ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TRẦN DIỆU LINH

NGHIÊN CỨU Ở MỨC ĐỘ PHÂN TỬ KHẢ NĂNG KHÁNG

CARBAPENEM CỦA MỘT SỐ VI KHUẨN GRAM ÂM

PHÂN LẬP TỪ BỆNH NHÂN TẠI BỆNH VIỆN VIỆT ĐỨC

VÀ BỆNH VIỆN QUÂN ĐỘI 108

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62420107

DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2017

Công trình được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội

và Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương.

Người hướng dẫn khoa học:

1. GS.TS. Đặng Đức Anh

2. GS. TS. Phạm Văn Ty

Phản biện 1: .....................................................................

.....................................................................

Phản biện 2: .....................................................................

.....................................................................

Phản biện 3: .....................................................................

.....................................................................

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp Đại học Quốc gia

chấm luận án Tiến sĩ họp tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

vào hồi giờ .…, ngày ..…tháng ...…năm 201.....

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam;

- Trung tâm thông tin thư viện - Đại học Quốc gia Hà Nội

1

MỞ ĐẦU

Vi khuẩn kháng kháng sinh là một vấn đề nghiêm trọng và đóng

vai trò trọng tâm trong công tác chăm sóc sức khoẻ con người trên

toàn thế giới. Sự quan ngại ngày càng lớn do sự xuất hiện và lây lan

nhanh chóng của các chủng vi khuẩn kháng carbapenem, hiện vẫn

được coi là kháng sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” điều trị các

trường hợp nhiễm trùng do vi khuẩn đa kháng thuốc gây ra trong các

bệnh viện. Do vậy vấn đề này đã và đang giành được sự quan tâm đặc

biệt của các nhà khoa học trên thế giới với số lượng các nghiên cứu về

vi khuẩn kháng kháng sinh ngày một tăng.

Việt Nam nằm trong khu vực châu Á được xem là "điểm nóng" của

vi khuẩn kháng kháng sinh. Hiện nay các báo cáo cho thấy vi khuẩn

Gram âm đã kháng lại carbapenem trong các bệnh viện ở mức độ cao.

Một số nghiên cứu đã chỉ ra vai trò của các gen NDM-1, KPC, OXA-

23 và OXA-58 trong cơ chế kháng carbapenem của vi khuẩn Gram âm

được phân lập tại một số bệnh viện ở Việt Nam và bước đầu xác định

được một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của các vi khuẩn kháng

carbapenem phân lập được. Để giải quyết các vấn đề còn tồn tại từ các

nghiên cứu trước đây như: sự tồn tại của các gen mã hoá sinh tổng hợp

enzyme carbapenemase (gọi tắt là gen carbapenemase) khác; mối liên

hệ về kiểu gen, sequence type (ST) giữa các chủng mang gen kháng ở

Việt Nam và trên thế giới đặc biệt là trong bối cảnh giao thông và du

lịch phát triển mạnh, tạo cơ hội cho sự lây lan của các chủng kháng

trên phạm vi thế giới; và đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn

Gram âm kháng carbapenem phân lập trong những bệnh viện lớn tại

Việt Nam, chúng tôi đã sử dụng các kỹ thuật tiên tiến nhất để thực

hiện đề tài: "Nghiên cứu ở mức độ phân tử khả năng kháng

2

carbapenem của một số vi khuẩn Gram âm phân lập từ bệnh nhân

tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Quân đội 108".

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

1. Phát hiện được các gen carbapenemase ở các chủng vi khuẩn E.

coli, K. pneumoniae, A. baumannii kháng carbapenem phân lập tại

Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương Quân đội 108.

2. Xác định được một số đặc điểm phân tử của các chủng vi khuẩn

mang gen carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh

viện Trung ương Quân đội 108.

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA LUẬN ÁN

- Kết quả nghiên cứu cho thấy vai trò của cơ chế sinh carbapenemase

trong đặc tính kháng carbapenem của vi khuẩn Gram âm phân lập tại

bệnh viện, qua đó bổ sung các số liệu quan trọng ở mức độ phan tử về

thực trạng kháng carbapenem ở Việt Nam.

- Luận án cung cấp các thông tin hữu ích về nguồn gốc và sự lây lan

của các chủng vi khuẩn Gram âm kháng carbapenem tại các địa điểm

nghiên cứu và mối quan hệ với các chủng kháng trên thế giới.

- Kết quả nghiên cứu là cơ sở khoa học để đưa ra các biện pháp kiểm

soát nhiễm khuẩn hiệu quả trong bệnh viện, đồng thời góp phần giảm

gánh nặng và nguy cơ lan truyền vi khuẩn kháng thuốc ra ngoài cộng

đồng.

- Việc áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến nhất trên thế

giới vào nghiên cứu này góp phần nâng cao được năng lực của NCS

nói riêng và của toàn nhóm nghiên cứu nói chung cũng như chất lượng

các công trình nghiên cứu ngang tầm với các quốc gia khác trong khu

vực và trên thế giới.

3

NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN

- Là nghiên cứu đầu tiên áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử tiên tiến

nhất hiện nay (giải trình tự toàn bộ hệ gen của vi khuẩn) để xác định

cơ chế kháng carbapenem ở mức độ phân tử bằng sinh tổng hợp

enzyme carbapenemase của một số chủng vi khuẩn Gram âm gây

nhiễm trùng phổ biến được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm lâm sàng.

- Kết quả nghiên cứu cho thấy một bức tranh rõ nét hơn về mối liên

hệ kiểu gen, sequence type giữa các chủng vi khuẩn kháng

carbapenem trong nghiên cứu này với các chủng vi khuẩn sinh

carbapenemase của một số bệnh viện khác tại Hà Nội và trên thế giới.

- Nghiên cứu đầu tiên về đặc điểm phân tử của các plasmid và yếu

tố di truyền di động mang gen carbapenemase.

