

Discusión _____________________________________________________________________________

211

en células tratadas con HMGB1 en presencia de IL-1β. Hay que tener en cuenta

además que una elevada presencia de ROS promueve a su vez la activación de NF-ĸB

(Revisado por Gloire y cols, 2006), de modo que el aumento en los niveles de ROS

inducido por HMGB1 e IL-1β podrían contribuir a intensificar, aún más, el daño

inducido por estos estímulos en sinoviocitos OA.

En líneas generales, podríamos concluir que la activación sostenida de las MAPK, de

Akt y de NF-ĸB por parte de HMGB1+IL-1β contribuye, mediante el aumento de la

proliferación celular, el estrés oxidativo y la síntesis de mediadores de naturaleza

catabólica, al mantenimiento de un entorno inflamatorio y degenerativo en la

membrana sinovial OA.

Relación entre HMGB1 y HO-1

Algunos autores han puesto de manifiesto la relación entre HO-1 y HMGB1, sobre

todo a nivel de procesos sépticos. En líneas generales, parece que existe una

correlación inversa entre ellas, tal y como lo demuestra el hecho de que ratones knock

out en HO-1 presenten niveles aumentados de HMGB1 y peor pronóstico en un

modelo de endotoxemia pulmonar (Takamiya y cols, 2009). De acuerdo con los datos

obtenidos en el capítulo de las citocinas y la HO-1, si consideramos que HMGB1 se

comporta como una citocina pro-inflamatoria más, debería comportarse como éstas

en cuanto a la expresión de HO-1, motivo por el cual estudiamos los efectos de HMGB1

sobre la HO-1: mientras que a nivel de ARNm no detectamos efecto alguno, la

estimulación de las células con HMGB1 disminuyó ligeramente la expresión basal de

HO-1, disminución que resultó mayor cuando las células se co-incubaron con HMGB1 e

IL-1β.

En vista de estos datos, decidimos estudiar los efectos de HMGB1 sobre las vías de

transcripción relacionadas con la HO-1. Como se ha descrito previamente, distintos

factores de transcripción y vías de señalización, como NF-ĸB, Nrf2 y la familia de las

MAPK participan en la inducción de la expresión de HO-1 (Revisado por Alam y Cook,

2007). Descartamos la participación de NF-ĸB y de las MAPK ya que el estímulo

Discusión _____________________________________________________________________________

212

concomitante de HMGB1 e IL-1β, que disminuyó significativamente la expresión de

HO-1, promovió la activación de ambas vías, por lo que estudiamos los efectos de

HMGB1 sobre la unión del factor de transcripción Nrf2 a su secuencia consenso en el

ADN. En condiciones basales Nrf2 se encuentra en el citoplasma unido a la proteína

Keap1, mientras que en presencia de ROS, se disocia de ésta y sufre un proceso de

translocación del citoplasma al núcleo donde, mediante la unión con proteínas Maf y

otros factores, promueve la expresión de genes que que confieren protección frente al

daño inducido por estrés oxidativo y también frente a la producción en exceso de

citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión etc., entre los que se encuentra la HO-1

(Revisado por Kim y cols, 2010). En nuestro estudio hemos comprobado que la citocina

pro-inflamatoria IL-1β redujo la activación de Nrf2, lo que justificaría la disminución de

la expresión de HO-1 por esta citocina, mientras que HMGB1 fue incapaz de ejercer

efecto alguno, ni en presencia ni en ausencia de IL-1β. Teniendo en cuenta este

resultado, y considerando también que a nivel de ARNm no observamos efecto alguno

de HMGB1 sobre HO-1, deducimos que la regulación de la expresión proteica de HO-1

por parte de HMGB1 podría tener lugar a nivel post-transcripcional.

Efectos de la inducción de HO-1 por CoPP y LV HO-1 en sinoviocitos OA

Una vez conocida la susceptibilidad de la HO-1 de ser modulada por una serie de

citocinas implicadas en la patogénesis de la OA, a las cuales habría que añadir el

HMGB1, decidimos determinar las consecuencias de la sobre-expresión de HO-1 por

distintos mecanismos. En primer lugar determinamos los efectos de la inducción de la

expresión de HO-1 por la molécula CoPP sobre una serie de parámetros característicos

del proceso inflamatorio de la OA.

