ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Nguyễn Thị Tú Linh

NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA MỘT SỐ GEN TY THỂ Ở

BỆNH UNG THƢ VÚ

Chuyên ngành: Nhân chủng học

Mã số: 62310302

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2016

Công trình đƣợc hoàn thành tại:

Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa Sinh học, Trường Đại

học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Trịnh Hồng Thái

PGS. TS. Tạ Văn Tờ

Phản biện:…………………………………………

Phản biện:…………………………………………

Phản biện:…………………………………………

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc

gia chấm luận án tiến sĩ họp tại………………………………………

vào hồi: giờ ngày tháng năm 20..

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin - Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

Ung thư vú là loại ung thư phổ biến nhất và là nguyên nhân gây

tử vong hàng đầu trong các loại ung thư ở nữ giới (Globocan 2012),

tuy nhiên, tỉ lệ sống sót có thể được cải thiện nếu bệnh nhân được

chẩn đoán ở giai đoạn sớm của bệnh (Anderson, 2008). Đối với sàng

lọc và chẩn đoán sớm ung thư vú, chụp nhũ ảnh và thăm khám vú

vẫn là phương pháp chuẩn trong lâm sàng (Vahabi, 2003), tuy nhiên

nguy cơ phát hiện dương tính giả cao (Elmore, 2010). Điều này cho

thấy cần phải có các chỉ thị sinh học đặc hiệu đối với sàng lọc và

phát hiện sớm bệnh.

ADN ty thể từ lâu đã được cho là có mối liên quan với quá trình

phát sinh ung thư vú (Carew, 2002), trong đó có sự thay đổi về số

lượng bản sao, biến đổi mức độ biểu hiện và hoạt động của các tiểu

đơn vị của chuỗi hô hấp và các đột biến điểm của ADN ty thể

(Tseng, 2006; Fan, 2009). Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu trên các

nhóm bệnh nhân khác nhau vẫn còn gây tranh cãi. Trên đối tượng

bệnh nhân người Việt Nam, nghiên cứu về về biến đổi của các gen ty

thể còn ít và chưa có tính hệ thống. Xuất phát từ thực tế trên, chúng

tôi đã tiến hành chọn đề tài: “Nghiên cứu biến đổi của một số gen ty

thể ở bệnh ung thư vú” nhằm mục tiêu sau: (1) Cung cấp dữ liệu có

tính hệ thống ban đầu về biến đổi của một số gen ty thể, bao gồm

biến đổi số bản sao ADN ty thể, mức độ mất đoạn lớn, biến đổi của

gen ATP6, tARN, ND1 và ND3, trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú

người Việt Nam; (2) Xác định được mối liên quan giữa các biến đổi

này với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú. Kết quả thu được của

luận án là tiền đề có thể phát triển để sử dụng trong đánh giá nguy

cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như tiên lượng bệnh.

2

Chƣơng 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ UNG THƢ VÚ

1.1.1. Tình hình mắc ung thƣ vú trên thế giới và ở Việt Nam

Trong các loại ung thư ở nữ giới, ung thư vú là dạng ung thư

phổ biến nhất và là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu trên toàn thế

giới cũng như tại Việt Nam (Globocan, 2012; Duc, 2010).

1.1.2. Các yếu tố nguy cơ gây ung thƣ vú

Các yếu tố nguy cơ được cho là nguyên nhân gây ung thư vú

bao gồm phóng xạ ion hóa, virus, các hóa chất gây ung thư, chế độ

ăn uống, hoạt động thể chất, hormone ngoại sinh và một số yếu tố

sinh sản ở nữ giới. Các yếu tố này gây đột biến các gen tiền ung thư

hoặc gen ức chế ung thư, từ đó gây ra sự mất ổn định của tế bào

trong sửa chữa các lỗi di truyền và dẫn đến hoạt hóa các gen gây ung

thư.

1.1.3. Các giai đoạn của ung thƣ vú

Đánh giá giai đoạn của ung thư vú dựa vào hệ thống phân loại

TNM, trong đó dựa vào kích thước và mức độ lan rộng của khối u

thể hiện qua 3 yếu tố: T (Tumor) – u nguyên phát, N (Node) – hạch

tại vùng và M (Metastase) – di căn xa (Edge, 2010).

1.1.4. Các chỉ thị sinh học của ung thƣ vú

Các chỉ thị sinh học hiện nay của ung thư vú được áp dụng chủ

yếu cho chẩn đoán, lựa chọn phương pháp và theo dõi điều trị

(Ludwig, 2005). Thăm khám vú và chụp nhũ ảnh là phương pháp

chuẩn trong sàng lọc và chẩn đoán sớm, tuy nhiên lại có tỉ lệ phát

hiện dương tính giả cao (Vahabi, 2003; Elmore, 2010). Do đó, cần

3

phải tìm kiếm các chỉ thị sinh học đặc hiệu sử dụng trong sàng lọc và

phát hiện sớm bệnh.

1.2. TỔNG QUAN VỀ ADN TY THỂ NGƢỜI

ADN ty thể là phân tử mạch vòng, bao gồm 16.569 bp, chứa 37

gen mã hóa cho 13 protein của phức hệ phosphoryl hóa oxi hóa

(OXPHOS), 22 tARN và 2 rARN.

1.3. BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ VÀ BỆNH UNG THƢ

Biến đổi của các gen ty thể được cho là có liên quan với quá

trình tạo u bởi vì các tế bào ung thư sử dụng con đường OXPHOS ít

hơn so với tế bào bình thường (Warburg, 1956). Biến đổi này bao

gồm: thay đổi số bản sao ADN ty thể, giảm biểu hiện của các gen ty

thể hoặc biến đổi hoạt tính enzyme của ty thể và các đột biến soma

hoặc đột biến dòng mầm của ADN ty thể (Kulawiec, 2008; Brandon,

2006).