CẤU TRÚC CỦA LUẬN ÁN

Luận án bao gồm 130 trang không kể tài liệu tham khảo và phụ

lục; gồm 3 chương, 37 hình, 10 bảng, 234 tài liệu tham khảo (14 tài

liệu tiếng Việt, 220 tài liệu tiếng Anh). Bố cục luận án gồm: Mở đầu

4 trang, Tổng quan 37 trang, Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 15

trang, Kết quả và bàn luận 59 trang, Kết luận 1 trang, Kiến nghị 1

trang; 4 bài báo có liên quan trực tiếp đến luận án đã được công bố.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. Vi khuẩn Gram âm và tính kháng kháng sinh

1.1.1. Vi khuẩn Gram âm

Vi khuẩn Gram âm là một nhóm vi khuẩn có lớp màng kép, có

nhiều gen quan trọng nằm trên những ADN vòng tách biệt, rải rác

trong nguyên sinh chất của vi khuẩn gọi là các plasmid. Plasmid

thường chứa các gen sản xuất kháng sinh, một số gen sản xuất các loại

độc tố và các protein có hoạt tính cao có chức năng tăng cường độc

4

lực cho vi khuẩn. Plasmid là công cụ giúp vận chuyển ADN từ vi

khuẩn này sang vi khuẩn khác thông qua hiện tượng truyền gen ngang

nên chúng đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực y, sinh, nông, dược

và môi trường.

1.1.2. Tính kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm

Tính đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể bắt nguồn từ hai yếu

tố: yếu tố di truyền quy định tính đề kháng của vi sinh vật và hoạt tính

của kháng sinh đã ức chế các vi khuẩn nhạy và chọn lọc những vi

khuẩn kháng. Tính đề kháng sẽ phát triển khi có mặt đồng thời 2 yếu

tố này trong môi trường hoặc vật chủ. Các gen quy định đặc tính kháng

và tế bào vi khuẩn sẽ cùng nhân lên và lan rộng dưới áp lực chọn lọc

của kháng sinh có trong môi trường.

1.1.3. Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm

Cơ chế kháng kháng sinh của vi khuẩn Gram âm thường được phân

thành 3 nhóm cơ chế chính: làm giảm sự hấp thụ kháng sinh vào bên

trong tế bào vi khuẩn, thay đổi đích tác động của kháng sinh và sản

sinh ra các enzyme để ức chế hoặc biến đổi kháng sinh.

1.1.4. Cơ sở di truyền học của cơ chế kháng kháng sinh

Đặc tính kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể là đề kháng tự nhiên

hoặc đề kháng thu được. Đề kháng tự nhiên là đặc điểm sinh học của

một loài, thường có được do yếu tố di truyền với mục đích bảo vệ vi

khuẩn khỏi tác động của kháng sinh. Đề kháng thu được là đề kháng

có được nhờ đột biến gen, nhận được gen đề kháng từ bên ngoài thông

qua truyền gen ngang hoặc kết hợp cả 2 cơ chế này.

5

1.2. Kháng sinh nhóm carbapenem và cơ chế kháng kháng sinh

nhóm carbapenem của vi khuẩn Gram âm

1.2.1. Kháng sinh nhóm carbapenem

Kháng sinh nhóm carbapenems được xem là “sự lựa chọn cuối

cùng”, thường được chỉ định điều trị các trường hợp nhiễm trùng nặng

hoặc nhiễm trùng do vi khuẩn kháng kháng sinh phổ rộng. Cơ chế tác

động của kháng sinh nhóm carbapenem là gắn và bất hoạt protein gắn

penicillin (PBP), qua đó ức chế quá trình hình thành peptidoglycan

của thành tế bào vi khuẩn.

1.2.2. Cơ chế đề kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn

Gram âm

Ba cơ chế đề kháng carbapenem phổ biến ở vi khuẩn Gram âm bao

gồm: các gen nằm trên nhiễm sắc thể hoặc plasmid mã hóa sinh tổng

hợp các enzyme carbapenemase phân giải phân tử carbapnenem; tạo

ra các đột biến làm giảm tính thấm của màng tế bào thông qua việc

thay đổi biểu hiện và/ hoặc hoạt động của các lỗ màng và phân tử PBP;

và sử dụng bơm đẩy để bơm kháng sinh ra ngoài tế bào vi khuẩn.

Trong các cơ chế này, cơ chế sinh tổng hợp carbapenemase là cơ chế

phổ biến và được nghiên cứu sâu rộng nhất.

Các enzyme carbapenemase được phát hiện chủ yếu thuộc nhóm A

(ví dụ như enzyme KPC và GES), nhóm B metallo-β-lactamase (ví dụ

như enzyme VIM, IMP và NDM) và nhóm D (ví dụ các enzyme họ

OXA như OXA-23, OXA-48, OXA-51, OXA-58, OXA-181). Đối với

các vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, các carbapenemase có ý

nghĩa lâm sàng nhất bao gồm KPC (nhóm A), VIM, IMP, NDM (nhóm

B) và OXA-48 (nhóm D).

6

1.3. Một số phương pháp hiện đại ứng dụng trong nghiên cứu cơ

chế đề kháng carbapenem ở mức độ phân tử và khả năng lan

truyền của các chủng vi khuẩn mang gen kháng

Các phương pháp nghiên cứu đặc tính và cơ chế kháng carbapenem

ở mức độ phân tử của các chủng vi khuẩn kháng thuốc bao gồm: kỹ

thuật phản ứng chuỗi polymerase (PCR); thử nghiệm Hodge test cải

tiến bổ sung Triton (Triton Hodge Test - THT) và Carba NP cải tiến;

S1-PFGE kết hợp với Southern blotting; phân loại plasmid và giải

trình tự gen.

Các phương pháp nghiên cứu khả năng lan truyền của các chủng vi

khuẩn mang gen kháng bao gồm: phương pháp điện di xung trường

(PFGE), phân loại trình tự đa vị trí (MLST) và tiếp hợp.