Una de las principales características de la sinovitis OA es la hiperplasia, sobre todo

a nivel de las células que componen la capa íntima. Se ha llegado incluso a observar

que el grado de proliferación de los sinoviocitos OA es en ocasiones similar al

Discusión _____________________________________________________________________________

213

detectado durante la progresión de la sinovitis artrítica (Furuzawa-Carballeda y cols,

2008). En nuestro estudio hemos comprobado que CoPP revierte la proliferación

celular inducida por IL-1β devolviéndola a valores similares a los basales. Además, esta

molécula ha resultado ser efectiva reduciendo la activación de las vías NF-ĸB y PI3-

K/Akt que no sólo conducen a un aumento en la transcripción de genes inflamatorios y

degenerativos, sino que promueven la supervivencia de células sinoviales AR (Revisado

por Liu y Pope, 2003). En esta línea, Lee y cols demostraron que la activación de NF-ĸB

es necesaria para el aumento en la proliferación de FLS de AR estimulados con IL-1β

(Lee y cols, 2009). Por tanto, cabe pensar que el efecto de CoPP contrarrestando la

proliferación celular inducida por IL-1β podría deberse a la reducida activación de estas

vías.

Durante el desarrollo de todo proceso inflamatorio se generan cantidades elevadas

de ROS que contribuyen a cronificar el daño inducido por otros mediadores. En el caso

concreto de la OA, el aumento de éstos y otros radicales con la edad puede ejercer un

papel clave durante la progresión de la enfermedad (Revisado por Henrotin y cols,

2003), lo que ha propiciado el estudio de estrategias anti oxidantes dirigidas a

contrarrestar estos procesos. En este contexto no hay que olvidar la actividad

antioxidante de la inducción de HO-1 en numerosos tipos celulares, bien por

disminución en la biodisponibilidad del grupo hemo, bien por la generación de

moléculas con capacidad antioxidante (Revisado por Alcaraz y cols, 2003). En línea con

los efectos antioxidantes de la vía de la HO-1, y en línea con los datos previos

obtenidos a nivel del cartílago (Megías y cols, 2009), el tratamiento de los sinoviocitos

OA con CoPP fue capaz de contrarrestar la generación de ROS, lo que representa una

estrategia más para el control de la sinovitis OA y la degeneración del cartílago

provocada por ésta. Numerosos estudios han comprobado que las ROS regulan la

activación de distintas vías de señalización y factores de transcripción sensibles a

procesos de oxidación-reducción, como las MAPK, NF-ĸB o AP-1 (Revisado por

Henrotin y cols, 2003), por lo que pensamos que la reducida generación de ROS por

parte de CoPP podría estar relacionada con la disminución en la activación de MAPK y

de NF-ĸB ejercida también por este inductor de HO-1.

Discusión _____________________________________________________________________________

214

Los efectos anti-inflamatorios que se le atribuyen a la vía de la HO-1 pasan, en la

mayor parte de los casos, por la reducción en la producción de mediadores pro-

inflamatorios como el NO, las citocinas, los eicosanoides, etc. (Revisado por Alcaraz y

cols, 2003). Además, la ausencia de HO-1 en ratones knock out en esta proteína se

relaciona con un aumento en la respuesta pro-inflamatoria (Kapturczak y cols, 2004).

Durante la OA, los niveles de NO se encuentran fuertemente aumentados, aunque

parece que las células de la membrana sinovial OA no son una fuente de dicho

mediador (Rediske y cols, 1994). De hecho, en nuestro modelo experimental no

detectamos niveles de NO, medido en forma de nitrito, ni en células basales ni en

células estimuladas con IL-1β (datos no mostrados). En cuanto a la producción de

citocinas, CoPP no pareció ser efectivo frente a las citocinas pro-inflamatorias IL-6 y

TNF-α, aunque de esta última se obtuvieron valores muy reducidos que sugieren una

menor participación de la misma en nuestro modelo experimental. En cambio, IL-1β

indujo un aumento en la expresión de la citocina anti-inflamatoria IL-10, que podría

resultar paradójico ya que IL-1β es una de las citocinas con mayor actividad catabólica

en la articulación OA mientras que IL-10 es una citocina con actividad anti-inflamatoria.

Sin embargo, podría tratarse de una respuesta de retroalimentación negativa,

destinada a contrarrestar o limitar el daño inducido por IL-1β. En esta línea, un estudio

sugirió que la inducción de IL-10 por parte de TNF-α en monocitos humanos formaba

parte de un mecanismo de retroalimentación (Wanidworanun y Strober, 1993). En

nuestros experimentos, el tratamiento con CoPP en presencia de IL-1β aumentó aún

más los niveles de lL-10, citocina que como hemos descrito previamente, media sus

efectos anti-inflamatorios, al menos en parte, a través de la HO-1 y cuya producción se

ve incrementada por la trasfección de cDNA de HO-1 en un modelo de daño pulmonar

(Inoue y cols, 2001a).

