Rol de la hiperandrogenizacin en la presentacinantignica y su consecuencia en la funcionalidad

ltea y activacin de linfocitos T. Accin de lametformina como tratamiento. Mecanismos

moleculares involucradosSander, Valeria Anala

2010

Tesis Doctoral

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesUniversidad de Buenos Aires

www.digital.bl.fcen.uba.ar

Contacto: digital@bl.fcen.uba.ar

Este documento forma parte de la coleccin de tesis doctorales de la Biblioteca Central Dr. LuisFederico Leloir. Su utilizacin debe ser acompaada por la cita bibliogrfica con reconocimiento de lafuente.

This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis Federico Leloir.It should be used accompanied by the corresponding citation acknowledging the source.

Fuente / source: Biblioteca Digital de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales - Universidad de Buenos Aires

Facultad de Ciencias Exactas y Naturales .

Univers idad de Buenos Aires

ROL DE LA HIPERANDROGENIZACIN EN LA PRESENTACIN

ANTIGNICA Y SU CONSECUENCIA EN LA FUNCIONALIDAD LTEA Y

ACTIVACIN DE LINFOCITOS T. ACCIN DE LA METFORMINA COMO

TRATAMIENTO. MECANISMOS MOLECULARES INVOLUCRADOS.

Tesis para optar al ttulo de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el rea de

CIENCIAS BIOLGICAS

Valeria Anala Sander

Director: Dra. Alicia Beatriz Motta.

Consejero de Estudios: Dr. Enrique Rodriguez.

Lugar de Trabajo: Laboratorio de Fisio-Patologa Ovrica. Centro de Estudios

Farmacolgicos y Botnicos (CEFyBO-CONICET-UBA).

Buenos Aires, 2010.

El contenido de esta tesis ha sido parcialmente publicado en:

Regulation of functional and regressing stages of corpus luteum development in mice. Role of reactive oxygen species (2008) V. A. Sander, L. Piehl, G. B. Pacorro, E Rubn de Celis and A.B. Motta. Reprod Fertil Dev. 20: 760-769, 2008.

Effect of DHEA and metformin on corpus luteum in mice (2009)

Sander VA, Facorro GB, Piehl L, Rubn de Celis E, Motta AB. Reproduction. 138:571-579.

Rol de la hiperandrogenizacin en la presentacin antignica y su consecuencia en la funcionalidad ltea y activacin de linfocitos T. Accin de la metformina como tratamiento. Mecanismos moleculares involucrados. El Sndrome del Ovario Poliqustico (SOP) es la endocrinopata ms frecuente en las mujeres en edad reproductiva y constituye la causa ms comn de esterilidad femenina. Su caracterstica principal es el hiperandrogenismo, una condicin que ha sido asociada a la insuficiencia ltea y a un incrementado riesgo de prdida de la preez temprana. A pesar de la relevancia del cuerpo lteo (CL) en la reproduccin, prcticamente no existen investigaciones abocadas al estudio de esta glndula en SOP. Por ello, en este trabajo evaluamos los mecanismos por los cuales el exceso de andrgenos modula la funcionalidad e involucin del CL, en un modelo murino de androgenizacin con dehidroepiandrosterona (DHEA). Tambin determinamos la capacidad de metformina de revertir dichas alteraciones. Durante la etapa funcional del CL, el hiperandrogenismo indujo la disminucin de la progesterona srica mediante la modulacin de las enzimas esteroidognicas. Por el contrario, la administracin de DHEA durante la regresin funcional provoc el rescate del CL, incrementando los niveles de progesterona mediante la regulacin de su biosntesis y degradacin, su accin anti-oxidante y la modulacin de las prostaglandinas. El hiperandrogenismo durante la regresin estructural increment la apoptosis y regul la expresin de molculas involucradas en la presentacin antignica en las clulas del CL. La metformina previno muchos de los efectos del hiperandrogenismo en la lutelisis, pero no evit la disfuncionalidad ltea en su etapa funcional. Concluimos que el hiperandrogenismo posee un efecto dual sobre el CL, dependiendo del estado de desarrollo lteo en el cul acte, generando estados patolgicos y disfuncionales, la mayora de los cuales pueden ser evitados por la metformina. Palabras clave: SOP, infertilidad, CL, estrs oxidativo, enzimas esteroidognicas, presentacin antignica, apoptosis, hiperandrogenismo, DHEA, metformina.

Role of hyperandrogenism on antigen presentation and its consequences on luteal functionality and T-lymphocyte activation. Treatment with metformin. Molecular mechanisms involved Polycystic ovary syndrome (PCOS), the most frequent endocrine disease that affects women of childbearing age, constitutes the major cause of female infertility. The main characteristic of PCOS is hyperandrogenism, a condition that has been associated to luteal insuficience and high rates of early pregnancy loss. In spite of the relevance of corpus luteum (CL) in reproduction, research about the influence of PCOS on luteal function is scarce. Therefore, the aim of the present study was to assess the mechanisms by which hyperandrogenization affects the lifespan of CL in a dehydroepiandrosterone (DHEA)-androgenized murine model. We also investigate the action of metformin in preventing ovarian dysfunctions produced by DHEA. During the functional stage of CL, hyperandrogenism induced a decline in serum progesterone levels, mainly due to the modulation of steroidogenic enzymes. On the contrary, treatment with DHEA during functional regression rescued CL from luteolysis, increased progesterone levels by regulating its biosyntheses and degradation, modulating prostaglandins and acting as an anti-oxidant agent. Hyperandrogenization during structural regression increased apoptosis and regulated molecules envolved in antigen presentation. Metformin prevented most of the effects of hyperandrogenization at both stages of luteal regression, but did not prevent luteal dysfunction at functional stage. Therefore, we conclude that hyperandrogenism has a dual effect on CL, depending on the stage of its development, leading to pathological and dysfunctional conditions, most of which metformin is able to restore. Key Words: PCOS, infertility, CL, oxidative stress, steroidogenic enzymes, antigen presentation, apoptosis, hyperandrogenization, DHEA, metformin.