1.4. MỘT SỐ BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở BỆNH UNG THƢ

VÚ

1.4.1. Biến đổi số bản sao của ADN ty thể

Các phân tử ADN ty thể dễ bị tổn thương hơn trong các tế bào

ung thư, và do đó ty thể thay đổi số lượng bản sao ADN của chúng

để phản ứng lại với hiện tượng này (Pelicano, 2004). Đối với ung thư

vú, số bản sao ADN ty thể được cho là giảm ở mô u so với mô không

ung thư (Tseng, 2006) và có liên quan với độ tuổi, độ mô học, tình

trạng của thụ thể estrogen và progesteron, kích thước khối u (Yu,

2007; Fan, 2009; Bai, 2011). Ngược lại, số bản sao ADN ty thể có xu

hướng tăng trong mẫu máu của các bệnh nhân ung thư vú so với đối

chứng và được cho là có liên quan với độ tuổi, giai đoạn bệnh (Shen,

4

2009; Lemnrau, 2015). Các kết quả này cho đến nay vẫn còn gây

tranh cãi và còn nhiều điều vẫn cần được làm sáng tỏ.

1.4.2. Mất đoạn lớn của ADN ty thể

Hệ gen ty thể được đặc trưng bởi một số ít các trình tự lặp đóng

vai trò là các điểm cắt để tạo ra các mất đoạn lớn của ADN ty thể

(Dakubo, 2010). Mất đoạn 4977 bp (∆mtDNA4977

), dạng biến đổi

thường gặp nhất, tạo ra phân tử ADN ty thể nhỏ hơn bình thường

nhưng vẫn có thể sao chép được và được tích lũy với tỉ lệ khác nhau

ở các mô sau nguyên phân. Trong nghiên cứu của Zhu (2004),

∆mtDNA4977

được cho là không đặc trưng ở ung thư vú. Ngược lại,

∆mtDNA4977 được tìm thấy trong 28/60 mẫu mô vú thường (47%)

trong khi đó chỉ có 3/60 mẫu u (5%) là có mất đoạn này (Tseng,

2006). Các kết quả thu được vẫn còn nhiều mâu thuẫn, do đó vẫn cần

phải tiếp tục nghiên cứu để đưa ra được kết luận chính xác hơn.

1.4.3. Biến đổi của gen ATP6

Gen ATP6, nằm từ vị trí 8527 – 9207 trên ADN ty thể, mã hóa

cho dưới đơn vị a của tiểu phần F0 thuộc phức hệ tổng hợp ATP.

Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú, Sharp (1992) không phát hiện

thấy có biến đổi nào trên gen ATP6. Tuy nhiên, một số nghiên cứu

khác lại phát hiện thấy tỉ lệ biến đổi của gen ATP6 trong khoảng từ

72% – 82,14%, trong đó có một số biến đổi được cho là làm tăng

nguy cơ mắc ung thư vú (Grzybowska-Szatkowska, 2014a;

Ghaffarpour, 2014; Thapa, 2016).

1.4.4. Biến đổi của gen tARN ty thể

Đột biến các gen tARN ty thể thường làm suy giảm hoạt tính

aminoacyl hóa của phân tử tARN, từ đó ảnh hưởng đến quá trình

tổng hợp và biểu hiện protein và chức năng của các enzyme

5

OXPHOS (Abbott, 2014). Trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú,

Grzybowska-Szatkowska (2012) cho rằng 6 biến đổi A15924G,

A12308G, T7581C, A8348G, T10034C và T10463C đều có mối liên

quan với ung thư vú. Ngược lại, Meng (2015) cho rằng các biến đổi

T7581C và A12308G có vai trò tiềm năng trong biểu hiện lâm sàng

của ung thư vú, còn các biến đổi khác thì không. Có thể thấy hiểu

biết về vai trò của các biến đổi gen tARN ty thể trên bệnh ung thư vú

còn rất hạn chế, do đó gây khó khăn trong việc dự đoán tác động đến

biểu hiệu lâm sàng của bệnh.

1.4.5. Biến đổi của gen ND3

Biến đổi A10398G làm thay đổi trình tự axít amin từ Threonine

thành Alanine trong sản phẩm của gen ND3 ty thể. Các nghiên cứu

trước đây đã phân tích mối liên quan giữa biến đổi A10398G và

nguy cơ mắc ung thư vú, tuy nhiên kết quả thu được cho đến nay còn

mâu thuẫn và gây nhiều tranh cãi (Canter, 2005; Bai, 2007)

1.4.6. Biến đổi của gen ND1

Gen ND1 của ty thể mã hóa cho một trong 7 tiểu đơn vị của

phức hệ hô hấp I và là bước đầu tiên trong chuỗi vận chuyển điện tử

của ty thể. Biến đổi gen ND1 được cho là làm thay đổi cấu trúc và

chức năng của protein NADH dehydrogenase subunit 1, từ đó thúc

đẩy quá trình phát sinh khối u. Một số biến đổi của gen ND1 được

báo cáo có liên quan với ung thư vú như T3398C, T4216C, A3796G

và được coi như là chỉ thị sinh học mới trong phát hiện sớm ung thư

vú (Tan, 2002; Grzybowska-Szatkowska, 2014b; Thapa, 2015).

Ngược lại, nghiên cứu khác lại cho rằng biến đổi của các gen thuộc

phức hệ V thường gặp hơn so với gen ND1 ở bệnh nhân ung thư vú.

6

Do đó cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu biến đổi của gen này trên

các nhóm đối tượng khác để cho kết quả chính xác hơn.

1.5. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CỦA ADN TY THỂ Ở VIỆT NAM

Tại Việt Nam, các nghiên cứu về biến đổi của gen ty thể trên đối

tượng bệnh nhân ung thư vú còn ít và chưa có tính hệ thống. Do đó,

nghiên cứu này được thực hiện với mục đích xác định các biến đổi

của một số gen ADN ty thể trên bệnh nhân ung thư vú người Việt

Nam và phân tích mối liên quan với các đặc điểm lâm sàng của bệnh,

góp phần làm sáng tỏ vai trò của ADN ty thể đối với bệnh ung thư vú

và cung cấp dữ liệu có tính hệ thống ban đầu cho các nghiên cứu tiếp

theo nhằm hỗ trợ cho đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như

tiên lượng bệnh hiệu quả hơn.