La participación de las quimiocinas en la patogénesis de la OA está aceptada,

aunque su papel en la membrana sinovial OA sea menos conocido que en el cartílago.

Sabemos que, aunque en pequeñas cantidades, los sinoviocitos OA secretan

espontáneamente algunas quimiocinas, cuyos niveles aumentan considerablemente en

presencia de distintos estímulos pro-inflamatorios (De Marco y cols, 1991), (Chabaud y

cols, 2001). Nuestros resultados demuestran que la inducción de HO-1 por CoPP

Discusión _____________________________________________________________________________

215

disminuye la migración celular a la vez que reduce la expresión de las quimiocinas CCL2

y CCL20. Estos datos están en línea con trabajos previos que demuestran que la

inducción de HO-1 y de Nrf2 disminuye la expresión de CCL2 en otros tipos celulares

(Shokawa y cols, 2006), (Murali y cols, 2007), (Levonen y cols, 2007). Otros autores han

demostrado además que la sobre-expresión de HO-1 por hemina, por taurina

cloramina o por transfección de cDNA de HO-1 disminuye la secreción de IL-8 en FLS de

AR (Kobayashi y cols, 2006), (Muz y cols, 2008). En cambio, Loboda y cols pusieron de

manifiesto que CoPP aumenta significativamente los niveles de IL-8, aunque a través

de un mecanismo independiente de la HO-1, en células endoteliales (Loboda y cols,

2006). Ello podría justificar que el tratamiento con CoPP apenas modificara la

producción de esta quimiocina en nuestras condiciones experimentales. En líneas

generales, pensamos que los efectos de la inducción de HO-1 sobre las quimiocinas

resultan interesantes, no sólo por la disminución en la migración que conllevan, sino

porque una elevada presencia de estos mediadores en el fluido sinovial influye muy

negativamente sobre la integridad del cartílago articular, a través de la inducción de

MMPs, del aumento en la invasividad y proliferación celular etc.

La inducción de HO-1 por CoPP en nuestro modelo de sinoviocitos humanos OA ha

demostrado disminuir la expresión de distintas MMPs, cuyos niveles resultan

fuertemente inducidos por IL-1β tras 24 horas de estímulo. Estos datos apoyan los

resultados previos obtenidos en condrocitos (Guillén y cols, 2008a), y tienen un

particular interés en el contexto del posible papel protector de la HO-1 en el cartílago

OA, dada la importancia de MMP-1 y MMP-3 en la degradación del colágeno y en la

activación de colagenasas, respectivamente. Es más, las elevadas cantidades de MMP-

3 secretada al fluido sinovial sugieren que el tejido sinovial constituye la mayor fuente

de ésta (Lohmander y cols, 1993). También hemos determinado los niveles de MMP-13

en su forma inactiva, y a pesar de que CoPP demostró ser efectivo también sobre esta

pro-enzima, los niveles obtenidos, mucho menores que los anteriores, nos sugieren

que el papel de esta enzima en el sinovio OA sea menos relevante que otras MMPs. En

un estudio comparativo entre fibroblastos de fluido sinovial y de sinovio OA se

demostró que MMP-3 era la MMP cuya síntesis resultaba más inducida por distintas

citocinas, en particular por IL-1β, seguida de la MMP-1. En cambio, los niveles de

Discusión _____________________________________________________________________________

216

MMP-13, tanto en células no estimuladas como en células estimuladas con distintas

citocinas, fueron bastante reducidos (Fuchs y cols, 2004). Estos datos nos hacen pensar

que el control de las MMPs a nivel del sinovio OA sería mucho más interesante sobre

las MMP-1 y -3, lo que apoya la idea de que las MMP-1 y MMP-3 representan una de

las dianas más relevantes sobre las que actuar a nivel de la membrana sinovial OA.

