identificación de los géneros bacterianos vibrio y...
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Identificación de los géneros bacterianos Vibrio y Helicobacter presentes en
diferentes cuerpos de agua y en heces de pingüinos de las islas Greenwich,
Dee y Barrientos, en la Antártida.
Por
Ana María Cunachi Pillajo
Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Magister Scientiarum, mención Microbiología
INSTITUTO VENEZOLANO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
I.V.I.C
CENTRO DE ESTUDIOS AVANZADOS
ALTOS DE PIPE
Octubre, 2013.
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El trabajo de Grado de Ana María Cunachi Pillajo, titulada “Identificación de los
géneros bacterianos Vibrio y Helicobacter presentes en diferentes cuerpos
de agua y en heces de pingüinos de las islas Greenwich, Dee y Barrientos,
en la Antártida”, ha sido aprobada por el jurado, quien no se hace responsable
de su contenido, pero la ha encontrado correcta en su calidad y en su forma de
presentación en fe de lo cual firman,
Dr. Walter Bentancourt.
IVIC
Dra. Paula Suárez.
USB
Dra. María Alexandra García Amado.
Tutor del trabajo de Grado
IVIC
Centro de Estudios Avanzados, IVIC.
Altos de Pipe, Octubre 2013.
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Resumen del Trabajo de Grado presentado como requisito parcial para optar al
título de Magister Scientiarum, mención Microbiología.
“Identificación de los géneros bacterianos Vibrio y Helicobacter presentes
en diferentes cuerpos de agua y en heces de pingüinos de las islas
Greenwich, Dee y Barrientos, en la Antártida”
Por
Ana María Cunachi Pillajo
CENTRO DE ESTUDIOS AVANZADOS
INSTITUTO VENEZOLANO DE INVESTIGACIONES CIENTÍFICAS
I.V.I.C
ALTOS DE PIPE, OCTUBRE 2013.
María Alexandra García Amado
Tutora del Trabajo de Grado
La Antártida es considerada la reserva de agua dulce y el ambiente más extremo
y prístino en la Tierra que alberga una fauna marina extraordinaria y una
microbiota diversa. Durante los últimos años el ambiente costero Antártico ha sido
perturbado, por actividades humanas, entre ellas el turismo y el establecimiento
de nuevas bases científicas. El presente trabajo identificó a los géneros
bacterianos Vibrio y Helicobacter y la especie H. pylori. El género Vibrio es
autóctono de los ambientes marinos y varias de sus especies pueden causar
enfermedades a humanos y fauna marina. La introducción de especies
microbianas de origen humano ha sido objeto de estudio por parte de varios
países. Particularmente, Vibrio cholerae es un patógeno humano que causa el
4
Cólera, una enfermedad transmitida por el agua que ha causado epidemias a nivel
mundial. Los serogrupos O1, O139 (toxigénicos) y los no-O1, no-O139 (no
toxigénicos) han sido detectados en aguas dulces y agua marinas y representan
riesgos para la salud pública. Por otra parte, existen especies de Helicobacter que
incluyen a H. pylori un patógeno de humanos capaz de sobrevivir en ambientes
acuáticos y de transmitirse a través del agua. En este estudio se analizaron por
PCR y secuenciación del gen 16S del ARN ribosomal, muestras de aguas marinas
y heces de pingüinos captadas en las Islas Greenwich, Dee y Barrientos durante
el verano del 2012 y 2013. La detección de Vibrio spp. se realizó mediante PCR
anidada en muestras de agua de diferentes fuentes Antárticas. La secuencia
obtenida de estas muestras demostró la presencia del grupo Aliivibrio en este
ambiente, a pesar de que este género no forma parte de la microbiota
gastrointestinal de los pingüinos pico rojo y barbijo encontrados en el área de
estudio, lo que sugiere que este género forma parte de la microbiota acuática. Por
otra parte, la detección de Helicobacter spp. mediante PCR semi anidada en las
muestras de agua y PCR en las heces de las dos especies de pingüinos, confirma
la adaptabilidad de este género bacteriano. La secuenciación de 3 productos de
amplificación obtenidos del agua de mar y deshielo y de 12 productos de
amplificación de heces pingüinos, sugiere que H. brantae, forma parte de la
microbiota del tracto gastrointestinal de estas aves marinas. H. pamentensis, una
especie relacionada con aves, fue también identificada en el agua marina
evidenciando la relación entre esta bacteria y su fuente de origen. La detección de
secuencias de H. pylori en muestras de aguas marinas captadas en sitios
turísticos como la isla Barrientos y en el efluente de la planta de tratamiento de la
base ecuatoriana Maldonado evidenciaron contaminación y la fuente asociada con
actividades humanas. La fuente de contaminación fue sustentada además con la
detección del marcador genético HF183 presente en humanos, utilizando
amplificación molecular en tiempo real. Por primera vez, se reporta la presencia
de los géneros Vibrio y Helicobacter en ecosistemas acuáticos y en pingüinos de
la Antártida, representando una contribución al conocimiento de la microbiota
Antártica y del estado de conservación de sus ecosistemas.
5
DEDICATORIA
Dedico este trabajo a Oswaldo, Mario, Piedad, Juan, Teresa y Serafín Cunachi
Pillajo, las personas más importantes de mi vida, quienes llenaron mis días de
amor y me enseñaron el verdadero significado de un abrazo y una sonrisa.
6
AGRADECIMIENTOS
A Dios sobre todas las cosas, por su infinita bondad. Al Instituto Venezolano de Investigaciones Científicas (IVIC) por el otorgamiento de la beca internacional y al Centro de Estudios Avanzados (CEA) y todo el personal que labora en sus oficinas por la ayuda administrativa durante mis estudios. Al Centro de Oceanología y Estudios Antárticos (COEA) y al Dr. Juan Alfonso coordinador científico Programa Antártico Venezolano. Al Instituto Antártico Ecuatoriano (INAE) y a la Secretaria de Ciencia, Tecnología e Innovación (Ecuador) por el financiamiento para los estudios de postgrado. Al centro de Microbiología y Biología Celular (CMBC) y a todo su personal Docente e Investigativo por la gran formación académica por ustedes impartida. Al centro de Bioquímica y Biofísica (CBB) y al Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal, por la colaboración para la realización de este trabajo. A mi tutora, la Dra. María Alexandra García Amado por su acertada dirección en la investigación y por su amistad. A las Dras. Milagro Fernández, Mónica Contreras, Paula Suárez y Soraya Silva por todo el apoyo brindado durante el desarrollo de la investigación. Al Dr. Walter Betancourt (CMBC) por sus acertadas sugerencias durante mi formación académica y en el desarrollo de la investigación. A Nelson Reyes, Lorelei Bozo, Damarys Sánchez, María Elena Chemello, Silvia Fraile, Franshelle Peña, Carolina Aristimuño, Juan Manuel Carrera, Helga Handt, Abraham Mora, Héctor Rojas y José Mora por toda su colaboración. Al personal de la Biblioteca Marcel Roche. Al personal logístico de la XVII Expedición Ecuatoriana a la Antártida. A Raúl Camacho L. Ms. C. Carlos Rodríguez M. Ph.D, Rigoberto Mancheno M. Ms.C y Norma Erazo S. Ms.C por su apoyo incondicional. Un agradecimiento especial a mis amigos Nory, Yolimar, Diana, Ricardo, Karina, Milagro, Antonio, Galo, Diego, Esteban, Evangelina, Alfonso, Kelly, Gaby, Giselle, Andrés, Rita y Heicher por su inmensa amistad y cariño durante mi permanencia en Venezuela.
vi
7
ÍNDICE GENERAL Resumen iii
Agradecimientos vi
Lista de Tablas x
Lista de Figuras xiii
I. Introducción 1
1. Antecedentes 5
1.1. Transmisión de Vibrio spp. y Vibrio cholerae 5
a) Fuentes de agua 5
b) Reservorios animales 7
1.2. Transmisión de Helicobacter spp. y Helicobacter pylori 8
a) Fuentes de agua 8
b) Reservorios animales 9
1.3. Métodos moleculares 11
1.3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 11
1.3.2. PCR anidada y semi-anidada 12
1.4. Genes específicos para la detección de especies bacterianas 14
1.4.1. Gen 16S ARNr 14
1.4.2. Gen 16S ARNr de Vibrio spp. y Helicobacter spp. 15
1.4.3. Genes específicos de V. cholerae 16
1.4.4. Genes específicos de H. pylori. 17
1.5. Justificación e Importancia 18
1.6. Hipótesis 19
II. Objetivos 20
2.1. Objetivo general 20
2.2. Objetivos específicos 20
III. Metodología 21
3.1. Área de estudio 21
3.2. Muestreos 22
3.3. Toma y procesamiento de muestras de agua y heces 24
3.3.1. Toma de muestras de agua 24
3.3.2. Toma de muestras de heces 25
3.4. Análisis moleculares de las muestras de agua y heces 26
3.4.1. Extracción de ADN 26
3.4.1.1. Muestras de agua 26
3.4.1.2. Muestras de heces 26
3.5. Reacción en cadena de la polimerasa PCR. 27
vii
8
3.6. Detección por PCR de Vibrio spp. y V. cholerae en ADN de agua
y heces.
27
3.7. Detección por PCR de Helicobacter spp. y H. pylori en ADN de
agua y heces.
28
3.8. Secuenciación de productos de PCR. 30
3.9. Análisis de secuencias. 32
3.9.1 Análisis Filogenéticos. 32
3.10 Detección del marcador molecular HF183 específico de
humanos (Bacteroides HF183), como indicador de contaminación
fecal en muestras de agua de la Antártida, mediante PCR en
tiempo real.
32
IV. Resultados 34
4.1. Muestras diferentes fuentes de agua colectadas en la Antártida 34
4.2. Parámetros físico-químicos de las muestras de agua 36
4.3. Análisis Molecular de las muestras de agua. 40
4.3.1. Detección de Eubacterias mediante PCR. 40
4.3.2. Detección de Eubacterias en muestras control 41
4.3.3. Detección del género Vibrio 42
4.3.4. Detección del género Helicobacter. 44
4.4. Secuenciación de los productos de PCR de muestras de agua
de la Antártida.
46
4.4.1. Secuenciación de productos de PCR para el género Vibrio. 46
4.4.2. Secuenciación de productos de PCR para el género
Helicobacter.
47
4.5. Análisis Filogenético de muestras de agua. 48
4.5.1. Árbol filogenético para el género Vibrio. 48
4.5.2. Árbol filogenético para el género Helicobacter. 50
4.6. Muestras de heces de pingüinos colectadas en la Antártida 51
4.6.1. Análisis Molecular de las muestras de heces de pingüinos. 51
4.6.1.1. Detección de Eubacterias mediante PCR. 51
4.6.1.2 Detección del género Vibrio. 53
4.6.1.3 Detección del género Helicobacter. 55
4.6.2 Secuenciación de los productos de PCR a partir de muestras
de heces de pingüinos.
58
4.6.2.1 Secuenciación de amplicones para el género Helicobacter. 58
4.7. Análisis Filogenético. 59
viii
9
4.8. Detección del marcador molecular HF183 específico de humanos
(Bacteroides HF183), como indicador de contaminación fecal en
muestras de agua de la Antártida, mediante PCR en tiempo real.
61
V. Discusión 62
5.1. Muestras de agua colectadas de diferentes fuentes en la
Antártida.
62
5.1.1. Parámetros físico-químicos de las muestras de agua. 62
5. 2. Análisis Molecular de las muestras de agua. 67
5. 2.1. Detección de Eubacterias mediante PCR. 67
5. 2.2. Detección de Eubacterias en muestras control. 68
5. 2.3. Detección del género Vibrio. 68
5. 2.4. Detección del género Helicobacter. 71
5.3. Muestras de heces de pingüinos colectadas en la Antártida. 75
5.3.1. Análisis Molecular de las muestras de heces de pingüinos. 75
5.3.1.1. Detección de Eubacterias mediante PCR. 75
5.3.1.2. Detección del género Vibrio. 76
5.3.1.3. Detección del género Helicobacter. 76
VI. Conclusiones 79
VII. Recomendaciones 81
VIII. Bibliografía 82
Hoja Curricular 105
ix
10
LISTA DE TABLAS.
Tabla Página
I Lugares de recolección, fuente de origen y coordenadas
de las muestras de agua colectadas en los años 2012 y
2013.
23
II Lugares de recolección de las muestras de heces de
pingüinos en los años 2012 y 2013.
24
III Secuencia de los cebadores, tamaño del fragmento a
amplificar y condiciones de PCR utilizadas para la
detección de los géneros Vibrio y Helicobacter en
muestras de agua y heces de pingüino.
29
IV Productos de PCR de regiones específicas del gen 16S
ARNr para Helicobacter spp. y Vibrio spp. en muestras de
agua y Helicobacter spp. en muestras de heces de
pingüinos.
31
V Valores de pH, conductividad (Cond.), oxígeno disuelto
(DO), temperatura (Temp.), Salinidad (Sal.), sólidos
totales disueltos (TDS) y potencial de reducción de
oxígeno (ORP) de las muestras de agua de la Antártida,
año 2012.
36
VI Valores de pH, conductividad (Cond.), oxígeno disuelto
(DO), temperatura (Temp.), salinidad (Sal.), sólidos
totales disueltos (TDS) y potencial de reducción de
oxígeno (ORP) de las muestras de agua de la Antártida,
año 2013. Media ± Desviación estándar. (-) No
determinado.
37
VII Análisis de varianza de un factor (ANOVA) para pH, OD,
temperatura y ORP en muestras de agua, Antártida, año
2013.
39
VIII Análisis de varianza de un factor (ANOVA) para
salinidad, conductividad, sólidos totales disueltos (TDS),
en muestras de agua de la Antártida, año 2013.
39
IX Extracción de ADN y amplificación por PCR del gen 16S
ARNr de Eubacterias a partir de las muestras de agua de
la Antártida, año 2012. + Presencia de la banda
esperada. - Ausencia de la banda esperada.
40
x
11
X Extracción de ADN y amplificación por PCR del gen 16S
ARNr de Eubacterias a partir de las muestras de agua de
la Antártida, año 2013. + Presencia de la banda
esperada. - Ausencia de la banda esperada.
41
XI Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S
ARNr específico del género Vibrio, a partir de muestras
de agua de la Antártida, año 2012. + Presencia de la
banda esperada. - Ausencia de la banda esperada.
43
XII Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S
ARNr específico del género Vibrio, a partir de muestras
de agua, Antártida año 2013. + Presencia de la banda
esperada. - Ausencia de la banda esperada.
44
XIII Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S
ARNr específico del género Helicobacter a partir de
muestras de agua de la Antártida, año 2012. + Presencia
de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada,
nd: no determinado.
45
XIV Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S
ARNr específico del género Helicobacter a partir de
muestras de agua de la Antártida, año 2013. + Presencia
de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada,
nd: no determinado.
46
XV Similitud de las secuencias consenso de las muestras de
agua, Antártida, año 2012 y año 2013, con las
secuencias del GenBank correspondientes a tres
especies del género Helicobacter. Entre paréntesis se
encuentran los números de accesión del GenBank.
48
XVI Extracción de ADN y amplificación por PCR de un
fragmento del gen 16S ARNr de Eubacterias a partir de
las muestras de heces de pingüinos de la Antártida, año
2012. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de
la banda esperada.
52
XVII Extracción de ADN y amplificación por PCR de un
fragmento del gen 16S ARNr de Eubacterias a partir de
muestras de heces de pingüinos de la Antártida, año
2013. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de
la banda esperada.
53
xi
12
XVIII. Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S
ARNr específico del género Vibrio, a partir de muestras
de heces de pingüinos, Antártida año 2012. + Presencia
de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada.
54
XIX Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S
ARNr específico del género Vibrio, a partir de muestras
de heces de pingüinos de la Antártida, año 2013. +
Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda
esperada.
55
XX Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S
ARNr específica del género Helicobacter a partir de
muestras de heces de pingüinos de la Antártida, año
2012. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de
la banda esperada, nd: no determinado.
56
XXI Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S
ARNr específica del género Helicobacter a partir de
muestras de heces de pingüinos de la Antártida, año
2013. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de
la banda esperada. nd: no determinado.
57
XXII Tabla de contingencia especies de pingüinos.
Helicobacter spp. en muestras de heces procedentes de
la Antártida, año 2013.
xii
58
13
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Mapa del continente Antártico y ubicación de isla
Greenwich (21E 358256 y Punta Fort William (21E
360701 3072777).
21
2 Muestras recolectadas de diferentes fuentes de agua de
la Antártida, (2012 y 2013).
34
3 Puntos de muestreo georeferenciados para las muestras
de agua y muestras de heces de los años 2012, 2013.
35
4 Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de
amplificación de 1517 pb del gen 16S ARNr de
Eubacterias, utilizando los cebadores 8F y 1525R,
obtenidos por PCR a partir de muestras de agua de la
Antártida, año 2012.
40
5 Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de
amplificación de 1517 pb del gen 16S ARNr de
Eubacterias, utilizando los cebadores 8F y 1525R,
obtenido por PCR a partir de muestras de agua destilada
estéril, año 2013.
42
6 Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de
amplificación de 575 pb del gen 16S ARNr específico del
género Vibrio, utilizando los cebadores VF169 y VF744, a
partir de muestras de agua de la Antártida, año 2012.
42
7 Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de
amplificación de 575 pb del gen 16S ARNr específico del
género Vibrio en muestras de agua de mar, río y residual
procedentes de la Antártida, año 2013.
43
8 Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de
amplificación de 399 pb del gen 16S ARNr específico
para el género Helicobacter utilizando los cebadores
HeliF y HeliR, a partir de muestras de agua de la
Antártida, año 2012.
44
9 Árbol filogenético de secuencias parciales del gen 16S
ARNr de género Vibrio y Aliivibrio, a partir de secuencias
del GenBank y una secuencia obtenida de la muestra de
agua de mar ZAMal (2012).
49
xiii
14
10 Árbol filogenético de secuencias parciales del gen 16S
ARNr del género Helicobacter, a partir de secuencias del
GenBank y secuencias obtenidas a partir de muestras de
agua de la Antártida (2012 y 2013).
50
11 Muestras de heces de pingüinos recolectadas en la
Antártida (años 2012 y 2013).
51
12 Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de
amplificación (fragmento de 399 pb) del gen 16S ARNr
específico del género Helicobacter en muestras de heces
de pingüinos barbijo procedentes de la Antártida, 2013.
56
13 Árbol filogenético de secuencias parciales del gen 16S
ARNr del género Helicobacter, a partir de secuencias del
GenBank y secuencias obtenidas a partir de muestras de
agua de la Antártida (2012 y 2013) y secuencias
obtenidas a partir de muestras de heces de pingüinos
pico rojo y pingüinos barbijo (2012 y 2013).
60
Xiv
15
I. INTRODUCCIÓN.
El continente Antártico se ha aislado geográficamente del resto del mundo desde
hace millones de años y sus ambientes son considerados los más prístinos y
extremos que quedan en la tierra (Bargagli, 2008). En ambientes extremos, muy
pocos organismos son capaces de crecer; sin embargo, estos ambientes están
dominados por microorganismos que incluyen bacterias, Archaea, hongos y virus.
Varios trabajos han reportado el aislamiento de distintas especies bacterianas a
partir de muestras de agua de mar, lagos, hielo glacial y nieve de las islas y el
continente Antártico (Cavicchioli et al., 2002; Gilbert, 2002; Huang et al., 2013).
Las bacterias más comunes en los ambientes antárticos son bacterias psicrófilas,
cuyas temperaturas de crecimiento oscilan entre ≤ 0°C y ≤ 15°C y tienen forma de
varillas o filamentos. Estas bacterias que se encuentran en un número apreciable
en estos ambientes extremos son importantes en varios ciclos de la materia
orgánica debido a que descomponen una variedad de carbohidratos lípidos y
proteínas y otras tienen importante actividad enzimática (Bowman et al., 1997;
Thomas et al., 2002; Margolles et al., 2012).
La microbiota antártica ha cambiado durante los últimos años debido a que varias
estaciones científicas situadas en la costa liberan al ambiente marino sus desechos
residuales sin ser tratados (Hughes et al., 2004). Se ha reportado la presencia de
bacterias indicadoras de contaminación fecal humana en zonas cercanas a la Bahía
Fildes procedentes de algunas bases chilenas como Escudero, O’Higgins y Base
Prat (Calisto et al., 2009). Sin embargo, no se ha reportado la presencia de los
géneros Vibrio y Helicobacter en ambientes antárticos a pesar que ambos géneros
muestran gran adaptabilidad y supervivencia en numerosos ambientes bajo diversas
condiciones ecológicas (González-Fraga et al., 2007; Goldman et al., 2009).
Los miembros del género Vibrio son habitantes autóctonos de las aguas marinas
y varias de sus especies pueden causar enfermedades tanto en el hombre como en
vertebrados e invertebrados marinos. Estas bacterias son bacilos curvos, Gram
negativas, anaerobias facultativas, miden hasta 2,6 μm de largo y 5 μm de ancho,
móviles por flagelación polar y no forman endosporas (Pascual, 2005). Cada
especie de Vibrio parece tener un nicho ecológico específico, ya que pueden vivir
como células nadando libremente o unidas a superficies proporcionadas por
algas, plantas y animales marinos. La formación de biopelículas o su entrada al
estado viable pero no cultivable (VBNC por sus siglas en inglés), ocurre en
respuesta a la escasez de nutrientes lo cual facilita su persistencia en el ambiente
acuático durante largos períodos o entre las epidemias como en el caso de V.
cholerae (Binsztein et al., 2004; Antonova et al., 2011).
16
Taxonómicamente el género Vibrio fue uno de los primeros grupos bacterianos
en ser descrito ubicándolo dentro de la siguiente clasificación:
Reino: Bacteria
Phylum: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Vibrionales
Familia: Vibrionaceae
Género: Vibrio
Especie: V. cholerae (Whitman et al., 2012).
Se conocen alrededor de 30 especies dentro de éste género entre las cuales
se describe a V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulníficus, V. mimicus, V.
fluvialis, V. alginolyticus, V. cincinnatiensis, V. hollisae, V. furnissii, V. damsela, V.
metshnikovii y V. carchariae entre otras (Drake et al. 2007).
Una de las especies de mayor interés clínico es Vibrio cholerae, agente causal
del Cólera, una enfermedad transmitida por el agua que se caracteriza por una
diarrea líquida y vómitos causando una rápida deshidratación e incluso la muerte.
El carácter patógeno de V. cholerae se atribuye a la producción de la toxina
colérica (CT) (Fernández et al., 2009). Se conocen más de 200 serogrupos de V.
cholerae, los serogrupos O1 y O139 poseen la CT y son responsables de grandes
epidemias de Cólera. Los serogrupos no-O1 y no-O139 no son toxigénicos y
están relacionados con brotes diarreicos esporádicos (Pruzzo et al., 2005). Las
rutas de transmisión de V. cholerae son la fecal-oral y oral-oral de forma directa
entre personas (Gachorro et al., 2002). Otra ruta es a través del agua y alimentos
marinos contaminados con material fecal; sin embargo, el biotipo O1 ha sido
reportado aún en ambientes acuáticos libres de contaminación fecal humana
(Barroto, 1997). Algunos serogrupos de V. cholerae han sido recuperados a partir
de agua de ríos, arroyos, lagos, embalses y canales de riego, sugiriendo que este
patógeno puede sobrevivir en el ambiente (Ogg et al., 1989).
En el ambiente, V. cholerae puede encontrarse en forma de vida libre o unido a
superficies que contienen quitina proporcionadas por plantas, insectos, algas,
copépodos y crustáceos. La forma de vida libre o también llamada planctónica,
ocurre bajo condiciones de temperaturas elevadas y abundancia de nutrientes
(Pruzzo et al., 2008; Mishra et al., 2012).
Cuando la concentración de nutrientes y temperatura disminuyen junto con una
salinidad elevada V. cholerae entra en un estado latente denominado estado
viable pero no cultivable. En este estado la bacteria cambia su morfología y
17
disminuye drásticamente su tasa metabólica pero no pierde su patogenicidad
(Binsztein et al., 2004; Mishra et al., 2012). Sin embargo, cuando las condiciones
ambientales y climáticas mejoran V. cholerae recupera su estado morfológico y
fisiológico como en las condiciones óptimas de vida libre. Varios estudios
evidencian que cuando aumenta la temperatura en los ambientes marinos,
principalmente en los tropicales, hay mayor riesgo para un nuevo brote del Cólera
que puede significar el origen de epidemias o pandemias (Lafuente et al., 2006;
Caferr et al., 2007).
Durante varios años, solo los ambientes marinos tropicales han estado
relacionados con la presencia de V. cholerae y el brote de enfermedades, pero no
se ha determinado aún si esta bacteria puede sobrevivir en ambientes marinos
con bajas temperaturas como los Antárticos.
Un escenario similar podría ocurrir con bacterias del género Helicobacter, que
viven en el tracto gastrointestinal de humanos y animales. Se han descrito
formalmente 33 especies aisladas del tracto gastrointestinal de mamíferos y aves,
muchas de las cuales están asociadas a enfermedades en sus hospedadores.
Las especies de este género crecen a una temperatura de 37°C, tienen forma
curva o helicoidal, miden hasta 1μm de diámetro y 5μm de longitud, son micro-
aerófilas, Gram negativas y móviles por flagelación polar monótrica o lofótrica
(Owen, 1998; Fernández, 2011).
La especie tipo es Helicobacter pylori, la cual puede causar gastritis, úlceras
gástricas y cáncer gástrico. Se estima que alrededor del 50% de la población
humana mundial está infectada con esta bacteria cuyo crecimiento es favorecido
por la presencia del gen esencial glmM que codifica a la enzima fosfoglucosamina
mutasa (Kansau et al., 1996; Basso et al., 2010).
La patogenicidad de H. pylori está asociada a factores de virulencia como la
enzima ureasa, adhesinas, hemaglutininas, una toxina vacuolizante asociada al
gen vacA, y la citotoxina asociada al gen CagA. Todos estos genes forman parte
de la isla de patogenicidad cag PAI que es un segmento de ADN responsable de
los genes de virulencia (Premoli et al., 2004). Las cepas reportadas como cagA+
son las más virulentas y se asocian a cuadros clínicos más severos (Rivas-
Traverso et al., 2000; Contreras et al., 2007).
Helicobacter pylori se propaga a través de varias rutas, como son de persona a
persona, iatrogénica es decir causada por procedimientos médicos inadecuados
como uso de instrumental no esterilizado luego de haber entrado en contacto con
18
la mucosa gástrica y, por zoonosis definido como el paso desde un reservorio
animal a humanos (Cava et al., 2003).
Estudios epidemiológicos y ambientales sugieren que el agua juega un rol
importante en la transmisión de H. pylori por lo que es considerada una de las
rutas potenciales de transmisión a humanos (Fernández-Delgado et al., 2008;
Azevedo et al., 2008).
Varios microorganismos patógenos pueden infectar más de una especie
hospedadora, es decir humanos, animales domésticos y animales silvestres
(Haydon et al., 2002). La fauna silvestre no esta exenta de albergar patógenos
infecciosos de interés zoonótico y actúan como reservorios o como víctimas de
enfermedades transmisibles de humanos y animales domésticos (Artois et al.,
2011).
Los pingüinos son las aves silvestres que dominan la avifauna Antártica, tienen
una vida larga y un nicho ecológico permanente por lo que son considerados
bioindicadores ambientales. Además, poseen en su tracto gastrointestinal una
microbiota muy diversa que incluye bacterias intestinales patógenas. Su estudio
es importante para comprender la fisiología digestiva única que poseen estas
aves y que les confiere la capacidad de almacenar reservas de proteínas y lípidos
a muy largo plazo (Metcheva et al., 2006; Barbosa, 2011; Dewar et al., 2013).
Se ha reportado que el género Vibrio y en particular los serogrupos O1 y no O1
de V. cholerae pueden utilizar aves como reservorios. A pesar de ello, no se ha
reportado si los pingüinos también pueden albergar a bacterias del género Vibrio
(Ogg et al., 1989).
El género Helicobacter también ha sido reportado en aves silvestres y en
particular las especies H. pullorum, H. pametensis, H. canadensis, H. anseris y H.
brantae, han sido aisladas de la mucosa intestinal y heces de aves. De estas
especies H. pullorum y H. canadensis están asociadas también con gastroenteritis
en humanos, sugiriendo que las aves pueden actuar como reservorios (Stanley et
al., 1994; Waldenström et al., 2007). En pingüinos se ha aislado el género
Campylobacter a partir de muestras de heces, un género muy relacionado con
Helicobacter (Debruyne et al., 2010).