Chƣơng 2 – NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. NGUYÊN LIỆU

2.1.1. Đối tƣợng

Mẫu mô u (được lấy tại vị trí khối u) và mô lân cận u (cách vị trí

có khối u từ 5 – 10 cm) của 102 bệnh nhân ung thư vú; mẫu mô u và

mô máu của 20 bệnh nhân mắc u xơ vú và mẫu máu của 65 người

cho máu khỏe mạnh.

2.1.2. Hóa chất

Các hóa chất được mua từ các hãng tin cậy (Sigma, Merk) và

đạt độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử.

7

2.1.3. Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng thuộc phòng Proteomics và sinh học

cấu trúc (KLEPT) và Phòng thí nghiệm Bộ môn Sinh lý học và Sinh

học người, Khoa Sinh học, Trường ĐHKHTN đều có độ chính xác

và tin cậy cao.

2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Tách chiết ADN tổng số

2.2.1.1. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu mô

Mẫu mô được tách chiết bằng QIAamp DNA Mini Kit

(QIAGEN, Đức) theo quy trình của nhà sản xuất.

2.2.1.2. Tách chiết ADN tổng số từ mẫu máu

Mẫu máu được tách chiết bằng GeneJET Whole Blood Genomic

DNA Purification Mini Kit theo quy trình của nhà sản xuất.

2.2.2. Điện di kiểm tra sản phẩm trên gel agarose và

polyacrylamide

2.2.3. Khuếch đại đoạn gen quan tâm bằng phƣơng pháp PCR

2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR

Sử dụng ExoSAP-IT (Affymetrix) theo quy trình của nhà sản

xuất.

2.2.5. Phân tích PCR-RFLP

Các đột biến điểm trong ADN ty thể được phát hiện bằng kỹ

thuật PCR-RFLP sử dụng các enzyme giới hạn NlaIII, DdeI, Hin6I,

SatI, FspBI (Thermo Scientific) theo quy trình của nhà sản xuất.

8

2.2.6. Nhân dòng và tách chiết ADN plasmid

Nhân dòng bằng vector pJET1.2/blunt Cloning Vector theo kit

của Fermentas. Tách chiết ADN plasmid sử dụng QIAprepSpin

Miniprep Kit (Qiagen) và thực hiện theo quy trình của nhà sản xuất.

2.2.7. Định lƣợng ADN bằng realtime PCR

Định lượng số bản sao và mất đoạn lớn trong ADN ty thể bằng

phương pháp realtime PCR dựa trên gen HBB đại diện cho ADN

nhân), gen ND1 (nằm trong vùng ít mất đoạn) và gen ND4 (nằm

trong vùng hay xảy ra mất đoạn) đại diện cho ADN ty thể.

Hiệu suất khuếch đại của phản ứng realtime PCR được xác định

dựa vào đường chuẩn theo công thức:

% Hiệu suất = (10-1/slope

– 1) x 100%

Trong đó: slope là hệ số góc của đường chuẩn định lượng.

Công thức xác định số bản sao tương đối của ADN ty thể là:

Số bản sao tƣơng đối của ADN ty thể = 2(Ct HBB – Ct ND1)

Mức độ mất đoạn của ADN ty thể được xác định bằng công

thức:

Mức độ mất đoạn = (1 – 2(Ct ND1 – Ct ND4)

)*100%

2.2.8. Định lƣợng ADN bằng HPLC

Phương pháp HPLC được sử dụng để định lượng số bản sao

ADN ty thể dựa trên gen ACTB đại diện cho ADN nhân và gen ND1

đại diện cho ADN ty thể. Tỉ số bản sao của ADN ty thể so với ADN

nhân được tính toán dựa theo công thức:

Số bản sao tƣơng đối của ADN ty thể = k x S1/S2

Trong đó: k = 1,235. S1: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm

gen ND1. S2: Diện tích đỉnh sắc ký của sản phẩm gen ACTB

9

2.2.9. Xử lý số liệu và tính toán thống kê

Sử dụng các công cụ tin sinh: BioEdit v7.0, BLAST, ClustalX,

chương trình RNAfold WebServer để phân tích số liệu. Xử lý các số

liệu thu được theo các phương pháp thống kê thường dùng: phép thử

χ², Shapiro-Wilk (Expanded) Test, Mann-Whitney U Test và Kruskal

– Wallis Test. Ước tính nguy cơ gây bệnh được biểu thị bằng tỉ số

odds (OR) và khoảng tin cậy 95% (95% CI). Tất cả các kiểm định

thống kê được ghi nhận theo 2 chiều và giá trị p < 0,05 được coi là

có ý nghĩa thống kê.

Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MẪU MÔ VÀ MẪU MÁU

ADN tổng số được tách chiết từ 102 cặp mẫu mô u và lân cận u

của bệnh nhân mắc ung thư vú, 20 cặp mẫu mô u và mẫu máu của

bệnh nhân mắc u xơ vú và 65 mẫu máu của người khỏe mạnh.

3.2. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI SỐ BẢN SAO CỦA ADN TY THỂ

Trong nghiên cứu này, biến đổi số bản sao của ADN ty thể được

tiến hành phân tích định lượng đồng thời bằng HPLC và realtime

PCR nhằm so sánh kết quả thu được khi thực hiện bằng cả hai

phương pháp.

3.2.1. Kết quả định lƣợng số bản sao của ADN ty thể bằng HPLC

Sử dụng kỹ thuật PCR, đã khuếch đại thành công đoạn đoạn

ADN của gen ND1 có kích thước 433 bp đại diện cho ADN ty thể và

đoạn ADN của gen ACTB có kích thước 107 bp đại diện cho ADN

nhân. Sản phẩm được nhân dòng bằng vector pJET1.2 và biến nạp

vào E. Coli DH5 và giải trình tự để khẳng định chính xác. Sau đó,

10

tiến hành xây dựng đường chuẩn giữa tỉ số hàm lượng ADN của gen

ND1/ACTB và tỉ số băng HPLC thu được. Kết quả thu được đường

chuẩn với hệ số tương quan cao (R2 = 0,9961).