Una interesante estrategia terapéutica para contrarrestar la inflamación sinovial OA

supondría el contrarrestar la activación del HMGB1, toda vez que conocemos su

implicación en este proceso. Así se está haciendo en la sinovitis característica de la AR,

en la que el papel de HMGB1 es más conocido (Revisado por Ulloa y cols, 2003),

(Revisado por Andersson y Erlandsson-Harris, 2004), (Revisado por Andersson y Harris,

2010). Algunos fármacos antirreumáticos ya comercializados, como el aurotiomalato

sódico, la dexametasona o la cloroquina han resultado ser efectivos, al menos in vitro,

a nivel de HMGB1 (Zetterstrom y cols, 2008), (Schierbeck y cols, 2010). En relación con

la HO-1, no hay que olvidar que tanto la inducción de ésta por hemina o por CoPP,

reduce la secreción extracelular de HMGB1 en distintos modelos in vitro e in vivo de

shock séptico (Gong y cols, 2008), (Tsoyi y cols, 2009). De acuerdo con estos

precedentes, nos planteamos la posibilidad de que el tratamiento con CoPP, a través

de la HO-1, fuera capaz de actuar sobre la expresión de HMGB1. Nuestros resultados

indican que el estímulo pro-inflamatorio IL-1β aumenta la expresión de HMGB1 tras 24

horas de estímulo, efecto que disminuye considerablemente en las células tratadas

con CoPP. Además, nuestros experimentos con IL-1β muestran cómo esta citocina

potencia significativamente los procesos de translocación citoplasmática, como

comprobaron previamente Wang y cols en macrófagos murinos (Wang y cols, 1999),

proceso reducido en presencia de CoPP, como determinamos por Western Blot en los

extractos nucleares y citosólicos y que confirmamos posteriormente por

inmunofluorescencia. Ya que este tratamiento resultó capaz de contrarrestar las dos

etapas anteriores, era lógico pensar que pudiese interferir también el proceso de

secreción extracelular, como demostramos mediante la determinación de los niveles

de HMGB1 en el medio de cultivo.

Aunque la prevalencia de un receptor u otro como responsable de los efectos del

HMGB1 es un aspecto que a día de hoy no está totalmente resuelto, de acuerdo con

Discusión _____________________________________________________________________________

217

nuestros datos de la serie de HMGB1, parece que el receptor RAGE ejerce un papel

destacado en los efectos de este estímulo en nuestras condiciones experimentales, por

lo que, en este contexto es interesante señalar que la inducción de HO-1 conseguida

por CoPP resulta capaz de reducir la expresión de RAGE en sinoviocitos OA.

La activación de Akt y de las enzimas de la familia de las MAPK, así como la

activación de NF-ĸB, contribuyen al desarrollo y progresión de la OA. En concreto, la

activación de las MAPK por IL-1β promueve efectos catabólicos en condrocitos

humanos articulares (Fan y cols, 2007a), mientras que el empleo de inhibidores

farmacológicos de IKK, como ejemplo de agentes inhibidores de la activación de NF-ĸB,

contrarresta los niveles de citocinas y MMPs inducidos fuertemente por la

estimulación con IL-1β en células y explantes de tejido sinovial OA (Lauder y cols,

2007). Por todo esto, pensamos que resultaría interesante conocer los efectos de CoPP

a este nivel. Así, esta molécula resultó capaz de contrarrestar la fosforilación y la

consiguiente activación de las MAPK ERK 1/2, JNK 1/2, p38 y también de Akt. Además,

CoPP fue capaz de disminuir la unión de NF-ĸB a su secuencia consenso en el ADN

mediante la inhibición en la fosforilación de IĸBα y la reducción en la translocación

p65. Por todo esto, y considerando que, en líneas generales, la activación de estas vías

promueve procesos de activación celular y de expresión de genes pro-inflamatorios y

degenerativos, podríamos relacionar los efectos beneficiosos del tratamiento con CoPP

a nivel de proliferación y estrés, y también sobre la producción de quimiocinas y

MMPs, con la reducción en la activación de estas vías de señalización.

Algunos estudios han puesto de manifiesto la implicación de las MAPK en el control

de la expresión y liberación de HMGB1 por parte de distintos estímulos catabólicos

(Tang y cols, 2007), (Hayakawa y cols, 2010). En concreto, Hayakawa y cols han

comprobado que la secreción de HMGB1 en cultivos primarios de astrocitos

estimulados con IL-1β depende de la activación de ERK 1/2 (Hawakaya y cols, 2010),

dato que podríamos relacionar con nuestros resultados, en los que la disminución

sostenida de las MAPK por parte de CoPP podría ser responsable de la reducida

liberación extracelular de HMGB1.

