1

IMMUNHISZTOKÉMIAI MÓDSZEREK

Klinikai Kutató MSc Képzés

Debrecen, 2013. 03. 20. Dr. Csonka Tamás

DEOEC Pathologiai Intézet

Definíciók

  Immunkémia  Immunhisztokémia  Immunciokémia  Immunfluoreszcencia

  Epitóp  paratóp

  Elsődleges antitest  Másodlagos antitest   Jelölő rendszerek  Kettős jelölés

Immunhisztokémiai reakció kivitelezése

  Preanalitikai   Rögzítés módja, időtartama

  Szövettípus, mérete

  Antigénfeltárás hatékonysága, eszköze módja

  Analitikai   Reagens minősége, affinitása

  Jelző/előhívó rendszer

  Reagens hígitása

  Inkubációs idő, hőmérséklet

  Postanalitikai   Kontrollok +/-

  Reakció értékelése, értelmezése

Fixálás

 Keresztkötő – pl. formalin, glutáraldehid  Amino, imino, amid, karboxil csoport kovalens

keresztkötése  Fehérje térszerkezet torzul, epitophoz nem lehet

hozzáférni

 Koagulációs – aceton, metanol  Víz helyetesítéssel denaturlája a fehérjét  Kevésbé gátol, de a struktúra jobban károsodik

 Kettő keveréke – pikrinsavas-ecetsavas formalin

Aldehid rezisztens Antigén

 Mérettől függő 4-16 óra 4%-os formaldehidben   Paraffin vagy epoxi gyantába ágyazás   „Metszetragasztás” APES (3-aminopropil-

trietoxiszilán) 2%-os acetonos oldata (2h 560C szárítás)

Aldehid érzékeny Antigén

 Acetonos rögzítés (enyhe koagulációs)  Friss-fagyasztott  Sejt/szövettenyészet  Aspirációs citológia  Vérkenet

  Előnye hogy a lipidek egy részét kioldja => javítja a reagensek penetrációját

 Hátránya alaposan a tárgylemezre kell szárítani a mintát (2h vagy overnight szobahő); minden lépés <30p

2

Pre-analitikai szakasz hibái

  1. Fixálás: módja, időtartama, szövet típusa, mérete   Túl rövid fixálás neutrális pufferelt formalinban (NPF)ban   Elkésett fixálás   Más fixálószer alkalmazása, nem NPF   Túl hosszú fixálás NPF oldatban nem probléma!

  2. Megfelelő dekalcinálás:   Agresszív dekalcinálás

  3. Megfelelő víztelenítés   4. Metszetkészítés:

  Metszési hibák, szétterített, szétfőzött metszet

Elkésett, vagy túl rövid fixálás következményei:

  Antigén veszteség   Növekvő háttérreakció   Kockázat: bizonytalan immunreakció   Gyenge a metszetek tapadása a lemezhez   Standard feltárással tovább károsodik a morfológia   Kockázat: paraffinblokkban is antigénveszteség tapasztalható

Dekalcinálás hatása az immunhisztokémiára

  Erős savak: gyors dekalcinálás-10% HCL - IHC+   Gyenge savak: közepes -10% Formic acid- IHC++   Kálcium kelát: lassú dekalcinálás -5 - 10% EDTA-IHC+++

Metszetek vastagsága, szárítása, és annak hatása

  3 - 4 um metszeteket készítünk UltraPlus lemezekre   metszetek szárítása 1-2 óra 60°C-on, vagy száríthatjuk 37 °C-

on éjszakán át, majd 1 óra 60°C-on   Ha a metszet tapadásával probléma van akkor 16 óra 60°C -on

elfogadható, de néhány antigén kimutathatósága csökken:  OR, PR, Ki67, HMB45, Melan-A, S100 poly

Antigén feltárás

  Csak formalinos fixációnál

  Kevert fixálásnál rövidebb ideig

  HIER - Mechanizmusa pontosan nem ismert – feltehetően enyhe de általános hidrolízis

  Proteáz emésztésnél – specifikus és erőteljes peptid-kötés hasítása

  Pufferek:   0.01-0.1M pH6 citromsavas-citrát ( + 0,1% Tween detergens)