Agradecimientos. A Alicia, por abrirme las puertas de la investigacin cientfica, aguantar mi tozudez y acompaarme en este camino que constituye una parte insustituible de mi vida. A Emi, mi amiga y compaera, que hizo que escribir esta tesis no slo sea parte de mi trabajo, sino una excusa para compartir mis das con ella (y comer muchsimos chips). A Javi, por hacerme feliz cada da y apoyar mis decisiones incondicionalmente. A Guille (quien tambin admira a Eduardo) por haberme permitido ser su amiga y ensearme muchsimas cosas, por ejemplo, donde queda Cachirulo. A mis amigas del alma, Agata y Sil, por aguantarme, por escucharme, por quererme, por ser irremplazables Gracias! A Eve y Moni, por TODA la ayuda y la contencin que me brindaron, todos los mates que compartimos y el afecto que me regalaron. A mis amigos Mari, Mel, Juan, Wal, Javi, el otro Javi, Carol, Emma, Jorge y Leo, por hacer que el mundo sea mejor slo por estar en l. A Pauli, Romi, Kari, Sabri, Meli, Mara, Nora, la otra Romi, Vero y Eva por la compaa, la ayuda, la buena onda y sobre todo, por ser un grupo brbaro, que hace que la competencia entre pares sea una frase vaca de contenido para m. A Carlos, por estar all, siempre dispuesto a prestarme un odo y a ayudarme de manera honesta y desinteresada. Al CEFYBO por permitirme trabajar y darme la oportunidad de conocer gente maravillosa. A Eduardo y David, a quienes admiro y respeto, por mostrarme un Universo maravilloso y desconocido, educarme, alentarme y transmitirme sus valores. Al Peln, al Andr, la bobe y la ta Negra, por ser mi familia y por conocer lo mejor y lo peor de mi, y as y todo, quererme. A mi familia postiza, por ser tan generosos, buena gente y aceptarme como soy. Y sobre todo, a mis paps, a quienes quiero muchsimo y valoro, por ensearme a nunca bajar los brazos y pelear cada da por mis ideales, sin importar lo difcil que resulte.

A mi familia y amigos

NDICE

Introduccin

12

1. Infertilidad 12 2. Reproduccin 18 3. Tratamiento del SOP y restablecimiento de la fertilidad

42

Hiptesis y objetivos

46

Materiales y Mtodos

52

1. Modelos experimentales 52 2. Obtencin de tejidos 55 3. Disgregacin celular 58 4. Determinaciones experimentales 59 5. Anlisis estadstico

80

Resultados

82

Primera Parte Caracterizacin de la fisiologa del cuerpo lteo durante su desarrollo y regresin

82

Segunda Parte Efectos del hiperandrogenismo sobre la funcionalidad y la involucin ltea. Capacidad de la metformina como moduladora de dichos efectos. Seccin A: Efectos del hiperandrogenismo y tratamiento con metformina el CL Funcional.

138 139

Seccin B: Efectos del hiperandrogenismo y tratamiento con metformina en el inicio de la lutelisis (CL Regresin Funcional)

178

Seccin C: Efectos del hiperandrogenismo y tratamiento con metformina en la Regresin Estructural del CL

214

Discusin

241

Conclusiones

275

Referencias Bibliogrficas 285

- 8 -

ABREVIATURAS

17-HSD-I: 17- hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo I. 20-HSD: 20- hidroxiesteroide deshidrogenasa. 20-DHP: 20- dihidroprogesterona. 3-HSD-II: 3- hidroxiesteroide deshidrogenasa 5,4 isomerasa tipo II. A: antro.

AA: cido araquidnico.

ADN: cido desoxirribonucleico.

ADNc: ADN complementario.

AMPc: adenosn monofosfato cclico.

AMPK: protena quinasa activada 5 monofosfato, tambin conocida como PRKA.

ARNm: cido ribonucleico mensajero.

ATP: adenosn trifosfato.

BSA: albmina bovina srica.

BSO: S-n-butyl homocysteina sulfoximina. CAT: catalasa.

CC: citrato de clomifeno.

CG: capa de clulas de la granulosa.

CYP19A1: citocromo P450 aromatasa (protena).

Cyp19a1: citocromo P450 aromatasa (gen).

CL: cuerpo lteo.

cle: clula ltea esteroidognica.

CLF: cuerpo lteo en formacin.

clne: clula ltea no esteroidognica.

CO: cmulo oforo.

COX: ciclooxigenasa.

CPA: clula presentadora de antgeno.

CR: corona radiata.

CT: capa de clulas de la teca.

DHEA: dehidroepiandrosterona.

DMPO: 5,5-dimetil-1-pirrolina N-oxido. DNAsa: endonucleasa que degrada ADN.

dNTPs: deoxi-nucletidos tri-fosfato. DTNB: 5,5-ditio-bis-2-cido nitrobenzoico.

DTT: ditiotreitol.

E, E2: estradiol.

EDTA: cido etilendiaminotetraactico.

ER: receptor de estrgeno.

ESHRE-ASRM: European Society of Human Reproduction and Embryology/American

Society for Reproductive Medicine.

ESR: resonancia de espn electrnico, tambin conocido como EPR.

- 9 -

FA: folculo antral.

FACS: citometra de flujo (del ingls Fluorescense Activated Cell Sorting).

FasL: ligando de la molcula Fas.

FITC: isocianato de fluorescena.

FP: folculo preantral.

FPO: Folculo Pre-Ovulatorio.

FSH: hormona folculo estimulante.

FT: folculo terciario.

GnRH: hormona liberadora de gonadotrofinas.

GPX: glutatin peroxidasa.

GR: glutatin reductasa.

GSH: glutatin reducido.

GSSG: glutatin oxidado.

h: horas.

hCG: gonadotrofina corinica humana.

HEPES: cido N-2-hidroxietilpiperacina-N'-2'-etanesulfnico.

HETE: cido hidroxieicosatetranoico.

HPETE: cido hidroxiperoxieicosatetranoico.

IFN-: interfern . IgG: Inmunoglobulina G.

IHQ: Inmunohistoqumica.

IL: interleuquina.

ip: intraperitoneal.

LH: hormona luteinizante.

L-OO: radical lipdico.

L-OOH: lpidos.

LPS: lipopolisacrido.

LT: linfocito T.

M: mdula.

MDA: malondialdehdo.

MHCI: complejo mayor de histocompatibilidad de tipo I.

MHCII: complejo mayor de histocompatibilidad de tipo II.

MMLV: virus Moloney de leucemia murino.

NFkB: factor nuclear k B.

NIH/NICHD:National Institutes of Health/ National Institute of Child Health and

Human Development.

O: oocito.

ON: xido ntrico.

OSE: epitelio ovrico superficial.

P: progesterona.

P450arom: citocromo P450 aromatasa; tambin mencionada como CYP19A1 (protena) o .

Cyp19a1 (gen).

P450c17: 17-hidroxilasa/17,20- liasa.

- 10 -

P450scc: citocromo P450 de corte de cadena lateral.

PAF: factor activador de plaquetas.

PBS: buffer fosfato salino.

PCR: reaccin en cadena de la polimerasa.

PE: ficoeritrina.

PF: folculo primario.

PG: prostaglandina.

PGI2: prostaciclina.

PKA: proten-kinasa A.

PKC: proten-kinasa C.

PLA2: fosfolipasa A2.

PMSG: gonadotrofina srica de yegua preada.

PRKA: protena quinasa activada 5 monofosfato, tambin conocida como AMPK.

RIA: Radioinmunoanlisis.

ROS: especies reactivas del oxgeno.

RT: transcripcin reversa.

s.c.: subcutnea.