1.4. Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn

Gram âm trên thế giới và tại Việt Nam

1.4.1. Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn

Gram âm trên thế giới

Các kháng sinh thế hệ mới đắt tiền, thậm chí ngay cả một số kháng

sinh thuộc “nhóm lựa chọn cuối cùng” như nhóm carbapenem đang

mất dần hiệu lực. Vi khuẩn mang gen carbapenemase nhóm A, B và

D đã xuất hiện trên toàn thế giới ở cả mức độ gây ra những vụ dịch

lớn hoặc các trường hợp riêng rẽ.

1.4.2. Tình hình kháng kháng sinh nhóm carbapenem của vi khuẩn

Gram âm tại Việt Nam

Tại Việt Nam, vi khuẩn Gram âm đã kháng lại kháng sinh ở mức

độ cao. Tại 6 bệnh viện vào năm 2008 đã ghi nhận mức độ kháng

carbapenem của các chủng P. aeruginosa là 20% và của các chủng A.

baumannii là gần 50%. Theo một nghiên cứu mới nhất ở bệnh nhân

nhi thuộc Khoa hồi sức cấp cứu tại 3 bệnh viện tuyến đầu của Việt

7

Nam đã cho thấy tỉ lệ kháng carbapenem ở các chủng K. pneumoniae,

P. aeruginosa và A. baumannii lần lượt là 55%, 71% và 65%.

Các nghiên cứu về cơ chế kháng carbapenem tại Việt Nam cho thấy

sự xuất hiện của các gen NDM-1, KPC, OXA-23, OXA-51 và OXA-

58 ở các chủng vi khuẩn đường ruột và A. baumannii phân lập tại một

số bệnh viện lớn. Tỉ lệ vi khuẩn kháng kháng sinh nhóm carbapenem

đang có xu hướng tăng và ngày càng lan rộng ở Việt Nam.

CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Địa điểm nghiên cứu

Chọn có chủ đích Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện Trung ương

Quân đội (TƯQĐ) 108.

2.2. Thiết kế nghiên cứu

Mô tả và phân tích trong phòng thí nghiệm.

2.3. Thời gian và địa điểm thực hiện nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện trong giai đoạn từ năm 2015 đến năm

2017. Địa điểm thực hiện: Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương và Đơn

vị nghiên cứu lâm sàng Oxford tại Hà Nội (OUCRU), Việt Nam;

Trường Đại học Cardiff và Trường Đại học Oxford, Vương quốc Anh;

Viện Nghiên cứu Quốc gia các bệnh truyền nhiễm, Nhật Bản.

2.4. Đối tượng và cỡ mẫu nghiên cứu

622 chủng vi khuẩn E. coli, K. pneumoniae, A. baumannii phân lập

từ mẫu bệnh phẩm tại 2 bệnh viện Việt Đức và TƯQĐ 108 cho kết

quả kháng sinh đồ kháng với ít nhất một loại kháng sinh thuộc nhóm

carbapenem.

2.6. Phương pháp nghiên cứu

Nuôi cấy vi khuẩn; tách chiết ADN; phản ứng PCR; Hodge test và

Carba NP cải tiến; thử nghiệm xác định nồng độ kháng sinh tối thiểu

8

ức chế sự phát triển của vi khuẩn (MIC); PFGE; giải trình tự toàn bộ

hệ gen của vi khuẩn (WGS); S1-PFGE và Southern blotting; tiếp hợp

vi khuẩn.

2.7. Xử lý và phân tích số liệu

Phần mềm Excel và các phần mềm tin sinh học chuyên dụng khác.

2.9. Đạo đức trong nghiên cứu

Mọi thông tin cá nhân của bệnh nhân đều được bảo mật.

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1. Một số đặc điểm chung của các chủng vi khuẩn phân lập tại 2 bệnh viện

Tổng số chủng vi khuẩn thu thập trong giai đoạn nghiên cứu là 622

chủng trong đó từ Bệnh viện Việt Đức là 318 chủng và từ Bệnh viện

TƯQĐ 108 là 304 chủng.

Trong tổng số 622 chủng thu thập được, A. baumannii chiếm tỉ lệ

lớn nhất là 53% (n=330), tiếp theo là K. pneumoniae 26% (n=162) và

thấp nhất là E. coli với 21% (n=130). Tỉ lệ A. baumannii kháng

carbapenem rất cao phù hợp với các công bố trước đây về tỉ lệ chủng

A. baumannii chiếm ưu thế tại các bệnh viện của Việt Nam.

3.2. Phát hiện các gen mã hoá khả năng sinh tổng hợp enzyme

carbapenemase ở các chủng vi khuẩn kháng carbapenem phân lập

tại 2 bệnh viện

Trong 3 loại vi khuẩn nghiên cứu, chủng A. baumannii có tỷ lệ

mang gen carbapenemase cao nhất với 92,12% (304/330 chủng), tiếp

theo là K. pneumoniae với 54,32% (88/162 chủng) và cuối cùng là E.

coli với 30,0% (39/130 chủng) (Bảng 3.2). Điều này cho thấy nhiều

khả năng cơ chế kháng kháng sinh nhóm carbapenem chủ yếu của các

chủng A. baumannii và K. pneumoniae phân lập tại Bệnh viện Việt

Đức và Bệnh viện TƯQĐ 108 là thông qua việc sinh tổng hợp enzyme

9

carbapenemase, phù hợp với kết quả của một số nghiên cứu khác tại

Việt Nam và trên thế giới.

Kết quả cho thấy các chủng vi khuẩn phân lập tại 2 bệnh viện mang các

gen carbapenemase thuộc cả 3 nhóm: nhóm A (KPC), nhóm B (NDM,

IMP) và nhóm D (OXA-48, OXA-23 và OXA-58) (Bảng 3.2).

Bảng 3.2: Số lượng chủng vi khuẩn kháng carbapenem mang các gen carbapenemase

Gen OXA-23 là gen carbapenemase phổ biến nhất chiếm 45% (280/622

chủng) tuy nhiên lại chỉ được tìm thấy ở A. baumannii. Gen NDM đứng

thứ 2 với 19,8% (123/622 chủng) nhưng lại được tìm thấy ở cả 3 loại vi

khuẩn, phù hợp với các phát hiện trước đây tại Việt Nam và trên thế giới.