Estudios recientes aplicando técnicas moleculares de última generación tales
como la pirosecuenciación reportan a la familia Helicobacteraceae en el tracto
digestivo de pingüinos sugiriendo que especies del género Helicobacter pudieran
estar presentes en sus heces (Dewar et al., 2013).
19
Los géneros Vibrio y Helicobacter tienen en común su capacidad para causar
infecciones gastrointestinales en humanos y animales, además presentan gran
adaptabilidad y supervivencia a variadas condiciones utilizando numerosos
reservorios y múltiples rutas de transmisión.
Bajo estas consideraciones y debido a que no existen reportes de estas
bacterias en ecosistemas de la Antártida, el presente trabajo pretendió determinar
si estos géneros y sus especies de mayor importancia en salud pública pudieran
estar presentes en las condiciones extremas de Punta Fort William en la Isla
Greenwich e islas aledañas cerca de la Base Ecuatoriana Pedro Vicente
Maldonado (Antártida), con la finalidad de establecer un estudio de línea base
para futuras investigaciones.
1. Antecedentes.
Los ambientes acuáticos son considerados los principales reservorios de
algunos microorganismos patógenos que representan un riesgo para la salud
pública (Girones et al., 2010). En particular, en este trabajo se describen los
reservorios ambientales en los que están presentes los géneros bacterianos Vibrio
y Helicobacter.
1.1. Transmisión de Vibrio spp. y Vibrio cholerae.
Durante las últimas décadas varios estudios ambientales han contribuido
significativamente al aislamiento y descripción de nuevas especies de Vibrio,
destacando el rol del agua y los animales como potenciales reservorios y fuentes
de transmisión de estas bacterias (Noguerola et al., 2007).
a) Fuentes de agua.
En los ambientes acuáticos coexisten alrededor de 30 especies patógenas y no
patógenas del género Vibrio. En el agua, el número de células de Vibrio y
principalmente de la especie V. cholerae es muy bajo o no detectable pero
sobrevive por largos períodos en estado viable no cultivable (VBNC) y es capaz
de retornar al estado cultivable cuando las condiciones le son favorables (Huq et
al., 1990).
El estado VBNC es un estado de latencia que ocurre cuando las condiciones
ambientales básicamente temperatura y osmolaridad no son adecuadas y la
disponibilidad de sustratos generadores de energía es baja. En este estado de
latencia mantiene su metabolismo pero no puede ser cultivada utilizando métodos
convencionales de laboratorio (Mcdougald et al., 1998; Binsztein et al., 2004;
20
Chaiyanan, et al., 2007).
Las células de V. cholerae pueden permanecer en el ambiente en su estado
VBNC por muchos años y continúan manteniendo la capacidad para causar la
enfermedad pero su potencial patogénico en el ambiente no es homogéneo ya
que algunas cepas pueden conservar los genes de virulencia y otras no (Halpern
et al., 2006).
La transmisión indirecta de V. cholerae ocurre mediante la ingesta de agua o
comida contaminada con heces que contienen la bacteria, la misma que puede
desarrollar o no su carácter patogénico. Vibrio cholerae ha jugado un rol
prominente en la historia humana por causar grandes epidemias y numerosas
muertes en el mundo (Huq et al., 2005; Lafuente et al., 2006; Mendes-Márques et
al., 2013).
Desde 1817 hasta 1991, se han registrado ocho pandemias a causa del Cólera,
ocasionando la muerte de un gran número de personas a nivel mundial. Desde
entonces, cuando los ambientes marinos experimentan variaciones de la
temperatura, pH y/o salinidad, se presentan brotes de Cólera en varias partes del
mundo, lo que ha permitido resaltar el rol del agua como reservorio y como
vehículo de transmisión de este patógeno.
Registros de la Organización Mundial de la Salud (OMS) publicados en el 2010,
muestran que África sigue siendo el continente más afectado, países como Mali,
Mozambique, Sud África y Zambia presentan brotes de la enfermedad
frecuentemente al igual que Asia y América Latina (Shar et al., 2010; Kanungo et
al., 2010).
El último brote de Cólera en Haití registrado en el año 2010, evidenció el rol del
agua como vehículo de transmisión y la incidencia de la actividad humana en el
ambiente marino, después de determinarse que la cepa de V. cholerae que
provocó la epidemia era procedente de una fuente geográficamente muy distante
que fue introducida por contaminación con las heces de una persona infectada
(Chen-Shan, et al., 2011).
En el año 2010 y hasta el 2011 los reportes anuales emitidos por el Marine
Climate Change Impacts Partnership Annual Report Card (MCCIP), sostienen que
el calentamiento global en los mares del Reino Unido constituye un factor
potencial para el futuro incremento de la población de Vibrio en los ambientes
21
acuáticos y como un problema de salud pública emergente, por el aumento del
número de personas infectadas por esta bacteria. Esta condición también se ha
reportado en países del Noreste de Europa, en donde ha habido un incremento
sin precedentes en el número de infecciones relacionadas con aguas
recreacionales donde están presentes especies de Vibrio de agua caliente (Vezulli
et al., 2011).
Los ambientes extremos de la Antártida no estarían exentos de los efectos a
causa del calentamiento global ocurrido en los últimos 50 años, debido a que en
estos sitios confluyen las corrientes oceánicas y el aumento de las temperaturas
ha causado cambios significativos como el derretimiento de glaciares y la
formación de icebergs presentes en el mar (Turner et al., 2005).
También el aumento de las actividades logísticas y turísticas en la Antártida
podrían introducir algunas especies bacterianas entre ellas Vibrio, a partir de
algunos humanos infectados o animales marinos portadores de esta bacteria que
pueden ser arrastrados por las corrientes marinas hasta la Antártida. Vibrio podría
adaptarse a las nuevas condiciones de temperatura en el mar Antártico y
posiblemente por su carácter patogénico asociarse al surgimiento de
enfermedades infecciosas en especies silvestres (aves y mamíferos) como ya se
ha reportado para otras bacterias patógenas (Dobson et al., 2001; Tin et al.,
2009).
b) Reservorios animales.
Los animales pueden actuar como reservorios de bacterias patógenas,
bacterias de los géneros Yersinia, Vibrio, Campylobacter y Helicobacter. Estas
bacterias han sido reportadas en mamíferos y aves proponiendo su rol zoonótico
en la transmisión de patógenos a humanos (Waldenström et al., 2003; Cabello et
al., 2008)
Diferentes estudios afirman que la zoonosis como ruta de transmisión es otra
alternativa que utilizan algunas bacterias como Vibrio para persistir en el
ambiente. La fauna silvestre principalmente aves acuáticas y migratorias son
consideradas hospedadores introductorios de microorganismos patógenos ya que
pueden transportarlos hasta nuevos vectores y hospedadores a miles de
kilómetros de distancia (Rappole et al., 2000; Rodríguez et al., 2010).
Algunas especies de Vibrio, han sido identificadas en aves acuáticas. En la
década de los ochenta Ogg et al., (1989) reportaron el aislamiento de V. cholerae
a partir de heces de veinte especies de aves acuáticas en un estudio realizado en
22
los estados norteamericanos Colorado y Utha. En 1990, se reportó el aislamiento
de una especie de Vibrio halofílico a partir de heces de cormoranes
(Phalacrocorax albiventer), cisnes (Cygnus melancoryphus), pelicanos (Pelecanus
onocrotalus) y otras especies de aves acuáticas (Buck, 1990).
Otras especies de Vibrio como V. parahaemolyticus y V. vulníficus han sido
aisladas a partir de muestras de heces de aves acuáticas silvestres en Japón y en
el nororiente de Venezuela se aislaron especies de Vibrio no toxigénico a partir de
muestras de heces de aves migratorias (Miyasaka et al., 2006; Rodríguez et al.,
2010).
Las densas colonias de pingüinos presentes en la Antártida son un grupo
susceptible para albergar microorganismos patógenos como Vibrio, ya que estos
forman parte del ecosistema marino y podrían facilitar la transmisión rápida de
agentes infecciosos entre ellos y a otros animales (Bonnedahl et al., 2005).
1.2. Transmisión de Helicobacter spp. y Helicobacter pylori.
El género Helicobacter constituye un grupo bacteriano en expansión, y de
acuerdo a su lugar de colonización se dividen en especies entéricas cuando
colonizan el intestino y especies gástricas cuando colonizan el estómago
(Fernández, 2011).
Por muchos años se ha descrito el hábitat de Helicobacter limitado al nicho
gástrico y como únicas rutas de transmisión la fecal-oral, oral-oral y gástrica. Sin
embargo, en los últimos años varios estudios han evidenciado la presencia de
diferentes especies de Helicobacter en reservorios ambientales como las fuentes
de agua, donde viven por largos períodos sin perder su viabilidad (Azevedo et al.,
2008, Percival et al., 2009).
a) Fuentes de agua.
El agua, es uno de los principales vehículos de transmisión de patógenos
incluyendo a Helicobacter. La ingesta de agua contaminada particularmente con
heces de humanos o animales facilita a la bacteria la entrada a su hospedador
específico donde encuentra las condiciones óptimas para crecer, colonizar y dar
inicio a una infección (Brown, 2000; Cellini et al., 2004). A pesar que H. pylori
encuentra sus condiciones óptimas en el tracto digestivo humano, el agua ha sido
el ecosistema más estudiado como reservorio de esta bacteria, mostrando
evidencias de su supervivencia por largos períodos en los ambientes acuáticos
(Azevedo et al., 2009).
23
Estudios in vitro realizados mediante inoculación de cepas de H. pylori en agua
destilada, agua salina y agua de mar artificial han mostrado la capacidad de H.
pylori para sobrevivir y permanecer viable en estos medios por varios días y hasta
semanas a temperaturas entre 4°C y 15°C y a un amplio rango de valores de pH
(Beneduce et al., 2003).
En los últimos años se ha sugerido que la ingesta de agua de consumo
humano es una de las mayores rutas para adquirir la infección por H. pylori. La
forma de supervivencia de esta bacteria en la mayoría de los ambientes acuáticos
es el estado VBNC, el cual le permite protegerse de las condiciones adversas
(Skovgaard, 2007; Al-Sulami et al., 2012; Ghosh et al., 2012; Gião et al., 2011).
Algunos estudios realizados durante el año 2011 en varios países detectaron
un alto porcentaje de H. pylori en muestras de agua potable (Azevedo et al., 2008;
Campos et al., 2011; Gião et al., 2011). Particularmente en Costa Rica, la
presencia de esta especie estuvo relacionada con una alta incidencia de cáncer
gástrico en la población (Campos et al., 2011).
Las fuentes de agua pueden potenciar las rutas de transmisión fecal-oral, ya se
ha podido cultivar células de H. pylori a partir de muestras de agua de plantas de
tratamiento, donde los procesos de cloración no han sido suficientes para la
eliminación de este patógeno (Bellack et al., 2006; Vale et al., 2010; Moreno et al.,
2012). Sin embargo, el grado de contaminación fecal al que está expuesto un
ambiente acuático es determinante para la identificación o no del patógeno.
Estudios efectuados a partir de muestras de agua de río en Japón e Irán
evidenciaron resultados negativos a la hora de identificar H. pylori en zonas donde
el nivel de contaminación fue menor, mientras que en las zonas de mayor
contaminación fecal la identificación fue positiva para esta especie (Fujimura et
al., 2004; Massoudian et al., 2012; Kawaguchi et al., 2009; Yáñez et al., 2009).
Además de los ambientes acuáticos, Helicobacter y sus especies cuenta con
un rango amplio de hospedadores animales.
b) Reservorios animales.
Numerosas especies de Helicobacter han sido aisladas a partir del estómago,
intestino e hígado de mamíferos y aves. Principalmente las aves marinas son
consideradas reservorios y han actuado como agentes de dispersión de
patógenos a otros ambientes y hospedadores (Carlos et al., 2008).
Diferentes especies de Helicobacter tienen potencial zoonótico: H. heilmannii y
H. felis están asociadas con gastritis en una variedad de animales y en humanos,
24
H. pollorum ha sido aislado de humanos y pollos y H. canis frecuentemente
está presente en perros, gatos y humanos. La especie H. pylori puede ser
transmitida entre humanos y animales incluso a partir de una fuente de su mismo
origen como la leche (Fox, 2002; Tabatabaei, 2012).
A pesar de haber identificado varias especies de Helicobacter en un amplio
rango de hospedadores animales, no existen reportes de la presencia de estas
especies en animales silvestres de la Antártida. Sin embargo, patógenos como
Salmonella entérica y Campylobacter sp. ya han sido aisladas a partir de algunas
especies de pingüinos y otras aves silvestres antárticas evidenciando el impacto
negativo de la actividad humana en estos ecosistemas y el riesgo de las aves
cuando actúan como reservorios de patógenos procedentes de otros
hospedadores (Barbosa et al., 2009).
Trabajos realizados en aves y mamíferos de las regiones Antárticas y sub-
Antárticas reportan la presencia de Campylobacter lari, un patógeno humano
(Frenot et al., 2005; Griekspoor et al., 2009; Debruyne et al., 2010). El potencial
zoonótico de C. lari causó Campylobacteriosis en nuevos hospedadores
evidenciando el daño causado por microorganismos no autóctonos (Leotta et al.,
2006). Adicionalmente estudios recientes ha reportado la presencia de la familia
Helicobacteraceae en el heces de varias especies de pingüinos (Dewar et al.,
2013).
Los trabajos descritos anteriormente demuestran la importancia de las fuentes
de agua naturales y los reservorios animales para la supervivencia y transmisión
de especies de los géneros Vibrio y Helicobacter. Sin embargo, aislar y crecer
estas bacterias a partir de muestras ambientales, representa una tarea muy
compleja debido a la variabilidad de su morfología y fisiología en el ambiente.
Las técnicas microbiológicas convencionales, como el cultivo, no han sido
eficientes para detectar estos géneros bacterianos en muestras de ambientes
naturales y en ocasiones los métodos inmunológicos (inmunofluorescencia,
ensayos inmuno-absorbentes) han sido una mejor alternativa para su detección
(Connelly et al., 2012).
No obstante, los métodos moleculares basados en la amplificación del ácido
nucleico presente en los microorganismos ha sido ampliamente utilizada para la
detección de los géneros Vibrio y Helicobacter (Sheikh et al., 2012; Al-Sulami et
al., 2012).
25
1.3. Métodos moleculares.
Los métodos o técnicas moleculares, se basan en el análisis de la información
procedente de bio-moléculas como los ácidos nucleicos (ADN y ARN). Esta
información permite identificar, clasificar y cuantificar la abundancia de especies
microbianas, así como también explicar la funcionalidad y estructura genética de
las mismas (Somerville et al., 1989; Hugenholtz, 2002, Rastogi et al., 2011).
Existen varias aplicaciones de estos métodos moleculares, las cuales varían
con respecto al poder discriminatorio, reproducibilidad, facilidad de aplicación, uso
y facilidad de interpretación de datos. En este contexto, una de las técnicas
moleculares más utilizada es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por
sus siglas en inglés: Polimerase Chain Reaction) (Lasker, 2002; Barghouti, 2011).
1.3.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
La PCR es una amplificación enzimática in vitro de un segmento de ADN
específico. La reacción de amplificación solo puede ocurrir en presencia de los
siguientes elementos: ADN molde; oligonucleótidos iniciadores (cebadores), ADN
polimerasa, desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs) y un termociclador que es el
dispositivo que controla la temperatura requerida en cada fase y que puede oscilar
entre 4°C y 94°C.
El ADN molde, es la secuencia especifica de ADN que se desea amplificar y
dependiendo de la muestra su cantidad puede variar entre 1 y 20 ng. Los
componentes más sensibles de la reacción son las cadenas de ácidos nucleicos
denominadas oligonucleótidos iniciadores (cebadores) su longitud puede
variar entre 18 y 30 nucleótidos y la concentración que se usa en la reacción varía
entre 0,1 y 0,5 μM. Mientras que la enzima ADN polimerasa, cuya máxima
actividad ocurre entre los 70° y 80°C, es considerada fundamental en el
procedimiento de amplificación ya que mantiene la resistencia y estabilidad a las
altas temperaturas requeridas en cada fase de la reacción y es la responsable de
ir añadiendo a los desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs), que son
monómeros distinguibles entre sí por sus bases nitrogenadas, la variación en su
concentración afecta la especificidad y fidelidad de la reacción, las
concentraciones usualmente utilizadas varían entre 0.2 a 1 mM (Rodríguez et al.,
2004).
El proceso de amplificación comienza con la separación de las hebras de ADN
(desnaturalización) por efecto de altas temperaturas; una vez abierta la doble
hélice, un juego de cebadores (iniciadores) se unen en las regiones
26
complementarias de cada hebra de ADN (hibridación) y la enzima ADN
polimerasa va añadiendo los (dNTPs) desoxirribonucleótidos trifosfato (extensión)
dando lugar al proceso de síntesis de una nueva hebra que es la replica del ADN
molde. Seguidamente por acción de la temperatura, cada hebra nueva se separa
de su homóloga de forma que los cebadores reconocen nuevamente sus regiones
complementarias formando nuevas hebras y el ciclo continúa con repeticiones de
las tres fases de la amplificación hasta crear una gran cantidad de copias de un
fragmento específico proveniente del ADN molde (Gerhardt et al., 2004;
Rodríguez et al., 2004).
Sin embargo, la especificidad de la reacción suele ser afectada por
contaminación (errores en la manipulación) o presencia de sustancias inhibidoras
de la polimerasa (etanol, carbohidratos, polifenoles) en las muestras analizadas.
La especificidad y sensibilidad de la reacción, puede ser mejorada a través de la
aplicación de algunas variantes en el procedimiento, como la aplicación de una
PCR anidada o PCR semi-anidada (Delabre et al., 1998; Field et al., 1998;
Babalola, 2003).
1.3.2. PCR anidada y semi-anidada.
La PCR anidada, es la amplificación de un segmento de ADN interno en un
segmento de ADN previamente amplificado. Para su realización se debe contar
con dos juegos de cebadores, el primer juego de cebadores permite la
amplificación de un segmento de ADN específico, luego éste producto es
sometido a una segunda amplificación utilizando el segundo juego de cebadores
que deben ser específicos para una secuencia interna de la primera amplificación
(Jou et al., 1997; Wang et al., 2004).
La aplicación de la PCR anidada, permite verificar la especificidad del primer
juego de cebadores e incrementar la sensibilidad de la segunda reacción ya que
se la considera mil veces más eficiente que una PCR simple, este método se
utiliza principalmente cuando la concentración del ADN blanco de un
microorganismo es muy baja (Wang et al., 2004).
La PCR semi-anidada es un método muy similar a la PCR anidada que ayuda
a mejorar la especificidad de la amplificación de un segmento de ADN, con la
diferencia que se utiliza uno de los cebadores tanto en la primera amplificación
como en la segunda. La PCR semi-anidada ha tenido mucho éxito en la detección
de genes específicos para especies de varios microorganismos a partir de
muestras de agua y otros ambientes incluyendo bacterias patógenas como
Shigella, Vibrio y H. pylori. Estas variantes han servido también para la
27
identificación de varias especies microbianas a partir de muestras de heces
(Theron et al., 2000; Theron et al., 2001; Alam et al., 2003; Babalola, 2003).
Las principales ventajas de la PCR y sus variantes en comparación a las
técnicas de cultivo tradicionales, se fundamentan principalmente a la mayor
sensibilidad (capacidad de detectar la presencia de un gen en particular a bajas
concentraciones) y especificidad (capacidad de detectar la presencia de un gen
de un organismo en particular), así como la disminución del tiempo y costo para
obtener resultados mediante la automatización del procedimiento (Delabre et al.,
1998).
La utilización de oligonucleótidos específicos ha permitido la detección de un
número muy bajo de algunos microorganismos como las bacterias en diferentes
ambientes aún en formas viables pero no cultivables proporcionando datos
satisfactorios al menos con respecto a especies patógenas (Covadonga et al.,
1995).
A estas ventajas se suman:
La amplificación de secuencias de ADN específicas a partir de mezclas
complejas.
La amplificación de alelos mutantes que permiten la detección de
enfermedades genéticas de humanos y animales.
La amplificación de grandes cantidades de una sola molécula que pudiera
ser utilizada experimentalmente (Wakefield, 2003).
Sin embargo, las técnicas moleculares también tienen varias desventajas como
la incapacidad para diferenciar entre organismos vivos o muertos. Generando
datos de sobre estimación de la abundancia total de géneros como Vibrio en
muestras ambientales, tras detectar el ADN de células muertas que permanece
intacto (Johansson et al., 2002; Asplund, 2013).
En la PCR y sus variantes (PCR anidada y semi-anidada) otra desventaja es la
alta probabilidad de contaminación durante la transferencia del ADN molde o el
producto de la primera amplificación lo cual produce resultados falsos positivos
(Jou et al., 1997; Wang et al., 2004).
28
1.4. Genes específicos para la detección de especies bacterianas.
La comparación de las secuencias de los genes que codifican para el ARNr es
una herramienta poderosa para determinar las relaciones filogenéticas y
evolutivas entre organismos tanto procariotes como eucariotes (Weisburg et al.,
1991).
En procariotes, el cronómetro molecular más importante es el gen 16S ARNr
debido a que su ARN es funcionalmente constante y su estructura primaria es
muy conservada, a pesar de mostrar algunas regiones variables (Woese, 1987;
Vandamme et al., 1996). Siete de cada 10 bacterias tienen una similitud hasta en
un 97% de su secuencia del gen 16S ARNr y el 3% restante está determinado por
las regiones variables (Stackebrandt et al., 1994).
1.4.1. Gen 16S ARNr.
El gen 16S ARNr es un polirribonucleótido codificado por el gen rrs
denominado ADN ribosomal 16S, su secuencia de nucleótidos de cadena sencilla
se alterna con segmentos de doble cadena que dan lugar a una estructura
secundaria. Además, en su secuencia se hallan una o mas regiones
características que se denominan oligonucleótidos o secuencias “firma”, estas
secuencias cortas aparecen en todos o en la mayor parte de los miembros de un
determinado grupo filogenético y nunca o raramente están presentes en otros
grupos, (incluidos los mas próximos) por lo tanto estas regiones son utilizadas
para identificar a cada bacteria dentro de su propio género (Rodicio et al., 2004).
Las características de este gen consideradas la base para el estudio de la
taxonomía y filogenia bacteriana son:
Su presencia en todos los microorganismos y casi todas las bacterias como
una familia de operones o multigenes.
Se trata de una molécula muy antigua que ha estado y sigue presente en
las bacterias actuales.
Su estructura y la función que cumple ha permanecido constante, pero que
algunos cambios al azar en su secuencia ocurren de manera
suficientemente lenta, lo cual implica evolución.
Contiene en su secuencia suficiente variabilidad para diferenciar no solo los
organismos más alejados, sino también los más próximos.
29
El tamaño de la secuencia, con 1500 pb es considerado suficiente para
secuenciación y fines informáticos (Woese, 1987; Vandamme et al., 1996;
Rodicio et al., 2004; Janda et al., 2007).
Se asume entonces, que dado su alto grado de conservación en la mayoría de
microorganismos, el gen 16S ARNr es un componente fundamental de la función
celular de la mayoría de microorganismos, el análisis de las regiones conservadas
en este gen ha permitido una rápida identificación de cepas bacterianas de
importancia clínica por su carácter patógeno (Clarridge, 2004).
1.4.2. Gen 16S ARNr de Vibrio spp. y Helicobacter spp.
Además de las regiones conservadas, el gen 16S ARNr generalmente contiene
nueve regiones hípervariables, que demuestran considerable diversidad de las
secuencias entre las especies bacterianas y pueden ser utilizadas para la
identificación de las mismas (Chakravorty et al., 2007).
Una de las regiones hípervariables en el gen 16S ARNr es la conformada por el
operón rrn. El número de operones rrn en bacterias varía de 1 a 11, marcando la
variabilidad de las secuencias, algunas especies patogénicas del género Vibrio
tienen entre 8 y 9 operones, mientras que las especies no patogénicas tienen 10
operones. En cambio especies como H. pylori tan solo muestran 2 operones en la
estructura del gen 16S ARNr (Chun et al., 1999; Moreno et al., 2002).
La presencia de múltiples copias de estos operones están relacionados
directamente con las tasas de crecimiento de las especies, las mayores tasas de
crecimiento logran las especies que tienen varios operones rrn y aquellas que
tienen un número menor tienen mucha dificultad en su crecimiento (Stevenson et
al., 1998; Davies et al., 2003).
Los análisis de la secuencia del gen 16S ARNr en varias especies del género
Vibrio, muestran regiones conservadas y regiones variables las mismas que han
evolucionado a velocidades ligeramente diferentes. La variabilidad de nucleótidos
en estas regiones variables marca la diferencia entre las cepas clínicas y
ambientales, debido a que en ocasiones contienen genes en “clusters” que
otorgan el carácter patogénico (Faruque et al., 1998; Drake et al., 2007; Dryselius
et al., 2007).
Un trabajo realizado por Liu y col. muestra el diseño de un juego de cebadores
que amplifican un fragmento de alrededor de 575 pb del gen 16S ARNr
considerado específico para las especies del género Vibrio (Liu et al., 2006).
Mientras que para el género Helicobacter la región conservada corresponde a un
30
fragmento del gen 16S ARNr de 399 pb considerada constante y que proporciona
la información filogenética para éste género (Germani et al., 1997; Dewhirst et al.,
2005).
1.4.3. Genes específicos de V. cholerae.
El genoma de V. cholerae consiste de dos cromosomas, un cromosoma grande
de 2.96 millones de pb y un cromosoma pequeño de 1,97 millones. Un fragmento
muy conservado en su genoma, pertenece a una región de operon rrn de las
regiones espaciadoras (ISR) localizadas entre los genes 16S y 23S del ADN
ribosómico (Vanden Broeck, et al. 2007; Chun et al. 1999).
Las regiones espaciadoras intergénicas, especialmente las situadas entre
genes 16S ARNr y 23S ARNr, poseen una estructura secundaria y
frecuentemente genes que codifican para ARNt, sin embargo, con frecuencia
múltiples operones contienen la misma región intergénica. En V. cholerae, las
secuencias de las regiones intergénicas están asociadas al operon rrn 8,
consideradas como secuencias conservadas que podrían mostrar mayor
información de la variación genética que las regiones codificantes del ARNr (Chun
et al., 1999; Ghatak et al., 2005).
Por el contrario, la mayoría de genes de virulencia parecen existir en grupos
denominados islas de patogenicidad (genes de virulencia que se encuentran
agrupados en un locus dentro de alguno de los cromosomas del patógeno) y otros
genes que codifican para varias de sus toxinas como la hemolisina. Sin embargo,
la enterotoxina colérica es el factor de virulencia responsable de su condición
patogénica (Faruque et al., 1998; Goel et al., 2007).
La enterotoxina colérica codificada por los genes ctxAB se encuentra en
operones flanqueados por dos o más copias de secuencias ISR, que en conjunto
constituyen elementos genéticos característicos de estas islas de patogenicidad
(Pearson et al., 1993; Davis et al., 2000).
En el caso de la toxina colérica (CT), el bacteriófago CTX, confiere el operon
ctx que contiene a los genes ctxA y ctxB al genoma de V. cholerae y los genes
ctxAB que codifican para esta toxina. Sin embargo, el gen ctxA fue reconocido
como la subunidad activa, responsable de la toxicidad intracelular de la molécula
de CT constituyéndose así en un gen blanco para la determinación del carácter
patógeno de V. cholerae (Blackstone et al., 2007; Vanden Broeck et al., 2007).
31
1.4.4. Genes específicos de H. pylori.
La especie H. pylori posee un genoma circular de alrededor de 1 667 867 pb y
un ARNr muy conservado, el análisis de la secuencia de su genoma indica que
posee genes responsables de la codificación de sistemas muy bien desarrollados
para la motilidad, disponibilidad de hierro, así como para la restricción del ADN y
sus respectivas modificaciones (Tomb et al., 1997).
H. pylori posee un alto nivel de expresión de genes considerados únicos, como
el gen glmM (ureC). Este gen se encuentra en una sola copia cromosómica por
cada célula bacteriana y codifica para la enzima fosfoglucosamina mutasa de gran
especificidad y esencial para el crecimiento de esta especie, por lo tanto es
considerado un gen blanco y participa directamente en la síntesis de la pared
celular (Labigne et al., 1991; Kansau et al., 1996; Espinoza et al., 2011).