SDS: dodecilsulfato de sodio SDS-PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sdico.

SF: folculo secundario.

SH: grupo sulfhidrilo.

Sirt1: gen regulador de silenciamiento T1. SOD: superxido dismutasa.

SOP: Sndrome del ovario poliqustico.

Sp: protena de especificidad.

StAR: protena reguladora de la esteroidognesis aguda.

TA: temperatura ambiente.

TBA: cido tiobarbitrico.

TCA: cido tricloro actico.

TCR: receptor de clula T.

Th: T helper.

TNB: 5-tio-2-nitrobenzoato.

TNF-: factor de necrosis tumoral . TX: tromboxano.

TXNIP: gen de la protena interactuante con tioredoxina. UI: Unidades Interenacionales.

V: vaso.

VEGF: factor de crecimiento del endotelio vascular.

ZP: zona pelcida.

Introduccin

Introduccin

- 12 -

1. Infertilidad

Ay, qu prado de pena! Ay, qu puerta cerrada a la hermosura!,

que pido un hijo que sufrir, y el aire me ofrece dalias de dormida luna.

Yerma, Federico Garca Lorca.

Desde pocas prehistricas, y a lo largo de las civilizaciones que poblaron y

pueblan el mundo, el embarazo ha sido un smbolo de prosperidad y alegra. La

infertilidad, por el contrario, se halla asociada a sentimientos de fracaso y exclusin

(Ombelet y col. 2008), siendo considerada actualmente por la Organizacin

Mundial de la Salud, un tema de inters para la Salud Pblica. Aunque en nuestro

pas no existen datos oficiales acerca del alcance de este trastorno, se estima que de

manera semejante a lo que pasa en el mundo, alrededor del 9% de las parejas en

edad reproductiva es infrtil (Boivin y col. 2007).

Existen numerosos factores, tanto femeninos como masculinos, que pueden

producir infertilidad, aunque las tres causas ms comunes son: la disfuncin

espermtica, la disfuncin ovulatoria y el dao de las trompas de Falopio (Cahill y

Wardle 2002). La patologa ms importante asociada a la esterilidad femenina la

constituye el Sndrome del Ovario Poliqustico (SOP) (Sastre y col. 2009), afectando

principalmente la funcionalidad ovrica.

1.1. El sndrome del ovario poliqustico.

El Sndrome de Ovario Poliqustico es la endocrinopata ms frecuente entre

las mujeres en edad reproductiva, representando al 4 -18% de esta poblacin segn

el criterio utilizado para su diagnstico (revisado en Teede y col. 2010). Al analizar

la poblacin de mujeres subfrtiles, estos porcentajes aumentan abruptamente, ya

que el 50% de las mujeres con abortos recurrentes y el 87% de las que poseen ciclos

menstruales irregulares padecen SOP (Abbot y col. 2002). Los sntomas ms

comunes del SOP son hiperandrogenismo clnico o bioqumico, oligomenorrea o

amenorrea y anovulacin (Franks 1995, Asuncin y col. 2000).

Introduccin

- 13 -

1.2. Criterio diagnstico.

Dada la alta heterogeneidad de esta patologa, result necesario establecer

los criterios que se utilizaran para su diagnstico. Con este fin, se realizaron

distintos consensos mundiales de especialistas, y actualmente son las conclusiones

de dos de ellos las ms empleadas para definir este sndrome. El criterio establecido

por el consenso del NIH/NICHD1 de 1990 afirma que se diagnosticar SOP ante la

presencia de anovulacin crnica e hiperandrogenismo, mientras que el consenso

de Rotterdam auspiciado por ESHRE-ASRM2 en el 2003 fue ms amplio,

acordndose el diagnstico de SOP cuando al menos dos de las siguientes

condiciones estn presentes: i) oligo o anovulacin, ii) hiperandrogenismo clnico o

bioqumico o iii) ovarios poliqusticos. En ambos casos se defina esta patologa

luego de la exclusin de otras condiciones mdicas que causen ciclos menstruales

irregulares y exceso de andrgenos como ser hiperprolactinemia, sndrome de

Cushing, acromegalia, neoplastia secretora de andrgenos, o hiperplasia adrenal

congnita. (Carmina 2004, Azziz y col. 2006). 1

1.3. Etiologa.

El SOP puede ser visto como un desorden heterogneo asociado a diferentes

grados de anormalidades metablicas y reproductivas, determinado por la

interaccin de mltiples factores genticos y ambientales. Son numerosas las

hiptesis acerca de su etiologa, aunque por la diversidad de fenotipos de SOP

existentes resulta muy difcil poder establecerla con certeza. Entre los factores

genticos que han sido relacionados con el origen de esta patologa encontramos:

genes involucrados en la esteroidognesis ovrica y adrenal, los efectos de las

hormonas esteroideas, la secrecin de gonadotrofinas, la secrecin y accin de la

insulina, la homeostasis y la inflamacin crnica. La alta variabilidad en los

fenotipos de SOP sugiere que adems de genes, otros factores contribuiran al

1 NIH/NICHD:National Institutes of Health/ National Institute of Child Health and Human Development. 2 ESHRE-ASRM: European Society of Human Reproduction and Embryology/American Society for Reproductive Medicine.

Introduccin

- 14 -

desarrollo de la enfermedad. Entre ellos pueden incluirse el consumo de grasas y

carbohidratos, estrs peripuberal y sobre-exposicin a hormonas. Estos factores

ambientales podran actuar en distintas etapas de la vida de la mujer, promoviendo

el desarrollo de SOP (revisado en Dasgupta y Reddy 2008).

Una de las teoras ms aceptadas acerca del origen de esta enfermedad

seala que el SOP podra tener la siguiente secuencia de origen: durante la

gestacin, la gonadotrofina corinica (hCG) placentaria, la hormona luteinizante

(LH) de la pituitaria fetal y los genes que regulan la foliculognesis y la

esteroidognesis, individualmente o en conjunto, provocaran hiperandrogenismo,

conduciendo as a una exposicin a andrgenos en exceso durante la etapa prenatal

y potencialmente prepuberal de la hembra en desarrollo. Luego, en la etapa

postpuberal, la exposicin temprana a un exceso de andrgenos produce: (i)

inhibicin de la retroalimentacin negativa para LH provocando su anormal

acumulacin y (ii) aumento de la adiposidad abdominal (central) que genera

resistencia a insulina (incrementada por genes que regulan la diferenciacin de

adipocitos, secrecin y accin de insulina). La hiperinsulinemia resultante acta de

forma sinrgica con la hipersecrecin de LH, aumentando la esteroidognesis, e

induciendo el arresto prematuro de folculos en desarrollo y la anovulacin (Abbott

y col. 2002).