  0.1-0.5M pH8-10 Tris-HCl

  0.1M pH8 EDTA-NaOH

  Gyári feltárók, pl.: DAKO TRS

Antigén feltárás

  Heat inducet antigen retrieval – HIER  Mikrohullámú sütőben: 100 0C, 800-900W, 1l puffer,

20-25perc  Kukta: 120 0C, 1 atm túlnyomással, 3l puffer, max. nyomás

után 2-4perc

  Ezt kövretően érdemes TBS-sel mosni   Emésztés:

 Proteinase K  Trypsin  Pepsin  Pronase

3

Antigén feltárás

  Optimalizálni kell a hőmérsékletet, az időt, a pH-t (puffert)   ‘Hőmérséklet szabályozás’ = hőmérséklet × idő:

  121ºC/1 perc 100ºC/20 perc 95ºC/40 perc 60ºC/24 óra

Enzimes antigén feltárás: idő és hőmérséklet függése

Antigén feltárás

  EnVision™ FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) Tris/EDTA puffer, pH 9-es puffer. „3-in-1” módszer - előmelegítés 65 C-ra, 20’ 97oC - lehűlés 65 C-ra

  Deparrafinál, hidratál, és antigén feltáró hatással is bír.

Blokkolás

  Endogén peroxidáz   Metanolos 0,5% H2O2, 20-30perc

  Deparaffinálás után

  Szöveti Fc receptor, pozitív töltésű szöveti molekulák, szabad aldehid csoportok, hidrofób csoportok   Nagy koncentrációjú indiferens fehérje, pl.: 1-5% BSA, FCS, más állati

szérum, sovány tejpor

  Szöveti biotin (ABC módszernél; vese, máj, GIT)   Biotin mentes módszer

  Endogén alkalikus foszfatáz   Levamisol – immun-alkalikus foszfatáz módszernél

  Formaldehid fixált, fagyasztott metszeteknél   Aspecifikus immunfluoreszcens reakció (fokozott hidrofóbia miatt)

Endogén peroxidáz blokkolás:

  Néhány antigén érzékeny az endogén peroxidáz blokkolásra, ha a H202 koncentrációja magas.

  Használjunk általánosan alkalmazott Dako peroxidáz blokkoló oldatot

  A blokkolást a primer antitesttel való inkubálás után végezzük   Blokkolást a deparaffinálás után, hosszabb ideig, kisebb

koncentrációjú H2O2-ben végezzük.0.15-0.30 % H202

Antitestek, inkubációs körülmények

  Ált. IgG, némely esetben IgM

  Alosztályspecifikus jelzett antitestek kettős jelölésnél

  Mosásnál TBS, PBS

  Reagensek hígitása: 1% BSA, 0.1% Na-azid pufferben

  Peroxidázzal konjugált antitestnél azidos TBS nem használható

  Antitestek tárolása:   Hígitva 4 0C

  Aliquotokra osztva -20 0C !Nem fagyasztjuk vissza!

  Inkubáció:   Szobahő, over-night (2-5x magasabb hígitásban)

  4 0C, over-night (alacsony affinitás esetén)

4

Antitestek, inkubációs körülmények

 Antitestek hígitása:  Monolonális, ascites eredetű: 50-néhány100x  Sejtkultúra felülúszóból származó: 10-50x  Poliklonális antitesteknél: 100-néhány1000x

Immunhisztokémiai jelölőmódszerek

 Direkt módszer   Indirekt módszer   Enzim-immunkomplex módszer (PAP)  Avidin-biotin enzimkomplex módszer (ABC, S-ABC)   Enzimmel jelölt avidin módszer   EPOS módszer   EnVision módszer

Streptavidin-biotin-peroxidáz komplex

  Bitoin: 244Da, H-vitamin

  Streptavidin: 60kDa, neutrális izoelektromos pont, 4 biotint köt meg

  Inkubációs lépések:

  1 primer antitest

  2 biotinnal jelölt antitest

  3 S-ABC komplex (1:3 arány strepatividin:biotinált-peroxidáz)

  Antitesthez kapcsolt számtalan biotin, peroxidáz-biotinja révén még több kötés

  Biotinnal jelölt anti-egér és anti-nyúl keverék

  Lehet anti-kecske, anti- tengerimalac, anti-patkány

EnVision módszer (DAKO)