Các gen khác chỉ xuất hiện với số lượng hạn chế: OXA-58 ở A. baumannii

(n=20; 3,2%), KPC và OXA-48 đều có ở E. coli và K. pneumoniae với tỉ

lệ lần lượt là 2,9% (n=18) và 1,6% (n=10). Đây là báo cáo đầu tiên về sự

có mặt của gen KPC ở chủng E.coli và gen OXA-48 ở các chủng vi khuẩn

đường ruột phân lập tại các bệnh viện của Hà Nội. 13 trong tổng số 622

chủng mang đồng thời 2 hoặc 3 gen carbapenemase khác nhau cho thấy

nguy cơ xảy ra hiện tượng tái tổ hợp giữa các plasmid mang gen dẫn đến

việc các gen kháng khác nhau sẽ nằm trên cùng 1 plasmid.

Gen NDM có 4 biến thể mới gồm: NDM-1, NDM-4, NDM-6,

NDM-9; OXA-48 có 1 biến thể OXA-181. Sự xuất hiện của các biến

10

thể cho thấy các gen carbapenemase đã và đang biến đổi cùng với sự

tiến hoá tính đề kháng của các chủng vi khuẩn.

Tất cả các chủng E. coli và K. pneumoniae được giải trình tự toàn

bộ hệ gen đều chứa ít nhất 1 gen mã hoá sinh tổng hợp ESBL điển

hình như TEM, SHV và CTX; gen mã hoá khả năng kháng nhiều nhóm

kháng sinh khác như quinolones, aminoglycoside, sulphonamide v.v.

Việc phát hiện được nhiều loại gen carbapenemase phổ biến trên

thế giới trong các chủng vi khuẩn phân lập tại bệnh viện ở Việt Nam đã

cho thấy tình trạng vi khuẩn kháng kháng sinh ở Việt Nam thực sự là vấn

đề rất cấp thiết, cần được kiểm soát chặt chẽ.

3.3. Xác định khả năng sinh carbapenemase và mức độ nhạy cảm

kháng sinh của các chủng vi khuẩn mang gen

3.3.1. Xác định khả năng sinh carbapenemase của các chủng vi

khuẩn mang gen

Kết quả thử nghiệm có > 90% số chủng E. coli và K. pneumoniae

cho kết quả dương tính với thử nghiệm Hodge test cải tiến bổ sung

Triton (THT) còn ở A. baumannii tỉ lệ này chỉ là 52,30% (Bảng 3.4).

Trong khi đó, thử nghiệm Carba NP cải tiến có độ nhạy và độ đặc hiệu

cao với các chủng A. baumanni (91,78%). Tỉ lệ sinh carbapenemase

của các chủng E. coli và K. pneumoniae lần lượt là 97,44% và 85,23%. Bảng 3.4: Kết quả thử nghiệm khả năng sinh carbapenemase của các chủng

kháng bằng phương pháp THT và CarbaNP cải tiến.

11

Do độ nhạy và độ đặc hiệu của 2 phương pháp với các chủng và

các gen carbapenemase khác nhau là khác nhau nên tổng hợp kết quả

của cả 2 phương pháp có 100% (39/39) chủng E. coli, >90% chủng K.

pneumoniae và A. baumannii mang gen có khả năng sinh

carbapenemase.

Các bệnh viện ở Việt Nam hiện nay vẫn chưa áp dụng 2 kỹ thuật

này để phát hiện và kiểm soát sự lây lan của các chủng vi khuẩn kháng

sinh carbapenemase như khuyến cáo của CLSI. Từ kết quả của nghiên

cứu này cho thấy Carba NP cải tiến có độ nhạy cao với cả 3 loại vi

khuẩn, thời gian thực hiện ngắn (khoảng 2 giờ), thao tác thực hiện đơn

giản và giá thành hợp lý nên việc đưa Carba NP cải tiến vào áp dụng

tại các bệnh viện Việt Nam để sàng lọc và phát hiện nhanh các chủng

sinh carbapenemase là hoàn toàn khả thi và cần thiết, đặc biệt là khi

nhận thức được tầm quan trọng của việc phát hiện sớm các chủng sinh

carbapenemase đối với các nỗ lực tăng cường hiệu quả cho công tác

điều trị và kiểm soát nhiễm khuẩn bệnh viện.

3.3.2. Xác định mức độ nhạy cảm kháng sinh của các chủng vi

khuẩn mang gen kháng theo tiêu chuẩn lâm sàng

Kết quả MIC cho thấy tỷ lệ vi khuẩn kháng lại IMP và MEM theo

tiêu chuẩn lâm sàng đều ở mức cao, cao nhất là ở A. baumannii

(85,56% và 90%), thấp nhất là ở E. coli (76,92% và 69,23%). Trong

đó nhiều chủng kháng lại kháng sinh nhóm carbapenem ở nồng độ cao

32-256 µg/ml. Mức độ đề kháng của các chủng vi khuẩn với các kháng

sinh khác như CIP, CAZ rất cao, trong đó cao nhất là CTX với tỉ lệ

các chủng E. coli, K. pneumoniae và A. baumannii kháng lần lượt là

94,87%, 96,3% và 96,67%. Sự có mặt rất phổ biến của các gen sinh

ESBL như TEM, SHV, CTX trong các chủng kháng là cơ sở giải thích

cho mức độ đề kháng cao với các kháng sinh này. Đa số các chủng

12

kháng (> 90%) vẫn nhạy với colistin. Nếu các chủng đã kháng các

kháng sinh thông thường và nhóm carbapenem lại kháng cả colistin sẽ

dẫn đến nguy cơ không còn thuốc kháng sinh có tác dụng điều trị.