1.4. Desrdenes asociados.

El SOP se halla asociado a severos desrdenes que incluyen: i) trastornos

reproductivos: hiperandrogenismo (Abbott y col. 2002, Codner y col. 2007),

disfuncionalidad ovrica (Franks y col. 2008), fallas de la fase ltea (Joseph-Horne y

col. 2002, Lunn y col. 2002), complicaciones en el embarazo e infertilidad (Rai y col.

2000, Glueck y col. 2002); ii) trastornos metablicos: insulino resistencia (Dhinsda y

col. 2004), intolerancia a la glucosa (Rice y col. 2005), diabetes mellitus tipo 2

(Norman y col. 2001), hirsutismo (Glintborg y Andersen 2010), sndrome

metablico, riesgo cardiovascular aumentado e inflamacin crnica (Moran y Teede

2009) y iii) trastornos psicolgicos: ansiedad incrementada, depresin y peor

Introduccin

- 15 -

calidad de vida (Himelein y Thatcher 2006, Deeks y col. 2010). Los fenotipos que se

presentan entre las mujeres con SOP varan ampliamente dependiendo de sus

genotipos y los factores ambientales a los que estn expuestas, e incluso entre las

diferentes etapas de sus vida.

1.5. Hiperandrogenismo.

El SOP es una patologa que involucra numerosos desrdenes y que no

puede ser diagnosticada mediante un nico test. Sin embargo, el

hiperandrogenismo es el defecto central en esta afeccin, a tal punto que durante

una de las ltimas reuniones de expertos en el tema se acord que el SOP, ante

todo, es un desorden de hiperandrogenismo (Azziz y col. 2006). Esta afirmacin se

ve sostenida por el hecho de que el 75% de la poblacin diagnosticada con SOP es

hiperandrognica (Huang y col. 2010). Del mismo modo, en un estudio realizado en

mujeres hiperandrognicas se report que el 80% de ellas sufra SOP (Azziz y col.

2004), demostrndose as la amplia relacin existente entre ambas alteraciones.

El hiperandrogenismo promueve el desarrollo de afecciones como ser el

hirsutismo, la alopecia andrognica, y en los casos ms severos, virilizacin y

masculinizacin (Azziz y col. 2004). Por otro lado, esta patologa ha sido

relacionada con hiperinsulinemia (Hagymsi y col. 2009, Rieder y col. 2008),

sndrome metablico, incrementada secrecin de citoquinas (Escobar-Morreale y

col. 2001) e inflamacin (Alemzadeh y col. 2010). En lo que concierne a los

desrdenes reproductivos, el exceso de andrgenos est involucrado en la

alteracin de los ciclos reproductivos, la oligo-anovulacin, defectos de la fase

ltea, prdida de la preez e infertilidad (Lee y col. 1991, 1998, Ginsburg 1992,

Henmi y col. 2001, Glueck y col. 2002, Lunn y col. 2002, Cocksedge y col. 2008).

1.6. Modelos de hiperandrogenismo y SOP.

El SOP, tal como se ha mencionado previamente, es una afeccin muy

heterognea, por lo que durante las ltimas dcadas se han utilizado numerosos

Introduccin

- 16 -

modelos animales que permitieron investigar diferentes aspectos de su etiologa y

fisiopatologa. Dado que el hiperandrogenismo es su caracterstica central, se

investigaron qu esteroides se hallaban incrementados en las mujeres con SOP,

encontrndose que la dehidroepiandrosterona (DHEA) era uno de los andrgenos

circulantes ms abundantes en estas pacientes (Mahesh y Greenblatt 1962, Coney

1984). En la figura 1 se esquematiza la cascada esteroidea, y por ende, el camino

biosinttico de DHEA. Este descubrimiento permiti el desarrollo de un modelo

murino de SOP mediante la administracin de DHEA, que reprodujo muchas de

sus alteraciones asociadas (Roy y col. 1962) como por ejemplo la formacin de

quistes, el incremento en los niveles de DHEA, testosterona y LH (Lee y col. 1991).

Subsecuentes estudios avalaron este modelo (Lee y col. 1991, Anderson y col. 1992,

Lee y col 1998, Henmi y col. 2001) y lo confirmaron como ptimo para el estudio de

la patologa qustica.

En estudios previos realizados en nuestro laboratorio, se encontr que la

administracin de DHEA en ratones prepberes hembras de la cepa BALB/c

induce la formacin de quistes de ovario, aumenta la produccin de esteroides e

insulina, modifica el balance oxidante-antioxidante, el sistema oxido ntrico

(ON)/ON sintetasa, la secrecin ovrica de prostaglandinas, el contenido srico de

TNF- y regula la expresin fenotpica de linfocitos T, tanto en el ovario como en los ganglios retroperitoneales (Luchetti y col. 2004, Elia y col. 2006, Sander y col.

2006). Asimismo, con el objetivo de investigar los efectos del exceso de andrgenos

durante el embarazo, se desarroll un modelo de hiperandrogenizacin con DHEA

durante la preez temprana en ratones de esta misma cepa, evaluando sus efectos

en la etapa peri y post-implantatoria. La administracin de DHEA promueve una

disminucin significativa de los niveles circulantes de progesterona en ambas

etapas, impide la implantacin embrionaria en la primera y aumenta el ndice de

reabsorcin embrionaria en la segunda (Sander y col. 2005). Los mecanismos por

los cuales induce estos efectos estaran asociados a un aumento del estrs oxidativo,

hiperinsulinemia, disminucin de la NO sintetasa, alteracin del perfil de

citoquinas Th1/Th2 y modulacin de las prostaglandinas, entre otros (Solano y col.

2006, Luchetti y col. 2008). Estos resultados sugieren que el exceso de andrgenos

Introduccin

- 17 -

generara numerosas y variadas alteraciones en la funcionalidad del cuerpo lteo

(CL), que no slo podran afectar el normal desarrollo de la preez, sino que

tambin estaran implicadas en la prdida de la ciclicidad ovrica y

consecuentemente podran ser el origen de la irregularidad menstrual y ovulatoria

en las mujeres con SOP.

A pesar de la relevancia de esta hiptesis en lo que respecta a la

fisiopatologa del hiperandrogenismo, son muy pocas las investigaciones llevadas a

cabo acerca de la funcionalidad ltea en SOP.

Figura 1 - Va de la esteroidognesis en el ovario, marcando la posicin de la dehidroepiandrosterona .Los cuatro anillos de las molculas de colesterol se identifican con las 4 primeras letras del alfabeto y los carbonos se enumeran en la secuencia que se muestra en la representacin. Clave de la figura, 3-HSD-II: 3- hidroxiesteroide deshidrogenasa 5,4 isomerasa tipo II, 17-HSD-I: 17- hidroxiesteroide deshidrogenasa tipo I, P450arom: citocromo P450 aromatasa, P450c17: 17-hidroxilasa/17,20- liasa, P450scc: citocromo P450 de corte de cadena lateral, StAR: protena reguladora de la esteoidognesis aguda. Adaptado de Kronemberg y col. (2009).