Además, en las cepas de H. pylori, la presencia de la proteína de membrana
cagA un antígeno inmunogénico de tamaño variable y función desconocida, es la
principal determinante de la virulencia, la proteína es codificada por el gen cagA
presente en la isla de patogenicidad del mismo nombre. En la estructura del gen
se observa una región altamente conservada en el extremo 5’ y la variación en el
tamaño de la proteína se ha correlacionado con la presencia de un número
variable de secuencias repetidas situadas en su región 3’ razón por la cual es
considerado también como gen blanco en la detección de esta especie bacteriana
(Tummuru et al., 1993; Yamaoka et al., 1998; Basso et al., 2008).
Actualmente, los métodos moleculares constituyen una herramienta
fundamental para la detección de microorganismos presentes en todos los
ambientes del planeta, razón por la cual su utilización para realizar
investigaciones en ecosistemas prístinos como los Antárticos permitirán elucidar si
estos géneros pueden ser encontrados en ambientes extremos. De esta manera
se podría orientar investigaciones para determinar microorganismos de origen
humano que puedan sobrevivir y adaptarse a las condiciones ecológicas de los
ambientes en la Antártida.
32
1.5. Justificación e Importancia.
En los últimos 10 años, la Antártida ha experimentado el aumento de las
actividades científicas, logísticas y turísticas que claramente han conducido a la
acumulación de impactos de diferente magnitud en sus ambientes, incluyendo su
flora y fauna (Tin et al., 2009). Quizás el mayor impacto es la introducción de
algunos patógenos humanos (Dobson et al., 2001), que debido a la disminución
de los glaciales y al aumento de temperatura han favorecido su adaptación a las
condiciones ambientales extremas y podrían favorecer la emergencia de
enfermedades en la fauna Antártica (Tuemmers et al., 2011).
Es importante determinar si existen microorganismos patógenos en el
continente Antártico e islas sub-Antárticas que formen parte de la microbiota local
o que por lo contrario han sido introducidos por las actividades antrópicas o
humanas a estos ambientes (Bonnedahl et al., 2005; Skovgaard, 2007).
Se considera de gran importancia llevar a cabo la detección de los géneros
Vibrio y Helicobacter en reservorios naturales y posibles hospederos animales en
la Antártida. Estas bacterias presentan características fisiológicas y mecanismos
de supervivencia que podrían favorecer su adaptación a las condiciones extremas
de estos ambientes acuáticos. Además, la detección de las especies con carácter
patogénico como V. cholerae y H. pylori evidenciaría el incumplimiento de varias
regulaciones establecidas para la actividad humana, enmarcadas en los acuerdos
instituidos en el Tratado Antártico.
Particularmente, el protocolo al Tratado Antártico, adoptado en Madrid en 1991,
establece en los artículos 2 y 3, la protección del medio ambiente Antártico y exige
que las actividades humanas sean planificadas y se realicen de modo que se
limiten las repercusiones negativas en el medio Antártico y en sus ecosistemas ya
que estos riesgos se relacionan con posibles contaminaciones locales por
derrames de productos de combustión y aguas residuales. Otros impactos
negativos pudieran ocasionar la desaparición del hábitat, alteración de la flora y
fauna silvestre y la introducción de especies exóticas y enfermedades
principalmente en la fauna Antártica.
33
1.6. Hipótesis
1.6.1 Los géneros Vibrio y Helicobacter podrían estar presentes en las heces
de pingüinos y ambientes acuáticos de la Antártida, debido a que
algunas de sus especies pueden colonizar el tracto digestivo de
diferentes animales, además varias especies de estos géneros podrían
tener capacidad de adaptación a condiciones extremas. Por el contrario,
la ausencia de los géneros Vibrio y Helicobacter en las heces de
pingüinos y en los ambientes acuáticos demostraría que estos géneros
no forman parte de la microbiota del tracto digestivo de estas aves ni del
ambiente acuático.
1.6.2 Debido a que la Antártida es un ambiente prístino se esperaría que las
especies patógenas humanas como V. cholerae y H. pylori no
estuvieran presentes. La presencia de estas especies estaría
relacionada con la introducción de microorganismos de origen humano
como resultado de las actividades antrópicas en la Antártida.
34
II. OBJETIVOS.
2.1. Objetivo general.
“Detectar los géneros Vibrio y Helicobacter en diferentes cuerpos de agua y en
heces de pingüinos de las islas Greenwich, Dee y Barrientos en la Antártida.
2.2. Objetivos específicos.
Detectar el género Vibrio y la especie V. cholerae en diferentes cuerpos de
agua y en heces de pingüinos mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
Detectar el género Helicobacter y la especie H. pylori en diferentes cuerpos
de agua y en heces de pingüinos mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR).
35
III. METODOLOGIA.
3.1. Área de estudio
La isla Greenwich, coordenadas UTM (Universal Transverse Mercator): 21E
358256 3071559, está ubicada entre las islas Robert y Livingston y forma parte
del Archipiélago Shetland del Sur, en la Península Antártica (Santana et al., 2002).
Al norte de la isla Greenwich se encuentra la Punta Fort William (UTM: 21E
360701 3072777) (Fig. 1), lugar donde se sitúan las instalaciones de la Base
Ecuatoriana Pedro Vicente Maldonado (EPVM). Las zonas circundantes a la
estación ecuatoriana y las islas más cercanas Dee y Barrientos fueron definidas
como las áreas de muestreo, durante la V Expedición Científica Venezolana en el
año 2012. En el verano del 2013 se tomaron muestras en las mismas zonas del
2012 y en dos lugares adicionales: Punta Ambato y el área circundante a la base
chilena Arturo Prat.
Figura 1. Mapa del continente Antártico y ubicación de isla Greenwich (21E 358256 3071559) y
Punta Fort William (21E 360701 3072777).
La Punta Fort William tiene una superficie de 80 Ha y está limitada por los
glaciares Quito y Traub, y gran parte de su área superficial permanece cubierta de
hielo durante todo el año (Burbano et al., 2008). Al oeste de la Punta Fort William
en las coordenadas UTM: 21E 357184 3074487, se encuentra Punta Ambato,
una zona formada por una meseta rocosa de origen volcánico de alrededor de 40
a 45 m de altura y una playa extensa con presencia de varias rocas a donde
llegan algunos ejemplares de la fauna marina antártica como mamíferos y
pingüinos (Santana et al., 2002).
Hacia la costa Norte de la Isla Greenwich, en la Bahía Chile, se encuentra la
Base chilena Arturo Prat en las coordenadas UTM: 21E 361792 3067246. La
36
superficie actual de la Base es 1380 m2 y es una de las áreas donde se han
evidenciado algunos efectos negativos debido a la actividad humana, como la
presencia de bacterias indicadoras de contaminación fecal (Calisto et al., 2009).
La isla Dee (21E 356244 3076306 UTM) tiene aproximadamente 4,5 Km2 de
superficie y se caracteriza por la presencia de extraordinarios afloramientos rocosos
y madera petrificada que permanecen bajo el hielo durante la mayor parte del año y
solo pueden observarse durante el verano austral (Torres et al.; 2009).
La isla Barrientos (21E 357986 3077558 UTM) está a menos de 7.3 Km de la
estación ecuatoriana (EPVM). Es uno de los sitios con mayor posibilidad para la
evaluación de los impactos turísticos sobre el terreno y la vida silvestre, ya que es
uno de los 10 lugares más visitados de la Península Antártica. Sus principales
atractivos turísticos son la presencia de petreles, mamíferos y las grandes
colonias de pingüinos situadas hacia la costa, que en el verano entran en su
período de reproducción, incubación de huevos y cría de polluelos. Además, en el
verano es posible observar una mínima vegetación por lo cual éste sector es
considerado el más frágil ante las actividades turísticas (Reck et al., 2007;
Hodgson, 2009; Jadwiszczak et al., 2011).
3.2. Muestreos.
Los muestreos se efectuaron durante el verano austral (Ene-Feb) 2012 y 2013
y en ambos años se recolectaron tanto muestras de agua de diferentes fuentes
así como heces de pingüino pico rojo (Pygoscelis papua) y pingüino barbijo
(Pygoscelis antarctica), que son las especies más abundantes en las zonas de
muestreo referidas. En la Tabla I se describen los lugares de recolección de las
muestras de agua indicando su origen y las coordenadas UTM de los muestreos
2012 y 2013. Las coordenadas UTM fueron registradas con un GPS modelo
76CSX (Garmin).
37
Tabla I. Lugares de recolección, fuente de origen y coordenadas de las muestras de agua colectadas en los años 2012 y 2013.
Lugar
Año 2012 Año 2013
Fuente De agua
Muestra Coordenadas
(UTM)
Fuente de
agua Muestra
Coordenadas (UTM)
Zona A. Isla Greenwich
deshielo deshielo deshielo
mar
Pto5 Pto6 Pto7 Mal
21E 358056 3072882 21E 358270 3072992 21E 358375 3072803 21E 358470 3072931
deshielo deshielo mar mar mar mar mar mar mar mar mar residual residual residual
EPVM1a EPVM2a ZAT1a ZAT2a ZAT3a ZAT4a ZAT5a ZATp1a ZATp2a ZATp3a ZAT6a ZAEPVM3a ZADes.tanq ZADes.dir
21E 358622 3072819 21E 358549 3072797 21E 358397 3072951 21E 357884 3072956 21E 357319 3073096 21E 356596 3073379 21E 356145 3073641 21E 358293 3073718 21E 358361 3073371 21E 358369 3073009 21E 358715 3073439 21E 358442 3072875 21E 358549 3072797 21E 358442 3072875
Zona B. Isla Greenwich
deshielo mar
Pto2 Pto10
21E 358970 3072642 21E 359030 3072583
rio rio deshielo mar
RC1a RC2a ZB4a ZB3a
21E 359308 3072879 21E 359342 3072693 21E 359406 3072584 21E 359398 3072714
Zona C. Isla Greenwich
río mar deshielo
Pto3 Pto8 Pto9
21E 358878 3072452 21E 358908 3072082 21E 358933 3071835
mar mar
ZC1a ZC2a
21E 359219 3072042 21E 359145 3071925
Isla Dee
lago
2P2
21E 356188 3075591
mar deshielo
Dee1a Dee2a
21E 356023 3074717 21E 355689 3074852
Barrientos mar Barrientos 21E 358363 3077481
deshielo deshielo mar mar
Barr2a Barr4a Barr1a Barr3a
21E 357327 3077357 21E 357454 3077228 21E 358377 3077427 21E 357314 3077395
Pta. Ambato. Isla Greenwich
deshielo ZAPA1a
21E 355883 3073379
Base Prat Isla Greenwich
BP mar mar
BP1a BP2a
21E 362763 3069518 21E 362396 3069049
Las muestras de heces de cada una de las especies de pingüinos fueron
recolectadas y georeferenciadas como se describe en la Tabla II. En la isla
Barrientos, donde se sitúan las colonias de pingüinos se recolectaron muestras de
varios ejemplares muy cercanos entre sí, razón por la cual se determinó un solo
punto de georeferencia dentro de la colonia.
38
Tabla II. Lugares de recolección de las muestras de heces de pingüinos en
los años 2012 y 2013.
Lugar Año 2012 Año 2013
Especie Muestra Coordenadas
(UTM) Especie Muestra
Coordenadas (UTM)
Zona A. Isla Greenwich
P. papua P2.1 P2.2 P2.3
21E 358748 3073159 21E 358748 3073159 21E 358748 3073159
P. papua
EPVM1 EPVM2 EPVM3 EPVM4 EPVM5 EPVM6
21E 358506 3077627
Zona B. Isla Greenwich
P. papua P5.1 P5.2 P5.3 P6.1 P6.2 P6.3
21E 359343 3072999 21E 359343 3072999 21E 359343 3072999 21E 359332 3072905 21E 359332 3072905 21E 359332 3072905
P. papua RC1 RC2
21E 359365 3072759 21E 359390 3072551
Zona C. Isla Greenwich
P. papua
ZC1 ZC3 ZC4
21E 359219 3072042 21E 358848 3071747 21E 359100 3071758
Isla Dee
P. papua P. antarctica
Dee1 Dee2 Dee3 Dee4 Dee5 Dee6
21E 356023 3074717 21E 355689 3074582 21E 355689 3074581 21E 355782 3074574 21E 355783 3074606 21E 355815 3074519
Isla Barrientos
P. papua P9.1 P9.2 P9.3
21E 358310 3077385 21E 358310 3077385 21E 358310 3077385
P.papua P. antarctica
B1, B2 B3, B4 B5, B6 B7, B8 B9, B10 B11, B12 B13, B14 B15 B16, B17, B18, B19, B20, B21 B22, B23 B24, B25 B26, B27
21E 358316 3077472 21E 358405 3077450
Pta. Ambato Isla Greenwich
P. antarctica P. Amb1 P. Amb2 P. Amb3 P. Amb4
21E 355675 3073168 21E 355675 3073168 21E 355675 3073168 21E 355975 3073487
3.3. Toma y procesamiento de muestras de agua y heces.
3.3.1. Toma de muestras de agua. Los puntos escogidos fueron
georeferenciados y se registraron los parámetros físico-químicos: pH,
conductividad, oxígeno disuelto (DO), temperatura, salinidad, sólidos totales
disueltos (TDS) y potencial de reducción de oxígeno (ORP), utilizando la sonda
multiparamétrica, modelo UX22 (Horiba Process & Environmental).
39
Cada muestra fue tomada en un envase estéril de 5 L, previamente lavado con
agua del sitio de muestreo (curado), luego se introdujo el envase hasta
aproximadamente 10 cm por debajo de la superficie y se llenó de agua, se
identificó la muestra y se la transportó hasta la EPVM, para su filtración. Las
muestras fueron mantenidas a temperatura ambiente (0°C) hasta su filtración por
un período no mayor a 2 horas.
En la EPVM, en el año 2012 se filtraron 500 ml de agua utilizando un sistema
de filtración Millipore, a través de una membrana Durapore GV de 0,22 μm y 47
mm de diámetro (GSWP04700) y un bomba de vacío modelo WP6211560
(Welch), este procedimiento se realizó por triplicado para cada muestra. Luego
cada filtro fue colocado en un tubo de 15 ml y congelado a -20°C, para luego ser
transportados en cadena de frío por aproximadamente 25 días hasta llegar al
laboratorio en el IVIC.
En el año 2013, se realizó el mismo procedimiento utilizando membranas de
filtración de 0,22 μm y 47 mm de diámetro, modelo N°66477 (Pall Corporation) y
tres sistemas de filtración de policarbonato modelo SM16510 (Sartorious)
insertados a una base metálica modelo 16826 (Sartorious) y a una bomba de
vacío modelo 2534B_01 (Welch). Entre la filtración de cada muestra de agua de
diferentes localidades, los sistemas fueron lavados con agua destilada estéril e
irradiados con UV por 15 min. Con la finalidad de confirmar que no había
contaminación bacteriana entre muestras, una vez terminada la filtración de las
muestras de agua colectadas, se realizó un control negativo que consistió en filtrar
500 ml de agua destilada estéril aplicando el mismo procedimiento descrito para
las muestras.
3.3.2. Toma de muestras de heces. Las muestras de heces de pingüinos fueron
tomadas del sedimento y colocadas en un recolector de heces estéril con ayuda
de una espátula, los recolectores fueron cerrados herméticamente con parafilm,
etiquetados y congelados a -20°C hasta llegar al laboratorio en el IVIC. En cada
punto de muestreo se fotografió al ejemplar de pingüino para su identificación.
40
3.4. Análisis moleculares de las muestras de agua y heces.
3.4.1. Extracción de ADN.
3.4.1.1. Muestras de agua.
El procedimiento de extracción de ADN de las muestras de agua filtradas se
realizó en el laboratorio de Fisiología Gastrointestinal, CBB (IVIC), utilizando el
estuche comercial QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN).
La mitad del filtro de una de las réplicas fue cortado en trozos pequeños bajo
condiciones de esterilidad los mismos que fueron colocados en un tubo eppendorf
estéril de 1.5 ml, al cual se le añadieron las soluciones siguiendo las instrucciones
descritas por la casa comercial para muestras de tejido.
Para confirmar que no hubo contaminación externa en el proceso de extracción
de ADN, se incluyó un control negativo, utilizando un tubo estéril de 1.5 ml con
exclusivamente las soluciones del kit, sometiéndolo al mismo procedimiento
descrito para las muestras.
3.4.1.2. Muestras de heces.
La extracción del ADN de las muestras de heces de pingüinos, se realizó en el
laboratorio de Fisiología Gastrointestinal, CBB (IVIC), utilizando el estuche
comercial denominado Power Soil DNA isolation kit (MOBIO Laboratorios). Se
tomaron 250 mg de cada muestra de heces y se siguió el protocolo indicado por la
casa comercial para muestras de suelos. Además se incluyó un control negativo
en el procedimiento de extracción de ADN de las heces, que consistió de un tubo
estéril de 1,5 ml con las soluciones del kit y que fue sometido al mismo
procedimiento descrito para las muestras.
Posteriormente, 5μl del ADN extraído tanto de las muestras de agua como de
las muestras de heces fue depositado en un gel de agarosa (2%) con bromuro de
etidio. La electroforesis del gel en buffer TBE 0.5X fue realizado a 150V durante
60 min, para observar el rendimiento de la extracción del ADN por
transiluminación mediante una lámpara UV. El ADN de las muestras fue
almacenado a -20°C, para ser utilizado en la amplificación por PCR de fragmentos
de genes específicos que permitan detectar los géneros de interés.
41
3.5. Reacción en cadena de la polimerasa PCR.
Para confirmar la presencia de ADN bacteriano y descartar las posibles
inhibiciones de la PCR en todas las muestras de agua y heces, se realizó una
PCR utilizando los cebadores 8F y 1525R (Tabla III) que amplifican el gen 16S
ARNr de Eubacteria (Contreras et al., 2007). Como control positivo de esta
reacción se amplificó ADN de un aislado clínico de Helicobacter pylori,
proporcionado por la Dra. Mónica Contreras del Laboratorio de Fisiología
Gastrointestinal, CBB (IVIC) y como control negativo se utilizó agua estéril en
lugar de ADN molde para confirmar la ausencia de contaminación. Las
condiciones de la PCR están descritas en la Tabla III.
También se realizó la PCR utilizando los cebadores antes descritos para
confirmar que los controles negativos del sistema de filtración y de la extracción
de ADN no estaban contaminados, sometiéndolos al mismo procedimiento de
amplificación descrito para las muestras.
3.6. Detección por PCR de Vibrio spp. y V. cholerae en ADN de agua y
heces.
La presencia del género Vibrio en las muestras de agua y en las heces de
pingüinos se determinó realizando una PCR con los cebadores VF169 y VR744
(Tabla III) que amplifican una región de 575 pb del gen 16S ARNr específica para
este género (Liu et al., 2006).
Además, para la detección del género Vibrio en el ADN de las muestras de
agua se realizó una PCR anidada utilizando dos grupos de cebadores. En la
primera reacción de PCR se utilizaron los cebadores 8F y 1525R para amplificar
el gen 16S ARNr de Eubacteria. El producto de la primera PCR fue utilizado como
ADN molde para la segunda reacción de PCR con los cebadores VF169 y VR744
específicos para una región del gen 16S ARNr de Vibrio. Las condiciones de la
PCR se describen en la Tabla III.
Como control positivo de la PCR para el género Vibrio se utilizó el ADN de un
aislado clínico de Vibrio parahaemolyticus N° 847 procedente del Centro
Venezolano de Colecciones de Microorganismos (CVCM) del Instituto de Biología
Experimental de la Universidad Central de Venezuela proporcionada por la Dra.
Paula Suárez (USB) y como control negativo se utilizó agua estéril en lugar de
ADN molde de la reacción.
42
3.7. Detección por PCR de Helicobacter spp. y H. pylori en ADN de agua y
heces.
La presencia del género Helicobacter en las muestras de agua y heces de
pingüinos se determinó realizando una PCR con los cebadores específicos HeliF y
HeliR (Tabla III) que amplifican una región del gen 16S ARNr para este género
(Germani et al., 1997).
La especie H. pylori, se detectó utilizando cebadores específicos glmMF y
glmMR (Tabla III) que amplifican un fragmento del gen glmM que codifica para la
enzima fosfoglucosamina mutasa que cataliza la conversión de glucosamina-6-
fosfato a glucosamina-1-fosfato y es de gran especificidad como un gen único y
esencial para el crecimiento de esta especie (Kansau et al., 1996).
En las muestras de agua, la detección del género Helicobacter se realizó
mediante una PCR semi-anidada utilizando dos grupos de cebadores. En la
primera reacción de PCR se utilizaron los cebadores HeliF y EpsilonR (Tabla III)
que amplifican una región del gen 16S ARNr de Epsilonbacteria. El producto de la
primera PCR fue utilizado como ADN molde para la segunda reacción de PCR
con los cebadores HeliF y HeliR específicos para Helicobacter. Como control
positivo para todas las PCR del género Helicobacter y H. pylori se amplificó el
ADN del aislado clínico de H. pylori antes descrito y como control negativo se
utilizó agua estéril en lugar de ADN molde. Las condiciones de amplificación de la
PCR se describen en la Tabla III.
43
Tabla III. Secuencia de los cebadores, tamaño del fragmento a amplificar y
condiciones de PCR utilizadas para la detección de los géneros Vibrio y
Helicobacter en muestras de agua y heces de pingüino.
Región
específica
(gen)
Secuencia de los cebadores Tamaño
del
fragmento
Condiciones
de la PCR
Referencia
Gen 16S ARNr. Eubacteria.
8F: 5’ –AGA GTT TGA TCC TGG
CTC AG -3’ 1525R: 5’ –AAG GAG GTG ATC
CAG CC-3’
1517pb 94°C x 6 min, 30 ciclos de 94°Cx 45seg, 55°C x 45seg, 72°C x 1min. 72°C x 10 min
Contreras et al., 2007.
Gen 16S ARNr. Vibrio spp.
V169F: 5’ –GGA TAA CYA TTG
GAA ACG ATG -3’ V744R: 5’ –CAT CTG AGT GTC
AGT RTC TG-3’
575pb 95°C x 5 min, 30 ciclos de 94°Cx 1min, 54°C x 1min, 72°C x 1min. 72°C x 10 min.
Liu et al., 2006.
Gen 16S ARNr.
Helicobacter
spp. (parcial).
HeliF: 5’ –AAC GAT GAA GCT
TCT AGC TTG CTA G-3’
HeliR: 5’ –GTG CTT ATT CST
NAG ATA CCG TCA T-3’
399 pb 94°C x 5 min, 35
ciclos de 94°C x
0.3 min, 60° x 1
min, 72°C x 1
min. 72°C x 10
min
Germani et
al., 1997.
Gen glmM. H.
pylori. GlmMF: 5’-GGA TAA GCT TTT
AGG GGT GTT AGG GG-3’
GlmMR: 5’-GCT TAC TTT CTA
ACA CTA ACG CGC-3’
294pb 95°C x 5 min, 35
ciclos de 94°C x 1
min, 56°C x 1 min,
72°C x 7 min.
Kansau et
al., 1996.
Gen 16S ARNr.
Epsilonbacteria
HeliF: 5’ –AAC GAT GAA GCT
TCT AGC TTG CTA G-3’
Epsilon R: 5’-TAT TCA CCG YRR
CAT GGC TGA TYY R-3’
967pb 94°C x 5 min, 35
ciclos de 94°C x
0.3 min, 60° x 1
min, 72°C x 1
min. 72°C x 10
min.
Germani et
al., 1997.
Todas las reacciones de PCR se realizaron en un termociclador modelo Gen
AMP 9700 (Applied Biosystems, CA.) y se utilizó el producto comercial
denominado Puretaq Ready to go PCR (GE Healthcare) siguiendo las
instrucciones de la casa comercial. Este estuche ha sido probado y estandarizado
en el Laboratorio de Fisiología Gastrointestinal, CBB (IVIC).
44
Concluida la amplificación tanto para los géneros como para la especie H.
pylori, 15 μl del producto de la PCR fue visualizado mediante corrida en gel de
agarosa (2%) con bromuro de etidio, la electroforesis se realizó en buffer TBE
0.5X (0.045M de TBE y 0.001M EDTA) a 150 V durante 70 min, posteriormente el
gel fue observado mediante luz UV y los resultados fotografiados.
Con la finalidad de identificar las posibles especies de los géneros Vibrio y
Helicobacter se procedió a la purificación y secuenciación de algunos de los
productos de amplificación obtenidos tanto en las muestras de agua como de
heces de pingüinos.
3.8. Secuenciación de productos de PCR.
Para identificar las especies de Helicobacter presentes en las muestras, se
escogieron 12 muestras de heces de pingüinos y 8 muestras provenientes de
diferentes fuentes de agua, mientras que para identificar las especies de Vibrio se
seleccionaron 2 muestras de agua de mar como se describe en la Tabla IV.
En las muestras de heces de pingüinos, se realizó una PCR para el género
Helicobacter con un volumen de reacción de 100μl (Tabla III). Mientras que en las
muestras de agua se realizó una PCR semi-anidada para el género Helicobacter,
obteniéndose 100 μl del producto de la segunda reacción (PCR2) (Tabla III).
Luego los productos de amplificación tanto de las muestras de heces de pingüinos
como de las muestras de agua fueron purificados utilizando el kit QIAquick PCR
Purification N° 28104 (Qiagen) siguiendo el procedimiento descrito por la casa
comercial.
Para identificar las especies de Vibrio, se realizó una PCR anidada para el género
Vibrio con un volumen de reacción de 100μl (Tabla III). El producto de la segunda
PCR (100 μl) fue corrido en un gel de agarosa (2%) y la banda del peso
molecular esperado fue cortada y purificada mediante el kit QIAquick Gel
Extraction N°28704 (Qiagen) siguiendo el procedimiento descrito por la casa
comercial.
45
Tabla IV. Productos de PCR de regiones específicas del gen 16S ARNr para
Helicobacter spp. y Vibrio spp. en muestras de agua y Helicobacter spp. en
muestras de heces de pingüinos.
Especie de pingüino
Muestras para Helicobacter spp. Año
Concentración de ADN
Pingüino
pico rojo
(Pygoscelis
papua)
Zona A. Isla Greenwich P2.2
2012
50 ng/μl
Zona B. Isla Greenwich P5.2 10 ng/μl
Barrientos P9.1 5 ng/μl
Zona B. Isla Greenwich. RC2
2013
5 ng/μl
Zona C. Isla Greenwich. ZC4 50 ng/μl
Barrientos. B6 50 ng/μl
Barrientos. B9 50 ng/μl
Zona A. Isla Greenwich EPVM1 100 ng/μl
Pingüino
barbijo
(Pygoscelis
antárctica).
Isla Dee. Dee5
2013
20 ng/μl
Isla Greenwich.PAmb2 30 ng/μl
Barrientos. B18 10 ng/μl
Barrientos. B25 10 ng/μl
Agua de mar Isla Greenwich. ZCPto8
2012
50 ng/μl
Agua de
deshielo
Isla Greenwich. ZCPto9 50 ng/μl
Agua de mar Isla Greenwich. ZAMal 100 ng/μl
Agua de
deshielo
Isla Dee. Dee2
2013
100ng/μl
Agua de mar Isla Greenwich. ZAT5 50 ng/μl
Agua mar Isla Greenwich. ZCPto2 100 ng/μl
Agua mar Barrientos. Barr1 100 ng/μl
Agua residual Isla Greenwich. ZADes.dir. 100 ng/μl
Muestras para Vibrio spp.
Agua de mar Isla Greenwich. ZAMal 2012 50 ng/μl
Agua de mar Barrientos. Barr 3 2013 50 ng/μl
46
En todos los productos purificados, la concentración de ADN fue estimada
utilizando el marcador de peso molecular (PM) N° 10068-013 (Invitrogen), la
electroforesis se realizó en buffer TBE 0.5X (0.045M de TBE y 0.001M EDTA) a
150 v durante 70 min, luego el gel fue observado mediante luz UV y fotografiado.
El ADN purificado fue almacenado a -20°C.
Los productos de PCR purificados fueron secuenciados con ambos cebadores,
tanto para el género Helicobacter como para el género Vibrio utilizando los
servicios de secuenciación de la compañía Macrogen Inc (Seoul, Korea).