Tiến hành định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu

nghiên cứu sử dụng sản phẩm PCR đa mồi của gen ACTB và ND1.

Kết quả thu được cho thấy giảm số bản sao ADN ty thể ở mô u (2,9

± 3,9) so với mô lân cận u (4,1 ± 4,8) và giảm số bản sao ở mô u xơ

(2,7 ± 3,1) so với mô lân cận u của bệnh nhân ung thư vú. Sự khác

biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Kết quả định lượng số bản

sao của ADN ty thể trong các mẫu nghiên cứu được thể hiện trong

Hình 3.9.

Hình 3.1. Biến đổi số bản sao mtDNA xác định bằng phƣơng pháp

HPLC (*: p < 0.05)

Giảm số bản sao ADN ty thể được cho là liên quan đến sự hình

thành khối u ở bệnh nhân ung thư vú do ảnh hưởng đến chức năng

điều hòa quá trình chết theo chương trình của tế bào, từ đó làm cho

các tế bào đột biến gây ung thư thoát khỏi chết theo chương trình để

trở thành tế bào bất tử.

11

3.2.2. Kết quả định lƣợng số bản sao của ADN ty thể bằng

realtime PCR

Các plasmid mang đoạn gen HBB và ND1 đã tách dòng và tinh

sạch được pha loãng với hệ số 10, từ 109 đến 10

1 bản sao/µl, để xây

dựng đường chuẩn và xác định giới hạn phát hiện của phản ứng. Kết

quả cho thấy giới hạn phát hiện của phương pháp là khoảng 20 bản

sao ADN trong một phản ứng với đường chuẩn có hệ số tương quan

R2 = 0.999 và 0.9934 đối với gen ND1 và HBB tương ứng. Hiệu suất

khuếch đại tương ứng của gen ND1 và HBB là 96.69% và 93.08%.

Kết quả định lượng số bản sao của ADN ty thể trong các mẫu nghiên

cứu được thể hiện trong Hình 3.15.

Hình 3.2. Biến đổi số bản sao ADN ty thể trong các loại mô nghiên

cứu (*: p < 0.05)

Kết quả cho thấy số bản sao của ADN ty thể trong mô u thấp

hơn có ý nghĩa thống kê so với mô lân cận u (p = 0,0173). Kết quả

này phù hợp với các nghiên cứu trước đây cho rằng số bản sao ADN

ty thể giảm ở mô u so với mô lân cận u ở bệnh nhân ung thư vú (Fan,

2009; Bai, 2011; Hu, 2016). Số bản sao ADN ty thể trong mô của

bệnh nhân mắc u xơ thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với mô u (p =

12

0,0143) và mô lân cận u (p = 0,0001) của bệnh nhân mắc ung thư vú.

Bên cạnh đó, số bản sao của ADN ty thể trong máu của bệnh nhân u

xơ cao hơn có ý nghĩa thống kê so với số bản sao trong máu của

người khỏe mạnh bình thường với mức ý nghĩa 0,05 (p = 0,0003).

Trong các nghiên cứu trước đây, số bản sao của ADN ty thể trong

máu cao hơn được cho là làm tăng nguy cơ mắc ung thư vú (Shen,

2009; Lemnrau, 2015).

So sánh sự thay đổi số bản sao ADN ty thể theo các đặc điểm

lâm sàng cho thấy không có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa

số bản sao của ADN ty thể theo độ tuổi (< 50 hoặc ≥ 50), kích thước

khối u (< 5 hoặc ≥ 5 cm3), số hạch (< 10 hoặc ≥ 10), kích thước hạch

(< 0,5 hoặc ≥ 0,5 cm), giai đoạn hạch N, mức độ biệt hóa và giai

đoạn bệnh. Tuy nhiên, số bản sao ADN ty thể thấp hơn có ý nghĩa

thống kê ở giai đoạn T3-4 so với giai đoạn T1-2 (p = 0,0058) ở nhóm

bệnh nhân ung thư vú. Tương tự với nghiên cứu của Mambo và cs

(2005), kết quả không thấy có mối liên quan giữa biến đổi số bản sao

với độ mô học của khối u và di căn, do đó biến đổi này được cho là

xảy ra ở giai đoạn sớm của quá trình phát sinh khối u và có thể được

sử dụng như là một công cụ chẩn đoán phân tử để xác định các bất

thường di truyền của khối u. 3.3. PHÂN TÍCH MỨC ĐỘ MẤT

ĐOẠN LỚN CỦA ADN TY THỂ

3.3.1. Xác định mất đoạn 4977 bp

Xác định ∆mtDNA4977

được dựa trên phản ứng nhân bản các

đoạn gen ND1 đại diện cho vùng không mất đoạn của ADN ty thể,

gen ND3 thuộc vùng mất đoạn 4977 bp và đoạn ADN nằm ngoài các

trình tự lặp 13 bp (ngoài vùng mất đoạn 4977 bp) bằng phương pháp

PCR lồng.

13

Thực hiện phân tích trên các mẫu xác định được tỉ lệ của

∆mtDNA4977

là 61.76% (63/102 mẫu) ở mô u, 77.45% (79/102 mẫu)

ở mô lân cận u và 15.38% (10/65 mẫu) trong máu của người bình

thường. Bên cạnh đó, tỉ lệ mất đoạn 4977 bp được xác định thấp hơn

có ý nghĩa thống kê ở mô u so với mô lân cận u, và giữa máu của

người bình thường so với mẫu mô u và lân cận u của bệnh nhân ung

thư vú (OR = 8,88, 95% CI = 1,2 – 5,7, p < 0,05). Kết quả này cũng

thống nhất với một số kết quả nghiên cứu trước đây (Dani, 2004;

Tseng, 2006; Ye, 2008), từ đó ủng hộ quan điểm ∆mtDNA4977

đóng

vai trò vào sự phát sinh khối u và tiến triển của ung thư vú. Nguyên

nhân của hiện tượng giảm số bản sao ở mô u có thể do sự mở rộng

của dòng tế bào ung thư trong quá trình phát triển hoặc các tế bào có

đột biến ∆mtDNA4977

bị loại bỏ đi bởi quá trình apoptosis (Wu,

2005).