Introduccin

- 18 -

2. Reproduccin.

The potential to reproduce is a matter of timing

Murdoch y Van Kirk (1998).

El avance de la investigacin cientfica y tecnolgica durante las ltimas

dcadas ha generado un incremento del conocimiento sin precedentes en el campo

de la reproduccin. El desarrollo de tcnicas de reproduccin asistida ha sido, sin

lugar a dudas, uno de los desencadenantes ms importantes de este crecimiento.

Sin embargo, an nos encontramos muy lejos de comprender cabalmente los

procesos que regulan la reproduccin. En el caso de las mujeres, las alteraciones en

los mecanismos que modulan la funcionalidad ovrica, la implantacin

embrionaria o el embarazo pueden desencadenar la infertilidad. A continuacin,

trataremos de explicar someramente algunos de los procesos y factores

involucrados en la funcin reproductora femenina, y algunas de las modificaciones

que pueden sufrir en presencia de hiperandrogenismo y SOP.

2.1. Ciclo reproductivo femenino.

Los rganos que conforman el aparato reproductor femenino son comunes a

todos los mamferos, a pesar de que existen algunas diferencias entre taxones. En

ratas y ratones, el sistema reproductor comprende los ovarios, los oviductos, el

tero bicorne y la vagina (figura 2).

Los roedores, al igual que la mayora de los mamferos placentarios, poseen

ciclos reproductivos, caracterizados por la presencia de un ciclo estral regular, en el

cual tienen lugar cambios fisiolgicos, histolgicos y citolgicos en el tracto

reproductivo, iniciados y regulados por el eje hipotlamo-hiposario-gonadal.

En la rata y el ratn, el ciclo estral comprende cuatro etapas: proestro, estro,

metaestro y diestro, y su duracin es de aproximadamente cuatro o cinco das.

Dado que estos animales ciclan continuamente a lo largo del ao, el diestro es

seguido inmediatamente por el proestro del siguiente ciclo.

Introduccin

- 19 -

El estmulo del apareamiento, en algunos animales domsticos y en los

roedores, promueve la secrecin de gonadotrofinas. En consecuencia, los cuerpos

lteos comienzan a producir progesterona y se inhibe la funcin del eje hipotlamo-

hipofisario-gonadal, retrasando el inicio del prximo ciclo. En el caso de que no

exista fertilizacin, los cuerpos lteos (CLs) continan funcionales en un proceso

denominado pseudopreez, que en la rata puede prolongarse alrededor de 10 das.

Este ltimo tambin puede ser inducido farmacolgicamente por la aplicacin de

gonadotrofinas exgenas (Komar y Curry 2002).

Figura 2- Sistema urogenital femenino en el ratn. Fuente: The Laboratory Mouse, Cook M.

2.2. El ovario.

El ovario (lat. ovum, huevo; gr. ooforon) o gnada femenina posee dos

funciones principales; la primera de ellas es la produccin de clulas germinales

(oocitos) que permite la continuidad de la especie, y la segunda radica en la

generacin de molculas bioactivas, principalmente esteroides (estrgenos y

progestgenos) y factores de crecimiento, que resultan cruciales para la

funcionalidad ovrica, la regulacin del eje hipotalamo-hipofisario-gonadal y el

desarrollo de caractersticas sexuales secundarias (Edson y col. 2009).

En las ratas, la superficie del ovario se encuentra recubierta por una capa

celular simple, el epitelio ovrico superficial (OSE) (figura 3A). Este epitelio es

Introduccin

- 20 -

continuo con el mesovario, el cual en los roedores encierra completamente al ovario

y al oviducto, dentro de un compartimento simple, la bursa ovrica. El estroma

ovrico forma el cuerpo del ovario y est compuesto por distintos tipos de clulas,

generalmente con forma de huso. El estroma ubicado inmediatamente bajo el OSE es

denso y fibroso, y forma una zona diferenciada compacta denominada tnica

albuginea (figura 3A). El estroma que se halla ubicado bajo la tnica albuginea se

divide en dos secciones que no siempre pueden ser bien diferenciadas: la corteza

perifrica y la mdula central (figura 3B). En las ratas sexualmente maduras, la

corteza contiene numerosos folculos en distintos estadios de desarrollo y cuerpos

lteos (CLs). La mdula, en cambio, ubicada en la zona central del ovario se

encuentra muy inervada y posee una importante vasculatura.

Figura 3- Morfologa del ovario. A) Seccin de ovario de rata, donde se muestra el epitelio ovrico superficial y parte del estroma, tincin con hematoxilina-eosina, A: 400X. B) Seccin de ovario de ratn donde se diferencian la mdula, la corteza, folculos y cuerpos lteos, tincin con hematoxilina- eosina, A: 40X. Clave de la figura: OSE: epitelio ovrico superficial, TA: tnica albuginea, C: corteza, M: mdula, F: folculo, CL: cuerpo lteo. 2.3. Desarrollo folicular y ovulacin. Alteraciones inducidas por SOP.

La formacin de gametas femeninas (oognesis) es un proceso que ocurre en

el ovario. En la mayora de las hembras de mamferos se inicia en la vida

intrauterina, quedando determinado en esta etapa el nmero definitivo de clulas

germinales. En el humano, los folculos comienzan a formarse en el cuarto mes de

vida fetal y si bien algunos de ellos inician su crecimiento de inmediato, la mayora

A B

Introduccin

- 21 -

permanecer en un estado de reposo hasta el momento en que degenere, o sea

reclutado y comience a crecer. Esta poblacin es denominada poblacin de

folculos arrestados. Se definieron tres tipos de folculos arrestados: primordiales

(oocito rodeado por una capa de clulas de la granulosa aplanadas), intermedios

(oocito rodeado por una capa mixta de clulas de la granulosa aplanadas y cbicas)

y primarios pequeos (oocito rodeado por una capa de clulas cbicas). En el ovario

adulto, la foliculognesis comienza cuando los folculos dejan esta poblacin e

ingresan en la fase de crecimiento (reclutamiento). De all en adelante, el folculo

atraviesa un proceso de desarrollo que incluye la proliferacin y diferenciacin de

las clulas de la granulosa y el incremento en tamao del oocito. Durante el

crecimiento, se forma la zona pelcida alrededor del oocito y progresivamente los

folculos se convierten en folculos secundarios. En esta etapa del desarrollo las

clulas del estroma ovrico que rodean la lmina basal se alinean formando la capa

de clulas de la teca (Gougeon 1996).