3.9. Análisis de secuencias.
Las secuencias obtenidas fueron ensambladas usando el programa cap3
Sequence Assembly Programm (Huang et al., 1999) y comparadas con la base de
datos de la librería de nucleótidos del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
mediante BLASTn (Altschul et al., 1997).
3.9.1. Análisis Filogenéticos.
Los árboles filogenéticos tanto para el género Vibrio como para el género
Helicobacter fueron construidos mediante la alineación de secuencias de la base
de datos del GenBank utilizando los programas SINA Alignment (Pruesse et al.,
2012) y Mega 5.2 para la construcción del árbol filogenético (Tamura et al., 2011).
3.10. Detección del marcador molecular HF183 específico de humanos
(Bacteroides HF183), como indicador de contaminación fecal en muestras de
agua de la Antártida, mediante PCR en tiempo real.
Para determinar contaminación fecal humana se estudio la presencia de un
marcador genético presente en el género Bacteroides identificado con las siglas
HF183 de donde se derivó el clon. Para esto se utilizó 5 μl de ADN de las
muestras de agua del efluente de la planta de tratamiento de agua residual
ZADes.dir, agua de mar Barr1, agua de deshielo ZAPA1 procedentes de la
Antártida. Como control positivo de las reacciones se utilizó ADN procedente de
agua del río Guaire proporcionada por el Dr. Walter Betancourt, (CMBC) y un
control negativo que consistió en 5 μl de agua estéril.
Para la PCR en tiempo real se utilizó una mezcla de reacción Sybr Advantage
qPCR Premix (TAKARA, Wisconsin, EEUU) y el juego de cebadores HF183sf (5’
47
ATC ATG AGT TCA CAT GTC CG-3’) y HF183sr (5’ TAC CCC GCC TAC CTA
ATG-3’) cada uno a una concentración 0.2 μM que amplifican un fragmento de 82
pb del gen 16S ARNr específico de Bacteroides presente en humanos (Seurink et
al., 2005).
La mezcla de la reacción fue preparada con 20 μl y contenía 5 μl de ADN
molde para un volumen final de 25 μl. La reacción de amplificación fue llevada a
cabo en un termociclador SmartCycler® (Cepheid, Francia), bajo las siguientes
condiciones de amplificación: desnaturalización inicial por 30 segundos a 95°C, 40
ciclos de 30 segundos a 95°C, 60 segundos a 53°C y 60 segundos a 60°C con la
lectura encendida a este nivel, y seguido por un gradiente de 60° a 95° con un
incremento de 0,2 segundo por grado centígrado para generar una curva de
disociación. El análisis de amplificación se llevo a cabo con el Software del
sistema Dx 3.0a.
48
IV. RESULTADOS.
4.1. Muestras de diferentes fuentes de agua colectadas en la Antártida.
Cuarenta (40) muestras de agua procedentes de diferentes fuentes fueron
colectadas en la Antártida durante dos períodos de muestreo. En el primer
período de muestreo (Enero-Febrero 2012), se colectaron un total de 11 muestras
de agua de diferentes localidades distribuidas de la siguiente manera: cinco (5)
muestras de agua de deshielo; cuatro (4) muestras de agua de mar; una (1)
muestra de agua de río (Río Culebra) y una (1) muestra de agua del Lago Dee
(Fig. 2).
En el segundo período de muestreo (Enero-Febrero 2013), se colectaron un
total de 29 muestras de agua de diferentes localidades distribuidas de la siguiente
manera: siete (7) muestras de agua de deshielo; diecisiete (17) muestras de agua
de mar; dos (2) muestras de agua de río (Río Culebra) y tres (3) muestras de agua
residual de la planta de tratamiento de la EPVM (Fig. 2).
Figura 2. Muestras recolectadas de diferentes fuentes de agua de la Antártida (2012 y 2013).
La localización geográfica de los puntos muestreados durante los dos períodos
se representa en el mapa (Fig. 3), tanto para las muestras de agua como para las
muestras de heces de pingüinos pico rojo (P. papua) y pingüinos barbijo (P.
antarctica).
49
Figura 3. Puntos de muestreo georeferenciados para las cuarenta muestras de agua, año 2012: 1-11 (ZAPto5, ZAPto6, ZAPto7, ZAMal, ZBPto2, ZBPto10, ZCPto3, ZCPto8, ZCPto9, Dee2P2, Barrientos); año 2013: 12-40 (ZAEPVM1, ZAEPVM2, ZAT1, ZAT2, ZAT3, ZAT4, ZAT5, ZATp1, ZATp2, ZATp3, ZAT6, ZAEPVM3, ZADes.tanq, ZADes.dire, ZBRC1, ZBRC2, ZB4, ZB3, ZC1, ZC2, Dee1, Dee2, Barr2, Barr4, Barr1, Barr3, ZAPA1, BP1, BP2), y las sesenta muestras de heces de las dos especies de pingüinos presentes en la Antártida durante los dos períodos de muestreo ▲1-12 heces de pingüinos pico rojo (P2.1, P2.1, P2.3, P5.1, P5.2, P5.3, P6.1, P6.2, P6.3, P9.1, P9.2, P9.3); ▲13-25 heces de pingüinos pico rojo (EPVM1, EPVM2, EPVM3, EPVM4, EPVM5 EPVM6, RC1, RC2, ZC1, ZC3, ZC4, Dee1, Dee2); heces de pingüinos barbijo 26- 29 (Dee3, Dee4, Dee5, Dee6); heces de pingüinos pico rojo 30-44 (B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, B10, B11, B12, B13, B14, B15); heces de pingüinos barbijo 45-60 (B16,B17, B18, B19, B20, B21, B22, B23, B24,
B25, B26, B27, PAmb1, PAmb2, PAmb3, PAmb4).
50
4.2. Parámetros físico-químicos de las muestras de agua.
Se tomaron los parámetros físico-químicos del agua tanto para el año 2012
(Tabla V) como para el año 2013 (Tabla VI). Los valores de algunos parámetros
como pH, conductividad, oxígeno disuelto (DO), temperatura, salinidad, sólidos
totales disueltos (TDS) y potencial de reducción de oxígeno (ORP) no fueron
registrados para todos los sitios de muestreo en el 2012, debido a las dificultades
presentadas por las condiciones del tiempo. En cambio durante el 2013, se
registraron en todos los lugares de muestreo los valores para pH, conductividad,
oxígeno disuelto (DO), temperatura, salinidad, sólidos totales disueltos (TDS) y
potencial de reducción de oxígeno (ORP).
Tabla V. Valores de pH, conductividad (Cond.), oxígeno disuelto (DO),
temperatura (Temp.), salinidad (Sal.), sólidos totales disueltos (TDS) y potencial
de reducción de oxígeno (ORP) de las muestras de agua de la Antártida, año
2012.
Muestras pH Cond. (S/m)
DO (mg/l)
Temp. (°C)
ZAPto5, agua deshielo 5,34 5,7 12,1 7,96
ZAPto6, agua deshielo 6,1 9,4 13,2 3,89
ZAPto7, agua deshielo 5,57 7,2 11,9 9,6
ZAMal, agua de mar - - - -
ZBPto2, agua deshielo 5,85 5,5 11,2 10,27
ZBPto10, agua de mar 6,5 7,5 10,8 8,9
ZCPto3, agua de río 5,25 5,9 12,6 3,97
ZCPto8, agua de mar 7,02 6,9 13,1 6,7
ZCPto9, agua deshielo 6,9 6,5 14,3 2,1
Dee2P2, agua de lago 6,33 12,8 13,2 3,65
Barrientos, agua de mar - - - -
(-): No determinado
51
52
53
Con la finalidad de establecer diferencias entre las fuentes de agua en cuanto a
los valores de los parámetros físico-químicos descritos, se realizó un análisis
estadístico de varianza de un factor (ANOVA, por sus siglas en inglés) utilizando
el programa SPSS 19.0.
Los parámetros de pH, DO, temperatura y ORP no muestran diferencias
estadísticas significativas entre los tipos de fuentes de agua, p≥0.05. Al comparar
las medias para cada parámetro y la variación entre los puntos de muestreo, se
encontró igualdad de medias para el pH, DO, temperatura y ORP en todas las
fuentes, sugiriendo que estos parámetros no varían en estas fuentes de agua
(Tabla VII).
Tabla VII. Análisis de varianza de un factor (ANOVA) para pH, OD, temperatura y
ORP en muestras de agua de la Antártida, año 2013.
Parámetro Distribución de frecuencias (F)
Sig. α
pH 0,387 0,763
DO (mg/l) 2,486 0.084
Temperatura (°C) 1,952 0,147
ORP (mV) 1,115 0,362
Por el contrario, el ANOVA realizado para los parámetros de salinidad,
conductividad y sólidos totales disueltos (TDS) muestra diferencias estadísticas
significativas (p<0.05) entre los tipos de fuentes de agua (Tabla VIII). El ANOVA
indica que al menos una fuente de agua varia en los datos registrados para
salinidad, conductividad y TDS, sugiriendo la variabilidad de estos parámetros
entre las muestras colectadas.
Tabla VIII. Análisis de varianza de un factor (ANOVA) para salinidad,
conductividad, sólidos totales disueltos (TDS) en muestras de agua de la
Antártida, año 2013.
Parámetro Distribución de frecuencias (F)
Sig. α
Salinidad (‰) 126,825 ** 0,000
Conductividad (S/m) 32,021 ** 0,000
(TDS) (g/l) 35,208** 0,000
54
4.3. Análisis Molecular de las muestras de agua.
4.3.1. Detección de Eubacterias mediante PCR.
Las 11 muestras de agua colectadas en el año 2012 fueron procesadas para la
extracción de ADN. La electroforesis en gel de agarosa (2%) del ADN extraído,
reveló una banda en todas las muestras analizadas. Posteriormente, este ADN
fue utilizado para la amplificación del gen 16S ARNr de Eubacterias y en todas las
muestras se observó la banda esperada de 1517 pb (Fig. 4, Tabla IX). Esto
demostró que las muestras contenían ADN bacteriano y que el procedimiento
permitió obtener ADN de buena calidad para los subsiguientes pasos de
amplificación molecular del gen 16S ARNr para los géneros de interés.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Figura 4. Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de amplificación de 1517 pb del gen 16S ARNr de Eubacterias, utilizando los cebadores 8F y 1525R, obtenidos por PCR a partir de muestras de agua de la Antártida, año 2012. Pozos: 1) agua deshielo ZBPto2; 2) agua de río ZCPto3; 3) agua deshielo ZCPto5; 4) agua deshielo ZCPto6; 5) agua deshielo ZCPto7 ; 6) agua de mar ZCPto8; 7) agua deshielo ZCPto9; 8) agua de lago Dee2P2; 9) agua de mar Barrientos; 10) agua de mar ZAMal; 11) control negativo de la PCR (agua); 12) control positivo de la PCR (ADN de H. pylori); 13) peso molecular 100-3.000 pb (Axygen).
Tabla IX. Extracción de ADN y amplificación por PCR del gen 16S ARNr de Eubacterias a partir de las muestras de agua de la Antártida, año 2012. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada.
Fuente
Muestras
Ext.
ADN
PCR gen 16S ARNr
Eubacteria
deshielo
ZAPto5, ZAPto6,
ZAPto7, ZBPto2,
ZCPto9
+
+
mar ZAMal, ZBPto10,
ZCPto8, Barrientos + +
río ZCPto3 + +
lago Dee2P2 + +
1517 pb
55
Los resultados obtenidos de la extracción de ADN para las 29 muestras de
agua colectadas en el año 2013 (Tabla X) fueron positivos en sólo 4 de las 29
muestras. Sin embargo, la electroforesis de los productos de amplificación del gen
16S ARNr de Eubacterias, mostró resultados positivos en las 29 muestras indica
la calidad del ADN extraído de estas muestras.
Tabla X. Extracción de ADN y amplificación por PCR del gen 16S ARNr de
Eubacterias a partir de las muestras de agua de la Antártida, año 2013. +
Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada.
Fuente
Muestras
Ext.
ADN
PCR gen 16S
ARNr Eubacteria
deshielo
ZAEPVM1, ZAEPVM2, ZB4, Dee2, Barr2, Barr4, ZAPA1
-
+
mar
ZAT1, ZAT2, ZAT3, ZAT4, ZAT5, ZATp1, ZATp2, ZATp3, ZAT6, ZB3, ZC1, ZC2, Dee1, Barr1, BP1, BP2
-
+
mar Barr3 + +
río ZBRC1, ZBRC2 - +
residual
ZAEPVM3, ZADes.tan ZADes.dir
+
+
4.3.2. Detección de Eubacterias en muestras control.
Las 9 muestras de agua destilada estéril, utilizadas como control del proceso
de filtración, fueron sometidas al procedimiento de extracción de ADN. La
electroforesis en gel de agarosa (2%) no mostró bandas en ninguno de los
controles. Además, la amplificación del gen 16S ARNr de Eubacterias fue
negativa en todas las muestras de agua destilada estéril (Fig. 5), confirmando la
ausencia de ADN bacteriano en los controles. Estos resultados permitieron
descartar una posible contaminación bacteriana durante el proceso de filtración de
las muestras de agua colectadas en la Antártida.
56
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Figura 5. Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de amplificación de 1517 pb del gen 16S ARNr de Eubacterias, utilizando los cebadores 8F y 1525R, obtenido por PCR a partir de muestras de agua destilada estéril, año 2013. Pozos: 1-9) agua destilada estéril procesadas en los días 13/01/13, 14/01/13, 15/01/13, 16/01/13, 17/01/13, 18/01/13, 19/01/13, 23/01/13 y 25/01/13; 10) control de las soluciones del Kit de extracción de ADN; 11) control negativo de la PCR (agua); 12) control positivo de la PCR (ADN de H. pylori); 13) peso molecular 100-3.000 pb (Axygen).
4.3.3. Detección del género Vibrio.
La amplificación de un fragmento de 575 pb del gen 16S ARNr específico para
el género Vibrio utilizando los cebadores VF169 y VR744, fue negativa en el ADN
de las 11 muestras de agua (año 2012), indicando que el género no estaba
presente en estas muestras. Por esta razón, no se realizó la detección de la
especie V. cholerae (Fig. 6, Tabla XI).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de amplificación de 575 pb del gen 16S ARNr específico del género Vibrio, utilizando los cebadores VF169 y VF744, a partir de muestras de agua de la Antártida, año 2012. Pozos: 1) agua deshielo ZBPto2; 2) agua de río ZCPto3; 3) agua deshielo ZCPto5; 4) agua deshielo ZCPto6; 5) agua deshielo ZCPto7; 6) agua de mar ZCPto8; 7) agua deshielo ZCPto9; 8) agua de mar Barrientos; 9) agua de lago Dee2P2; 10) agua de mar ZAMal; 11) agua de mar ZBPto10; 12) control negativo de PCR (agua); 13) control positivo de PCR (ADN de V. parahaemolyticus CVCM 847); 14) peso molecular 100-3.000 pb
(Axygen).
Sin embargo, con la finalidad de incrementar la sensibilidad de la reacción, se
realizó una PCR anidada, la cual mostró resultados positivos para 9 de las 11
muestras analizadas (Tabla XI).
575 pb
1517 pb
57
Tabla XI. Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S ARNr específico
del género Vibrio, a partir de muestras de agua de la Antártida, año 2012. +
Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada.
Fuente Muestra Gen 16S ARNr Vibrio spp.
PCR PCR anidada
deshielo
ZAPto5, ZAPto6 ZAPto7, ZCPto9
-
+
deshielo ZCPto2 - -
mar ZAMal, ZBPto10, ZCPto8, Barrientos
- +
río ZCPto3 - + lago Dee2P2 - -
Como ocurrió en el año 2012, la amplificación del fragmento del gen 16S ARNr
específico para el género Vibrio fue negativa en todas las muestras de agua del
2013. Por lo tanto, no se realizó la detección de la especie V. cholerae. Para
detectar Vibrio spp. se incrementó la sensibilidad de la reacción realizando una
PCR anidada que mostró resultados positivos para las 29 muestras y bandas del
mismo peso molecular (575 pb) del control positivo (V. parahaemolyticus CVCM
847) (Fig. 7, Tabla XII).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de amplificación de 575 pb del gen 16S ARNr específico del género Vibrio en muestras de agua de mar, río y residual procedentes de la Antártida, año 2013. Pozos: 1) agua de mar Dee1; 2) agua de mar ZB3; 3-7) agua de mar ZAT1, ZAT2, ZAT3, ZAT4, ZAT5; 8-9) agua de mar ZC1, ZC2; 10-11) agua de mar Barr1, Barr3; 12-15) agua de mar ZATp1, ZATp2, ZATp3, T6; 16-17) agua de mar BP1, BP2; 18-19) agua de río ZBRC1, ZBRC2; 20-22) agua residual ZAEPVM3, ZADes. Tanq, ZADes. dir; 23) control negativo de la primera PCR (agua); 24) control negativo de la segunda PCR (agua); 25) control positivo (ADN de V. parahaemolyticus CVCM 847); 26) peso molecular 100-3.000pb (Axygen).
58
Tabla XII. Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S ARNr específico
del género Vibrio, a partir de muestras de agua, Antártida año 2013. + Presencia
de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada.
Fuente Muestra
Gen 16S ARNr Vibrio
spp.
PCR PCR
anidada
deshielo
ZAEPVM1, ZAEPVM2,
ZB4, Dee2, Barr2,
Barr4, ZAPA1
-
+
mar
ZAT1, ZAT2, ZAT3,
ZAT4, ZAT5, ZATp1,
ZATp2, ZATp3, ZAT6,
ZB3, ZC1, ZC2, Dee1,
Barr1, Barr3, BP1, BP2
-
+
río ZBRC1, ZBRC2 -
+
residual
ZAEPVM3, ZADes.tan,
ZADes.dir
-
+
4.3.4. Detección del género Helicobacter.
La amplificación de una región interna de 399 pb del gen 16S ARNr específico
para el género Helicobacter, utilizando los cebadores HeliF y HeliR, fue positiva
(banda leve) sólo en el ADN de una muestra (ZAMal) de las 11 analizadas (Fig. 8,
Tabla XIII). Sin embargo, la amplificación del gen glmM (294 pb) específico de H.
pylori, realizada en la muestra de agua ZAMal, fue negativa.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de amplificación de 399 pb del gen 16S ARNr específico para el género Helicobacter utilizando los cebadores HeliF y HeliR, a partir de muestras de agua de la Antártida, año 2012. Pozos: 1) agua deshielo ZBPto2; 2) agua de río ZCPto3; 3) agua deshielo ZCPto5; 4) agua deshielo ZCPto6; 5) agua deshielo ZCPto7 ; 6) agua de mar ZCPto8; 7) agua deshielo ZCPto9; 8) agua de lago Dee2P2 9) agua de mar Barrientos; 10) agua de mar ZAMal; 11) agua de mar ZBPto10; 12) control negativo PCR (agua); 13) control positivo (ADN de H. pylori); 14) peso molecular 100-3.000 pb (Axygen).
399 pb
59
Con la finalidad de incrementar la sensibilidad de la reacción, se realizó una
PCR semi-anidada con las 10 muestras negativas, obteniéndose un resultado
positivo en 8 de estas muestras (Tabla XIII).
Tabla XIII. Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S ARNr específico
del género Helicobacter a partir de muestras de agua de la Antártida, año 2012. +
Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada, nd: no
determinado.
Fuente Muestra
Gen 16S ARNr
Helicobacter spp.
PCR PCR semi-
anidada
deshielo ZAPto5, ZAPto7,
ZBPto2, ZCPto9 - +
deshielo ZAPto6 - -
mar ZAMal + nd
mar ZBPto10, ZCPto8 - +
mar Barrientos - -
río ZCPto3 - +
lago Dee2P2 - +
Así mismo para el año 2013, el género Helicobacter fue detectado mediante la
amplificación de una región interna (399 pb) del gen 16S ARNr en sólo 3 de las 29
muestras de agua colectadas (Tabla XIV). Sin embargo, la detección del gen
glmM (294 pb) específico para H. pylori realizada en estas 3 muestras de agua
(ZBRC1, Barr1 y Barr3) no mostró la banda esperada, sugiriendo que H. pylori no
estaba presente en estas muestras de agua. Con la finalidad de aumentar la
sensibilidad de la PCR, se realizó una PCR semi-anidada a las 26 muestras
negativas, de las cuales 24 mostraron resultados positivos como se describe en la
Tabla XIV.
60
Tabla XIV. Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S ARNr específico
del género Helicobacter a partir de muestras de agua de la Antártida, año 2013. +
Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada, nd: no
determinado.
Fuente
Muestra
Gen 16S ARNr Helicobacter
spp.
PCR PCR semi-
anidada
deshielo
ZAEPVM1, ZAEPVM2,
ZB4, Dee2, Barr2,
Barr4, ZAPA1
-
+
mar ZAT1, ZAT6 - -
mar
ZAT2, ZAT3, ZAT4,
ZAT5, ZATp1, ZATp2,
ZATp3, ZB3, ZC1, ZC2,
Dee1, BP1, BP2
-
+
mar Barr1, Barr3 + nd
río ZBRC1 + nd
río ZBRC2 - +
residual
ZAEPVM3, ZADes.tan
ZADes.dir
-
+
4.4. Secuenciación de los productos de PCR de muestras de agua de la
Antártida.
4.4.1. Secuenciación de los productos de PCR para el género Vibrio.
Con la finalidad de verificar que los productos de amplificación obtenidos para
Vibrio spp. pertenecen a este género, se realizó la secuenciación de dos muestras
de agua de mar: ZAMal (2012) y Barr3 (2013). Los electroferogramas de
secuencias obtenidos para cada muestra con cada uno de los cebadores fueron
analizados y editados. Luego las secuencias generadas para ambos cebadores
(VF169 y VR744) fueron ensambladas utilizando el programa cap3 Sequence
Assembly Programm (Huang et al., 1999) para obtener una secuencia consenso
en cada muestra. Las secuencias consenso de ambas muestras fueron
comparadas con otras secuencias de la base de datos GenBank del National
Center for Biotecnology Information (NCBI, por sus siglas en inglés) mediante
Basic Local Alignment and Search Tool (Blastn, por sus siglas en inglés) (Altschul
et al., 1997).
61
La secuencia del producto de amplificación de la muestra de agua de mar
ZAMal (KF428997) mostró una similitud del 99% con las secuencias de Aliivibrio
logei (AB681961), Aliivibrio logei cepa S11 (JF412238) y Aliivibrio fischeri
(AB819695) sugiriendo la presencia de Vibrio spp. en el producto amplificado a
partir del ADN del agua de mar ZAMal.
En cambio, para la muestra de agua de mar Barr3, el análisis del
electroferograma de la secuencia obtenida con el cebador VF169 no fue de buena
calidad y por lo tanto la secuencia no fue analizada. Sin embargo, la secuencia
generada con el cebador VR744 fue de buena calidad y la misma fue comparada
con otras secuencias del GenBank mediante Blastn, la misma que mostró similitud
en un 98% con una secuencia procedente de una bacteria de hielo marino
antártico (AY165578).
4.4.2. Secuenciación de productos de PCR para el género Helicobacter.
Los productos de amplificación obtenidos para el género Helicobacter
provenientes de 8 muestras de agua correspondientes a los años 2012 (3
muestras) y 2013 (5 muestras) fueron secuenciados. Las secuencias consenso
obtenidas fueron comparadas con secuencias registradas en el GenBank,
mostrando 98% a 100% de similitud con las secuencias de H. pylori aislada de
humanos y H. brantae y H. pametensis aisladas de aves (Tabla XV) lo cual
sugiere la presencia de este género en las muestras de agua debido a su alto
porcentaje de similitud que permite inferir la homología con Helicobacter spp.
Únicamente la secuencia obtenida del producto de amplificación de la muestra
de agua de deshielo Dee2 no presentó similitud con ninguna secuencia
correspondiente al género Helicobacter, pero mostró un 99% de similitud con una
bacteria no cultivada denominada clon OA9-3od-066 (JN976677) (Tabla XV). Por
lo tanto, esa secuencia fue eliminada del grupo de muestras de agua utilizadas
para realizar el análisis filogenético.
Para la muestra de agua de mar ZAMal (2012) no se logró obtener la secuencia
consenso, debido a que el electroferograma de secuencia generado con el
cebador HeliR no fue de buena calidad. Sólo se pudo comparar la secuencia
generada a partir del cebador HeliF con la base de datos del GenBank, la cual
mostró 99% de similitud con una bacteria no cultivada denominada clon
Ontario1337 procedente de heces de ganso (FJ390762). Esta secuencia también
62
fue eliminada del grupo de muestras de agua utilizadas para realizar el análisis
filogenético.
Tabla XV. Similitud de las secuencias consenso de las muestras de agua de la Antártida, años 2012 y 2013, con las secuencias del GenBank correspondientes a tres especies del género Helicobacter. Entre paréntesis se encuentran los números de acceso al GenBank.
Muestra N° de
nt % de
similitud Secuencia GenBank
2012. Agua de mar. ZCPto8
(KF428979) 397 100%
H. pametensis B9A
(NR028019).
2012. Agua de des. ZCPto9
(KF428980) 340 99%
H. pametensis B9A
(NR028019); H. brantae MIT
049366 (NR043799).
2013. Agua de des. Dee2. 421 99%
Clon no cultivado OA9-30d-066
(JN976677) de origen
ambiental.
2013. Agua de mar. ZAT5
(KF428981) y
ZCPto2 (KF428982)
370
386
98%
H. pametensis B9A.
(NR028019); H. brantae MIT
049366 (NR043799).
2013. Agua de mar. Barr1
(KF428983) 341 97%
H. pylori UM037 (CP005492),
H. pylori HK3D (KC759152) y
H. pylori HK3B (KC759151).
2013. Agua residual.
ZADes.dir (KF428984) 387 99%
H. pylori HK3D (KC759152) y
H. pylori HK3B (KC759151).
4.5. Análisis Filogenético de muestras de agua.
Con la finalidad de determinar las distancias filogenéticas que existen entre las
secuencias obtenidas en este estudio con las reportadas en el GenBank, se
realizó un árbol filogenético construido a partir del análisis de las secuencias
parciales del gen 16S ARNr tanto para el género Vibrio (Fig. 9) como para el
género Helicobacter (Fig. 10).
4.5.1. Árbol filogenético para el género Vibrio.
Se realizó un árbol filogenético comparando la secuencia parcial del gen 16S
ARNr de la muestra de agua de mar ZAMal (KF428997) año 2012, con otras
secuencias del género Vibrio. En el análisis filogenético podemos observar que la
muestra de agua de mar ZAMal, forma un clado con las especies V. logei, V.
salmonicida y V. fischeri (Fig. 9), confirmando por primera vez la presencia del
63
género Vibrio en aguas de la Antártida. Sin embargo, el valor de confiabilidad
(bootstrap) mostrado entre la secuencia de esta muestra y las procedentes del
GenBank permite inferir que es muy poco probable que la secuencia obtenida a
partir del producto de amplificación de la muestra en estudio, llegue a estar
relacionada con la especie que se muestra en el clado (Beaz Hidalgo, 2008).
Figura 9. Árbol filogenético de secuencias parciales del gen 16S ARNr de los géneros Vibrio y Aliivibrio, a
partir de secuencias del GenBank y una secuencia obtenida de la muestra de agua de mar ZAMal (2012). El
árbol filogenético fue construido por el método del vecino más cercano (Neighbor joining) y el modelo básico
de evolución Kimura2, con valores de confiabilidad (boostrap values) de 10.000 pseudoréplicas.
64
4.5.2. Árbol filogenético para el género Helicobacter.
Se realizó un árbol filogenético a partir de las secuencias parciales del gen 16S
ARNr específico del género Helicobacter, en donde se observó que la muestra de
agua de mar ZCPto8 (KF428979) forma un clado con la especie H. pametensis,
mientras que la muestra de agua de deshielo ZCPto9 (KF428980) y las aguas de
mar ZAT5 (KF428981) y ZCPto2 (KF428982) forman un clado con H. brantae. Sin
embargo, la muestra de agua de mar Barr1 (KF428983) y la muestra de agua
residual ZADes.dir (KF428984) se agrupan en un clado junto con H. pylori aislada
de humanos (Fig. 10).