 Kétlépéses indirekt jelzőrendszer  ~400kDa dextrán lánc – 100 enzim, több10

antitest   Egy antitest kötődése nagyszámú enzimet köt  Van peroxidáz és alkalikus foszfatáz jelölt formája   Lehet anti-egér+anti-nyúl Ig egyáránt rajta   EPOS – ha a dextrán lánchoz a primer antitest

kapcsolódik

Envision Evision Flex plusz

EnVision Flex+

Jelerősítés: 3 lépéses módszer • EnVision™ FLEX+ Mouse (egér) •  (Kód: K8021) erősítés 4-5x • EnVision™ FLEX+ Rabbit (nyúl) •  (Kód: K8009) erősítés 2-3x.

Biotin mentes! 3-5 x érzékenyebb!

5

Immunaray-ezüst módszer (IGSS)

 Antitesten keresztül kötött kolloidális arany hidrokinon jelenlétében ezüstkiválást katalizál

 A kivált fémezüst tovább katalizál   Fénymikroszkópban fekete ezüst csapadék  Ultrastruktúrális vizsgálatokra is alkamas

Mai detektáló rendszerek:

  EnVision Flex/Flex+-Dako   UltraView-Ventana   Optiview-Ventana   UltraVision LP- Thermo autostainer-   UltraVision One-Thermo   Refine- Leica   ImPress-Leica   Super Sensitive-Biogenex   Super Picture-Invitrogen-3rd Gen IHC Detection Kit   HiDef Detection™ HRP Polymer   Quanto- Thermo autostainer-   Mach 4-Biocare   Optiview ampl

Reakció termék láthatóvá tétele

  Immunperoxidáz   H2O2 szubsztát

  DAB vagy AEC kromogén

  Az elbomló szubsztát oxidálja a kromogént, melyből polimerizált csapadék lesz

  DAB Co,Ni,Cu-val komplexet képez, ami mélyíti a színt

  DAB-fém komplex argilofil – ezüstel erősíthető

  Immun-alkalikus foszfatáz   Naftol-foszfát vagy indol-foszfát szubsztát

  Diazónium, tetrazónium só kromogén

  A szubsztráttól megfosztott naftol csapadékot (azofesték) képez a di/tetrazóniummal.

  Alkoholban vagy xilolban kioldódik!

Reakció termék láthatóvá tétele

  IGSS   Metszetnek kloridion mentesnek kell lennie – alapos desztvizes mosás

  Fizikai előhívó jó fényérzékenységű legyen – ezüst acetát és hidrokinon citrát pufferes oldata (pH3.5)

  Immunfluoreszcens   UV és látható fény gerjeszti őket

  Más hullámhoszú fényt sugároz ki (emisszió)

  Fontos a kisugárzott fényre specifikus színszűrő

  Pl.: AMCA (~350nm;~450nm), FITCH (~480nm;~530nm) TRITC(~550nm;~5765nm), Cy5(~650nm;~670nm)

  Az immunfesték gyorsan halványul (fading) – spec. Metszetfestő anyagok használata

  Konfokális lézer scanning mikroszkópia – új lehetőségek

Kettős jelölések

  Immunenzimatikus módszerek kombinálása  Fénymikroszkóppal vizsgálható  Feltétel: különböző sejteken, vagy különöböző

sturktúrákban  Szekvenciálisan kell elvégezni a reakciókat

  Immunfluoreszcens módszerek kombinációja  Együttes expresszió is azonosítható  Fluoreszcens mikroszkóp, eltérő abszorpciós és emissziós

festékek, megfelelő színszűrők

 Abban az esetben ha kereszt reakció nem várható (nyúl, egér) az reagensek összekeverhetőek.

Kontroll

  Pozitív kontroll   Belső kontrollok

  Külső kontrollok – kimutatható formában biztosan tartalmazó szövet/tenyészet

  A vizsgálandó mintával azonos módon kell kezelni

  Negatív kontroll   Antitest tisztított antigénnel való kimerítése

  Azonos állatból származó indiferens Ig-k

  Normál szérum

6

Immunfestő automaták