Los dos primeros estadios de desarrollo, folculos primarios y secundarios

(figura 4A), son de crecimiento autnomo, es decir, poco influenciados por las

hormonas plasmticas. Esto sucede en primer trmino porque se encuentran en una

zona poco vascularizada y en segundo trmino por la baja expresin de receptores

para dichas hormonas. La continuidad de su desarrollo est relacionada con la

migracin del folculo a una zona vascularizada, la diferenciacin de dos zonas en

la capa de la teca-la teca interna y la externa- y la aparicin de receptores para la

hormona folculo estimulante (FSH), el estradiol (E2) y la testosterona en las clulas

de la granulosa. As, stas ltimas expresan receptores para FSH y las clulas de la

teca, receptores para la hormona luteinizante (LH).

El folculo terciario o antral (figura 4B) contiene varias capas de clulas de la

granulosa, debido a la accin proliferativa de FSH, y ambas capas de clulas de la

teca. Finalmente se forma el antro, una cavidad que posee fluido folicular. El oocito

queda ubicado de manera excntrica, rodeado por un conjunto de clulas de la

granulosa, el cmulo oforo, que protruye dentro del antro. Las clulas de la

granulosa que rodean inmediatamente al oocito forman una estructura denominada

corona radiata.

Introduccin

- 22 -

Como resultado del efecto estimulatorio de las gonadotrofinas que llegan

por los capilares al folculo en desarrollo, un pequeo nmero de folculos

terciarios ingresan en el estadio preovulatorio, aumentan enormemente de tamao

y se transforman en folculos de De Graff (figura 4C).

Figura 4- Etapas del desarrollo folicular en la rata. A) Folculos primarios y secundarios, tincin con hematoxilina eosina, A: 200X. B) Folculo terciario, tincin con hematoxilina-eosina, A: 200X. C) Folculo de Graaf, tincin con hematoxilina-eosina, A: 400X. Clave de la figura: PF: folculo primario, SF: folculo secundario, FT: folculo terciario, FA: antro folicular, CO: cmulo oforo, CR: corona radiata, O: oocito, ZP: zona pelcida, CG: capa de clulas de la granulosa.

Durante la etapa de maduracin folicular y bajo la influencia de LH y FSH,

los folculos producen y liberan estrgenos, predominantemente estradiol. Esta

sntesis ocurre gracias a la accin coordinada de las clulas de la teca y de la

granulosa. En este proceso coordinado, los andrgenos sintetizados por las clulas

tecales, son aromatizados a estrgenos en las clulas de la granulosa. Mientras que

la LH estimula a las clulas tecales para producir andrgenos, la FSH aumenta los

niveles de aromatasa promoviendo su conversin a estradiol (Niswender y col.

2000). Los niveles circulantes de estradiol aumentan progresivamente,

acompaando el crecimiento de los folculos, llegando hasta un nivel crtico que

activa el centro cclico hipotalmico. Esto resulta en la liberacin de un pulso de la

hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), seguido de uno de LH, el cual

desencadena la ovulacin y la posterior formacin del cuerpo lteo.

La anovulacin o la oligo-ovulacin es un sntoma muy frecuente entre las

mujeres con SOP y la oligomenorrea o amenorrea se presenta muy tempranamente

en su adolescencia (Homburg 2009). Aunque son mltiples los factores que

intervienen en la disfuncionalidad ovulatoria en SOP, existe consenso entre los

A B C

Introduccin

- 23 -

investigadores al sealar al hiperandrogenismo como la causa subyacente de dichas

irregularidades.

Los efectos del hiperandrogenismo sobre la foliculognesis son complejos e

involucran la modulacin de factores tanto ovricos como sistmicos que han sido

ampliamente revisados en los trabajos de Jonard y Dewailly (2004), Franks y col.

(2008), Holmburg (2009). Brevemente, se ha demostrado que el hiperandrogenismo

acelera la progresin de folculos primordiales y primarios a preantrales y antrales,

a la vez que reduce el ndice de atresia en los folculos tempranos (Hillier y col.

1997, Vendola y col. 1998, Weil y col. 1999). En los casos en los cuales las mujeres

con SOP no logran ovular, se cree que en el comienzo de la seleccin folicular,

poseen un mayor nmero de folculos de alta sensibilidad a FSH o maduros, por

lo que se produce el arresto folicular y la anovulacin. Esto sucede debido a que

adquirieron muy rpidamente la capacidad de secretar estradiol, suprimiendo la

maduracin de los folculos vecinos (arresto folicular) e impidiendo la seleccin del

folculo dominante. Sin un folculo dominante, capaz de liberar al oocito en

respuesta al incremento de LH, no se produce la ovulacin ni el normal proceso de

retroalimentacin negativa necesario para inhibir la secrecin de sta

gonadotrofina. Bajo el estmulo trfico de las gonadotrofinas, los folculos

arrestados continan secretando hormonas, que se acumulan en el antro y devienen

en la formacin de quistes.

Sin embargo, no todas las mujeres con SOP presentan ciclos anovulatorios.

En estos casos, se cree que al inicio del ciclo la mayor parte de los folculos son de

baja sensibilidad, de manera que aquel que logre superar el umbral de secrecin de

estradiol ms velozmente, ser seleccionado para la ovulacin suprimiendo al resto

de los folculos que regresarn por atresia. El hecho de que existan distintos

fenotipos ovulatorios en SOP, permite plantear la hiptesis de que en el ovario

poliqustico coexisten poblaciones foliculares de alta y baja sensibilidad a

gonadotrofinas, que podran estar moduladas por factores extra e intraovricos, y

cuyo balance determinar periodos alternados de arresto folicular y ovulacin

(Franks y col. 2008).

Introduccin

- 24 -

2.4. El cuerpo lteo: glndula indispensable para la ciclicidad ovrica y la preez.

El CL es una glndula endocrina nica, de naturaleza transitoria, que se

forma a partir de las clulas remantes de la teca y de la granulosa folicular luego de

la ovulacin, y del cual dependen la ciclicidad ovrica y el mantenimiento de la

preez temprana. Estas funciones las desempea mediante la secrecin de su

producto principal, la progesterona.

Muchas de las mujeres que padecen SOP logran ovular espontneamente, sin

embargo, la funcionalidad de sus CLs estara alterada. Esta hiptesis surge de datos

previos que indican que las pacientes con SOP poseen ciclos ovricos ms largos

(Joseph-Horne y col. 2002, Ma y col. 2010), una deficiente secrecin de progesterona

durante el inicio de la fase ltea (Joseph-Horne y col. 2002, Meenakumari y col.

2004), y un mayor nmero de cuerpos lteos en regresin en sus ovarios (Lunn y

col. 2002). Por otro lado, la sntesis deficiente de progesterona durante la fase ltea

podra ser la causa de que la tasa de embarazos en mujeres con SOP slo alcance al

40-50% (an en los casos en los cuales se induce la ovulacin) y del incremento en

la tasa de abortos espontneos durante el primer trimestre de embarazo (Homburg

y col. 1988, Jakubowicz y col. 2002, Glueck y col. 2002). A pesar de la ineludible

relevancia de la funcionalidad ltea para la fertilidad, prcticamente no hay

investigaciones abocadas al estudio de esta glndula en el SOP, por lo tanto slo

expondremos los procesos fisiolgicos involucrados en su modulacin.