La mayor parte de los efectos observados por el tratamiento con CoPP son

dependientes de la HO-1, puesto que la presencia de un siRNA específico de HO-1 los

Discusión _____________________________________________________________________________

218

contrarresta. No obstante, decidimos confirmar dichos efectos mediante la sobre-

expresión directa de HO-1, para lo que recurrimos a la transfección de vectores virales,

ampliamente utilizados en el campo de la terapia génica. En concreto trabajamos con

vectores lentivíricos modificados para sobre-expresar el gen de la HO-1, cuya utilidad

ha sido demostrada en distintos modelos de enfermedad, como la hipertensión

arterial (Cao y cols, 2010). Esta serie experimental nos sirvió para confirmar que los

efectos protectores de la HO-1 en sinoviocitos OA, son debidos a la reducción en la

expresión de MMPs, de quimiocinas y también de HMGB1.

Efectos del CO liberado por CORM-2 en sinoviocitos OA

El CO endógeno ha demostrado poseer efectos vasoactivos, anti-proliferativos,

antioxidantes y anti-inflamatorios que contribuyen a los efectos protectores de la HO-1

(Revisado por Bauer y Pannen, 2010). Es por esto que se han ensayado distintas

estrategias terapéuticas con las que poder mimetizar los efectos de este gas. Así, la

inhalación de CO ha demostrado resultar beneficiosa en distintos modelos de

enfermedad (Revisado por Ryter y cols, 2006). En esta línea, el desarrollo de moléculas

con capacidad de liberar CO a los tejidos biológicos resulta una estrategia muy

interesante. De hecho, algunas de éstas moléculas, conocidas como CORMs, han

conseguido reproducir los efectos del CO en numerosos modelos de enfermedades

inflamatorias (Revisado por Alcaraz y cols, 2008). Quizás, la principal limitación que

presentan estos agentes es que, a día de hoy, se desconoce si la cantidad de CO

liberado por los mismos es comparable con la cantidad de CO liberado por acción de la

enzima HO-1, tal y como recoge un estudio reciente con CORM-3 (Urquhart y cols,

2007). No obstante, otros autores defienden que es necesario el empleo de

concentraciones suprafisiológicas de CORM-2 para contrarrestar los procesos

patológicos en los que sea útil una sobre-activación de la vía de la HO-1, en tanto que

la HO-1 fisiológica resulta incapaz de detener el daño (Song y cols, 2009).

Estudios previos de nuestro laboratorio en un modelo de condrocitos OA han

puesto de manifiesto la utilidad de CORM-2, ya que al igual que la inducción de HO-1

Discusión _____________________________________________________________________________

219

por CoPP, protege frente a los efectos catabólicos y anti-anabólicos de la IL-1β a través

de la inhibición de distintos factores de transcripción (Megías y cols, 2008), (Guillén y

cols, 2008b). En cambio, los efectos de los CORMs a nivel de la membrana sinovial OA

son desconocidos, por lo que en la última etapa de esta Tesis, y tras haber confirmado

los efectos beneficiosos de la inducción de HO-1, decidimos explorar los efectos de la

molécula CORM-2 en nuestro modelo celular.

Algunos autores han demostrado la capacidad de los CORMs de inducir la expresión

de HO-1 en células basales no estimuladas (Sawle y cols, 2005). En nuestro estudio

hemos comprobado que, si bien concentraciones crecientes de CORM-2 son capaces

de inducir dicha expresión, cuando se tratan las células en presencia del estímulo pro-

inflamatorio IL-1β, los niveles de expresión de HO-1 son bastante similares a los

basales, ya que CORM-2 es incapaz de revertir los efectos inhibitorios de IL-1β sobre la

expresión de HO-1. Este dato es similar al obtenido en condrocitos OA estimulados con

IL-1β, ya que también en éstos la inducción de HO-1 es bastante débil (Guillén y cols,

2005), y sugiere que los efectos de CORM-2 en sinoviocitos OA no dependen, o

dependen muy ligeramente, de la inducción de HO-1.

Al igual que ocurrió con la inducción de HO-1 por CoPP, también CORM-2 fue capaz

de disminuir la proliferación celular inducida por estimulación con IL-1β y que

podríamos relacionar con la inhibición en la activación de NF-ĸB, AP-1 y también con la

inhibición de la fosforilación de ERK 1/2 ejercida por CORM-2, ya que distintos estudios

han puesto de manifiesto la relación entre la activación de estas vías y la inducción de

la proliferación en FLS estimulados con IL-1β (Inoue y cols, 2001b), (Morita y cols,

1998), (Revisado por Mor y cols, 2005).