Đáng lưu ý là trong tổng số 431 chủng có 11 chủng kháng với cả 6

loại kháng sinh, chiếm 2,55%. Với tốc độ gia tăng nhanh chóng của tỉ

lệ đề kháng carbapenem ở các vi khuẩn Gram âm trong những năm

gần đây ở Việt Nam, hoàn toàn có khả năng tỉ lệ này sẽ tăng lên nhanh

chóng, cảnh báo khả năng lan rộng của các chủng vi khuẩn kháng hết

các loại kháng sinh dẫn đến thất bại trong điều trị.

3.4. Xác định mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn mang

gen carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Việt Đức và Bệnh viện

Trung ương quân đội 108

3.4.1. Xác định mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn

mang gen carbapenemase bằng phương pháp PFGE

Nhìn chung các chủng E. coli mang gen kháng có độ tương đồng

không cao, chỉ có 2 nhóm kiểu gen có độ tương đồng ≥ 80%. Trái lại

các chủng K. pneumoniae và A. baumannii có độ tương đồng cao hơn

với 6 nhóm kiểu gen (Hình 3.8).

Ở cả 3 loại vi khuẩn đều ghi nhận hiện tượng các nhóm kiểu gen

tương đồng bao gồm các chủng thuộc cùng 1 khoa, hoặc thuộc các

khoa khác nhau của 2 bệnh viện được phân lập cùng năm hoặc nhiều

năm khác nhau. Đây là cơ sở để đưa ra giả thuyết về sự lây lan của

các chủng mang gen kháng giữa các bệnh nhân của cùng 1 khoa;

sự lưu hành của các chủng kháng qua nhiều năm tại khoa đó và

khả năng lây lan giữa các khoa khác nhau.

Các chủng không thuộc một nhóm kiểu gen do độ tương đồng thấp

nên không cùng nguồn gốc và có thể hình thành một cách riêng lẻ dưới

13

áp lực của chọn lọc tự nhiên hoặc lây nhiễm từ môi trường bên ngoài

bệnh viện.

Hình 3.8: Mối liên hệ về kiểu gen giữa các chủng A. baumannii mang gen kháng mã hóa carbapenemase phân lập từ 2 bệnh viện.

3.4.2. Xác định mối liên hệ về kiểu gen và sequence type của các

chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase tại Việt Nam và trên thế

giới bằng phương pháp WGS

3.4.2.1. Mối liên hệ về kiểu gen và sequence type của các chủng vi

khuẩn E. coli mang gen carbapenemase tại Việt Nam và trên thế giới

Kết quả phân tích mối liên hệ về kiểu gen của các chủng vi khuẩn

mang gen carbapenemase phân lập tại 2 bệnh viện tương đồng với kết

quả PFGE: có mối liên hệ chặt chẽ về kiểu gen giữa các chủng vi

khuẩn được phân lập vào các năm khác nhau ở cùng 1 khoa và ở các

khoa khác nhau của Bệnh viện Việt Đức. Điều này một lần nữa củng

cố thêm cho giả thuyết về sự lưu hành của các chủng mang gen

kháng trong nội bộ 1 khoa qua các năm cũng như sự lan truyền

giữa các khoa khác nhau.

14

Từ kết quả phân tích, so sánh core genome của các chủng vi khuẩn

trong nghiên cứu này với 2 bệnh viện lớn khác của Hà Nội (Hình 3.10),

có thể nhận thấy hai vấn đề nổi cộm ở các bệnh viện lớn tại Hà Nội:

(i) sự phát tán rộng rãi của plasmid mang gen NDM trong các chủng

E. coli (gen NDM phân bố ở 10/12 ST có chủng mang gen kháng và

tỉ lệ dương tính với gen NDM rất cao); (ii) kiểu kháng và nguồn gốc

của các chủng kháng ở các bệnh viện có sự khác biệt cho thấy nhiều

khả năng các chủng kháng hình thành do áp lực chọn lọc tự nhiên từ

thói quen sử dụng kháng sinh khác nhau ở các bệnh viện hơn là bắt

nguồn từ sự lây lan giữa các bệnh viện với nhau.

Hình 3.10: Cây phân loại core genome và sequence type của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen carbapenemase phân lập tại 4 bệnh viện ở Hà Nội.

Một chủng duy nhất của bệnh viện TƯQĐ 108 thuộc ST457, là ST

gần đây được phát hiện mang gen MCR-1 kháng colistin ở Việt Nam

và Trung Quốc. Nếu các chủng E. coli ST457 mang gen kháng

carbapenem và colistin truyền plasmid cho nhau tạo nên thế hệ sau

kháng cả 2 loại kháng sinh này trên nền đã kháng nhiều nhóm kháng

sinh khác, có thể vô hiệu hoá các loại kháng sinh sử dụng trên lâm

15

sàng và gây ra những hậu quả đặc biệt nghiêm trọng cho sức khoẻ

con người.

So sánh ST của các chủng E. coli sinh carbapenemase được phân

lập tại Việt Nam với trên thế giới (Hình 3.11) nhận thấy một số ST

phổ biến ở khắp các châu lục như ST131, ST101, ST167, ST617,

ST648, ST38 đều đã xuất hiện ở Việt Nam, đặc biệt là ST131 chịu

trách nhiệm cho những vụ dịch nhiễm khuẩn bệnh viện lớn xảy ra

trong môi trường bệnh viện. Có những ST mới chỉ được ghi nhận lần

đầu tại Việt Nam như ST48, ST709, ST448, ST2930, ST3580, trong

đó ST48 và ST709 đều thuộc clonal complex ST10 thường mang gen

sinh ESBL ở người, động vật và môi trường, cho thấy mối nguy hiểm

tiềm tàng về khả năng lây lan các chủng vi khuẩn mang gen kháng

sang các vật chủ khác nhau.

Hình 3.11: Biểu đồ mối liên hệ và phân bố sequence type của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen carbapenemase trên thế giới.