Figura 10. Árbol filogenético de secuencias parciales del gen 16S ARNr del género Helicobacter obtenido de
secuencias del GenBank y secuencias a partir de muestras de agua de la Antártida (2012 y 2013). El árbol
filogenético fue construido por el método del vecino más cercano (Neighbor joining) y el modelo básico de
evolución Kimura2, con valores de confiabilidad (boostrap values) de 10.000 pseudoréplicas.
65
Los valores de confiabilidad (bootstrap) mostrados por las secuencias
obtenidas de las muestras: agua de mar ZCPto8 (69%), agua de mar ZCPto2 y
ZAT5, agua de deshielo ZCPto9 (80%), agua de mar Barr1 y agua del efluente de
la planta de tratamiento de aguas residuales ZADes.dir (90%) indican también una
baja probabilidad de la relación entre estas secuencias y las especies con las
cuales forman en clado. Sin embargo, indican la presencia del género
Helicobacter.
4.6. Muestras de heces de pingüinos colectadas en la Antártida.
Sesenta muestras de heces de pingüinos fueron colectadas durante el verano
austral del 2012 y del 2013. En el primer período de muestreo, se colectaron 12
muestras de heces de pingüino pico rojo (P. papua). Mientras que en el segundo
período, se colectaron 28 muestras de heces de pingüino pico rojo (P. papua) y
20 muestras de heces de pingüino barbijo (P. antarctica) (Fig. 11).
Figura 11. Muestras de heces de pingüinos recolectadas en la Antártida (años 2012 y 2013).
4.6.1. Análisis Molecular de las muestras de heces de pingüinos.
4.6.1.1. Detección de Eubacterias mediante PCR.
Las 12 muestras de heces de pingüino pico rojo (P. papua) colectadas en el
2012 fueron sometidas al procedimiento de extracción de ADN. La electroforesis
en gel de agarosa (2%) mostró una banda en 6 de las 12 muestras. Sin embargo,
en la amplificación del gen 16S ARNr de Eubacterias a partir de este ADN, se
obtuvieron resultados positivos para las 12 muestras (Tabla XVI).
66
Este resultado demostró la obtención de ADN de buena calidad para los pasos
subsiguientes de amplificación molecular.
Tabla XVI. Extracción de ADN y amplificación por PCR de un fragmento del gen
16S ARNr de Eubacterias a partir de las muestras de heces de pingüinos de la
Antártida, año 2012. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda
esperada.
Fuente Muestra Ext.
ADN
PCR gen 16S
ARNr
Eubacteria
P. papua
P2.1, P2.2,
P2.3, P5.1,
P5.2, P5.3
-
+
P. papua
P6.1, P6.2, P6.3, P9.1, P9.2, P9.3
+
+
Las 48 muestras de heces colectadas en el año 2013 pertenecieron a las dos
especies de pingüinos más abundantes en los lugares de muestreo,
representadas por los pingüinos pico rojo y barbijo. Las 28 muestras de heces de
pingüinos pico rojo y las 20 muestras de heces de pingüino barbijo fueron
sometidas al procedimiento de extracción de ADN y la electroforesis en gel de
agarosa (2%), mostrándose una banda sólo para 26 muestras (Tabla XVII), de las
cuales 22 correspondieron a las heces de pingüinos pico rojo y sólo 4 a las heces
de pingüinos barbijo.
En la tabla XVII también se muestran los resultados obtenidos para la
amplificación del gen 16S ARNr de Eubacterias por PCR, en donde se observó
resultados positivos para 44 de las 48 muestras de heces de pingüinos. Las
muestras ZC1 de pingüino pico rojo y Dee6, PAmb3 y Pamb4 de pingüinos barbijo
que no mostraron la banda esperada, probablemente como resultado de la
inhibición de la PCR para el gen 16S ARNr, razón por la cual fueron descartadas
del grupo de muestras consideradas para el análisis.
67
Tabla XVII. Extracción de ADN y amplificación por PCR de un fragmento del gen
16S ARNr de Eubacterias a partir de muestras de heces de pingüinos de la
Antártida, año 2013. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda
esperada.
Fuente Muestra Ext. ADN PCR gen 16S
ARNr Eubacteria
P. papua
EPVM1, EPVM2,
EPVM3, EPVM4,
EPVM5, EPVM6
-
+
P. papua R.C1, R.C2 + +
P. papua ZC1 + -
P. papua
ZC3, ZC4, Dee1
Dee2, B1, B2, B3,
B4, B5, B6, B7, B8,
B9, B10, B11, B12,
B13, B14, B15
+
+
P. antarctica
Dee3, Dee4, Dee5,
B16, B20, B22,
B23, B24, B25,
B26, B27, PAmb1,
PAmb2
-
+
P. antarctica Dee6, PAmb3,
PAmb4 - -
P. antarctica
B17, B18, B19, B21 +
+
4.6.1.2. Detección del género Vibrio.
La amplificación de un fragmento de 575 pb del gen 16S ARNr específico para
Vibrio muestra un resultado negativo para las 12 muestras de heces de pingüinos
pico rojo, lo cual sugiere su ausencia en esta especie de pingüinos (Tabla XVIII), y
en consecuencia no se procedió a la detección por PCR de la especie V.
cholerae.
68
Tabla XVIII. Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S ARNr específico
del género Vibrio, a partir de muestras de heces de pingüinos, Antártida año 2012.
+ Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada.
Fuente Muestra
PCR gen 16S
ARNr. Vibrio
spp.
P. papua
P2.1, P2.2, P2.3,
P5.1, P5.2, P5.3,
P6.1, P6.2, P6.3,
P9.1, P9.2, P9.3
-
Sólo 44 de las 48 muestras de heces de pingüinos que mostraron resultados
positivos para Eubacterias, fueron utilizadas para la detección del género Vibrio.
El género Vibrio no fue encontrado en las muestras de heces de pingüinos
barbijo; sin embargo, una muestra (EPVM3) de las 27 muestras de heces de los
pingüinos pico rojo presentó una banda muy leve del mismo peso molecular (575
pb) del control positivo (V. parahaemolyticus CVCM 847) (Tabla XIX). Estos
resultados sugieren la ausencia de este género en las heces de estas dos
especies de pingüinos, y por lo tanto no se procedió a la amplificación del gen
específico de V. cholerae, incluso en la muestra que presentó la banda leve.
69
Tabla XIX. Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S ARNr específico
del género Vibrio, a partir de muestras de heces de pingüinos de la Antártida, año
2013. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda esperada. nd: no
determinado
Fuente Muestra Gen 16SARNr
Vibrio spp.
P. papua
EPVM1, EPVM2,
EPVM4, EPVM5,
EPVM6, R.C1, R.C2,
ZC3, ZC4, Dee1,
Dee2, B1, B2, B3,
B4, B5, B6, B7, B8,
B8, B10, B11, B12,
B13, B14, B15
-
P. papua EPVM3 +
P. papua ZC1. nd
P. antarctica
Dee3, Dee4, Dee5,
B16, B17, B18, B19,
B20, B21, B22, B23,
B24, B25, B26, B27,
PAmb1, PAmb2
-
P. antarctica Dee6, PAmb3,
PAmb4 nd
4.6.1.3. Detección del género Helicobacter.
La detección del género Helicobacter mediante la amplificación de una región
interna del gen 16S ARNr fue positiva en las 12 muestras de heces de pingüinos
obtenidas en el 2012 (Tabla XX). Sin embargo, la detección de H. pylori mediante
la amplificación del gen glmM (294 pb) fue negativa en todas las muestras,
descartándose la presencia de esta especie patógena de humanos en las heces
de pingüinos (Tabla XX).
70
Tabla XX. Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S ARNr específica
del género Helicobacter a partir de muestras de heces de pingüinos de la
Antártida, año 2012. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda
esperada.
Fuente Muestra
PCR gen 16S
ARNr
Helicobacter
spp.
PCR gen
glmM
H. pylori
P. papua
P2.1, P2.2, P2.3,
P5.1, P5.2, P5.3,
P6.1, P6.2, P6.3,
P9.1, P9.2, P9.3
+
-
El género Helicobacter fue evaluado en 44 muestras de heces de pingüinos, de
las cuales 27 correspondían a pingüinos pico rojo y 17 a barbijo (Tabla XXI).
Helicobacter spp. estuvo presente en 20 muestras de las heces de pingüinos pico
rojo (74%) y en 16 de pingüinos barbijo (94%) (Fig. 12).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa (2%) del producto de amplificación (fragmento de 399 pb) del gen 16S ARNr específico del género Helicobacter en muestras de heces de pingüinos barbijo procedentes de la Antártida, 2013. Pozos: 1-3) Dee 3, 4 y 5; 4-5) PAmb1 y 2; 6-16) B16, B17, B18, B19, B20, B22, B23, B24, B25, B26 y B27; 17) control negativo de PCR (agua); 18) control positivo de PCR (ADN de H. pylori); 19) peso molecular 100-3.000 pb (Axygen).
A las 36 muestras de heces correspondientes a las dos especies de pingüinos que mostraron resultados positivos para Helicobacter, se procedió a la amplificación del gen glmM (294 pb) específico de H. pylori utilizando el juego de cebadores glmMF y glmMR. Se observó un resultado negativo en todas las muestras, indicando la ausencia de este patógeno en las heces de pingüinos pico rojo y barbijo (Tabla XXI).
399 pb
71
Tabla XXI. Amplificación por PCR de un fragmento del gen 16S ARNr específica
del género Helicobacter a partir de muestras de heces de pingüinos de la
Antártida, año 2013. + Presencia de la banda esperada. - Ausencia de la banda
esperada. nd: no determinado.
Fuente Muestra
PCR gen 16S ARNr
Helicobacter spp.
PCR gen glmM
H. pylori
P. papua
EPVM1, EPVM2
EPVM3, R.C1,
R.C2, ZC3, ZC4,
B1, B2, B5, B6,
B7, B8, B9, B10,
B11, B12, B13,
B14, B15
+
-
P. papua
EPVM4, EPVM5 EPVM6, Dee1,
Dee2, B3, B4
-
nd
P. papua ZC1 nd nd
P. antarctica
Dee3, Dee4,
Dee5, B16, B17,
B18, B19, B20,
B22, B23, B24,
B25, B26, B27,
PAmb1, PAmb2
+
-
P. antarctica Dee6, PAmb3,
PAmb4 nd nd
P. antarctica B21 - nd
Debido a que Helicobacter fue detectado en casi todas las muestras de heces
de las dos especies de pingüinos, se realizó un análisis estadístico de tablas de
contingencia y la prueba de Chi-cuadrado (X2) que nos permitiera establecer la
relación existente entre la presencia de la bacteria en las dos especies de
pingüinos (Tabla XXII). La presencia de Helicobacter fue comparada entre 27
muestras de heces de pingüinos pico rojo frente a 17 muestras de heces de
pingüinos barbijo, observándose un 45,5% frente a un 36,4% que
estadísticamente representan un 81,8% de la muestra total. Además el valor de
X2=2,817; p=0,093 indica que no existen diferencias estadísticas significativas de
la presencia de este género bacteriano entre estas dos especies de pingüinos.
72
Tabla XXII. Tabla de contingencia especies de pingüinos*Helicobacter spp. en
muestras de heces procedentes de la Antártida, año 2013.
Helicobacter Total
Si No
P. papua Recuento % dentro de la especie % Helicobacter % del total
20 74,1% 55,6% 45,5%
7 25,9% 87,5% 15,9%
27 100% 61,4% 61,4%
P. antarctica Recuento % dentro de la especie % Helicobacter % del total
16 94,1% 44,4% 36,4%
1 5,9% 12,5% 2,3%
17 100% 38,6% 38,6%
Total Recuento % dentro de la especie % Helicobacter % del total
36 81,8% 100% 81,8%
8 18,2% 100% 18,2%
44 100% 100% 100%
4.6.2. Secuenciación de los productos de PCR a partir de muestras de heces
de pingüinos.
4.6.2.1. Secuenciación de los productos de PCR para el género
Helicobacter.
Se secuenciaron 8 productos de amplificación obtenidos para el género
Helicobacter provenientes de muestras de heces de pingüinos pico rojo (3
muestras del 2012 y 5 muestras del 2013) y 4 productos de amplificación a partir
de muestras de heces de pingüinos barbijo (2013).
Las secuencias consenso de las muestras de heces de pingüinos pico rojo P9.1
(KF428987), ZC4 (KF428989), B9 (KF428991) y EPVM1 (KF428992) y de
pingüinos barbijo PAmb2 (KF428994) y B25 (KF428996), presentaron un 99% de
similitud con las secuencias de las especies H. brantae MIT 049366 (NR043799) y
H. pametensis B9A Sey. (NR028019). La secuencia consenso de la muestras de
heces de pingüino pico rojo P9.1 presentó un 99% de similitud con Helicobacter
sp. (AY203900) procedente de la mucosa gástrica de foca (Phoca groenlandica).
Adicionalmente, la muestra EPVM1 de heces de pingüino pico rojo tuvo un 99%
de similitud con Helicobacter sp. (M88152) procedente de heces de hurones.
Mientras que las secuencias consenso de las muestras de heces de pingüinos
pico rojo P2.2 (KF428985), P5.2 (KF428986), RC2 (KF428988) y B6 (KF428990),
y de pingüinos barbijo Dee5 (KF428993) y B18 (KF428995) muestran una menor
73
similitud (98%) con las secuencias de las especies del género Helicobacter
anteriormente descritas.
4.7. Análisis Filogenético.
Para determinar las distancias filogenéticas que existen entre las secuencias
obtenidas en este estudio con las reportadas en el GenBank, se realizó un árbol
filogenético construido a partir del análisis de la secuencia parcial de la región
interna del gen 16S ARNr específico del género Helicobacter, obtenida a partir de
las muestras de heces de las dos especies de pingüinos (Fig. 13). Las secuencias
obtenidas a partir de los productos de amplificación de las muestras de heces de
ambas especies de pingüinos formaron un clado con la especie H. brantae,
agrupando además dentro del mismo clado a las muestras de agua de mar ZAT5
y ZCPto2 y a la muestra de agua de deshielo ZCPto9 (Fig. 13). A pesar de que el
valor de confiabilidad (bootstrap) 69% muestra una baja probabilidad que estas
secuencias estén relacionadas con la especie H. brantae este resultado sugiere la
presencia de esta especie tanto en las muestras de agua como en las heces de
los pingüinos presentes en estos ecosistemas.
74
Figura 13. Árbol filogenético de secuencias parciales del gen 16S ARNr del género Helicobacter, a partir de
secuencias del GenBank y secuencias obtenidas a partir de muestras de agua de la Antártida (2012 y 2013) y
secuencias obtenidas a partir de muestras de heces de pingüinos pico rojo y barbijo (2012 y 2013) . El árbol
filogenético fue construido por el método del vecino más cercano (Neighbor joining) y el modelo básico de
evolución Kimura2, con valores de confiabilidad (boostrap values) de 10.000 pseudoréplicas.
75
4.8. Detección del marcador molecular HF183 específico de humanos
(Bacteroides HF183), como indicador de contaminación fecal en muestras de
agua de la Antártida, mediante PCR en tiempo real.
Con respecto a la detección del marcador molecular HF183 específico de
humanos (Bacteroides HF183), se logró mediante PCR en tiempo real la
amplificación de un fragmento del gen 16S ARNr de 82 pb específico de
Bacteroides en humanos, que fue positiva para el ADN de la muestra de agua del
fluente de la planta de tratamiento de agua residual ZADes.dir (CT = 21,1)
únicamente.
Este resultado fue comprobado con el análisis de la curva de disociación de la
doble banda o producto de amplificación, el cual registró una temperatura de
disociación a 80,6°C similar a la del control positivo (agua del río Guaire),
indicando de esta manera que se trataba de una muestra que contenía la bacteria
portadora de este marcador genético asociado con contaminación fecal humana.
76
V. DISCUSIÓN.
5.1. Muestras de agua colectadas de diferentes fuentes en la Antártida.
La presencia de los géneros bacterianos Vibrio y Helicobacter y las especies V.
cholerae y H. pylori en ambientes acuáticos de la Antártida, fue analizada en 40
muestras de agua de diferentes fuentes, durante dos períodos de muestreo (Tabla
I, Fig. 3).
Las fuentes de agua natural contienen una gran cantidad y diversidad de
especies de bacterias. Esta diversidad bacteriana varía considerablemente entre
los tipos de fuentes de agua (Fricker, 2003).
Las fuentes de agua marina, poseen también una fauna diversa. Los animales
constituyen importantes reservorios de microorganismos debido a que proveen los
nutrientes necesarios y las condiciones adecuadas para su desarrollo y
supervivencia (Stewart et al., 2008).
5.1.1. Parámetros físico-químicos de las muestras de agua.
Al analizar los parámetros físico-químicos de las muestras de agua colectadas
en el año 2012 (Tabla V), observamos que el pH registrado en la muestra de agua
de río fue 5,25, mientras que en las muestras de agua de deshielo varió entre
5,34-6,9 y en las muestras de agua de mar, varió entre 6,5-7,2. Al comparar estos
datos con los obtenidos durante el muestreo en el año 2013 (Tabla VI) se observó
que en el agua de río, el pH varió entre 4,78-6,20; en las muestras de agua de
deshielo varió entre 4,36-6,22 y en las muestras de agua de mar varió entre 4,34-
6,07 (Tabla VI). Estos resultados indican que durante el verano del 2012, el pH de
las fuentes de agua varió de ácido a neutro, mientras que durante el verano del
año 2013 las fuentes de agua mostraron sólo pH ácidos, lo que indica que este
parámetro es muy variable entre las fuentes naturales de agua en estos
ambientes extremos.
La acidez del pH del agua de las diferentes fuentes, es atribuida a la diferencia
de concentración de materia orgánica y al inicio de la actividad biológica, debido a
la transición estacional (Bellingham, 2009). La diferencia de acidez observada
entre las muestras de agua de deshielo EPVM1(pH=4,3) y Barr4 (pH=6,2)(Tabla
VI), indica la incidencia de la concentración de materia orgánica en el pH del
agua, ya que la muestra de agua EPVM1 procedía del Glaciar Quito donde hubo
presencia de sedimentos y biopelículas, consecuentemente mayor concentración
de materia orgánica y mayor actividad biológica, no así, en la muestra Barr4 que
77
fue captada de una laguna de deshielo en formación con muy baja presencia de
sedimentos y baja actividad biológica.
También en la muestra de agua de río ZBRC1 (pH 6,2) (Tabla VI), se registró
un pH ácido, sin embargo esta acidez puede atribuirse al congelamiento del agua
durante el invierno. Según lo reportado por Ali y col. (2010), la acidez en el hielo
depende de la concentración de iones procedentes de sulfatos y de la disolución
del CO2 atmosférico que frecuentemente se acumula en las capas de hielo que se
van formando. El pH de las muestras de agua marina varió 4,34-6,07 (Tabla VI), el
contenido de materia orgánica en el mar esta relacionada con la presencia de
zooplancton, fitoplancton y sedimentos (barro y arena) suspendidos en la columna
de agua por efecto de las corrientes marinas o por actividades humanas (Hansell
et al., 2009; Bellingham, 2009). La acumulación de elementos como nitrógeno y
fósforo implicados en procesos de mineralización llevados a cabo por el
fitoplancton y zooplancton se ve favorecida por el descongelamiento de las capas
de hielo y en consecuencia alteran las condiciones redox acidificando el agua de
mar (Quayle et al., 2002).
Con respecto a la conductividad, la muestra de agua de río colectada en el
2012 (Tabla V), registró un valor de 5,9 S/m; en las muestras de agua de deshielo
la conductividad varió entre 5,5-9,4 S/m y en las muestras de agua de mar varió
entre 6,9-7,5 S/m (Tabla V). Por el contrario, durante el muestreo del año 2013
(Tabla VI), la conductividad en el agua de río varió entre 16,66-18,53 S/m, en las
muestras de agua de deshielo varió entre 5,69-31,50 S/m y en el agua de mar
varió entre 2,41-6,73 S/m (Tabla VI). Estos resultados indican que la
conductividad fue menos variable entre las fuentes de agua muestreadas en el
año 2012, contrastando con lo observado entre las fuentes de agua muestreadas
en el año 2013, las mismas que presentaron un mayor rango de variación.
En los ambientes antárticos, la principal fuente de sales de cloruro de sodio y
potasio, considerados determinantes en la conductividad, es el agua lluvia, otras
pequeñas cantidades se originan a partir de algunos procesos erosivos y otras
son arrastradas por las corrientes marinas. En el agua dulce la conductividad
varía entre 0.001 a 0.1 S/m y en el agua de mar puede llegar hasta 0.5 S/m
(Bellingham, 2009). Sin embargo, los altos valores de conductividad registrados
tanto para las muestras de agua de mar 2,41-6,73 S/m como para las muestras de
agua dulce 5,96-31,5 S/m (Tabla VI) se validan ya que las condiciones antárticas
extremas inciden en el espectro electromagnético natural bajo el océano, el
mismo que está influenciado por cambios en la temperatura y frecuentes
perturbaciones bio-geoquímicas que dan origen a la liberación de iones
inorgánicos (Chave et al., 1982; Pawlowicz, 2010).
78
La concentración de oxígeno disuelto (DO) registrada en la muestra de agua de
río colectada en el año 2012 (Tabla V) fue 12,6 mg/L, en las muestras de agua de
deshielo la concentración de DO varió entre 11,2-14,3 mg/L, y en las muestras de
agua de mar varió entre 10,8-13,1 mg/L. Comparando estos resultados con los
datos obtenidos en las muestras colectadas en el 2013 (Tabla VI) se observó que
la concentración de DO registrada para el agua de río varió entre 5,06-5,46 mg/L,
en las muestras de agua de deshielo varió entre 4,76-7,96 y en las muestras de
agua de mar varió entre 4,50-6,76 mg/L, lo cual indica que la concentración de DO
registrada en las fuentes de agua muestreadas en el año 2012 (Tabla V) es mayor
que la concentración de DO registrada en las diferentes fuentes de agua
muestreadas en el año 2013 (Tabla VI).
El oxígeno disuelto (DO) también varía en períodos de 24 horas y
estacionalmente ya que está estrechamente relacionado con la temperatura y la
actividad biológica y es esencial para todas las formas de vida acuática. La
concentración de DO tanto en el agua dulce como en el agua de mar oscila entre
15 mg/l a 0°C hasta 8 mg/l a 25°C, y en agua dulce sin contaminación esta a casi
10mg/l. En agua contaminada por materiales suspendidos, residuos de varios
tipos y presencia de microorganismos descomponedores que utilizan oxígeno, la
concentración de DO disminuirá hasta menos de 2mg/l y por ende las condiciones
anaeróbicas del agua eliminarán varias formas de vida pero favorecerán el
crecimiento de otras (Warrick et al., 2003; Bellingham, 2009). La diferencia de
concentración de DO registrada entre las muestras de agua de la desembocadura
del río Culebra al mar ZB3 (DO=4,5 mg/l) y la de agua de deshielo Barr4 (DO=7,9
mg/l) (Tabla VI), muestran dicha variación y sugiere que una alta concentración de
DO se debe a la baja actividad biológica.
En las muestras de agua colectadas en el año 2012 (Tabla V), la temperatura
registrada en el agua de río fue de 3,97°C, en las muestras de agua de deshielo
varió entre 2,1-10,27°C y en las muestras de agua de mar, varió entre 6,7-8,9°C.
Mientras que en las muestras de agua colectadas en el año 2013 (Tabla VI), la
temperatura en el agua de río varió entre 4,56-6,08°C, en las muestras de agua
de deshielo varió entre 3,34-8,28°C y en las muestras de agua de mar varió entre
2,85-8,79°C. Estos resultados indican que la temperatura fue el parámetro con
mayor variación entre las fuentes de agua muestreadas durante los dos períodos
y concuerdan con lo reportado por Vaughan y col. (2003) quienes manifiestan que
algunas zonas antárticas como la Península Antártica, han experimentado
drásticos calentamientos, elevando su temperatura rápidamente y causando
graves impactos en estos ambientes.
79
La temperatura es el mejor indicador del estado de los ecosistemas acuáticos
antárticos debido a las particularidades de su clima, que ya ha sido afectado a
causa del calentamiento global (Marshall et al., 2002). Se ha reportado un
incremento mensual de hasta 2,5°C en los registros de temperatura atmosférica
afectando las condiciones oceánicas y consecuentemente todos los ambientes
acuáticos cuya variabilidad ha sido estudiada por más de 60 años (Turner et al.,
2005).
El análisis de varianza de un factor (ANOVA) de la temperatura, no mostró
diferencias estadísticas significativas entre las fuentes de agua (Tabla VII),
resultados que concuerdan con lo reportado por Murray y col. (2007) quienes
manifiestan que estacionalmente los ambientes polares mantienen casi constante
su temperatura, principalmente el agua de mar (1.8°C bajo cero). Sin embargo, las
fuentes de agua suelen mostrar pequeñas variaciones diarias de temperatura que
son determinantes en los sensibles ciclos biológicos de los organismos y
microorganismos acuáticos (Bellingham, 2009). Temperaturas como las
registradas en el agua de mar ZATp3 (Temp=2,8°C) y BP1 (Temp=8,7°C) (Tabla
VI), muestran que esta variabilidad en las aguas marinas depende de la influencia
de otros factores incluyendo las corrientes y la velocidad del viento.
El potencial de reducción de oxígeno (ORP) que mide la actividad o fuerza de
los compuestos oxidantes o reductores en la solución acuosa, también es
influenciado por procesos biológicos como la fotosíntesis y la presencia de
compuestos orgánicos. Cuando la concentración de DO es consumida se eleva el
ORP (Bellingham, 2009). El registro de ORP en el agua de mar BP1 (ORP=288,66
mV) (Tabla VI) mostró la mayor actividad de compuestos oxidantes o reductores.
Dicha actividad es atribuida a la salinidad de agua y a la presencia de iones
cargados. Los altos valores de ORP favorecen procesos como nitrificación, de-
nitrificación y la oxidación de carbono orgánico (Wang et al., 2011). En cambio, la
muestra ZADes.tanq (ORP=150,33 mV) (Tabla VI), del efluente de la planta de
tratamiento de aguas residuales presentó el valor de ORP más bajo, los ORP
bajos favorecen la formación de metano, ácidos y sulfuros frecuentemente
presentes en aguas residuales (Myers et al., 2006).
Como se esperaba, las muestras de agua de mar mostraron una salinidad que
varió entre 1,4-4% (Tabla VI). Además, las muestras de agua con mayor
concentración de sales también presentaron altos valores de sólidos totales
disueltos (TDS). La cantidad de TDS varió entre 43-44 g/L (Tabla VI), ya que la
presencia de compuestos iónicos como las sales, incrementan la concentración
de TDS en el agua (Hayashi et al., 2004). Sin embargo, las muestras con mayor
concentración de sal y TDS mostraron valores variables de conductividad por lo
que se sugiere que la concentración de sales de sodio y potasio varían entre una
80
misma fuente de agua. Dicha variabilidad, depende de la salinidad y la cantidad
de sólidos totales disueltos mediante la presencia de iones inorgánicos en la
solución acuosa tales como: Mg++, Ca++, K+, Na+, Cl-, SO24 y CO3
2- (Bellingham,
2009).
La muestra de agua de deshielo Dee2 (Tabla VI) también mostró presencia de
sales, esto puede atribuirse a factores como la congelación que acumula iones de
la atmósfera y/o el flujo de corrientes marinas que suelen estar interconectadas
(Burton, 1981). Sin embargo, las demás muestras de agua dulce (deshielo y río)
mostraron una menor concentración de TDS, que varió entre 0,11-0,21 g/L pero
una mayor conductividad (Tabla VI), lo cual indica que las muestras de agua dulce
contienen cantidades significativas de iones de sodio y potasio favoreciendo la
conductividad (Weber-Scannell et al., 2007).
La variabilidad observada en los datos para salinidad, conductividad y TDS,
muestran la estrecha relación entre estos parámetros. La baja salinidad (1,4%) y
baja conductividad (2,41 S/M) registradas para la muestra de agua de mar ZB3
colectada en la zona transicional entre la desembocadura del río Culebra y el mar
(Tabla VI), hace suponer la baja concentración de sales de sodio y potasio
afectando a la conductividad. Sin embargo, esta muestra contiene una cantidad
de TDS considerable (16 g/L) (Tabla VI), probablemente debido a la presencia de
otros compuestos y sedimentos continuamente presentes en el agua de mar
(Barlow, 2003).