2.4.1. Formacin del cuerpo lteo.

La formacin del CL a partir de la reprogramacin de las clulas foliculares

remantes del folculo ovulado, es llevada a cabo mediante un proceso denominado

luteinizacin. Este proceso comienza con la activacin de los receptores de LH (LHr)

en las clulas foliculares debido al pico preovulatorio de LH y desencadena

cambios irreversibles, estructurales y genmicos que permitirn la diferenciacin

final de estas clulas en clulas lteas secretoras de progesterona.

Introduccin

- 25 -

Antes de la ovulacin, el principal producto de secrecin del ovario es el

estradiol, hormona que posee una importante funcin mitognica y que promueve

la divisin de las clulas de la granulosa (Richards y col. 1987). El estradiol es

sintetizado de manera coordinada por las clulas foliculares. Mientras que las

clulas de la teca sintetizan andrgenos, las de la granulosa son capaces de

aromatizarlos y producir estrgenos. Adems, las clulas de la granulosa poseen las

enzimas necesarias para sintetizar progesterona. La compartimentalizacin de la

produccin esteroidea en el folculo ovrico se halla esquematizada en la figura 5,

segn Nussey y Whitehead (2001).

Luego de la ruptura del folculo y la expulsin del oocito, las paredes del

folculo colapsan, ocupando el espacio que delimitaba el antro y el cuerpo lteo en

formacin es invadido por numerosos capilares. La luteinizacin de las clulas de la

teca y de la granulosa modifica la cascada esteroidognica y la progesterona pasar

a ser el esteroide ms importante sintetizado por ambos tipos celulares. Sin

embargo, en un gran nmero de especies, entre las que se incluyen al hombre y a la

rata, el CL mantiene la capacidad de producir estradiol (Niswender y col. 2000).

Figura 5-Principal ruta esteroidognica en el folculo ovrico. La androstenediona, formada en las clulas de la teca bajo la accin estimuladora de la LH, difunde a travs de la membrana basal hacia las clulas de la granulosa, donde bajo la accin de la FSH, es convertida a estradiol. En los folculos en desarrollo los receptores de LH se expresan slo en las clulas de la teca, mientras que los de FSH slo lo hacen en las clulas de la granulosa. El folculo preovulatorio desarrolla receptores de LH en las clulas de la granulosa de manera previa al pico de LH. Las clulas de la teca adquieren la capacidad de sintetizar estradiol (lneas punteadas), la cual persistir cuando estas clulas se incorporen al CL (Figura adaptada de Nussey y Whitehead, 2001).

Introduccin

- 26 -

Est ampliamente aceptado que las clulas lteas derivadas de las clulas de

la granulosa y de la teca dan origen a dos tipos celulares con caractersticas

fisiolgicas y morfolgicas diferentes: las clulas lteas grandes (especies no-

primates) o clulas de la granulosa lutenicas (especies primates) y las clulas lteas

pequeas (especies no-primates) o clulas de la teca lutenicas (especies primates),

respectivamente; sin embargo, si bien esta observacin est documentada en

animales domsticos, no hay bibliografa que avale esta hiptesis en roedores

(Stocco y col. 2007). En la mayora de las especies, ambos tipos celulares se mezclan

durante la formacin del CL. Una clara excepcin a esto la constituyen los primates,

en los cuales las dos poblaciones celulares se mantienen separadas, conservando la

organizacin folicular.

Una de las caractersticas ms asombrosas del CL radica en la amplia

heterogeneidad de las clulas que lo componen, ya que adems de las clulas lteas

grandes y pequeas, encontramos en esta glndula fibroblastos, clulas

endoteliales, pericitos y diferentes tipos de clulas del sistema inmune como los

macrfagos, neutrfilos y linfocitos T.

2.4.2. Funcionalidad del cuerpo lteo y acciones fisiolgicas de la progesterona.

La funcin principal del CL es el mantenimiento de la preez. En la mayora

de los mamferos, como por ejemplo la rata, el CL permanece funcional durante

toda la preez mientras que en los primates, el CL constituye el sostn de la preez

temprana, ya que es reemplazado por la placenta en el segundo trimestre de

gestacin. Su principal producto de secrecin es la progesterona.

La progesterona es un modulador esencial de la funcin reproductiva

femenina en el tero, el ovario, la glndula mamaria y el cerebro. Tambin

desempea un papel importante en tejidos no reproductivos, como el sistema

cardiovascular, el sistema seo y el sistema nervioso central. Sus principales

acciones se detallan en la tabla 1. Los efectos de la progesterona son mediados por

el receptor nuclear de progesterona, el cual interacciona con co-reguladores

Introduccin

- 27 -

transcripcionales formando agregados nucleares y regulando la expresin de genes

(Scarpin y col. 2009).

Aunque son numerosos los factores que modulan la funcionalidad del CL,

las protenas y enzimas involucradas en la cascada esteroidognica han sido

reconocidas como los principales puntos de su regulacin. Es as que la protena

reguladora de la esteroidognesis aguda (StAR), encargada de transportar el

colesterol hacia la membrana interna de la mitocondria, ha sido propuesta como el

punto clave de la regulacin de la biosntesis de progesterona (Juengel y col. 1995,

Pescador y col. 1996, Fiedler y col. 1999) y su expresin ha sido correlacionada con

la etapa funcional del CL (Juengel y col. 1995, Townson y col. 1996). Una vez en la

membrana interna de la mitocondria, el colesterol es modificado por la accin del

complejo del citocromo P450 de corte de cadena lateral (P450SCC), obtenindose

pregnenolona. Esta, a su vez, es transformada en progesterona por la accin de la

3-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo II (3-HSD II), enzima cuya expresin se incrementa dramticamente durante la formacin del CL y que se mantiene

constitutivamente expresada durante la preez (Kaynard y col. 1992).

El nivel de progesterona secretado por el CL en los roedores no depende slo

de su sntesis por parte de las clulas lteas esteroidognicas, sino tambin de la

expresin y actividad de la enzima 20- hidroxiesteroide deshidrogenasa (20- HSD), la cual se encarga de catabolizar progesterona en un derivado inactivo, la

20- dehidroprogesterona (20- DHP). La expresin de la 20- HSD controla el progreso de la preez, y desencadena la disminucin en la secrecin de

progesterona (Stocco y col. 2000). Ms an, ratones deficientes en 20- HSD poseen niveles de progesterona altos y sostenidos, y en ellos, el parto se retrasa por varios

das (Piekorz et al. 2005).

En el caso de los roedores, el estradiol (E2) tambin desempea un papel

importante en la regulacin de la esteroidognesis durante la preez (Gibori y col.