Phân tích mối liên quan giữa tỉ lệ mất đoạn 4977 bp với các đặc

điểm bệnh học của bệnh ung thư vú cho thấy mất đoạn 4977 bp có

mối liên quan có ý nghĩa thống kê với di căn hạch (thấp hơn ở giai

đoạn N0 so với giai đoạn N1-2) (p = 0,0416). Bên cạnh đó, không có

sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tần số của mất đoạn 4977 bp

và các đặc điểm bệnh học khác.

3.3.2. Xác định các mất đoạn lớn khác ở bệnh nhân ung thƣ vú

Kết quả của phản ứng PCR lồng cũng phát hiện thấy các băng

có kích thước khác với băng 381 bp đại diện cho mất đoạn 4977 bp.

Một số trường hợp thể hiện đồng thời nhiều mất đoạn với kích thước

khác nhau. Các băng lạ có kích thước lớn hơn và nhỏ hơn 381 bp

được tinh sạch, giải trình tự và so sánh với trình tự chuẩn của ADN

ty thể. Hình 3.18 minh họa một số mất đoạn lớn khác của ADN ty

thể xác định được thông qua giải trình tự trực tiếp.

14

Hình 3.3. Mất đoạn lớn khác 4977 bp của ADN ty thể đƣợc xác định

thông qua giải trình tự trực tiếp

(A): vị trí nối sau khi mất đoạn 4977 bp. (B): mất đoạn 5156 bp.

(C): mất đoạn 5266 bp. (D): mất đoạn 5012 bp. Mũi tên chỉ vị trí nối

sau khi mất đoạn, trình tự lặp màu xanh: 13 bp (A), 3 bp (B)

Kết quả thu được ngoài mất đoạn 4977 bp, đã phát hiện thấy 18

mất đoạn lớn trên mô u, 11 mất đoạn lớn trên mô lân cận u của bệnh

nhân ung thư vú chưa được công bố trước đây trên cơ sở dữ liệu của

MITOMAP. Các mất đoạn lớn khác được tìm thấy với tỷ lệ 52,94%

(54/102 mẫu) ở mô u, 45,1% (45/102 mẫu) ở mô lân cận u và

27,69% (18/65 mẫu) ở mẫu máu đối chứng. Sự tăng dần của các mất

đoạn lớn ở máu bình thường, mô lân cận u và mô u khác biệt có ý

nghĩa thống kê với p < 0,05.

Tuy nhiên, kết quả này chưa đủ cơ sở để trả lời câu hỏi rằng liệu

các biến đổi của ADN ty thể có phải là các yếu tố góp phần vào quá

trình phát sinh ung thư hay các đột biến này chỉ đơn giản phát sinh

như một phần của hiệu ứng phụ trong quá trình tiến triển của ung thư

bởi vì nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố, trong số đó có mức độ của

15

các mất đoạn này trong mô. Do đó, để trả lời câu hỏi vai trò của các

mất đoạn lớn này đến ung thư vú như thế nào thì cần phải tiến hành

các nghiên cứu tiếp theo.

3.3.3. Xác định mức độ mất đoạn lớn bằng realtime PCR

Mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể được xác định bằng

phương pháp realtime PCR dựa trên sự có mặt của gen ND1 (nằm

trong vùng ít xảy ra mất đoạn) và gen ND4 (nằm trong vùng hay xảy

ra mất đoạn). Mức độ mất đoạn trong các loại mẫu khác nhau được

thể hiện trong Hình 3.20.

Hình 3.20. Mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể trong các loại mô

nghiên cứu (*: p < 0.05)

Kết quả cho thấy mức độ mất đoạn lớn của ADN ty thể cao nhất

ở mô u (54,6 ± 6,69) rồi giảm dần ở mô lân cận u (53,7 ± 7,00), máu

của người bình thường (51,7 ± 5,77), máu của bệnh nhân u xơ (51,5

± 3,94) và thấp nhất trong mô của bệnh nhân mắc u xơ (45,3 ± 7,24).

Không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa mức độ mất đoạn

lớn của mô u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú, cũng như giữa

máu của bệnh nhân mắc u xơ và máu của người bình thường. Ngược

16

lại, mức độ mất đoạn ít hơn ở mẫu mô u xơ (45,3 ± 7,24) so với mẫu

máu của bệnh nhân u xơ (51,5 ± 3,94) và ít hơn ở mô u xơ so với mô

u và lân cận u của bệnh nhân ung thư vú (54,6 ± 6,69 và 53,7 ± 7,00)

là có ý nghĩa thống kê (p < 0,05). Kết quả này trái ngược với nghiên

cứu của Ye và cs (2008) khi không tìm thấy sự khác biệt có ý nghĩa

thống kê về mức độ mất đoạn 4977 bp giữa mô u và lân cận u ở bệnh

nhân mắc ung thư vú và u xơ. Nie và cs (2015) lại thấy tỉ lệ mất đoạn

lớn trong máu của bệnh nhân ung thư vú cao hơn có ý nghĩa thống kê

so với trong máu của bệnh nhân mắc u vú lành tính (p < 0,001). Như

vậy có thể thấy mức độ mất đoạn của ADN ty thể giảm có thể là kết

quả của quá trình tiến triển ung thư thông qua phân chia tế bào một

cách nhanh chóng hoặc là kết quả của tác động chọn lọc thông qua

một cơ chế nào đó (ví dụ như chết theo chương trình) dẫn đến các tế

bào có mức độ mất đoạn lớn bị loại bỏ đi trong các mô ung thư (Wu,

2005).