Son pocos los datos disponibles acerca de los efectos de los CORMs sobre la

producción de quimiocinas. Se ha visto que CORM-3 modula la migración leucocitaria

en un modelo animal de sepsis (Mizuguchi y cols, 2009), mientras que CORM-2

disminuye la expresión de IL-8 en un modelo in vitro de enfermedad inflamatoria

intestinal (Megías y cols, 2007). En nuestro estudio hemos demostrado los efectos de

CORM-2 reduciendo la expresión de las quimiocinas IL-8, CCL2 y CCL20, que podrían

ser responsables a su vez, de la reducida tasa de migración ejercida por este

tratamiento. La producción de quimiocinas en el sinovio OA se relaciona, como hemos

Discusión _____________________________________________________________________________

220

visto previamente, con la activación de NF-ĸB, por lo que los efectos de CORM-2 sobre

estos mediadores podrían deberse a la reducida activación de dicho factor, ya que

CORM-2 disminuye la unión de NF-ĸB al ADN, proceso mediado por la inhibición de la

fosforilación de IĸB y la posterior translocación de p65. Por otra parte, hemos

comprobado que IL-8 ha sido la única quimiocina cuyos niveles de ARNm no se han

visto modificados por CORM-2, lo que podría indicar que la regulación de la

transcripción de dicha citocina por el CO se diera básicamente a nivel post-

transcripcional. En líneas generales, nuestros resultados aportan nuevas evidencias

sobre los efectos del CO sobre estos mediadores, implicados activamente en el

desarrollo de numerosas patologías.

La liberación de elevadas cantidades de ROS durante la patogénesis de la sinovitis

OA conduce a la activación de distintos factores de transcripción implicados en la

degeneración del cartílago, como NF-ĸB y AP-1 (Revisado por Hadjigogos, 2003). Por

otra parte, distintos estudios han demostrado la capacidad de la molécula CORM-2 de

reducir la generación de estos radicales en modelos in vitro de inflamación y de OA

(Sun y cols, 2008), (Megías y cols, 2008). En esta línea, nuestros resultados en

sinoviocitos OA apoyan el papel anti oxidante de CORM-2 y podrían sugerir que los

efectos protectores de esta molécula en la sinovitis OA se debieran, al menos en parte,

a la atenuación del estrés oxidativo.

El CO es capaz de unirse a centros metálicos de distintas proteínas, lo que conlleva

la modificación en la actividad de las mismas (Roberts y cols, 2004). De entre las

distintas metaloproteínas, se han observado efectos protectores del CORM-2 por

reducción en la actividad y expresión de varias MMPs en modelos in vitro de enfisema

pulmonar (Desmard y cols, 2005) y de inflamación intestinal (Megías y cols, 2007). En

nuestro estudio hemos demostrado que los niveles de MMP-1 y MMP-3 resultan

considerablemente reducidos por CORM-2, en línea con los datos previos obtenidos en

condrocitos OA (Megías y cols, 2008).

Tanto NF-ĸB como AP-1 median la inducción de MMP-1 y MMP-3 en fibroblastos

sinoviales estimulados con IL-1β (Revisado por Vincenti y Brinckerhoff, 2002), (Vincenti

y cols, 1998), (DiBattista y cols, 1995), por lo que los efectos de CORM-2 sobre estos

mediadores podrían depender de la regulación a la baja de ambos factores de

Discusión _____________________________________________________________________________

221

transcripción. Por otra parte, se sabe que JNK 1/2, a través de la fosforilación de la

proteína c-Jun, ejerce un importante papel en la activación de AP-1 y la consiguiente

transcripción de MMP-1 en fibroblastos sinoviales (Han y cols, 2001). También es

conocido que las MAPK cooperan con estos factores de transcripción durante la

inducción de MMP-1 por IL-1β (Barchowsky y cols, 2000). Además, otros autores han

demostrado que la activación de las MAPK ERK 1/2 y p38 resultan necesarias para

inducir la transcripción de MMP-1 en fibroblastos sinoviales de cultivo primario

(Brauchle y cols, 2000). Por otra parte, estudios previos de nuestro laboratorio en

condrocitos OA demostraron los efectos reguladores de CORM-2 sobre ERK 1/2 y p38

únicamente, mientras que en nuestros datos en sinoviocitos OA se observan efectos

inhibitorios de CORM-2 sobre la fosforilación de JNK 1/2 y ERK 1/2, con un efecto algo

menor en el caso de p38. La conclusión que extraemos es que la inhibición de las

MAPK por parte de CORM-2 podría participar en los efectos inhibitorios de este

tratamiento sobre la expresión de las MMP-1 y -3.