En las muestras de agua de mar la cantidad de TDS varió entre 16-44 g/L,
algunos valores concuerdan con el parámetro establecido para el agua de mar
hasta 35 g/L (Barlow, 2003). Sin embargo, valores como (TDS=44g/l) (Tabla VI)
de la muestra de agua de mar ZAT2, pueden deberse a la ocurrencia de procesos
erosivos ocasionados por actividades de transporte y a causa de contaminación
por descarga de aguas residuales.
Los TDS en las muestras de agua dulce, varió entre 0,11-36 g/L, que evidencia
la interconexión de los sistemas acuáticos debido a la entrada de agua marina
incorporando concentraciones de sal y sedimentos. La muestra de agua de
deshielo EPVM1 (TDS=0,11 g/l) (Tabla VI) registró el menor valor de TDS y
concuerda con el parámetro de TDS para agua dulce de 1 g/L (Barlow, 2003). La
excepción fue la muestra de agua de deshielo Dee2 que presenta una
concentración de TDS, similar a la de las muestras de agua de mar, ya que es
una muestra donde hubo presencia de abundantes sedimentos y residuos de
materia orgánica, atribuida también a la presencia de aves como pingüinos que
generan mayores contenidos de materia orgánica.
Los parámetros físico-químicos salinidad, conductividad y sólidos totales
disueltos (TDS) de las muestras de agua colectadas en diferentes fuentes, en el
81
año 2013, mostraron una mayor variación en el registro de datos. Esta variación
fue confirmada con el resultado del análisis de varianza de un factor (ANOVA) que
mostró una diferencia estadística significativa para estos parámetros entre las
fuentes de agua muestreadas (Tabla VIII).
Por el contrario, el resultado del análisis de varianza de un factor (ANOVA)
realizado para el pH, oxígeno disuelto (DO), temperatura y el potencial de
reducción de oxígeno (ORP) (Tabla VII), no mostró diferencias significativas, lo
cual indicaría que los valores registrados fueron casi constantes entre las fuentes
de agua, durante el verano antártico del año 2013. Estos resultados coinciden con
lo reportado por otros autores, quienes manifiestan que los parámetros físico-
químicos en los ambientes polares son estacionalmente constantes (Sthatam et
al., 1994; Van Trappen et al., 2002).
Con respecto a las muestras de agua residual colectadas en el verano del
2013, estas mostraron variabilidad en el pH (4,50-5,60); la conductividad (0,83
S/m); el DO (5,76-6,97 mg/L); temperatura (5,36-7,60°C); salinidad (0,06-0,98%);
TDS (0,83 g/L) y ORP (150,33-222 mV) (Tabla VI). La variabilidad de los
parámetros físico-químicos es dependiente del tipo de agua residual, en el caso
de las aguas residuales antárticas consideradas aguas residuales domésticas,
esta variabilidad depende de las actividades humanas (Martín García et al., 2006).
Además, la calidad y cantidad de las aguas negras procedentes del metabolismo
humano esta muy relacionada a la forma y estilo de vida de las personas (Henze
et al., 2008).
5. 2. Análisis Molecular de las muestras de agua.
5. 2.1. Detección de Eubacterias mediante PCR.
En este trabajo, se detectó ADN bacteriano mediante PCR en todas las
muestras de agua tanto del año 2012 (Fig. 4; Tabla IX) como del año 2013 (Tabla
X). La presencia de ADN bacteriano en las 40 muestras de agua colectadas en los
dos períodos permite indicar que los procedimientos de concentración y
purificación de ácidos nucleicos fueron apropiados para el objetivo de este trabajo.
La detección de ADN bacteriano mediante PCR, confirma la especificidad,
rendimiento y fidelidad de este método en la detección de bacterias a partir de
muestras ambientales (Theron et al., 2000; Theron et al., 2001; Sharma et al.,
2002) que según lo reportado por Giovannoni y col. (2005) y Azam y col. (2007)
manifiestan la existencia de alrededor de 1.000 bacterias en 1 mm3 (o μl) en la
capa superficial del agua marina (0-300 m), pero este número puede variar de
acuerdo a la fuente de agua, más aún en las fuentes de agua antártica donde
82
convergen grandes corrientes oceánicas, las temperaturas son muy bajas y hay
una muy baja concentración de nutrientes.
También las fuentes de agua dulce como lagos y ríos, contienen un amplio
grupo de microorganismos que difieren de otros ambientes acuáticos y algunos
grupos de microorganismos pueden ser únicos de estos ecosistemas. La
comunidad bacteriana en las fuentes de agua dulce (lagos) esta dominada por
Proteobacterias especialmente β-proteobacterias, Actinobacterias y otras (Newton
et al., 2011).
5.2.2. Detección de Eubacterias en muestras control.
No se detectó ADN bacteriano en las muestras control (agua destilada estéril)
(Fig. 5), lo cual confirma la ausencia de ADN contaminante en las muestras de
agua, utilizadas para estos ensayos. Estos resultados garantizan que el ADN
detectado en estas muestras corresponde a la población bacteriana presente en
los ecosistemas acuáticos en estudio.
5.2.3. Detección del género Vibrio.
Dentro de la clase γ-Proteobacteria se encuentra la familia Vibrionaceae la
misma que esta formada por tres géneros, Vibrio, Salinivibrio y Photobacterium
con 51 especies reconocidas dentro del género Vibrio (Thompson et al., 2004;
Reen et al., 2006). Entre estas especies se describe a V. cholerae, V.
parahaemolyticus, V. vulníficus, V. mimicus, V. fluvialis, V. alginolyticus, V.
furnissii, entre otras (Drake et al., 2007). Sin embargo, especies como V. fischeri,
V. logei, V. salmonicida y V. wodani están muy estrechamente relacionadas,
debido a lo cual han sido ubicadas como un grupo dentro del género Vibrio
(Urbanczyk et al., 2007).
El género Vibrio no fue detectado mediante PCR simple en ninguna de las
muestras de agua colectadas en el año 2012 (Fig. 6; Tabla XI) y tampoco fue
detectado en ninguna de las muestras de agua colectadas en el año 2013 (Tabla
XII).
Vibrio spp. es un género bacteriano propio de los ambientes marinos y sus
poblaciones se encuentran en altas densidades, la distribución y dinámica de sus
poblaciones, están influenciadas por los parámetros físico-químicos ambientales,
principalmente por la temperatura. La mayor abundancia de Vibrio spp. se
observa cuando la temperatura es mayor a 17°C mientras que por debajo de ésta,
las poblaciones decrecen grandemente. Por otro lado, el rango de salinidad que
toleran las especies de Vibrio varían desde ~2% a 2.5%, algunas especies crecen
a 0.5%, y otras como V. cholerae crecen en agua dulce (Jiang, 2001; Leyton et al.,
2008; Mishra et al., 2011; Mishra et al., 2012).
83
La detección de la presencia de Vibrio en este estudio fue posible en el 95% del
total de las muestras de agua colectadas en los dos períodos de muestreo
utilizando una PCR anidada que permite incrementar la sensibilidad de la reacción
(Tablas XI y XII).
Los resultados concuerdan con lo reportado por Thompson y col. (2004), los
cuales afirman que mediante el incremento de la sensibilidad de la PCR, las
poblaciones de Vibrio son detectadas aún si su concentración es baja, puesto que
incluso en ambientes marinos ricos en plancton la concentración de Vibrio spp. es
menor al 1% del total de las bacterias presentes en estos ecosistemas.
Considerando las condiciones extremas de los ambientes antárticos, se sugiere
que Vibrio spp. se encuentra a muy baja concentración en las fuentes de agua de
la Antártida, y que es necesario incrementar la sensibilidad de la reacción para
poder detectarlo (Connelly et al., 2012). Además, cuando se trabaja con muestras
ambientales principalmente de agua, la concentración de la población bacteriana
es muy variable, a veces reducida, debido a lo cual es importante aplicar variantes
en los métodos de detección para incrementar la sensibilidad (Theron et al.,
2001).
El incremento de la sensibilidad de la reacción para la detección del género
Vibrio, sugirió que la posibilidad de detectar la especie V. cholerae era nula y en
consecuencia se descartó la realización de la PCR para la detección de esta
especie patógena.
Aunque, la presencia de Vibrio spp. mediante PCR anidada en las muestras de
agua dulce (deshielo, río) observada en este estudio, permite inferir que las
probables especies presentes en estas fuentes pueden ser V. cholerae o V.
mimicus, dos especies estrechamente relacionadas que tienen la capacidad de
adaptarse y vivir en agua dulce (Hasan et al., 2010; Wang et al., 2011). Sin
embargo, se sugiere que la identificación de la especie o especies de Vibrio
presente en las fuentes de agua dulce de la Antártida, podría lograrse aplicando
técnicas como el cultivo a partir del cual se pudieran aplicar otros métodos
moleculares de mayor sensibilidad.
Con la finalidad de determinar que los productos obtenidos mediante la PCR
anidada pertenecen al género Vibrio, se secuenció el producto de amplificación de
la muestra de agua de mar ZAMal del año 2012. El resultado obtenido de la
secuenciación de este producto de amplificación (KF428997), mostró una similitud
de 99% con secuencias de las especies Aliivibrio logei y Aliivibrio fischeri.
Adicionalmente, el análisis filogenético (Fig. 9) mostró que este producto de
amplificación forma un clado junto con A. logei y A. salmonicida, lo cual permite
reportar por primera vez la presencia del género Vibrio en las aguas marinas
84
antárticas, ya que V. logei y V. fischeri son especies del género Vibrio que han
sido renombradas como Aliivibrio logei y Aliivibrio fischeri (Manukhov et al., 2011).
Varios reportes afirman que los estudios a nivel de comparaciones de las
secuencias del gen 16S ANRr y locus independientes de genes como recA, rpoA,
gapA, gyrB, pyrH y la región luxABE y otros, muestran ciertas diferencias entre
Aliivibrio, Vibrio y Photobacterium, pero los considera dentro de la misma familia,
la familia Vibrionaceae. Por otro lado, se ha observado que varias de las
secuencias analizadas en estos estudios para diferenciar estos géneros fueron
mal identificadas y que existe una diversidad aún desconocida dentro del género
Vibrio (Ast et al., 2009). La misma complejidad genética de la familia Vibrionaceae
sugiere que varias secuencias génicas del gen 16S ANRr por sí solas no pueden
ser utilizadas como criterios de separación entre especies estrechamente
relacionadas como ocurre con Vibrio y Aliivibrio, por lo que sugieren realizar
estudios más completos que permitan discriminar entre las especies del grupo V.
fischeri. Estas aseveraciones ya han sido validadas según lo reportado por Vesth
y col. quienes manifiestan que la comparación de tres genomas de Aliivibrio no
son diferentes de Vibrio (Pascual et al., 2010; Vesth et al., 2010; Manukhov et al.,
2011).
La secuencia de la muestra analizada se encuentra dentro del grupo V. fischeri
renombrado como Aliivibrio fischeri conformado por las especies A. logei, A.
fischeri, A. salmonicida y A. wodani. Estas especies son muy comunes en los
ambientes marinos y están estrechamente relacionadas entre sí, además
molecularmente están relacionadas con Photobacterium. A. fischeri y A. logei
viven en simbiosis bioluminiscente con ciertos peces y calamares, mientras que
las especies A. salmonicida y A. wodanis son descritas como patógenas de peces
(Urbanczyk et al., 2007; Ast et al., 2009).
Aliivibrio fischeri es una bacteria marina con propiedades de luminosidad,
capaz de adaptarse y vivir a una gran diversidad de nichos ecológicos,
encontrándose como células planctónicas en el agua de mar y sedimentos, así
como también asociadas a varios animales marinos principalmente peces. Los
reportes antes descritos, nos conducen a sugerir que la especie encontrada en la
muestra ZAMal año 2012 de las aguas marinas de la Antártida es A. fischeri y/o A.
logei (Ruby et al., 1998).
A. fischeri ha sido detectado en ambientes donde las temperaturas varían entre
12, 28 y 32°C, cuando esta fuera de su hospedador, es decir como células de vida
libre (Soto et al., 2009). Sin embargo, la evidencia mostrada en este estudio
sugiere la supervivencia de esta especie aún a temperaturas más bajas como las
registradas en los ambientes antárticos.
85
En la secuenciación del producto de amplificación de la muestra de agua de
mar Barr3, el electroferograma obtenido de la secuencia no resulto ser de buena
calidad y por lo tanto la secuencia no pudo ser analizada. Esto pudo ocurrir como
resultado de la variabilidad genética característica de la familia Vibrionaceae, ya
que Vibrio spp., pueden intercambiar genes incluyendo los de ARNr por la
presencia de bacteriófagos y la secuencia varia ampliamente entre cepas de la
misma especie (Thompson et al., 2004; Comeau et al., 2007).
Además, la cantidad de ADN insuficiente pudo haber afectado la secuenciación
o que en el producto de amplificación se encuentren dos o mas especies de Vibrio
presentes, imposibilitando obtener una secuencia legible, por lo cual el uso de
otras técnicas moleculares como la clonación, podrían ser de gran utilidad para la
identificación de especies presentes en este ecosistema.
La presencia de Vibrio spp. en las agua marinas de la Antártida, concuerda con
la detección de Vibrio spp. a 5°C en el Océano Antártico (Bendt et al., 2001) y con
lo reportado por Heidelberg y col. (2002) quienes detectaron V. cholerae a 0°C en
la bahía Chesapeake, por lo que también podría persistir a las bajas temperaturas
de la Antártida.
También, el aumento de la temperatura en el océano Antártico registrada
durante los últimos años por efecto del calentamiento global, podría favorecer el
crecimiento de las poblaciones de Vibrio en estos ambientes (Vaughan et al.,
2003; Vezulli et al., 2011).
5.2.4. Detección del género Helicobacter.
Los resultados obtenidos en este estudio confirman la presencia de
Helicobacter spp. mediante PCR en el 10% de las muestras de agua captadas
durante los dos períodos de muestreo. La muestra de agua de mar ZAMal
captada en el año 2012 (Fig. 8; Tabla XIII), la muestra de agua de río ZBRC1 y las
muestras de agua de mar Barr1 y Barr3 captadas en el año 2013 (Tabla XIV)
mostraron el producto de PCR esperado para este género bacteriano, lo cual
sugiere que esta bacteria esta presente en el agua de mar la isla Greenwich y el
agua de mar de la isla Barrientos y puede ser aislada de ecosistemas acuáticos
de la Antártida.
La presencia del género Helicobacter en estas fuentes de agua, podría estar
asociada con los diferentes hospedadores tanto humanos como animales. El agua
puede contener heces de portadores con importantes cantidades bacterianas que
podrían ser depositadas en los cuerpos de agua. Así mismo, el agua marina en la
costa de la Isla Barrientos podría contener altas concentraciones bacterianas
procedentes de excretas de animales marinos, incluyendo algunas especies de
86
pingüinos debido a la localización de varias colonias reproductivas de dos
especies de pingüinos en esta isla. Adicionalmente, debido a las actividades
turísticas que se desarrollan en este lugar durante el verano antártico también
podrían encontrarse bacterias procedentes de hospedadores humanos.
La detección de Helicobacter spp. fue lograda mediante la PCR semi-anidada
en el 85% del total de muestras de agua captadas durante los dos períodos de
muestreo (Tablas XIII y XIV), confirmando la presencia de este género bacteriano
en cuerpos de agua de la Antártida.
Este género bacteriano se ha reportado en heces de animales y ambientes
marinos tropicales (Fernández et al., 2007; Suárez et al., 2010), en agua marina,
agua de estuarios y agua dulce (Twing et al., 2011), agua de consumo humano
(Campos et al., 2011; Al-Sulami et al., 2012) y en agua residuales (Moreno et al.,
2012).
La presencia de Helicobacter spp. en ambientes acuáticos puede estar
relacionada con la supervivencia de esta bacteria fuera de sus hospedadores
humanos o animales, debido a su versatilidad de adaptación en varios ambientes
(Benson et al., 2004; Reavis et al., 2005; Kawaguchi et al., 2009). Sin embargo,
este es el primer estudio donde ser reporta este género bacteriano en cuerpos de
agua de la Antártida.
La utilización de la PCR semi-anidada incrementó la sensibilidad de la reacción
y permitió la detección de este género en un mayor número de muestras de agua,
sin embargo la detección de la especie H. pylori, sólo se pudo realizar mediante
PCR en el 10% de las muestras de agua en las que se detectó el género
Helicobacter, observándose que H. pylori no estaba presente en ninguna de estas
muestras. La detección de Helicobacter spp. sugiere la presencia de otras
especies en estos ambientes acuáticos, lo cual ha sido previamente reportado en
otros ecosistemas (Fernández-Delgado et al., 2008; Janzon et al., 2009; Campos
et al., 2011).
Aunque las rutas de transmisión del género Helicobacter no son del todo claras,
la presencia de alguna de sus especies patógenas en el ambiente podría estar
relacionada con fuentes de contaminación fecal (Al-Sulami et al., 2012;
Massoudian et al., 2012).
La evidencia de la presencia de Helicobacter spp., y la ausencia de H. pylori
mediante PCR, en las muestras de agua, condujo a buscar las posibles especies
presentes en estos ambientes, para lo cual se realizó la secuenciación de ocho
productos de amplificación obtenidos para Helicobacter spp., a partir del ADN de
las muestras de agua colectadas en el año 2012 (3 muestras) y 5 muestras
colectadas en el año 2013 (Tabla XV). Sin embargo, sólo pudimos realizar
comparaciones de las secuencias de seis productos de amplificación, ya que el
87
electroferograma de la muestra de agua de mar ZAMal (2012) mostró una
secuencia de baja calidad y la secuencia del producto de amplificación de la
muestra de agua de deshielo Dee2 (2013) presentó similitud con la secuencia de
una bacteria no cultivable de un género bacteriano diferente (Tabla XV).
La comparación de las secuencias de los seis productos de amplificación
(Tabla XV) con las secuencias del GenBank para el género Helicobacter,
mostraron similitud en un 98% y 100% con las secuencias de las especies H.
pametensis, H. brantae y H. pylori (Tabla XV). Además, cuando realizamos el
análisis filogenético de estas secuencias, éstas fueron agrupadas en clados
diferentes con las especies antes mencionadas (Fig. 10), lo cual permite reportar
por primera vez la presencia de estas especies de Helicobacter en diferentes
fuentes de agua de la Antártida.
Las especies H. pametensis y H. brantae no han sido detectadas en muestras
de agua, estas dos especies están relacionadas con hospedadores animales lo
cual indica la existencia de un hospedador animal (aves o mamíferos) portador de
estas bacterias en las fuentes de agua de la Antártida, sugerencia que concuerda
con lo reportado por Delille (1987) quién afirma que la distribución espacial de
bacterias en los ambientes marinos esta estrechamente relacionada con sus
hospedadores.
Además, algunas especies de Helicobacter, forman parte de los contenidos
intestinales de humanos y animales y estas especies no son descritas como
patogénicas, como el caso de H. pametensis (Melito et al., 2001). Así mismo, H.
brantae es otra especie relacionada con hospedadores animales principalmente
aves (Fox et al., 2006), lo cual sugiere que la presencia de estas especies en las
muestras de agua se debe a la contaminación mediante las heces de las aves.
Por otro lado, en la muestra de agua de mar Barr1 y en la muestra de agua del
efluente de la planta de tratamiento ZADes.dir, no se detectó la presencia de la
especie H. pylori mediante la amplificación del gen blanco glmM. Sin embargo, la
secuenciación de los productos de amplificación de estas dos muestras obtenidos
para Helicobacter spp. mediante la amplificación del gen 16S ARNr presentaron
similitudes entre 97-99% con la secuencia de la especie H. pylori (Tabla XV; Fig.
10).
Este resultado, sugiere la presencia de H. pylori en estas fuentes de agua y
que probablemente no fue detectada por amplificación de su gen blanco, ya sea
por una baja concentración de esta especie en los cuerpos de agua de la
Antártida, o debido a que la misma se encuentre en estado VBNC, cuyo bajo
metabolismo y expresión génica pudiera afectar a la expresión de su gen
constitutivo glmM o ureC el mismo que participa directamente en la síntesis de la
pared celular (Espinoza et al., 2011).
88
La secuencia parcial obtenida a partir del gen 16S ARNr, de la muestra de agua
de mar Barr1, mostró una similitud de 97% con la secuencia de H. pylori. La
presencia de H. pylori puede ser debido a que la muestra de agua de mar Barr1,
proviene de la Isla Barrientos, la cual es una isla turística, a donde llegan cientos
de personas trasladadas en barcos procedentes de varios sitios del mundo, los
cuales podrían estar descargando su desechos al mar.
La secuencia del producto de amplificación para Helicobacter spp. obtenido de
la muestra ZADes.dir proveniente del efluente de la planta de tratamiento de la
base ecuatoriana, mostró una similitud de 99% con la secuencia de H. pylori,
evidenciando la presencia de esta bacteria patógena en aguas residuales (Nayak
et al., 2007; Ahmed et al., 2007). Este resultado indica que el manejo inadecuado
de desechos líquidos introduce microorganismos de origen humano a los
ambientes acuáticos prístinos de la Antártida. La introducción de microorganismos
puede generar la perturbación de la microbiota autóctona (Cowan et al., 2011).
La presencia de bacterias indicadoras de contaminación fecal humana fue
también demostrada en este estudio. La detección del marcador molecular HF183
específico de humanos (Bacteroides HF183) en la muestra ZADes.dir del efluente
de la planta de tratamiento de la base ecuatoriana Maldonado que es descargada
al mar, se realizó mediante amplificación molecular en tiempo real y mostró un
resultado positivo evidenciando contaminación. Este resultado coincide con lo
reportado por Seurinck y col. (2005) quienes detectaron este marcador genético
en muestras de agua contaminadas con material fecal.
La presencia de microorganismos no nativos en los ambientes Antárticos
principalmente patógenos de humanos, procedentes de desechos frecuentemente
arrastrados por deshielos y corrientes marinas son potencialmente peligrosos para
la vida silvestre en la Antártida, puesto que pueden ser ingeridos por animales
marinos y causarles graves daños. El desarrollo de enfermedades como la
enteritis en aves causada por especies de Campylobacter ya ha sido reportada en
la fauna Antártica (Bonnedahl et al., 2005; Tin et al., 2009; Barbosa et al., 2009).
La presencia de H. pylori y de indicadores de contaminación fecal humana en
los ecosistemas Antárticos, principalmente en las áreas en las cuales se
desarrollan actividades humanas, evidencia que existen impactos antropogénicos
en estos ecosistemas que contienen el 90% de toda el agua dulce del mundo y
una extraordinaria fauna marina por lo que es necesario cumplir con las
regulaciones de manera responsable para preservar estos ambientes y la vida
que en ellos se desarrolla.
89
5.3. Muestras de heces de pingüinos colectadas en la Antártida.
Las sesenta muestras de heces de pingüinos colectadas en los dos períodos
de muestreo, pertenecieron a las dos especies más abundantes de las zonas en
estudio (Fig. 11) los pingüinos pico rojo (Pygoscelis papua) y los pingüinos barbijo
(Pygoscelis antarctica).
5.3.1. Análisis Molecular de las muestras de heces de pingüinos.
5.3.1.1. Detección de Eubacterias mediante PCR.
La presencia de ADN bacteriano fue positiva en todas las muestras de heces
de pingüinos pico rojo colectadas en el año 2012 (Tabla XVI), mientras que en la
heces de pingüinos colectadas en el año 2013 (Tabla XVII) se observaron
resultados positivos en 44 de las 48 muestras y consecuentemente las 4 muestras
negativas fueron eliminadas del estudio.
Estos resultados positivos comprueban la presencia de bacterias en las
muestras de heces de estas dos especies de pingüinos, tal como era de
esperarse ya que las heces contienen grandes cantidades de bacterias.
La microbiota gastrointestinal de animales y humanos es muy compleja y esta
constituida en su mayoría por bacterias cuya concentración en las heces alcanza
valores de 3.2 x 1011 células por gramo. Además, contienen alrededor de 300 a
500 especies de bacterias diferentes, varias de las cuales juegan un rol en el
desarrollo del sistema inmuninario, crecimiento y diferenciación de células
epiteliales así como adaptación nutricional. Los géneros bacterianos
predominantes en la microbiota gastrointestinal son Bacteroides, Eubacterium,
Bifidobacterium, Clostridium, Fusobacterium, Ruminococcus, Peptococcus y
Peptostreptococcus (Moore et al. 1974; Wang et al. 1996).
Otros autores también ha reportado que las muestras de heces recién
evacuadas representan una fuente potencial para la recuperación de bacterias
debido a la alta viabilidad que mantienen en este reservorio y ayudan a la
identificación de varias especies patógenas (Kabir, 2001; Hubálek, 2004; Tanaka
et al., 2005).
Los pingüinos no son la excepción, ya que su tracto gastrointestinal contiene un
ecosistema microbiano muy complejo y diverso formado por cientos de
microorganismos diferentes que han evolucionado junto con su hospedador y
varios de los cuales son liberados en sus heces (Koutsos et al., 2006).
Sin embargo, los resultados negativos para la presencia de ADN bacteriano en
las cuatro muestras de heces que fueron eliminadas del estudio (Tabla XVII)
sugirieron la presencia de inhibidores de la PCR.
90
La inhibición de la PCR puede ocurrir debido a la presencia de compuestos
muy variables y a diferentes concentraciones dependiendo de la nutrición, la flora
intestinal y el estilo de vida de humanos y animales (Pontirol et al., 2011; Radstöm
et al., 2004; Schrader et al., 2012).
Además, los grandes complejos de polisacáridos, sales biliares, lípidos y ácido
úrico, constituyen los mayores inhibidores de la PCR aunque éstos, no están
presentes en todas las muestras y sus concentraciones varían ampliamente entre
las mismas (Monteiro et al., 1997).
En las heces, una de las sustancias más comunes que causa la inhibición de la
PCR, es el ácido úrico, el mismo que se encuentra a diferentes concentraciones
en humanos y animales. En las aves, el ácido úrico es la principal vía de
excreción del nitrógeno y las heces de pingüinos frescas tienen altas
concentraciones de ácido úrico y puede ser la principal causa de inhibición de la
PCR (Lindeboom, 1984; Robin et al., 1987; Benoit et al., 2008).
5.3.1.2. Detección del género Vibrio.
El género Vibrio spp., no fue detectado mediante PCR, en ninguna de las
muestras de heces de pingüinos pico rojo colectadas en el año 2012 (XVIII) y
tampoco fue detectado en las muestras de heces de los pingüinos pico rojo y
pingüinos barbijo colectadas en el año 2013 (Tabla XIX). Estos resultados,
sugieren la ausencia de este género bacteriano en las muestras de heces de
estas dos especies de pingüinos.
La detección de Eubacterias mediante PCR, permitió indicar la calidad del ADN
bacteriano y descartar la presencia de sustancias inhibidoras de la reacción,
confirmando el resultado negativo para Vibrio spp. en las heces de los pingüinos
pico rojo (P. papua) y pingüinos barbijo (P. antarctica) sugiriendo que estos
pingüinos no poseen el género Vibrio.
Resultados similares fueron observados por Dewar y col. (2013) quienes
caracterizaron la microbiota de cuatro especies de pingüinos, entre ellos los
pingüinos pico rojo y no detectaron la presencia de bacterias de la familia
Vibrionaceae.
5.3.1.3. Detección del género Helicobacter.
El género Helicobacter fue detectado mediante PCR, en todas las muestras de
heces de pingüinos pico rojo colectadas en el año 2012 (Tabla XX) y en 36 de las
44 muestras de heces de los pingüinos pico rojo y pingüinos barbijo, colectadas
en el año 2013 (Tabla XXI).
91
La presencia de Helicobacter spp. en las heces de estas dos especies de
pingüinos, quedó demostrada mediante la realización de un análisis estadístico,
con Tablas de contingencia y la prueba de Chi-cuadrado para establecer la
relación existente entre la presencia/ausencia de la bacteria en pingüinos pico rojo
y pingüinos barbijo (Tabla XXII). Obteniéndose un X2=2,817 y p= 0,093 que indica
que no existe diferencias significativas para la presencia de este género
bacteriano entre estas dos especies de pingüinos.
Estos resultados confirman la presencia de Helicobacter spp. en las heces de
las dos especies de pingüinos y concuerda con lo reportado por Dewar y col.