16

3.4.2.2. Mối liên hệ về kiểu gen và sequence type của các chủng vi

khuẩn K. pneumoniae mang gen carbapenemase tại Việt Nam và trên

thế giới

Tương tự E. coli, các nhóm chủng K. pneumoniae có mối quan hệ

gần gũi về kiểu gen đều thuộc 1 ST hoặc các ST cùng một clonal

complex (Hình 3.12). Các chủng mang gen kháng phân bố vào 11 ST

khác nhau trong đó chiếm ưu thế là ST11 và ST15, các nhóm ST gây

ra những vụ dịch lớn trên thế giới.

Hình 3.12: Cây phân loại core genome và sequence type của các chủng vi khuẩn K. pneumoniae mang gen carbapenemase phân lập tại 2 bệnh viện.

Cả 3 gen KPC, NDM và OXA-48 đều xuất hiện ở các chủng thuộc

ST11. Việc các chủng thuộc cùng một ST mang nhiều gen

carbapenemase (nằm trên plasmid) sẽ là điều kiện thuận lợi để tạo ra

những chủng mang đồng thời nhiều gen kháng khác nhau thông qua

17

các phương thức truyền gen ngang, ví dụ đã ghi nhận 01 chủng K.

pneumoniae ST11 mang 2 gen NDM-1 và OXA-181.

Cũng tương tự các chủng E. coli, gen NDM phân bố rộng khắp ở

10/11 ST, trong khi KPC và OXA-48 lại có xu hướng khu trú vào một

vài ST nhất định.

Trong vài năm trở lại đây, một số dòng vi khuẩn kháng đang dần

thay thế clonal complex ST258 gây dịch ở nhiều quốc gia trên thế giới,

điển hình là ST307, dòng vi khuẩn gắn liền với sự lan rộng trên toàn

thế giới của gen CTX-M-15 sinh ESBL trước khi mang gen KPC và

gây ra những vụ dịch lớn ở Italy năm 2014 và gần đây là ở Hàn Quốc

năm 2015. Trong nghiên cứu này có 5 chủng ST307, dù số lượng còn

ít nhưng vẫn cần phải theo dõi sát sao dòng vi khuẩn này trong thời

gian tới do những hậu quả nghiêm trọng mà nó gây ra như tỉ lệ tử vong

cao, kéo dài thời gian điều trị so với các dòng vi khuẩn khác.

Khi tổng hợp thêm dữ liệu WGS ở 2 bệnh viện Thanh Nhàn và

Xanh Pôn và kết quả nghiên cứu ở bệnh viện Chợ Rẫy, Thành phố

Hồ Chí Minh, nhận thấy ST15 là dòng ST nổi trội ở các bệnh viện

lớn của Việt Nam.

Kết quả phân tích mối liên hệ về sequence type giữa các chủng K.

pneumoniae phân lập tại Việt Nam và trên thế giới (Hình 3.14) cho

thấy các chủng thịnh hành trên toàn thế giới như ST15, ST11, ST307,

ST395, ST231, ST37, ST16 cũng đều được ghi nhận tại Việt Nam.

Đáng chú ý là không phát hiện ST258 ở Việt Nam mặc dù chủng

này đã và đang gây đại dịch ở các quốc gia Châu Âu và Mỹ. Thay vào

đó, sự phổ biến của ST15 và ST11 ở Việt Nam hoàn toàn tương đồng

với tình hình chung ở khu vực Châu Á như Trung Quốc và Đài Loan,

những quốc gia hiện coi ST11 là ST chịu trách nhiệm chính cho sự lan

truyền rộng rãi và nổi trội của các chủng sinh carbapenemase. Như

18

vậy các chủng mang gen carbapenemase ở Việt Nam nhiều khả năng

có cùng nguồn gốc với các chủng trong khu vực Châu Á, điển hình là

Trung Quốc. Một trong những nguyên nhân dẫn đến tình trạng này là

vị trí tiếp giáp và mật độ thông thương rất cao giữa Việt Nam và Trung

Quốc.

Hình 3.14: Cây phân loại core genome và sequence type của các chủng vi khuẩn E. coli mang gen carbapenemase phân lập tại 4 bệnh viện ở Hà Nội

Với những phát hiện tương đồng về sự tồn tại của các ST thịnh

hành trên thế giới và các ST chỉ xuất hiện ở Việt Nam ở cả 2 chủng E.

coli và K. pneumoniae trong nghiên cứu này, có thể đưa đến kết luận:

sự hình thành và lan truyền của các chủng vi khuẩn kháng kháng

sinh được phân lập tại các bệnh viện của Việt Nam thông qua 2 con

đường chính: (i) sự lan truyền các chủng mang gen kháng từ các quốc

gia trong khu vực và trên thế giới; (ii) là sự hình thành do áp lực chọn

lọc tự nhiên, hậu quả của việc sử dụng kháng sinh trong điều trị trong

khoảng thời gian dài và liên tục. Dù là theo con đường nào đều thấy

19

rõ ràng là mức độ kháng kháng sinh của các chủng vi khuẩn ở các bệnh

viện Việt Nam đã ở mức báo động.

3.4.3. Xác định cơ chế lan truyền qua trung gian plasmid của các

chủng vi khuẩn mang gen carbapenemase

Plasmid mang gen NDM-1 và KPC tại Việt Nam chủ yếu thuộc

nhóm IncF, nhóm rất phổ biến ở họ vi khuẩn đường ruột. Điểm đặc

biệt của nhóm plasmid IncF là có thể mang đồng thời nhiều replicon

khác nhau, giúp mở rộng phổ vật chủ và tăng cường khả năng sao chép

do đó có tính linh hoạt và khả năng thích ứng rất cao, giúp chúng lan

truyền nhanh chóng trong các quần thể vật chủ. Khác với plasmid

mang gen KPC giữa 2 bệnh viện đều có cùng kích thước khoảng 55

kb, plasmid mang gen NDM-1 rất đa dạng về kích thước: 45 kb, 55

kb, 60 kb, 80 kb, 90 kb, 105 kb, 130 kb và 170kb (Hình 3.16).