A pesar de que son varias las evidencias que apoyan el papel del CO reduciendo la

activación del HMGB1 a través de distintos mecanismos (Tsoyi y cols, 2009), (Maicas y

cols, 2010), en nuestras condiciones experimentales no detectamos efecto alguno de

CORM-2 a este nivel. De este resultado podemos deducir que al menos en nuestras

condiciones experimentales, los efectos sobre HMGB1 son mediados por la inducción

de HO-1 y no por el CO, uno de los metabolitos de la reacción catalizada por esta

enzima.

En esta serie experimental detectamos un incremento en la producción de PGE2 y

en la expresión de COX-2 por parte de CORM-2 en presencia de IL-1β. Los datos que

encontramos en la literatura acerca de la relación entre los CORMs y la COX-2/PGE2

son bastante contradictorios. En condrocitos OA, CORM-2 reduce la producción de

PGE2 a través de la reducción en la expresión génica de mPGES-1, y en menor medida

de COX-2 (Guillen y cols, 2008b). En contraposición, una publicación reciente ha

demostrado que tanto el CO en forma de gas como el CO liberado por CORM-2 son

capaces de inducir, tanto solos como en presencia de LPS, la expresión de COX-2 y la

producción de PGE2 en macrófagos primarios y de línea celular, a través de la

activación de las enzimas MAPK y Akt (Lin y cols, 2010). Sin embargo, en nuestro

Discusión _____________________________________________________________________________

222

estudio, no podemos relacionar el incremento de COX-2/PGE2 con la activación de las

MAPK y Akt, ya que CORM-2 ha demostrado poseer efectos inhibitorios sobre la

activación de las MAPK p38, ERK 1/2 y JNK 1/2 y sobre la vía del NF-ĸB. Cabe pues

pensar que la propia molécula CORM-2 sea capaz de estabilizar el ARNm o la proteína

de COX-2 con el consiguiente incremento de PGE2. No obstante, habría que considerar

también la posibilidad de que la inducción de COX-2 por parte de IL-1β dependa de

otros factores de transcripción como C/EBP, tal y como describieron Thomas y cols en

un modelo de condrocitos (Thomas y cols, 2000). Teniendo en cuenta el dato anterior,

cabría la posibilidad de que este incremento fuera independiente de NF-ĸB y

dependiera en cambio de otras vías de transcripción, por lo que sería muy interesante

profundizar en este aspecto en etapas posteriores.

En conjunto, nuestros datos sugieren que los efectos protectores de CORM-2, sobre

la proliferación celular y el estrés oxidativo, así como sobre la producción de

quimiocinas y MMPs, podrían depender de la reducida activación de las MAPK ERK 1/2

y JNK 1/2, y en menor medida de p38, así como de la reducida activación de NF-ĸB y

AP-1. Sin embargo, el hecho de que este tratamiento haya resultado inefectivo sobre

HMGB1, y el hecho de que aumente la expresión del eje COX-2/PGE2, sugiere que al

menos en nuestras condiciones experimentales, el empleo de inductores de HO-1

resulte más útil que el empleo de dadores de CO.

7) C

on

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sio

nes

Conclusiones/Conclusions _____________________________________________________________________________

225

1) En sinoviocitos OA, las citocinas pro-inflamatorias IL-1β, TNF-α e IL-17

disminuyen significativamente la expresión basal de HO-1, mientras que las

citocinas anti-inflamatorias IL-10 e IL-13 la aumentan.

2) En estas células HMGB1 se comporta como una citocina pro-inflamatoria,

potenciando los efectos de IL-1β sobre la proliferación celular y el estrés

oxidativo, así como sobre la síntesis de citocinas, quimiocinas, MMPs y PGE2,

que podrían depender del aumento en la activación de Akt, de las MAPK ERK

1/2 y p38 y de NF-ĸB. Al igual que el resto de citocinas pro-inflamatorias,

también HMGB1 disminuye la expresión de HO-1, a través de un mecanismo de

regulación post-transcripcional.

3) La inducción de la expresión de HO-1 mediante CoPP ejerce efectos

beneficiosos por disminución de la proliferación celular, el estrés oxidativo y la

producción de quimiocinas y MMPs, que parecen depender de la reducida

activación de Akt, de las MAPK ERK 1/2, JNK 1/2 y p38, así como de NF-ĸB. Se

obtuvieron resultados similares mediante la sobre-expresión directa de HO-1 a

través de vectores virales modificados con el gen de la HO-1. Ambos

tratamientos redujeron además la activación de HMGB1, impidiendo su

translocación citosólica y la posterior secreción al medio de cultivo.