(2013) quienes realizaron un amplio estudio mediante pirosecuenciación para
identificar la diversidad de la microbiota gastrointestinal de pingüinos, encontrando
que las bacterias de la familia Fusobacteriaceae son predominantes en la
microbiota gastrointestinal de los pingüinos pico rojo. Sin embargo, detectaron que
un 8% bacterias pertenecen a la familia Helicobacteraceae en las heces de estos
pingüinos y otras especies.
Este estudio demostró la presencia de Helicobacter spp. en las heces de la
mayoría de estos pingüinos, lo cual pudiera atribuirse a que como estas aves
viven en colonias de un gran número de individuos, se favorece a la transmisión
de estas bacterias entre los individuos de una misma especie e incluso entre
estas dos especies de pingüinos. Además, es importante destacar el rol del agua
como vehículo de transmisión, ya que como lo describimos anteriormente
Helicobacter spp. también fue detectado en las fuentes de agua de la Antártida,
contribuyendo con los altos valores de la prevalencia de este género bacteriano
en estas aves acuáticas.
Helicobacter pylori ha sido reportada en heces de otros animales como vacas
(Safaei et al., 2011) y otros patógenos humanos como Salmonella spp. y C. jejuni
han sido reportados en heces de aves y mamíferos antárticos (Broman et al.,
2000; Palmgren et al., 2000; Oxley et al., 2005). Estos resultados sugieren que las
heces de los animales pueden ser reservorios de patógenos humanos. Sin
embargo la detección de H. pylori en las muestras de heces de pingüinos fue
negativa tanto en el año 2012 (Tabla XX), como en el año 2013 (Tabla XXI),
evidenciando que estas dos especies de pingüinos no son reservorios de H.
pylori.
A pesar de no detectar H. pylori, la presencia del género Helicobacter en un
gran porcentaje de las muestras, condujo a determinar cuales especies de este
género podrían estar presentes en las heces de estos pingüinos. Por lo tanto
fueron secuenciados 12 productos de amplificación, de los cuales 8 provenían de
heces de pingüinos pico rojo (P. papua) y 4 de heces de pingüinos barbijo (P.
antarctica). Las secuencias fueron comparadas con las secuencias del GenBank y
92
mostraron una similitud entre un 98% y 99% con las especies H. pametensis y H.
brantae. Resultados similares fueron obtenidos con el análisis filogenético (Fig.
13) que agrupó en un mismo clado a todas las secuencias de las heces de ambos
pingüinos, dos muestras de agua de mar (ZAT5 y ZCPto2) y la muestra de agua
de deshielo ZCPto9 junto con la especie H. brantae.
La presencia de H. brantae en las muestras de heces de pingüinos, concuerda
con lo reportado por Fox y col. (2006) quienes aislaron esta especie a partir de
heces de gansos, confirmando la relación de esta especie con las aves como sus
hospedadores. Este resultado sugiere que H. brantae forma parte de la compleja
microbiota intestinal de los pingüinos pico rojo y pingüinos barbijo, sin descartar
que esta especie bacteriana forme parte también de la microbiota intestinal de
otras especies de aves como skúas, petreles y palomas antárticas presentes en
estas islas.
Considerando que las colonias de las dos especies de pingüinos están
localizadas en la isla Barrientos, se hubiese esperado que la secuencia del
producto de amplificación para Helicobacter spp. de la muestra de agua de mar
Barr1 presentara similitud con la secuencia de H. brantae. Sin embargo, como se
describió anteriormente esta secuencia, tuvo similitud con la secuencia de H.
pylori, reiterando el impacto de las actividades antropogénicas en estos
ambientes.
93
VI. CONCLUSIONES.
1.- El género Vibrio está presente en diferentes fuentes de agua de la Antártida,
como parte de la microbiota natural de este ecosistema. Sin embargo, no fue
detectado en las muestras de heces de pingüinos pico rojo (P. papua) y pingüinos
barbijo (P. antarctica) mediante la amplificación del gen 16S ARNr.
2.- Las especies Aliivibrio fischeri y/o Aliivibrio logei son las posibles especies
detectadas en el ambiente marino de la Antártida según la similitud y el análisis
filogenético basado en la secuencia parcial del gen 16S ARNr.
3.- La detección de V. cholerae mediante genes específicos no fue realizada
debido a que la detección de Vibrio spp. mediante PCR simple fue negativa
sugiriendo que las especies de este género se encuentran en bajas proporciones.
4.- El género Helicobacter está presente tanto en las muestras de diferentes
fuentes de agua como en las heces de pingüinos pico rojo (P. papua) y pingüinos
barbijo (P. antarctica) mostrando la relación existente entre el medio acuático y su
fauna hospedadora de este género bacteriano.
5.- Helicobacter pylori no fue detectado mediante amplificación del gen blanco
glmM ni en las muestras de agua, ni en las muestras de heces de las dos
especies de pingüinos. Sin embargo, el análisis de las secuencias parciales del
gen 16S ARNr en dos muestras, una de agua marina y una muestra de agua del
efluente de la planta de tratamiento de aguas residuales colectadas en el verano
austral del 2013, arroja una alta similitud con la secuencia de H. pylori.
6.- Las especies H. pametensis y H. brantae son las posibles especies detectadas
en la mayoría de las muestras de agua de las diferentes fuentes antárticas.
Adicionalmente estas especies fueron detectadas en las heces de las dos
especies de pingüinos, lo cual sugiere que la especie de Helicobacter presente en
los pingüinos es la misma que se encuentra en el agua.
7.- La especie patógena de humanos H. pylori no fue detectada mediante PCR
dirigida a su gen específico probablemente debido a la baja densidad poblacional
y entrada al estado VBNC en respuesta a las condiciones extremas de la
Antártida.
8.- La detección del marcador molecular HF183 (Bacteroides) mediante
amplificación en tiempo real, en el agua del efluente de la planta de tratamiento de
94
aguas residuales de la estación ecuatoriana Maldonado, confirmó la
contaminación fecal humana en estos ambientes prístinos como resultado del
manejo inadecuado de desechos líquidos.
95
VII. RECOMENDACIONES
1.- Detectar la presencia de los géneros bacterianos Vibrio y Helicobacter a partir
de muestras de agua de diferentes fuentes de la Antártida, aplicando técnicas de
cultivo bacteriano.
2.- Estudiar otros posibles reservorios del género Vibrio como fitoplancton,
zooplancton y biopelículas presentes en los ambientes acuáticos antárticos.
3.- Ampliar el estudio de la microbiota gastrointestinal de las especies de
pingüinos más abundantes y otras especies de aves en las islas Greenwich, Dee
y Barrientos.
4.- Efectuar un monitoreo permanente de la calidad microbiológica del agua del
efluente de la planta de tratamiento de aguas residuales de la base ecuatoriana
Pedro Vicente Maldonado.
5.- Realizar el seguimiento de la detección de estos géneros en las muestras de
agua de diferentes fuentes y en las heces de estas dos especies de pingüinos en
estudios anuales que consideren los dos períodos estacionales para la
recolección de muestras.
96
VII. BIBLIOGRAFÍA.
Ahmed KS, Khuan AA, Ahmed I, Tiwari SK, Habeeb A, Ahi JD, Habibullah CM. 2007.
Impact of household hygiene and water source on the prevalence and
transmission of Helicobacter pylori: a South Indian perspective. Singapore medical
journal 48(6):543.
Alam MJ, Miyoshi SI, Shinoda S. 2003. Studies on pathogenic Vibrio
parahaemolyticus during a warm weather season in the Seto Inland Sea, Japan.
Environmental Microbiology 5(8):706-710.
Ali K, Sonbawane S, Chate DM, Siingh D, Rao PSP, Safai PD, Budhavant KB. 2010.
Chemistry of snow and lake water in Antarctic region. Journal of earth system
science 119(6):753-762.
Al-Sulami AA, Al-Edani TAA, Al-Abdula AA. 2012. Culture method and PCR for the
detection of Helicobacter pylori in drinking water in Basrah Governorate Iraq.
Gastroenterology research and practice 1-5.
Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ.
1997. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database
search programs. Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402.
Antonova ES, Hammer BK. 2011. Quorum-sensing autoinducer molecules
produced by members of a multispecies biofilm promote horizontal gene
transfer to Vibrio cholerae. FEMS microbiology letters 322(1):68-76.
Artois M, Blancou J, Dupeyroux O, Gilot-Fromont E. 2011. Sustainable control of
zoonotic pathogens in wildlife: how to be fair to wild animals? Revue
Scientifique et Technique-OIE 30(3):733-743.
Asplund ME. 2013. Ecological aspects of marine Vibrio bacteria Exploring
relationships to other organisms and a changing environment. Thesis for the
degree of Doctor of Philosophy in Marine Ecology. University of Gothenburg.
Ast JC. Urbanczyk H. Dunlap PV. 2009. Multi-gene analysis reveals previously
unrecongnized phylogenetic diversity in Aliivibrio. Systematic and applied
microbiology 32(6):379-386.
97
Azam F. Malfatti F. 2007. Microbial structuring of marine ecosystems. Nature
Reviews Microbiology 5(10):782-791.
Azevedo NF, Almeida C, Fernandes I, Cerqueira L, Dias S, Keevil CW, Vieira MJ.
2008. Survival of Gastric and Enterohepatic Helicobacter spp. in Water:
Implications for Transmission. Applied and environmental microbial 74(6):1805-
1811.
Azevedo NF, Huntington J, Goodman KJ. 2009. The Epidemiology of Helicobacter
pylori and Public Health Implications. Helicobacter 14(1):1-7.
Babalola OO. 2003. Molecular techniques: An overview of methods for the
detection of bacteria. African Journal of Biotechnology 2(12):710-713.
Barbosa A, Palacios Ma J. 2009. Health of Antarctic birds: a review of their
parasites, pathogens and diseases. Polar Biology 32(8):1095-1115.
Barbosa A. 2011. Efectos del cambio climático sobre pingüinos antárticos.
Ecosistemas 20(1):33-41.
Bargagli R. 2008. Environmental contamination in Antarctic ecosystems. Science of
the total Environment 400:212-226.
Barghouti SA. 2011. A Universal Method for the Identification of Bacteria Based on
General PCR Primers. Indian journal of microbiology 51(4):430-444.
Barlow PM. 2003. Ground water in freshwater-saltwater environments of the
Atlantic coast Vol. 162, Geological Survey (USGS).
Barroto RJ. 1997. La ecología de Vibrio cholerae serogrupo 01 en ambientes
acuáticos. Rev. Panam. Salud Pública 1(1):3-8.
Basso D, Plebani M, Kusters J. 2010. Pathogenesis of Helicobacter pylori
Infection. Helicobacter 15(1):14-20.
Basso D, Zambon CF, Letley DP, Stranges A, Marchet A, Rhead JL, Schiavon S,
Guariso G, Ceroti M, Nitti D, Rugge M, Plebani M, Atherthon JC. 2008. Clinical
Relevance of Helicobacter pylori cagA and vacA Gene Polymorphisms.
Gastroenterology 135(1):91-99.
98
Beaz Hidalgo R. 2008. Identificación de bacterias del género Vibrio asociadas al
cultivo de la almeja. Caracterización y patogénesis. Univ Santiago de
Compostela. 387.
Bellack NR, Koehoorn MW, MacNab YC, Morshed MG. 2006. A conceptual model
of water’s role as a reservoir in Helicobacter pylori transmission: a review of the
evidence. Epidemiology and infection 134 (3):439-449.
Bellingham K. 2009. Physicochemical Parameters of Natural Waters. Stevens,
Water Monitoring Systems, Inc 1-17.
Bendt A, Hüller H, Kammel U, Helmke E, Schweder T. 2001. Cloning, expression,
and characterization of a chitinase gene from the Antarctic psychrotolerant
bacterium Vibrio sp. Strain Fi:7. Extremophiles 5(2):119-126.
Beneduce L, Tarantino D, Spano G, Libergoli M, Labonia M, Massa S. 2003.
Survival of Helicobacter pylori in well water. World Journal of Microbiology &
Biotechnology 19(5):505-508.
Benoit JB, Lopez-Martínez G, Philips SA, Elnitsky MA, Yoder JA, Lee Jr. RE,
Denlinger DL. 2008. The seabird tick, Ixodes uriae, uses uric acid in penguin
guano as a kairomone and guanine in tick feces as an assembly pheromone on
the Antarctic Peninsula. Polar Biology 31(12):1445-1451.
Benson JA, Fode-Vaughan KA, Collins LP. 2004. Detection of Helicobacter pylori
in water by direct PCR. Letters in applied microbiology 39(3):221-225.
Binsztein N, Costagliola MC, Pichel M, Jurquiza V, Ramírez FC, Akselman R,
Vacchino M, Huq A, Colwell R. 2004. Viable but Nonculturable Vibrio cholerae
O1 in the Aquatic Environment of Argentina. Applied and Environmental
Microbiology 70(12):7481-7486.
Blackstone GM, Nordstrom JL, Bowen MD, Meyer RF, Imbro P, DePaola A. 2007.
Use of a real time PCR assay for detection of the ctxA gene of Vibrio cholerae
in an environmental survey of Mobile Bay. Journal of Microbiological Methods
68(2):254-259.
Bonnedahl J, Broman T, Waldenström J, Palmgren H, Niskanen T, Olsen B. 2005.
In Search of Human-associated Bacterial Pathogens in Antarctic Wildlife:
99
Report from Six Penguin Colonies Regularly Visited by Tourists. AMBIO: A
Journal of the Human Environment 34(6):430-432.
Bowman JP, MacCammon SA, Brown MV, Nichols DS, McMeekin TA. 1997.
Diversity and Association of Psychrophilic bacteria in Antarctic Sea Ice.
American Society for Microbiology 63(8):3068-3078.
Broman T, Bergström S, On S, Palmgrem H, McCafferty DJ, Sellin M, Olsen B.
2000. Isolation and Characterization of Campylobacter jejuni subsp. jejuni from
macaroni Penguins (Eudyptes chrysolopus) in the Subantarctic Region. Applied
and environmental microbiology 66(1):449-452.
Brown LM. 2000. Helicobacter pylori: Epidemiology and Routes of
Transmission. Epidemiologic Reviews 22(2):283-297.
Buck JD. 1990. Isolation of Candida albicans and Halophilic Vibrio spp. From
Aquatic Birds in Connecticut and Florida. Applied and Environmental
Microbiology 56(3):826-828.
Burbano L, Salazar D, Icaza P, Kadzim R, Fauzi R. 2008. DEM Punta Fort
Williams: Pasado, Presente y Futuro. Programas Antárticos Latinoamericanos.
Burton HR. 1981. Chemistry, physics and evolution of Antarctic saline lakes.
Hydrobiologia 81(1):339-362.
Cabello C, Cabello F. 2008. Zoonosis con reservorios silvestres: Amenazas a la
Salud Pública y a la economía. Rev. Med. Chile 136:385-393.
Caffer M, Terragno R, Fraga S, Viñas M, Pichel M, Binsztein N. 2007. Manual de
Procedimientos. Aislamientos, identificación y caracterización de V. cholerae.
WHO Global Salm Surv 3-6.
Calisto N, Gómez C. Astorga MS. 2009. Evidencia del impacto de las actividades
humanas en la calidad del agua antártica. Boletín Antártico Chileno 28(2):17-18.
Campos VM, Meléndez FM, Cascante GL, Soto AH, Rojas KB, Gutiérrez JO,
Camacho JS, Santamaría FG. 2011. Hallazgo de la bacteria Helicobacter pylori
en agua de consumo humano y su relación con la incidencia de cáncer gástrico
en Costa Rica. Tecnología en Marcha 24(3):3-14.
100
Carlos F, Reyes E, Orellana C, Bravo A, Abt G. 2008. Actualizaciones en el
Patógeno Emergente Helicobacter Pollorum Asociado a Industria Avícola.
Cienc Trab 10(28):47-49.
Cava F, Cobas G. 2003. Dos décadas de Helicobacter pylori. VacciMonitor
12(1):1-10.
Cavicchioli R, Siddiqui KS, Andrews D, Sowers KR. 2002. Low-temperature
extremophiles and their applications. Current Opinion in Biotechnology 13:253-
261.
Cellini L, Del Vecchio A, Di Candia M, Di Campli E, Favaro M, Donelli G. 2004. Detection of free and plankton-associated Helicobacter pylori in seawater.
Journal of Applied Microbiology 97:285-292.
Chaiyanan S, Chaiyanan S, Grim C, Maugel T, Huq A, Colwell RR. 2007.
Ultrastructure of coccoid viable but non-culturable Vibrio cholerae.
Environmental Microbiology 9(2):393-402.
Chakravorty S, Helb D, Burday M, Connell N, Alland D. 2007. A detailed analysis
of 16S ribosomal RNA gene segments for the diagnosis of pathogenic bacteria.
Journal of microbiological methods 69(2):330-339.
Chave AD, Cox CS. 1982. Controlled electromagnetic sources for measuring
electrical conductivity beneath the oceans: 1. Forward problem and model
study. Journal of Geophysical Research: Solid Earth 87(B7):5327-5338.
Chen-Shan C, Sorenson J, Harris JB, Robins WP, Charles RC, Jean-Charles RR,
Bullard J, Webster DR, Kasarskis A, Peluso P, Paxinos EE. Yamaichi Y,
Calderwood SB, Mekalanos JJ, Schadt EE, Waldor MK. 2011. The Origin of the
Haitian Cholera Outbreak Strain. New England Journal of Medicine 64(1):33-42.
Chun J, Huq A, Colwell RR. 1999. Analysis of 16S-23S rRNA Intergenic Spacer
Regions of Vibrio cholerae and Vibrio mimicus. Applied and Environmental
Microbiology 65(5):2202-2208.
Clarridge JE. 2004. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identification
of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases. Clinical
Microbiology Reviews 17(4):840-862.
101
Comeau AM, Suttle CA. 2007. Distribution, genetic richness and phage sensitivity
of Vibrio spp. From coastal British Columbia. Environmental microbiology
9(7):1790-1800.
Connelly JT. Baeumner AJ. 2012. Biosensors for the detection of waterborne
pathogens. Anal Bioanal Chem 402:117-127.
Contreras M, Morales A, García-Amado MA, De Vera M, Bermúdez V, Gueneau P.
2007. Detection of Helicobacter-like DNA in the gastric mucosa of
Thoroughbred horses. Letters in Applied Microbiology 45:553-557.
Covadonga RA, Garay E, Aznar R. 1995. Nested PCR Method for Rapid and
Sensitive Detection of Vibrio vulnificus in Fish, Sediments, and Water. Applied
and Environmental Microbiology 61(9):3476-3478.
Cowan DA, Chown SL, Convey P, Tuffin M, Hughes K, Pointing S, Vincent WF.
2011. Non-indigenous microorganisms in the Antarctic: assessing the riks.
Trends in microbiology 19(11):540-548.
Davies KM, Lewis PJ. 2003. Localization of rRNA Synthesis in Bacillus subtilis:
Characterization of Loci Involved in Transcription Focus Formation. Journal of
Bacteriology 185(7):2346-2353.
Davis BM, Moyer KE, Boyd EF, Waldor MK. 2000. CTX Prophages in Classical
Biotype Vibrio cholerae: Functional Phage Genes but Dysfunctional Phage
Genomes. Journal of Bacteriology 182(24):6992-6998.
Debruyne L, Broman T, Bergström S, Olsen B, On SLW, Vandamme P. 2010.
Campylobacter volucris sp. nov., isolated from black-headed gulls (Larus
ridibundus). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology
60(8):1870-1875.
Delabre K, Cervantes P, Lahoussine V, de Roubin MR. 1998. Detection of Viable
Pathogenic Bacteria from Water Samples by PCR. In OECD Workshop on
Molecular Methods for Safe Drinking Water France. 1-8.
Delille D. 1987. Spatial distribution of coastal Antarctic seawater bacteria:
relationship with avifauna. Polar Biology 8(1):55-60.
102
Dewar ML, Arnould JPY, Dann P, Trathan P, Groscolas R, Smith S. 2013.
Interspecific variations in the gastrointestinal microbiota in penguins.
Microbiology Open 2(1):195-204.
Dewhirst FE, Shen Z, Scimeca MS, Stokes LN, Boumenna T, Chen T, Paster BJ,
Fox JG. 2005. Discordant 16S and 23S rRNA Gene Phylogenies for the Genus
Helicobacter. Implications for Phylogenetic Inference and Systematics. Journal
of Bacteriology 187(17):6106-6118.
Dobson A, Foufopoulos J. 2001. Emerging infectious pathogens of wildlife.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London 356(1411):1001-
1012.
Drake SL, DePaola A, Jaykus LA. 2007. An Overview of Vibrio vulnificus and
Vibrio parahaemolyticus. Comprehensive Reviews in Food Science and Food
safety 6(4):120-144.
Dryselius R, Kurokawa K, Iida T. 2007. Vibrionaceae, a versatile bacterial family
with evolutionarily conserved variability. Research in microbiology 158(6):479-
486.
Espinoza MG, González Vásquez R, Morales Mendez I, Ruelas Vargas C, Giono
Cerezo S. 2011. Detection of the glmM Gene in Helicobacter pylori Isolates
with a Novel Primer by PCR. Journal of Clinical Microbiology 49(4):1650-1652.
Faruque SM, Albert JA, Mekalanos JJ.1998. Epidemiology, Genetics, and Ecology
of Toxigenic Vibrio cholerae. Microbiology and Molecular Biology Reviews
62(4):1301-1314.
Fernández H. 2011. Género Helicobacter: un grupo bacteriano en expansión, con
características zoonóticas. La Gaceta de Infectología y Microbiología Clínica
Latinoamericana 2(1):11-20.
Fernández M, Contreras M, Suárez P, Gueneau P, García-Amado MA. 2007. Use
of HP selective medium to detect Helicobacter pylori associated with other
enteric bacteria in seawater and marine molluscs. Letters in applied
microbiology 45(2):213-218.
103
Fernández S, Alonso G. 2009. Cólera y Vibrio cholerae. Revista del Instituto
Nacional de Higiene “Rafael Rangel” 40(2):50-69.
Fernández-Delgado M, Contreras M, García Amado MA, Michelangeli F, Suárez
P. 2008. Evidencias de la transmisión acuática de Helicobacter pylori.
Interciencia: Revista de ciencia y Tecnología de América 33(6):412-417.
Field D, Wills C. 1998. Abundant microsatellite polymorphism in Saccharomyces
cerevisiae, and the different distributions of microsatellites in eight prokaryotes
and S. cerevisiae, result from strong mutation pressures and a variety of
selective forces. Proceedings of the National Academy of Sciences 95(4):1647-
1652.
Fox JG, Taylor NS, Howe S, Tidd M, Xu S, Paster BJ, Dewhirst FE. 2006.
Helicobacter anseris sp. nov. and Helicobacter brantae sp. nov., isolated from
feces of resident Canada geese in the greater Boston area. Applied and
environmental microbiology 72(7):4633-4637.
Fox JG. 2002. The non-H pylori helicobacters: their expanding role in
gastrointestinal and systemic diseases. Gut 50(2):273-283.
Frenot Y, Chown SL, Whinam J, Selkirk PM, Convey P, Skotnicki M, Bergstrom
DM. 2005. Biological Invasions in the Antarctic: extent, impacts and
implications. Biological reviews 80(1):45-72.
Fricker CR. 2003. The presence of bacteria in water after regrowth. Applied
Environmental Microbiology 43:49-60.
Fujimura S, Kato S, Kawamura T. 2004. Helicobacter pylori in Japanese river
water and its prevalence in Japanese children. Letters in Applied Microbiology
38(6):517-521.
Gachorro 2002. Síndrome diarreico infeccioso. Editorial Médica Panamericana
Cap. 13.
Gerhardt P. 2004. Methods for General and Molecular Bacteriology. A major
revision of the classic Manual of Methods for General Bacteriology. Murray
RGE. Wood W A. Krieg N R. Editores. Chap. 7.
104
Germani Y, Dauga C, Duval P, Huerre M, Levy M, Pialoux G, Sansonetti P,
Grimont PAD. 1997. Strategy for the detection of Helicobacter species by
amplification of 16s rRNA genes and identification of H. felis in a human gastric
biopsy. Research in microbiology 148(4):315-326.
Ghatak A, Majumdar A, Ghosh RK. 2005. Molecular phylogenetic analysis of
Vibrio cholerae O1 El Tor strains isolated before, during and after the O139
outbreak based on the intergenomic heterogeneity of the 16S-23S rRNA
intergenic spacer regions. Journal of Biosciences 30 (5):619-625.
Ghosh P, Laxmanrao Bofhankar S. 2012. Determination of risk factors and
transmission pathways of Helicobacter pylori in asymptomatic subjects in
Western India using polymerase chain reaction. Asian Pacific Journal of
Tropical Disease 2(1):12-17.
Gião MS, Azevedo NF, Wilks SA, Vieira MJ, Keevil CW. 2011. Interaction of
Legionella pneumophila and helicobacter pylori with bacterial species isolated
from drinking water biofilms. BMC Microbiology 11 (57):1-10.
Gilbert JA. 2002. Cold Adaptation Strategies and Diversity of Antarctic Bacteria.
Tesis Doctoral. University of Nottingham.
Giovannoni SJ, Stingl U. 2005. Molecular diversity and ecology of microbial
plankton. Nature 437(7057):343-348.
Girones R, Ferrús MA, Alonso JL, Rodríguez-Manzano J, Calgua B, de Abreu
Correa A, Hundesa A, Carratala A, Bofill-Mass S. 2010. Molecular detection of
pathogens in water-The pros and cons of molecular techniques. Water
Research 44(15):4325-4339.
Goel AK, Bhadauria S, Kumar P, Kamboj DV, Singh L. 2007. Semi-nested
polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae from
environmental water samples. Indian Journal of Microbiology 47(3):207-211.
Goldman HV. 2009. From the editor- endings and beginnings in 2009. Polar
Research 28(2):141-145.
González Fraga S, Pichel M, Costagliola M, Cecilia M, Jurquiza V, Peressutti S,
Caffer MI, Aulet O, Hozbor C, Tracanna BC, de Gamundi AV, Hernández D,
105
Ramírez FC, Akselman R, Binsztein N. 2007. Environment and virulence factors
of Vibrio cholerae strains isolated in Argentina. Journal of Applied Microbiology
103(6):2448-2456.
Griekspoor P, Olsen B, Walddenström J. 2009. Campylobacter jejuni in Penguins,
Antarctica. Emerging Infectious Diseases 15(5):847-849.
Halpern M, Landsberg O, Raats D, Rosenberg E. 2006. Culturable and VBNC
Vibrio cholerae: Interactions with Chironomid Egg Masses and Their Bacterial
Population. Microbial Ecology 53(2):285-293.
Hansell DA, Carlson CA, Repeat DJ, Schlitzer R. 2009. Dissolved organic matter
in the ocean. A controversy stimulates new insights. Oceanography 22: 56-61.
Hasan NA, Grim CJ, Haley BJ, Chun J, Alam M, Taviani E, Hoq Mozammel,
Christine Munk A, Saunders E, Brettin TS, Bruce DC, Challacombe JF, Chris
Detter J, Han CS, Xie G, Nair B, Huq A, Colwell RR. 2010. Comparative
genomics of clinical and environmental Vibrio mimicus. Proceedings of the
national Academy of Sciences 107(49):21134-21139.
Hayashi M. 2004. Temperature-electrical conductivity relation of water for
environmental monitoring and geophysical data reversion. Environmental
monitoring and assessment 96(1-3):119-128.
Haydon DT, Cleaveland S, Taylor LH, Laurenson MK. 2002. Identifying Reservoirs
of Infection: A Conceptual and Practical Challenge. Emerging Infectious
Diseases 8(12):1468-1473.
Heilderberg JF, Heidelberg KB, Colwell RR. 2002. Bacteria of the γ-subclass
Proteobacteria associated with zooplankton in Chesapeake Bay. Applied and
Environmental Microbiology 68(11):5498-5507.
Henze M, Comeau Y. 2008. Wastewater characterization. Biological wasterwater
treatment: principles, modeling and design. IWA Publishing, London 33-52.
Hodgson J. 2009. Responses of Antarctic Penguins to the Effects of Climate
Change. PCAS. Gateway Antarctica University of Canterbury.
106
Huang JP, Swain AK, Thacker RW, Ravindra R, Andersen DT, Bej AK. 2013.
Bacterial diversity of the rock-water interface in an East Antarctic freshwater
ecosystem. Lake Tawani (P). Aquatic Biosystems 9(1):4.