Hình 3.16: Kết quả phát hiện plasmid mang gen NDM của một số chủng vi khuẩn phân lập tại 2 bệnh viện.

Trong khi đó plasmid mang gen OXA-48 trong nghiên cứu này

thuộc loại IncL/M kích thước khoảng 60kb, có khả năng tự truyền và

phổ vật chủ rộng, hoàn toàn tương đồng với plasmid mang gen OXA-

48 được phát hiện trên toàn thế giới.

Kết quả tiếp hợp thành công giữa các chủng vi khuẩn mang gen và

chủng vi khuẩn nhận E. coli J53 kháng sodium azide không cao (12,5

%; 3/24 chủng) gồm 1 chủng E. coli có plasmid mang gen NDM và 2

20

chủng K. pneumoniae mang plasmid chứa gen KPC. Mặc dù tỉ lệ tiếp

hợp thành công còn thấp nhưng việc truyền được plasmid giữa các

chủng nghiên cứu in vitro cũng đủ chứng minh các chủng vi khuẩn

hoàn toàn có thể truyền gen kháng qua trung gian plasmid. Đây là 1

trong những cơ chế quan trọng giúp các gen carbapenemase nói riêng

và các gen kháng kháng sinh khác nói chung lây lan trong môi trường

bệnh viện và thậm chí từ bệnh viện ra ngoài cộng đồng.

3.4.4. Xác định cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen

carbapenemase

3.4.4.1. Cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen KPC-2

Phát hiện được 3 mô hình cấu trúc khác biệt của yếu tố di truyền di

động mang gen KPC-2 ở những chủng này (Hình 3.18).

Hình 3.18: Các dạng cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen KPC-2.

Mô hình (I): KPC nằm trên transposon Tn4401b có khung là

transposon Tn3, ISKpn6 và ISKpn7, có khả năng di chuyển gen KPC

với hiệu suất cao và có thể "nhảy" sang nhiều loại plasmid có khả năng

tiếp hợp, do vậy nó đóng vai trò đặc biệt quan trọng trong việc lan

truyền gen KPC ở nhiều quốc gia trên thế giới. Mô hình (II): vẫn giữ

bộ khung Tn3 kèm với cụm ISKpn27-KPC-∆ISKpn6 mới chỉ được ghi

21

nhận tại Trung Quốc, có thể là kết quả sự lan truyền các chủng vi

khuẩn kháng thuốc từ Trung Quốc.

Mô hình (III) với sự xuất hiện của cụm ISEcp1-CTX-M bên cạnh

cụm ISKpn27-KPC-∆ISKpn6 trên cùng 1 plasmid chưa được ghi nhận

trong các công bố trước đây. Nhiều khả năng nguồn gốc hình thành

của plasmid này là sự tồn tại đồng thời của 2 plasmid mang gen KPC

và CTX trong 1 chủng vi khuẩn kháng kết hợp với hiện tượng tái tổ

hợp khiến cụm ISEcp1-CTX-M chèn vào cấu trúc ISKpn27-KPC-

∆ISKpn6 trên transposon Tn3. Đây là một trong những bằng chứng

quan trọng cho thấy sự tồn tại của nhiều gen mã hoá carbapenemase trong

cùng 1 chủng phân lập sẽ dẫn đến nguy cơ xảy ra hiện tượng tái tổ hợp dẫn

đến việc các gen kháng khác nhau sẽ nằm trên cùng 1 plasmid.

3.4.4.2. Cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen NDM-1

Có 4 mô hình cấu trúc khác nhau, trong đó mô hình (I) là phổ biển

nhất với cấu trúc điển hình của transposon Tn125, cũng đã được phát

hiện ở các quốc gia khác như Ấn Độ, Ba Lan, Trung Quốc (Hình 3.19).

Mô hình (II) và (IV) cho thấy các dấu hiệu của hiện tượng tái tổ hợp.

Mô hình (III) xuất hiện thêm 2 gen kháng kháng sinh khác là DHA-1

và AmpR mã hoá tính kháng cephalosporin phổ rộng và ampicilin. Rõ

ràng rằng với nguồn gen phong phú và dưới áp lực của chọn lọc tự

nhiên, các chủng vi khuẩn kháng ngày càng tiến hoá theo nhiều hướng

trong đó có khả năng tích hợp nhiều gen kháng trên cùng một plasmid

thông qua các phương thức truyền gen ngang.

Không chỉ ở Việt Nam mà nhìn chung trên thế giới đều nhận thấy

cụm ISAba125/∆ISAba125-NDM-1-ble được bảo tồn, nhưng vẫn tồn

tại rất nhiều dạng cấu trúc khác nhau, tương ứng với sự đa dạng của

các plasmid mang gen và sự lan truyền rộng rãi của gen NDM-1 giữa

các chủng vi khuẩn và trên toàn thế giới.

22

Hình 3.19: Các dạng cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen NDM-1

3.4.4.3. Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen IMP-1

Gen IMP-1 nằm trên integron class 1 và có nhiều điểm tương đồng

với integron mang gen IMP-5 của chủng A. baumannii phân lập ở Bồ

Đào Nha năm 1998. Cấu trúc này có một điểm khác biệt với integron

class 1 truyền thống là sự xuất hiện của yếu tố dịch chuyển lặp lại đảo

(MITE) có khả năng làm tăng khả năng dịch chuyển của integron.

Trước khi phức hợp MITE-integron được phát hiện trong chủng A.

baumannii phân lập từ bệnh phẩm lâm sàng, các nghiên cứu đã ghi

nhận sự xuất hiện của nó ở ba loài khác nhau thuộc họ Acinetobacter,

phát triển trong hệ đường ruột của tôm. Đây có thể là 1 bằng chứng

cho thấy mối liên quan giữa các chủng mang gen kháng có trong thực

phẩm và chủng phân lập được từ người.