4) El CO liberado por la molécula CORM-2 también demostró ejercer efectos anti-

inflamatorios y anti-degenerativos similares a los obtenidos por la inducción de

HO-1 y que podrían deberse a su vez a la reducida activación de las MAPK ERK

1/2, JNK 1/2, p38, y a la inhibición de NF-ĸB y de AP-1. Sin embargo, no

observamos efecto de esta molécula a nivel de HMGB1. Además, el hecho de

que aumente la expresión de COX-2/PGE2 sugiere que probablemente en estas

células resulten más interesantes las estrategias dirigidas a inducir la HO-1 que

las destinadas a mimetizar la liberación de CO.


226

5) En conjunto, nuestros datos demuestran el papel protector de la activación de

la HO-1 en la inflamación sinovial OA. Durante este proceso hemos descrito

además la participación de la proteína HMGB1, que coopera activamente en los

efectos catabólicos dirigidos por la IL-1β, existiendo una relación negativa entre

HMGB1 y HO-1. Ambas proteínas representan por tanto nuevas e interesantes

dianas sobre las que poder actuar a nivel terapéutico.


227

1) In OA synoviocytes pro-inflammatory cytokines IL-1β, TNF-α and IL-17

significantly decrease HO-1 basal expression, whereas anti-inflammatory

cytokines IL-10 and IL-13 increase it.

2) In these cells, HMGB1 behaves as a pro-inflammatory cytokine potentiating the

effects elicited by IL-1β on cell proliferation and oxidative stress, as well as on

the production of cytokines, chemokines, MMPs and PGE2, that could depend

on the increased activation of Akt, MAPK ERK 1/2 and p38, and NF-ĸB. As the

other pro-inflammatory cytokines tested, HMGB1 also decreases HO-1

expression through a post-transcriptional regulation mechanism.

3) HO-1 induction by CoPP exerts protective effects by decreasing cell

proliferation rate, oxidative stress and chemokine and MMP levels, which may

depend on the reduced activation of Akt, MAPK ERK 1/2, JNK 1/2 and p38, and

NF-ĸB. Similar data were obtained by achieving direct HO-1 over-expression

with viral vectors modified with HO-1 gene. Both treatments were able to

reduce HMGB1 activation, preventing its cytosolic translocation and the later

secretion into the culture medium.

4) CO released by CORM-2 molecule demonstrated anti-inflammatory and anti-

degenerative effects similar to those obtained by HO-1 induction, that could

depend on the reduced activation of MAPK ERK 1/2, JNK 1/2 and p38, and NF-

ĸB/AP-1 pathways. However, CORM-2 elicited no effect on HMGB1. Besides,

the fact that it increased COX-2/PGE2 levels may suggest that in these cells,

strategies to induce HO-1 are more interesting than those directed to mimic CO

release.

5) Overall, our data show the protective role of the activation of HO-1 pathway in

OA synovial inflammation. During this process, we have described the

participation of HMGB1, a protein that actively cooperates in the catabolic

effects orchestrated by IL-1β, with a negative relationship between HMGB1 and

HO-1. Both proteins represent new and interesting therapeutic targets to act.

8

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9) A

nex

os

Anexos ___________________________________________________________________________

267

9.1) Artículos publicados durante

el desarrollo de la presente Tesis Doctoral

1) Haem oxygenase-1 down-regulates high mobility group box 1 and matrix

metalloproteinases in osteoarthritic synoviocytes

Autores: Isabel García-Arnandis, María Isabel Guillén, Miguel Ángel Castejón,

Francisco Gomar, María José Alcaraz

Revista: Rheumatology Oxford (2010) 49(5):854-61

2) New molecular targets for the treatment of osteoarthritis

Autores: María José Alcaraz, Javier Megías, Isabel García-Arnandis, Victoria

Clérigues, María Isabel Guillén

Revista: Biochem Pharmacol (2010) 80(1):13-21

3) High mobility group box 1 potentiates the pro-inflammatory effects of interleukin-

1β in osteoarthritic synoviocytes.

Autores: Isabel García-Arnandis, María Isabel Guillén, Francisco Gomar, Jean

Pierre Pelletier, Joanne Martel-Pelletier, María José Alcaraz

Revista: Arthritis Res Ther (2010) 12(4):R165

4) Control of cell migration and inflammatory mediators production by CORM-2 in

osteoarthritic synoviocytes.

Autores: Isabel García-Arnandis, María Isabel Guillén, Miguel Ángel Castejón,

Francisco Gomar, María José Alcaraz

Revista: PLoS One (en revisión)







Anexos ___________________________________________________________________________

268

9.2) Informe del Comité Ético de Investigación Clínica

ho-1 y hmgb1 en un modelo

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