Trong nghiên cứu này, khi so sánh mức độ mất đoạn lớn của

ADN ty thể trong mô u với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú,

kết quả cho thấy mức độ mất đoạn cao hơn ở những bệnh nhân có

kích thước hạch lớn (≥ 0,5 cm) so với các bệnh nhân có kích thước

hạch nhỏ hơn 0,5 cm. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p =

0,024.

Trong các nghiên cứu trước đây, mức độ mất đoạn lớn của ADN

ty thể, cụ thể là ∆mtDNA4977

, được thấy giảm cùng với giai đoạn tiến

triển của ung thư đại trực tràng (p = 0,031) tuy nhiên số bản sao của

ADN ty thể lại thấy tăng lên (Chen, 2011b). Ngược lại, trong nghiên

cứu của Ye (2008), mức độ mất đoạn 4977 bp lại được thấy không

có mối liên hệ có ý nghĩa thống kê với các đặc điểm lâm sàng của

ung thư vú như độ tuổi, độ mô học, giai đoạn của khối u và tình trạng

17

của ER/PR ở cả bệnh nhân ung thư vú và bệnh nhân mắc u lành tính.

Sự mâu thuẫn này có thể liên quan đến các kỹ thuật sử dụng trong

phân tích và đặc điểm của nhóm mẫu khác nhau (ví dụ mẫu mô đông

lạnh so với mẫu đã được cố định bằng formalin, độ tuổi và nhóm

bệnh nhân khác nhau, loại mẫu mô hay máu) (Ye, 2008).

3.4. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN ATP6

Đoạn ADN chứa gen ATP6 được tiến hành nhân bản và giải

trình tự trực tiếp. Kết quả giải trình tự đã xác định được 20 biến đổi

trên mẫu mô u, trong đó có 13 biến đổi làm thay đổi trình tự axít

amin, và 13 biến đổi trên mẫu máu của người bình thường, trong đó

có 12 biến đổi đã được công bố và 1 biến đổi mới (9183insC). Trong

đó, biến đổi làm thay đổi trình tự axít amin có tần suất cao hơn ở mô

u so với mô máu là G9053A (22,86%, 8/35 mẫu) được lựa chọn để

sàng lọc trong các mấu nghiên cứu. Kết quả xác định thấy tỉ lệ dạng

biến đổi 9053A là 21,57% (22/102 trường hợp) ở mô của bệnh nhân

ung thư vú và 11,76% (12/65 trường hợp) ở mẫu máu của người

khỏe mạnh bình thường. Tuy nhiên, sự khác biệt này không có ý

nghĩa thống kê với p > 0,05. Kết quả phân tích cũng cho thấy không

có mối liên quan giữa biến đổi G9053A với các đặc điểm bệnh học

của ung thư vú như độ tuổi, kích thước u, số hạch, kích thước hạch,

mức độ xâm lấn, di căn hạch, mức độ biệt hóa và giai đoạn bệnh.

3.5. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN tARN TY THỂ

3.5.1. Xác định tần suất biến đổi của gen tARN ty thể

Đoạn ADN chứa 8 gen: MT-TI (tARNLeu

), MT-TQ (tARNGln

),

MT-TM (tARNMet

), MT-TW (tARNTrp

), MT-TA (tARNAla

), MT-TN

(tARNAsn

), MT-TC (tARNCys

) và MT-TY (tARNTyr

) được nhân bản và

giải trình tự trực tiếp. Kết quả đã xác định được tổng số 12 biến đổi

18

trong 20,4% bệnh nhân (10/49 trường hợp) thuộc 7 gen tARN nghiên

cứu, trừ gen MT-TM (mã hóa cho tARNMet

). Hầu hết các biến đổi tập

trung trên gen MT-TA (mã hóa cho tARNAla

) (41,67%, 5/12 biến

đổi). Đáng chú ý là có 3 biến đổi thuộc gen MT-TW (A5536T), MT-

TA (G5645T) và MT-TN (A5724G) chưa được công bố trên cơ sở dữ

liệu Mitomap trước đây. Đây có thể là các biến đổi mới của gen

tARN ty thể trên đối tượng bệnh nhân ung thư vú người Việt Nam.

Mặt khác, các biến đổi này được phát hiện với tần suất thấp do đó

các biến đổi này có thể là các biến đổi hiếm trong nhóm bệnh nhân

này. Tuy nhiên, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa tần

suất của các biến đổi này với đặc điểm bệnh học của ung thư vú.

3.5.2. Dự đoán sự thay đổi cấu trúc bậc 2 của phân tử tARN có

biến đổi

Để nghiên cứu sâu hơn tác động của các biến đổi mới chưa được

công bố (A5536T, G5645T và A5724G) lên cấu trúc bậc 2 của phân

tử tARN, chúng tôi sử dụng chương trình dự đoán cấu trúc bậc 2

RNAfold WebServer. Sự tác động của các biến đổi này lên cấu trúc

bậc 2 của các phân tử tARN tương ứng được thể hiện trong Hình

3.27. Theo đó, chỉ có 2 biến đổi A5536T và G5645T làm thay đổi

cấu trúc bậc 2 của phân tử tARNTrp

và tARNAla

, trong khi đó biến đổi

A5724G không làm ảnh hưởng đến cấu trúc của phân tử tARNAsn

.

Tuy nhiên, trong số đó chỉ có biến đổi A5536T làm giảm năng lượng

tự do tối thiểu (MFE) đối với phân tử tARNTrp

, điều này cho thấy

rằng biến đổi A5536T có thể đóng một vai trò quan trọng trong bệnh

ung thư vú.

A. MFE: -9,60 kcal/mol MFE: -10,00 kcal/mol

19

B. MFE: -4,90 kcal/mol

MFE: -4,70 kcal/mol

C. MFE: -9,60 kcal/mol

MFE: -9,60 kcal/mol

Hình 3.4. Dự đoán sự thay đổi cấu trúc của các phân tử tARN khi

có biến đổi A5536T, G5645T và A5724G

3.5.3. Sàng lọc biến đổi A5536T trên các mẫu nghiên cứu

Đoạn ADN của gen MT-TW chứa vị trí 5536 được nhân bản và

sàng lọc trên các mẫu nghiên cứu sử dụng phương pháp PCR-RFLP.