23

3.4.4.4. Cấu trúc của các yếu tố di truyền di động mang gen OXA-48

Tồn tại duy nhất một cấu trúc mang gen OXA-48: transposon

Tn1999 bao gồm cụm cấu trúc IS1999-OXA48-lysR-IS1999 thường

nằm trên 1 plasmid nhóm IncL/M, nhiều khả năng có chung nguồn

gốc với các plasmid phát hiện ở các quốc gia khác. Nhờ đặc tính của

Tn1999 cùng với plasmid mang transposon này, gen OXA-48 ở Việt

Nam xuất hiện ở nhiều loài vi khuẩn đường ruột như E. coli, K.

pneumoniae, E. cloacae và C. freunddi do đó việc phát hiện và kiểm

soát sự lây lan của các chủng mang OXA-48 là hết sức cấp thiết.

3.4.4.5. Cấu trúc của yếu tố di truyền di động mang gen OXA-23

Trong nghiên cứu này cũng phát hiện cấu trúc tương tự ở chủng A.

baumannii mang gen OXA-23 phân lập ở nhiều nơi trên thế giới. Sự

xuất hiện của ISAba1 trước gen OXA-23 có xu hướng làm tăng biểu

hiện cho gen này qua đó tăng tính đề kháng với kháng sinh nhóm

carbapenem. ISAba1 có mặt ở phần lớn các chủng nghiên cứu với

84/90 chủng (93,33%). Sự phổ biến của ISAba1 trong nghiên cứu của

chúng tôi hoàn toàn phù hợp với các công bố khác trên thế giới.

KẾT LUẬN

1. Đã phát hiện 431/622 chủng vi khuẩn (chiếm 69,3%) mang ít nhất

một gen carbapenemase nhóm A, B và D. Gen OXA-23 phổ biến nhất

nhưng chỉ giới hạn ở các chủng A. baumannii trong khi gen NDM-1

đã phát tán ở khắp các loại vi khuẩn và bệnh viện khác nhau. Lần đầu

phát hiện một số biến thể của các gen carbapenemase ở Việt Nam:

NDM-6, NDM-9 và OXA-181. Trên 90% chủng mang gen có khả

năng sinh enzyme carbapenemase cho thấy Carba NP cải tiến là kỹ

thuật có thể áp dụng rộng rãi tại các bệnh viện để sàng lọc chủng mang

gen kháng.

24

2. Có sự tương đồng về kiểu gen của các chủng vi khuẩn mang

gen carbapenemase trong cùng 1 khoa, giữa các khoa khác nhau và

giữa các năm khác nhau. Đã xuất hiện nhiều chủng gây dịch trên thế

giới tại Việt Nam bao gồm: E. coli ST101, K. pneumoniae ST15 và

ST11.

3. Đã chứng minh được sự lan truyền qua trung gian plasmid của

một số gen carbapenemase trong mô hình phòng thí nghiệm. Cấu trúc

của các yếu tố di truyền di động mang gen carbapenemase tại Việt

Nam có nhiều điểm tương đồng với các nước trong khu vực và trên

thế giới.

KIẾN NGHỊ

- Tiếp tục các nghiên cứu về cơ chế kháng carbapenem khác ở vi

khuẩn Gram âm; xác định khởi nguồn, tiến trình và cơ chế lan truyền

của các vi khuẩn kháng thuốc trong môi trường bệnh viện; đặc điểm

cấu trúc hoàn chỉnh của các plasmid mang gen kháng.

- Tăng cường công tác kiểm soát nhiễm khuẩn tại các bệnh viện

nghiên cứu.

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC

GIẢ ĐÃ XUẤT BẢN LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

1. Trần Diệu Linh, Nguyễn Hoài Thu, Trần Như Dương, Trần Vân Phương,

Phạm Duy Thái, Nguyễn Hiệp Lê Yên, Đặng Đức Anh, Đinh Duy Kháng,

Trịnh Hồng Sơn, Phạm Văn Ty, Nguyễn Bình Minh, Trần Huy Hoàng (2016),

"Escherichia coli mang gen blaKPC-2 phân lập tại Bệnh viện Việt Đức năm

2010-2012", Tạp chí Y học Việt Nam 443(6), tr. 70-73.

2. Nguyễn Hoài Thu, Trần Diệu Linh, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Phạm Duy

Thái, Trần Vân Phương, Nguyễn Hiệp Lê Yên, Trần Như Dương, Đặng Đức

Anh, Nguyễn Bình Minh, Đinh Duy Kháng, Phạm Văn Ty, Trần Huy Hoàng

(2016), "Một số đặc điểm dịch tễ học nhiễm khuẩn bệnh viện có nguyên nhân

từ các chủng vi khuẩn đường ruột sinh KPC kháng carbapenem phân lập tại

các bệnh viện Hà Nội", Tạp chí Y học Việt Nam 444(7), tr. 148-152.

3. Nguyễn Hoài Thu, Trần Diệu Linh, Nguyễn Thị Tuyết Mai, Phạm Duy

Thái, Trần Vân Phương, Nguyễn Hiệp Lê Yên, Trần Như Dương, Đặng Đức

Anh, Nguyễn Bình Minh, Đinh Duy Kháng, Phạm Văn Ty và Trần Huy

Hoàng (2016), "Tỷ lệ vi khuẩn mang gen mã hóa tính kháng Extended-β-

lactamases (ESBLs) trên các chủng vi khuẩn đường ruột kháng carbapenem

mang gen blaKPC-2 phân lập tại các bệnh viện", Tạp chí Y học dự phòng,

26(7), tr. 27-33.

4. Trần Diệu Linh, Nguyễn Thị Kim Phương, Phạm Duy Thái, Nguyễn

Thanh Thuỷ, Đặng Đức Anh, Trần Như Dương, Phạm Văn Ty, Phan Quốc

Hoàn, Lê Văn Hưng, Trần Huy Hoàng (2018), " Vi khuẩn Gram âm mang

gen mã hoá enzyme carbapenemase phân lập tại Bệnh viện Trung ương Quân

đội 108 trong giai đoạn từ 2014 đến 2015", dự kiến đăng trên Tạp chí Y học

dự phòng 28(1).