Huang X, Madan A. 1999. CAP3: A DNA sequence assembly program. Genome
Research 9(9):868-877.
Hubálek Z. 2004. An annotated checklist of pathogenis microorganisms associated
with migratory birds. Journal of Wildlife Diseases 40(4):639-659.
Hugenholtz P. 2002. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome
Biology 3(2):1-8.
Hughes KA, Thompson A. 2004. Distribution of sewage pollution around a
maritime Antarctic research station indicated by faecal coliforms, Clostridium
perfringes and faecal sterol markers. Environmental Pollution 127(3):315-321.
Huq A, Bradley Sack R, Nisam A, Longini IM, Balakrish Nair G, Ali A, Glenn Morris
J, Huda Khan MN, Kasem Siddique A, Yunus M, Jhon Albert M, Sack DA,
Colwell RR. 2005. Critical Factors Influencing the Occurrence of Vibrio cholerae
in the Environment of Bangladesh. Applied and Environmental Microbiology
71(8):4645-4654.
Huq A, Colwell RR, Rahman R, Ali A, Chowdhury MAR, Parveen S, Sack DA,
Russek-Cohen E. 1990. Detection of Vibrio cholerae 01 in the Aquatic
Environment by Fluorescent-Monoclonal Antibody and Culture Methods.
Applied and Environmental Microbiology 56(8):2370-2373.
Jadwiszczak P, Mörs T. 2011. Aspects of diversity in early Antarctic penguins.
Acta Paleontologica Polonica 56(2):269-277.
Janda JM, Abbott SL. 2007. 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial
Identification in the Diagnostic Laboratory: Pluses, Perils, and Pitfalls. Journal of
Clinical Microbiology 45(9):2761-2764.
Janzon A, Sjöling A, Lothigius A, Ahmed D, Qadri F, Svennerholm A. 2009. Failure
to detect Helicobacter pylori DNA in drinking and environmental water in Dhaka,
Bangladesh, using highly sensitive real-time PCR assays. Applied and
environmental microbiology 75(10):3039-3044.
107
Jiang SC. 2001. Vibrio cholerae in recreational beach waters and tributaries of
Southern California. In The Ecology and Etiology of Newly Emerging Marine
Diseases, (157-164 pp). Springer Netherlands.
Johansson A, Ibrahim A, Göransson I, Eriksson U, Gurycova D, Clarridge J,
Sjöstedt A. 2002. Evaluation of PCR-Based Methods for Discrimination of
Francisella Species and Subspecies and Development of a Specific PCR That
Distinguishes the Two Major Subspecies of Francisella tularensis. Journal of
Clinical Microbiology 38(11):4180-4185.
Jou NT, Yoshimory RB, Mason GR, Louie JS, Liebling M.1997. Single-Tube,
Nested, Reverse Transcriptase PCR for Detection of Viable Mycobacterium
tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology 35(5):1161-1165.
Kabir S. 2001. Detection of Helicobacter pylori in faeces by culture, PCR and
enzyme immunoassay. Journal of medical microbiology 50(12):1021-1029.
Kansau I, Raymond J, Bingen E, Courcoux P, Kalach N, Bergeret M, Braimi N,
Dupont C, Labigne A. 1996. Genotyping of Helicobacter pylori isolates by
sequencing of PCR products and comparison with the RAPD technique.
Research in Microbiology 147(8):661-669.
Kanungo S, Sah BK, Lopez AL, Sung JS, Paisley AM, Sur D, Clems JD, Nair GB.
2010. Cholera in India: an analysis of reports, 1997-2006. Bull World Health
Organ 88(3):185-191.
Kawaguchi K, Matsuo J, Osaki T, Kamiya S, Yamaguchi H. 2009. Prevalence of
Helicobacter and Acanthamoeba in natural environment. Letters in applied
microbiology 48(4):465-471.
Koutsos EA, Arias VJ. 2006. Intestinal ecology: interactions among the
gastrointestinal tract, nutrition, and the microflora. The Journal of Applied
Poultry Research 15(1):161-173.
Labigne A, Cussac V, Courcoux P. 1991. Shuttle Cloning and Nucleotide
Sequences of Helicobacter pylori Genes Responsible for Urease Activity.
Journal of Bacteriology 173 (6):1920-1931.
108
Lafuente S, Vilella A, Serrano B, González R, Bruni L. 2006. El Cólera.
Enfermedades Emergentes 8:10-15.
Lasker BA. 2002. Evaluation of Performance of Four Genotypic Methods for
Studying the Genetic Epidemiology of Aspergillus fumigatus Isolates. Journal of
Clinical Microbiology 40(8):2886-2892.
Leotta GA, Chinen I, Vigo GB, Pecoraro M, Rivas M. 2006. Outbreaks of Avian
cholera in Hope Bay, Antarctica. Journal of Wildlife Diseases 42 (2):259-270.
Leyton Y, Riquelme C. 2008. Vibrios en los sistemas marinos costeros. Revista de
Biología Marina y Oceanografía 43(3):441-456.
Lindeboom HJ. 1984. The nitrogen pathway in a penguin rookery. Ecology 269-
227.
Liu Y, Yang G, Wang H, Chen J, Shi X, Zou G, Wei Q, Sun X. 2006. Design of
Vibrio 1 6S rRNA Gene Specific Primers and Their Application in the Analysis of
Seawater Vibrio Community. Journal of Ocean University of China 5(2):157-
164.
Manukhov IV, Khrul´nova SA, Baranova A, Zavilgelsky GB. 2011. Comparative
Analysis of the lux Operons in Aliivibrio logei KCh1 (a Kamchatka Isolate) and
Aliivibrio salmonicida. Journal of bacteriology 93(15):3998-4001.
Margolles a, Gueimonde M, Sánchez B. 2012. Genome Sequence of the Antarctic
Psychrophile Bacterium Planococcus antarcticus DSM 14505. Journal of
bacteriology 194 (16):4465.
Marshall GJ, Lagun V, Lachlan-Cope TA. 2002. Changes in Antarctic Peninsula
tropospheric temperatures from 1956 to 1999: a synthesis of observations and
reanalysis data. International Journal of Climatology 22 (3):291-310.
Martín García I, Rodríguez JB, Rodríguez JS, Suárez BP, Bocardo JP, Martín NS.
2006. Guía sobre tratamientos de aguas residuales urbanas para pequeños
núcleos de población. Mejora de la calidad de los efluentes. Edit. Junta de
Andalucía. 126p. Sevilla.
109
Massoudian S, Moghadam RG, Naderi M, Moein FG, Ghane M. 2012. Absence of
Helicobacter pylori in The River Waters in the North of Iran. African Journal of
Microbiology Research 6(8):1790-1795.
Mcdougald D, Rice SA, Weichart D, Kjelleberg S. 1998. Nonculturability:
adaptation or debilitation?. FEMS Microbiology Ecology 25(1):1-9.
Melito PL, Munro C, Chipman PR, Woodward DL, Booth TF, Rodgers FG. 2001.
Helicobacter winghamensis sp. nov., a novel Helicobacter sp. isolated from
patients with gastroenteritis. Journal of clinical microbiology 39(7):2412-2417.
Mendes-Márques CL, Silveira Filho V da M, Rocha da Costa AP, de Lira Nunes M,
Viera da silva Filho S, Torres de Araujo Figueroa AC, Hofer E. Paiva de
Almeida AM, Contra Leal N. 2013. The Aquatic Environment as a Reservoir of
Vibrio cholerae O1 in Hydrographic Basins of the State of Pernambuco, Brazil.
The Scientific World Journal. En prensa.
Metcheva R, Yurukova L, Teodorova S, Nikolova E. 2006. The penguin feathers
as bioindicator of Antarctica environmental state. Science of the Total
Environment 362(1):259-265.
Mishra A, Taneja N, Sharma M. 2012. Viability kinetics, induction, resuscitation
and quantitative real-time polymerase chain reaction analyses of viable but
nonculturable Vibrio cholerae O1 in freshwater microcosm. Journal of applied
microbiology 112(5):945-953.
Mishra A, Taneja N, Sharma RK, Kumar R, Sharma NC, Sharma M. 2011.
Amplified fragment length polymorphism of clinical and environmental Vibrio
cholerae from a freshwater environment in a cholera-endemic area, India. BMC
Infectious Diseases 11(1):249.
Miyasaka J, Yahiro S, Arahira A, Tokunaga H, Katsuki K, Hara-Kudo Y. 2006.
Isolation of Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vulnificus from wild aquatic birds
in Japan. Epidemiology and Infection 134(04):780-785.
Monteiro L, Bonnemaison D, Vekris A, Petry KG, Bonnet J, Vidal R, Cabrita J,
Mégraud F. 1997. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces:
Helicobacter pylori model. Journal of clinical Microbiology 35(4):995-998.
110
Moore WEC, Holdeman LV. 1974. Human fecal flora: the normal flora of 20
Japanese-Hawaiians. Applied microbiology 27(5):961-979.
Moreno C, Romero J, Espejo R T. 2002. Polymorphism in repeated 16S rRNA
genes is a common property of type strains and environmental isolates of the
genus Vibrio. Microbiology 148(4):1233-1239.
Moreno Y, Ferrús MA. 2012. Specific detection of cultivable Helicobacter pylori
cells from wastewater treatment plants. Helicobacter 17(5):327-332.
Murray AE, Grzymski JJ. 2007. Diversity and genomics of Antarctic marine micro-
organisms. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological
Sciences 362(1488):2259-2271.
Myers M, Myers L, Okey R. 2006. The use of Oxidation-Reduction Potential as a
means of controlling effluent ammonia concentration in an extended aeration
activated sludge system. Water Environment Foundation 5901-5926.
Nayak AK, Rose JB. 2007. Detection of Helicobacter pylori in sewage and water
using a new quatitative PCR method with SYBR®green. Journal of applied
microbiology 103(5):1931-1941.
Newton RJ, Jones SE, Euler A, McMahon KD, Bertilsson S. 2011. A guide to the
natural history of freshwater lake bacteria. Microbiology and Molecular Biology
Reviews 75(1):14-49.
Noguerola I, Blanch AR. 2007. Identification of Vibrio spp. with a set of
dichotomous keys. Journal of applied microbiology 105(1):175-185.
Ogg JE, Ryder RA, Smith HL. 1989. Isolation of Vibrio cholerae from Aquatic Birds
in Colorado and Utah. Applied and Environmental Microbiology 55(1):95-99.
Owen RJ. 1998. Helicobacter - species classification and identification. British
Medical Bulletin 54(1):17-30.
Oxley A, McKay DB. 2005. Comparison of Helicobacter spp. Genetic sequences in
wild and captive seals, and gulls. Diseases of aquatic organisms 65(2):99-105.
111
Palmgren H, McCafferty D, Aspan A, Broman T, Sellin M, Wollin R, Bergström S,
Olsen B. 2000. Salmonella in sub-Antarctica: low heterogeneity in Salmonella
serotypes in South Georgia seals and birds. Epidemiology and infection
125(2):257.
Pascual J, Macián MC, Arahal DR, Garay E, Pujalte MJ. 2010. Multilocus
sequence analysis of the central clade of the genus Vibrio by using the 16S
rRNA, recA, pyrH, rpoD, gyrB, rctB and toxR genes. International journal of
systematic and evolutionary microbiology 60(1):154-165.
Pascual Ma. del R. 2005. Enfermedades de Origen Alimentario. Su prevención.
Ediciones Díaz de Santos. España 52-60.
Pawlowicz R. 2010. A model for predicting changes in the electrical conductivity,
Practical Salinity and Absolute Salinity of seawater due to variations in relative
chemical composition. Ocean Science 6(1):361-378.
Pearson GDN, Woods A, Chiang SL, Mekalanos JJ. 1993. CTX genetic element
encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization
factor. Proceedings of the National Academy of Sciences 90 (8):3750-3754.
Percival SL, Thomas JG. 2009. Transmission of Helicobacter pylori and the role of
water and biofilms. Journal of Water and Health 7(3):469-477.
Pontirol A, Travis ER, Sweeney FP, Porter D, Gaze WH, Mason S, Hibberd V,
Holden J, Courtenay O, Wellingtong EMH. 2011. Pathogen quantitation in
complex matrices: a multi-operator comparison of DNA extraction methods with
a novel assessment of PCR inhibition. Plos one 6(3):e17916.
Premoli G, González AJ, Millán-Mendoza B, Percoco T, Vielma A. 2004.
Diagnóstico de H. pylori mediante la reacción en cadena de la polimerasa. Rev.
Cubana. Med Trop 56(2):85-90.
Pruesse E, Peplies J, Glöckner FO. 2012. SINA: Accurate high-throughput multiple
sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics 28(14):1823-1829.
Pruzzo C, Gallo G, Canesi L. 2005. Persistence of vibrios in marine bivalves: the
role of interactions with haemolymph components. Environmental Microbiology
7(6):761-772.
112
Pruzzo C, Vezzulli L, Colwell RR. 2008. Global impact of Vibrio cholerae
interactions with chitin. Environmental Microbiology 10(6):1400-1410.
Quayle WC, Peck LS, Peat H, Ellis-Evans JC, Harrigan PR. 2002. Extreme
responses to climate change in Antarctic lakes. Science. 295 (5555):645.
Rappole JH, Derrickson SR, Hubálek Z. 2000. Migratory Birds and Spread of West
Nile Virus in the Western Hemisphere. Emerging Infectious Diseases 6(4):319-
328.
Rastogi G, Sani RK. 2011. Molecular Techniques to Assess Microbial Community
Structure, Function, and Dynamics in the Environment. I. Ahmad et al. (eds.), In
Microbes and Microbial Technology 29-57. Springer New York.
Reavis C. 2005. Rural health alert: Helicobacter pylori in well water. Journal of the
American Academy of Nurse Practitioners 17(7):283-289.
Reck G, Proaño R. 2007. Los Impactos del Turismo en Isla Barrientos, Shetland
Sur. VI Simposio Argentino y III Latinoamericano sobre Investigaciones
Antárticas.
Reen FJ, Almagro-Moreno S, Ussery D, Boyd EF. 2006. The genomic code:
inferring Vibrionaceae niche specialization. Nature Reviews Microbiology.
4(9):697-704.
Rivas-Traverso F, Hernández F. 2000. Helicobacter pylori: Factores de virulencia,
patología y diagnóstico. Rev Biomed 11:187-205.
Robin JP, Cherel Y, Girard H, Géloen A, Le Maho Y. 1987. Uric acid and urea in
relation to protein catabolism in long-term fasting geese. Journal of
Compararive Physiology B 157(4):491-499.
Rodicio Ma del R, Mendoza Ma del C. 2004. Identificación bacteriana mediante
secuenciación del ARNr 16S: fundamento, metodología y aplicaciones en
microbiología clínica. Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica
22(4):238-245.
Rodríguez IP, Barrera HA. 2004. La Reacción en Cadena de la Polimerasa a dos
Décadas de su Invención. Ciencia UANL, VII (3):323-335.
113
Rodríguez J, López P, Muñoz J, Rodríguez N. 2010. Detección de Vibrio cholerae
no toxigenico en aves Migratorias y Residentes (Charidriiformes) en una laguna
costera del Nororiente de Venezuela. Saber, Universidad de Oriente.
Venezuela 22(2):122-126.
Ruby EG, Lee KH. 1998. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes logh organ
association: current ecological paradigms. Applied and environmental
microbiology 64(3):805-812.
Safaei HG, Rahimi E, Zandi A, Rashidipour A. 2011. Helicobacter pylori as a
zoonotic infection: the detection of H. pylori antigens in the milk and faeces of
cows. Journal of research in medical sciences: the official journal of Isfahan
University of medical Sciences 16(2):184.
Santana E, Dumont JF. 2002. Geología de los alrededores de la estación
Ecuatoriana Pedro Vicente Maldonado (Isla Greenwich) e Isla Dee, Península
Antártica. Acta Antártica Ecuatoriana PROANTEC 1:7-32.
Schrader C, Schielke A, Ellerbroek L, Johne R. 2012. PCR inhibitors-ocurrence,
properties and removal. Journal of applied microbiology 113(5):1014-1026.
Seurinck S, Defoirdt T, Verstraete W, Siciliano SD. 2005. Detection and
quantification of the human-specific HF183 Bacteroides 16S rRNA genetic
marker with real-time PCR for assessment of human fecal pollution in
freshwater. Environmental Microbiology 7(2):249-259.
Shar AH, Kazi YF, Kanhar NA. 2010. Seasonal Variation of Vibrio cholerae and
Vibrio mimicus in Freshwater Environment. Proceedings of Pakistan Academy
Sciences 74(1):25-31.
Sharma R, Singh M, Sharma A. 2002. Polymerase chain reaction: An emerging
tool for research in pharmacology. Indian journal of pharmacology 34(4):229-
236.
Sheikh AF, Goodarzi H, Aslani S. 2012. Identification of Vibrio cholerae
pathogenicity island (ctxA, OmpW and tcpA) in non-O139 and non-O1 V.
cholerae strains isolated from Karun River in Ahvaz, Iran. African Journal of
Microbiology Research 6(6):1185-1189.
114
Skovgaard N. 2007. New trends in emerging pathogens. International Journal of
Food Microbiology 120(3):217-224.
Somerville CC, Knight IT, Straube WL, Colwell RR. 1989. Simple, Rapid Method
for Direct Isolation of Nucleic Acids from Aquatic Environments. Applied and
Environmental Microbiology 55(3):548-554.
Soto W, Gutierrez J, Remmenga MD, Nishiguchi MK. 2009. Salinity and
temperature effects on physiological responses of Vibrio fischeri from diverse
ecological niches. Microbial ecology 57(1):140-150.
Stackebrandt E, Goebel BM. 1994. Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA
Reassociation and 16s rRNA Sequence Analysis in the Present Species
Definition in Bacteriology. International Journal of Systematic 44 (4):846-849.
Stanley J, Linton D, Burnens AP, Dewhirst FE, On SLW, Porter A, Owen RJ,
Costas M. 1994. Helicobacter pullorurn sp. nov. - genotype and phenotype of a
new species isolated from poultry and from human patients with gastroenteritis.
Microbiology 140(12):3441-3449.
Stevenson BS, Schmidt TM. 1998. Growth Rate-Dependent Accumulation of RNA
from Plasmid-Borne rRNA Operons in Escherichia coli. Journal of Bacteriology
180(7):1970-1972.
Stewart JP, Gast RJ, Fujioka RS, Solo-Gabriele HM, Meschke JS, Amaral-Zettler
LA, Del Castillo E, Polz MF, Collier TK, Strom MS, Sinigalliano CD, Moeller
PDR, Holland AF. 2008. The coastal environment and human health: microbial
indicators, pathogens, sentinels and reservoirs. Environ Health 7(2):S3.
Sthatam JA, McMeekin TA. 1994. Survival of faecal bacteria in Antarctic coastal
waters. Antarctic Science 6(3):333-438.
Suárez P, Contreras M, Fernández-Delgado M, Salazar V, Peña R, Michelangeli
F, García-Amado MA. 2010. Detection of Helicobacter in the digestive tract of
an Atlantic spotted dolphin (Stenella frontalis). Journal of Wildlife Diseases
46(2):622-626.
Tabatabaei M. 2012. Application of Molecular and Cultural Methods for
Identification of Helicobacter spp. In Different Animal Sources. Global
Veterinaria 8(3):292-297.
115
Tamura K, Peterson D, Peterson N, Stecher G, Nei M, Kumar S. 2011. MEGA5:
Molecular Evolutionary Genetics analysis using Maximum Likelihood,
Evolutionary Distance, and Maximun Parsimony Methods. Molecular Biology
and Evolution 28(10):2731-2739.
Tanaka C, Miyazawa T, Watari M, Ishiguro N. 2005. Bacteriological survey of
feces from feral pigeons in Japan. The Journal of veterinary medical science/the
Japanese Society of Veterinary Science 67(9):951-953.
Theron J, Cilliers J, Du Preez M, Brözel VS, Venter SN. 2000. Detection of
toxigenic Vibrio cholerae from environmental water samples by an enrichment
broth cultivation-pit stop semi-nested PCR procedure. Journal of applied
microbiology 89(3):539-546.
Theron J, Morar D, Du Prezz M, Brözel VS, Venter SN. 2001. A Sensitive
Seminested PCR Method for the Detection of Shigella in Spiked Environmental
Water Samples. Water research 35(4):869-874.
Thomas DN, Dieckmann GS. 2002. Antartic Sea ice-a habitat for extremophiles.
Science 295 (5555):641-644.
Thompson JR, Randa MA, Marcelino LA, Tomita-Mitchell A, Lim E, Polz MF. 2004.
Diversity and dynamics of a North Atlantic coastal Vibrio community. Applied
and Environmental 70(7):4103-4110.
Thompson FL, Iida T, Swings J. 2004. Biodiversidad de vibrios. Microbiology
Molecular Biology Reviews 68(3): 403-431.
Tin T, Fleming ZL, Hughes KA, Ainley DG, Convey P, Moreno CA, Pfeiffer S, Scott
J, Snape I. 2009. Impacts of local human activities on the Antarctic environment
21(1):3-33.
Tomb JF, White O, Kerlavage AR, Clayton RA, Sutton GG, Fleischmannn RD,
Ketchum KA, Klenk HP, Gill S, Dougherty BA, Nelson K, Quackenbush J, Zhou
L, Kirkness EF, Peterson S, Loftus B, Richardson D, Dodson R, Khalak HG,
Glodek A, McKenney K, Fitzegerald LM, Lee N, Adams MD, Hickey EK, Berg
DE, Gocayne JD, Utterback TR, Peterson JD, Kelley JM, Cotton MD, Weidman
JM, Fujii C, Bowman C, Watthey L, Wallin E, Hayes WS, Borodovsky M, Karp
116
PD, Smith HO, Fraser CM, Venter JC.1997. The complete genome sequence of
the gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature 388 (6642):539-547.
Torres T, Otero RA, Cisterna M. 2009. Nuevos hallazgos paleoxilológicos en Isla
Dee, Islas Shetland del Sur, Península Antártica. Congreso Geológico Chileno
1-4.
Tuemmers C, Torres DE, De Los Ríos-Escalante P. 2011. Presencia de
patógenos antropogénicos en la fauna antártica: El rol potencial de especies de
aves migratorias. Revista Chilena de historia natural 84(2):301-302.
Tummuru Murali KR, Cover TL, Blaser MJ. 1993. Cloning and Expression of a
High-Molecular-Mass Major Antigen of Helicobacter pylori: Evidence of Linkage
to Cytotoxin Production. Infection and Immunity 61(85):1799-1809.
Turner J, Colwell SR, Marshall GJ, Lachlan-Cope TA, Carleton AM, Jones PD,
Lagun V, Reid PA, Iagovkina S. 2005. Antarctic climate change during the last
50 years. International journal of Climatology 25 (3):279-294.
Twing KI, Kirchman DL, Campbell BJ. 2011. Temporal study of Helicobacter pylori
presence in coastal freshwater, estuary and marine waters. Water research
45(4):1897-1905.
Urbanczyk H, Ast JC, Higgins MJ, Carson J, Dunlap PV. 2007. Reclassification of
Vibrio fischeri, Vibrio logei, Vibrio salmonicida and Vibrio wodanis as Aliivibrio
fischeri gen. nov., com. nov. Aliivibrio logei com. nov. Aliivibrio salmonicida com.
nov. and Aliivibrio wodanis com. nov. International journal of systematic and
evolutionary microbiology 57(12):2823-2829.
Vale FF, Vítor JMB. 2010. Transmission pathway of Helicobacter pylori: Does food
play a role a role in rural and urban areas?. International Journal of Food
Microbiology 138(1):1-12.
Van Trappen S, Mergaert J, Van Eygen S, Dawyndt P, Cnockaert MC, Swings J.
2002. Diversity of 746 heterotrophic Bacteria Isolated from Microbial Mats from
Ten Antarctic Lakes. Systematic and Applied Microbiology 25(4):603-610.
117
Vandamme P, Pot B, Gillis M, De Vos P, Kersters K, Swings J. 1996. Polyphasic
Taxonomy, a Consensus Approach to Bacterial Systematics. Microbiological
Reviews 60(2):407-438.
Vanden Broeck D, Horvath C, De Wolf M. 2007. Vibrio cholerae: Cholera toxin.
The International journal of biochemistry & cell biology 39 (10):1771-1775.
Vaughan DG, Marshall GJ, Connolley WM, Parkinson C, Mulvaney R, Hodgson
DA, King JC, Pudsey CJ, Turner J. 2003. Recent rapid regional climate warming
on the Antarctic Peninsula. Climate change 60(3):243-274.
Vesth T, Wassenaar TM, Hallin PF, Snipen L, Lagesen K, Ussery DW. 2010. On
the origins of a Vibrio species. Microbial ecology 59(1):1-13.
Vezulli l, Breattar I, Pezzati E, Reid PC, Colwell RR, Höfle MG, Pruzzo C. 2011.
Long-term effects of ocean warming on the prokaryotic community:evidencie
from the vibrios. The ISME journal 6(1):21-30.
Vezulli L, Brettar I, Pezzati E, Reid PC, Colwell RR, Höfle MG, Pruzzo C. 2011.
Long-term effects of ocean warming on the prokaryotic community: evidence
from de vibrios. The ISME Journal 6(1):21-30.
Wakefield M. 2003. Molecular Biology Tools and Techniques. Centre for
Bioinformation Science John Curtin School of Medical Research / Mathematical
Sciences Institute. The Australian National University.
Waldenström J, On SLW, Ottvall R, Hasselquist D, Harrington CS, Olsen B. 2003.
Avian Reservoirs and Zoonotic Potential of the Emerging Human Pathogen
Helicobacter canadensis. Applied Environmental Microbiology 69(12):7523-
7526.
Waldenström J, On SLW, Ottvall R, Hasselquist D, Olsen B. 2007. Species
diversity of Campylobacteria in a wild bird community in Sweden. Journal of
applied microbiology 102 (2):424-432.
Wang D, Wang H, Zhou Y, Zhang Q, Zhang F, Du P, Wang S, Chen C, Kan B.
2011. Genome sequencing reveals unique mutations in characteristic metabolic
pathways and the transfer of virulence genes between V. mimicus and V.
cholerae. Plos One 6(6):e21299.
118
Wang JY, Lee LN, Chou CS, Huang CY, Wang SK, Lai HC, Hsueh PR, Luh KT.
2004. Performance Assessment of a Nested-PCR Assay (the RAPID BAP-MTB)
and the BD ProbeTec ET System for Detection of Mycobacterium tuberculosis
in Clinical Specimens. Journal of Clinical Microbiology 42(10):4599-4603.
Wang RF, Cao WW, Cerniglia CE. 1996. PCR detection and quantitation of
predominant anaerobic bacteria in human and animal fecal samples. Applied
and Environmental Microbiology 62(4):1242-1247.
Wang Y, Liu DX, Ju MT, Jin ZH, Li TL. 2011. The Effect of Seawater Salinity on
the Equilibrium Time of Oxidation Reduction Potential. Advanced Materials
Research 301:1648-1651.
Warrick AW. 2003. Soil Water Dynamics.Oxford University Press. World Health
Organization, Water quality assessments: A guide to the use of biota, sediments
and water in environmental monitoring, 2nd ed. Edited by Deborah Chapman,
1996.
Weber-Scanell PK, Duffy LK. 2007. Effects of total dissolved solids on aquztic
organisms: a review of literature and recommendation for salmonid species.
American Journal of Environmental Sciences 3(1):1.
Weisburg W, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S Ribosomal DNA
Amplification for Phylogenetic Study. Journal of Bacteriology 173 (2):697-703.
Whitman WB, Goodfellow M, Kämpfer P, Busee HJ, Trujillo ME, Ludwing W. Parte
A. (Eds.) 2012. Bergey´s Manual® of systematic bacteriology (Vol.5).
Woese CR. 1987. Bacterial Evolution. Microbiological Reviews 51(2): 221-271.
Yamaoka Y, Kodama T, Kashima K, Graham DY, Sepulveda AR. 1998. Variants of
the 39 Region of the cagA Gene in Helicobacter pylori Isolates from Patients
with Different H. pylori-Associated Diseases. Journal of Clinical Microbiology
36(8):2258-2263.
Yáñez MA, Barberá VM, Soria E, Catalán V. 2009. Quantitative detection of
Helicobacter pylori in water samples by real-time PCR amplification of the cag
pathogenicity island gene, cagE. Journal of applied microbiology 107(2):416-
424.