20

Kết quả sàng lọc trên 91 bệnh nhân chỉ phát hiện được 1 trường hợp

duy nhất có biến đổi A5536T ở bệnh nhân # 26137. Biến đổi này của

gen tARN ty thể tác động đến cấu trúc bậc 2 của phân tử và do đó có

thể ảnh hưởng đến quá trình dịch mã và tổng hợp protein của ty thể

cũng như có thể cải biến các quá trình sinh học liên quan đến tiến

triển của ung thư vú.

3.6. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI CỦA GEN ND3

Đoạn gen ND3 chứa vị trí 10398 được nhân bản và sử dụng

enzyme DdeI để sàng lọc biến đổi A10398G trên các mẫu nghiên

cứu. Kết quả cho thấy có sự khác biệt về tỉ lệ biến đổi A10398G

trong các loại mô, trong đó tỉ lệ dạng biến đổi G là 59,8% (61/102

trường hợp) ở mô lân cận u, 57,8% (59/102 trường hợp) ở mô u và

47,7% (31/65 trường hợp) ở mẫu máu đối chứng. Theo Hình 3.33, có

thể thấy dạng biến đổi 10398G nhiều hơn dạng 10398A trong mẫu

mô nhưng lại ít hơn dạng 10398A trong mẫu máu của nhóm đối

chứng. Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0.05 (Hình

3.33).

Hình 3.5. Phân bố biến đổi A10398G trong các nhóm nghiên cứu

21

Kết quả này khác so với các nghiên cứu đã công bố trước đây.

Trong nghiên cứu của Czarnecka (2010a) trên đối tượng phụ nữ Ba

Lan, tỉ lệ 10398G là 23% và 10398A là 77%. Nghiên cứu của Nadiah

và cs (2012) trên phụ nữ Mã Lai thấy tần suất của dạng 10398A là

27% và 10398G là 73% trong nhóm bệnh nhân. Jiang và cs (2014)

nghiên cứu trên máu ngoại vi của các bệnh nhân ung thư vú người

Hán Trung Quốc thấy rằng không có sự khác biệt về đa hình

A10398G trong máu ngoại vi của nhóm bệnh nhân (10398A =

48,6%, 10398G = 51,4%) so với nhóm đối chứng. Tỉ lệ này ở nhóm

bệnh nhân người Bangladesh là 75% 10398A và 25% 10398G

(Ismaeel, 2013). Như vậy, có thể thấy rằng tần suất dạng 10398A và

10398G thay đổi phụ thuộc vào các nhóm tộc người khác nhau.

Hình 3.6. Phân bố biến đổi A10398G theo mức độ biệt hóa của mô

Kết quả phân tích cho thấy không có mối liên quan giữa biến

đổi A10398G với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú như độ tuổi,

kích thước khối u, số hạch, kích thước hạch, mức độ xâm lấn (giai

đoạn T), di căn hạch (giai đoạn N) và giai đoạn bệnh. Tuy nhiên, khi

phân tích biến đổi A10398G theo mức độ biệt hóa của u cho thấy sự

khác biệt của dạng 10398A và 10398G ở các mức độ biệt hóa khác

22

nhau là khác nhau (Hình 3.34). Ở mức độ biệt hóa rõ và kém, tần

suất dạng biến đổi 10398G thấp hơn so với 10398A. Trong khi đó ở

mức độ biệt hóa vừa, tần suất xuất hiện 10398G (63,64%) cao hơn rõ

rệt so với 10398A (36,36%). Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê

với mức ý nghĩa α = 0,05 (p = 0,004). Mức độ biệt hóa dùng để chỉ

mức độ giống các tế bào bình thường cùng một loại mô của các tế

bào u. Mức độ ác tính của ung thư có liên quan trực tiếp đến sự phát

triển, xâm lấn và di căn của tế bào ung thư. Thông thường, những

khối u có tính biệt hóa rõ, tế bào ung thư thường phát triển chậm,

mức độ ác tính thấp, di căn chậm. Mặt khác những khối u có tính biệt

hóa kém thì độ ác tính lại cao, di căn nhanh. Do đó, biến đổi

A10398G có thể có mối liên quan với tiến triển của bệnh ung thư vú.

3.7. PHÂN TÍCH BIẾN ĐỔI A4164G CỦA GEN ND1

Đoạn gen ND1 chứa vị trí 4164 được nhân bản và sử dụng

enzyme NlaIII để sàng lọc biến đổi A4164G trên các mẫu nghiên

cứu. Kết quả cho thấy tần suất của biến đổi A4164G là 15,69%

(16/102 trường hợp) ở mẫu mô của bệnh nhân ung thư vú và 10,77%

(7/65 trường hợp) ở mẫu máu của người khỏe mạnh bình thường (đối

chứng). Mặc dù biến đổi A4164G cũng thấy xuất hiện ở người bình

thường, tuy nhiên, tỷ lệ biến đổi thành G tại vị trí 4164 ở nhóm bệnh

nhân ung thư vú cao hơn nhóm đối chứng. Tuy nhiên sự khác biệt

này không có ý nghĩa thống kê với p > 0,05 (Hình 3.38).

23

Hình 3.7. Tỉ lệ biến đổi A4164G trong các nhóm nghiên cứu

Phân tích mối liên quan với một số đặc điểm bệnh học của ung

thư vú cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa biến

đổi A4164G của gen ND1 với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú

như độ tuổi, kích thước khối u, số hạch, kích thước hạch, mức độ

xâm lấn (giai đoạn T), mức độ hạch (giai đoạn N), mức độ biệt hóa

và giai đoạn bệnh. Trong các nghiên cứu trước đây, A4164G được

tìm thấy với tần suất thấp ở các bệnh nhân mắc bệnh Liệt thần kinh

thị giác di truyền Leber (LHON) (< 4%) và bệnh nhân mắc ung thư

phổi (3/30 mẫu bệnh nhân) (Fujitake, 2002; Fang, 2015). Trong

nghiên cứu này, tần suất của biến đổi A4164G trên đối tượng bệnh

nhân ung thư vú cũng rất thấp và không thấy có mối liên quan với

đặc điểm bệnh học của bệnh. Do đó, chúng tôi cho rằng không có

mối liên quan giữa biến đổi này với bệnh ung thư vú.

ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

(1) Luận án là công trình đầu tiên ở Việt Nam cung cấp dữ liệu có

tính hệ thống về biến đổi của một số gen ty thể, bao gồm: biến

đổi số bản sao của mtDNA, mất đoạn lớn của mtDNA, biến đổi

24

của các gen ATP6, tARN ty thể, ND3 & ND1 trên đối tượng bệnh

nhân ung thư vú người Việt Nam.

(2) Đã phát hiện thấy một số biến đổi mới của ADN ty thể ở bệnh

nhân ung thư vú, gồm: mất đoạn lớn của ADN ty thể, biến đổi

của gen mã hóa cho các phân tử tARN, 9183insC của gen ATP6

và một số biến đổi khác.

(3) Luận án đã đưa ra được các bước phát hiện một số đột biến gen

ty thể ở bệnh ung thư vú. Kết quả thu được của luận án là tiền đề

có thể phát triển để sử dụng trong đánh giá nguy cơ và hỗ trợ

chẩn đoán cũng như tiên lượng bệnh.

KẾT LUẬN

Từ những kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận sau:

1. Đã xác định được các biến đổi của một số gen ty thể ở bệnh nhân

ung thư vú Việt Nam, bao gồm:

- Giảm số bản sao ADN thể, giảm tỉ lệ mất đoạn 4977 bp, tăng

mức độ mất đoạn lớn ở mô u so với mô lân cận u của bệnh nhân

ung thư vú.

- Xác định được một số mất đoạn mới của ADN ty thể; 20 biến

đổi trên mẫu mô u của gen ATP6, trong đó có 1 biến đổi

9183insC chưa được công bố trước đây; 12 biến đổi thuộc 7 gen

tARN ty thể, trong đó có 3 biến đổi mới A5536T, G5645T và

A5724G chưa được công bố trước đây. Đã xác định được tỉ lệ

dạng biến đổi A10398G của gen ND3 và A4164G của gen ND1

tương ứng là 57,8% và 15,69% ở mô u; 47,7% và 10,77% ở mẫu

máu của người khỏe mạnh bình thường.

2. Đánh giá mối liên quan giữa các biến đổi này với các đặc điểm

bệnh học của bệnh ung thư vú cho thấy:

25

- Số bản sao ADN ty thể thấp hơn ở giai đoạn T3-4 so với giai đoạn

T1-2 ở nhóm bệnh nhân ung thư vú. Tỉ lệ mất đoạn 4977 bp thấp

hơn ở giai đoạn N0 so với giai đoạn N1-2. Mức độ mất đoạn cao

hơn ở các hạch có kích thước lớn (≥ 0.5 cm) so với hạch có kích

thước nhỏ hơn 0.5 cm.

- Không có mối liên quan giữa tần suất của biến đổi G9053A của

gen ATP6, biến đổi A4164G của gen ND1 và biến đổi của gen

tARN với các đặc điểm bệnh học của ung thư vú. Biến đổi

A10398G của gen ND3 có mối liên quan với mức độ biệt hóa của

khối u.

KIẾN NGHỊ

Từ quá trình nghiên cứu thực tế chúng tôi đưa ra một số kiến

nghị sau:

1. Tiếp tục sàng lọc các biến đổi của các gen khác trong ADN ty

thể ở các bệnh nhân ung thư vú.

2. Phát triển các kết quả ban đầu thu được của luận án này về xác

định và định lượng một số biến đổi của ADN ty thể để có thể áp

dụng trong đánh giá nguy cơ, hỗ trợ chẩn đoán cũng như tiên

lượng bệnh.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN

LUẬN ÁN

1. Nguyễn Thị Tú Linh, Nguyễn Bỉnh Hiếu, Đỗ Minh Hà, Tạ

Văn Tờ, Trịnh Hồng Thái, (2015), “Phân tích biến đổi

A10398G ty thể trên bệnh nhân ung thư vú ở Việt Nam”, Tạp

chí Khoa học ĐHQGHN: Khoa học Tự nhiên và Công nghệ,

31(2), tr 36-43.

2. Lưu Huyền Trang, Nguyễn Thị Tú Linh, Đỗ Minh Hà, Tạ

Văn Tờ, Trịnh Hồng Thái, (2015), “Mất đoạn 4977 bp trên

ADN ty thể ở bệnh nhân ung thư vú”, Tạp chí Sinh học,

37(1se), tr 111-116

3. Tô Thị Vân Anh, Nguyễn Thị Tú Linh, Đỗ Minh Hà, Tạ Văn

Tờ, Trịnh Hồng Thái, (2015), “Biến đổi của gen ND1 ty thể ở

bệnh nhân ung thư vú”, Tạp chí Sinh học, 37(1se), tr 143-149.

4. Jan Dimberg, Thai Trinh Hong, Linh Tu Thi Nguyen, Marita

Skarstedt, Sture Löfgren and Andreas Matussek, (2015),

“Common 4977 bp deletion and novel alterations in

mitochondrial DNA in Vietnamese patients with breast

cancer", Springer Plus, pp 4-58.

5. Linh Thi Tu Nguyen, My Thi Tra Quach, Dung Thi Do, Ha

Minh Do, To Van Ta, Thai Hong Trinh, (2015), “Novel

alteration of mitochondrial tRNATrp

in a group of Vietnamese

breast cancer patients”, Ann Transl Med, 3(S2): AB110, pp

72-73