1977), estimulando la sntesis de colesterol, su captura desde la circulacin y la

movilizacin intracelular en las clulas lteas (Azhar y col. 1989). Adems, el E2

parece estar involucrado directamente en la estimulacin de la secrecin de

Introduccin

- 28 -

progesterona y la hipertrofia de las clulas lteas durante la preez (revisado en

Niswender y col. 2000).

Tejido Funcin

Utero/ovarios Liberacin de oocitos. Facilitacin de la implantacin. Mantenimiento de la preez: quiescencia uterina. Estimulacin de la regeneracin estromal: fase ltea del ciclo.

Glndulas mamarias Desarrollo de los lbulos alveolares. Supresin de la sntesis de las protenas de la leche durante la preez.

Cerebro Mediacin de la respuesta sexual.

Sistema seo Regulacin de la masa sea: prevencin de la prdida de masa.

Tabla 1-Funciones fisiolgicas principales de la progesterona (Adaptada de Graham y Clarke, 1997). 2.4.3. Regresin del CL o lutelisis.

En la mayora de los mamferos que poseen ciclos reproductivos, cuando no

se da la concepcin luego de la ovulacin, el CL que se haba desarrollado en el

ovario debe ser eliminado para permitir el comienzo de un nuevo ciclo. Es as que

la lutelisis o regresin del CL es un proceso normal y necesario en el ciclo

reproductivo de los mamferos y se caracteriza por dos eventos relacionados: un

descenso en los niveles sricos de progesterona, comnmente denominado lutelisis

funcional, seguido por cambios morfolgicos y remodelacin del tejido del CL,

proceso referido como lutelisis estructural (McCracken y col. 1999). Los mecanismos

que desencadenan y controlan la regresin del CL han sido ampliamente

estudiados, sin embargo an no se conocen con certeza. Algunos de los mediadores

ms importes propuestos son la prolactina (Rothchild 1981), las prostaglandinas

(Knickerbocker y col. 1988), las especies reactivas del oxgeno (Motta y col. 2001,

Minegishi y col. 2002), las enzimas antioxidantes (Sugino y col. 2004), las clulas del

sistema inmune y sus productos de secrecin, las citoquinas (Davis y Rueda 2002,

Introduccin

- 29 -

Cannon y col. 2007, Bukovsky y Caudle 2008) y la apoptosis celular (Carambula y

col. 2003). Resulta importante destacar que no todos los factores involucrados en la

prdida de la capacidad esteroidognica son capaces de regular directamente la

apoptosis, ni viceversa; puede sugerirse entonces que la lutelisis funcional y

estructural son eventos modulados de manera diferenciada.

2.5. Factores involucrados en la funcionalidad ltea.

El gran nmero de factores involucrados en la modulacin del CL, as como

la amplia diversidad de rutas de sealizacin molecular que desencadenan, nos

impiden realizar una revisin completa de todos ellos. Sin embargo, trataremos de

dar cuenta de algunos de los ms importantes en los prrafos que siguen.

2.5.1. Las prostaglandinas.

Las prostaglandinas son sustancias derivadas de fosfolpidos de membrana

que regulan diversos procesos fisiolgicos como la preez (Solano y col. 2006,

Luchetti y col. 2008), la ovulacin (Husein y Kridly 2003) la lutelisis (Motta y col.

1999, 2001), la inflamacin (Kuroda y col. 2003), la secrecin gstrica (Heim y col.

1990) y el flujo sanguneo (Shirasuna y col. 2008).

La biosntesis de las prostaglandinas (PGs) comienza con la liberacin del

cido araquidnico (AA) de las molculas de fosfolpidos, paso catabolizado por la

enzima citoslica fosfolipasa A2 (cPLA2). Una vez libre, el AA es convertido a PGH2

por dos pasos coordinados en los que intervienen la accin de la enzima

ciclooxigenasa (COX) y luego la de una peroxidasa. El primer paso, en el cual el

cido araquidnico se convierte en PGH2 se considera el limitante en la sntesis de

estos prostanoides (revisado en Wiltbank y Ottobre 2003). Existen al menos dos

isoformas de la COX; la COX I que est ampliamente distribuda y que se expresa

constitutivamente en aquellos tejidos donde se la ha encontrado, y la COX II, cuya

expresin es inducida por una gran variedad de estmulos inflamatorios y

proliferativos (Hla y Neilson 1992). Estudios recientes demostraron que las especies

Introduccin

- 30 -

reactivas del oxgeno (ROS), muy involucradas en los procesos luteolticos,

estimulan la expresin del cido ribonucleico mensajero (ARNm) y de la protena

COX II in vitro (Nakamura y Sakamoto 2001; Sugino y col. 2004) e in vivo (Arosh y

col. 2004).

Luego de la conversin del AA en PGH2, pueden sintetizarse una gran

variedad de PGs en funcin de las PG sintetasas presentes en el tejido (la ruta de

biosntesis de prostaglandinas se resume en la figura 6). En el cuerpo lteo las dos

prostaglandinas ms relevantes son la PGE2 y la PGF2. Estos dos prostanoides ejercen efectos contrapuestos sobre la funcionalidad ltea. Diversos grupos de

investigacin han reportado que la adicin de PGE a cultivos de clulas lteas de

ovejas (Weems y col. 1997), vacas (Kotwica y col. 2003), ratas (Hurwitz y col. 2002) y

mujeres (Endo y col. 1988) aumentaron la produccin de progesterona. Por el

contrario, la liberacin de PGF2 es capaz de iniciar la regresin del CL en varias especies, incluyendo a primates no humanos (Knickerbocker y col. 1988, Gadsby y

col. 1990, Hansel 1996, Ristimaki y col. 1997), inhibiendo la secrecin de esta

hormona. Ms an, se ha demostrado que la PGF2 es capaz de reclutar y activar clulas inmunes en el CL y modificar la funcionalidad de las clulas endoteliales,

modulando tambin indirectamente la lutelisis (revisado en Davies y Rueda 2002).

Si bien la accin de la PGF2 sobre la esteroidognesis durante el inicio de la regresin ltea ha sido bien documentada, estudios in vitro e in vivo demostraron

que no es capaz de lograr la regresin ltea por si mismo dado que: i) si se retira el

CL bovino inmediatamente despus de la administracin PGF2 y se cultivan las clulas lteas, la seal luteoltica se termina y las clulas permanecen viables (Pate y

Nephew 1988); ii) el tratamiento in vitro con PGF2 no induce la muerte de las clulas esteroidognicas (Pate y Condon 1984) y iii) ratones que poseen el receptor

de PGF2 mutado poseen una duracin del ciclo estral normal, y logran una correcta ovulacin e implantacin embrionaria (Sugimoto y col. 1997).

Introduccin

- 31 -

Figura 6- Ruta biosinttica de las prostaglandinas. HETE: cido hidroxieicosatetranoico, HPETE: cido

hidroxiperoxieicosatetranoico,LT: leucotrienos, PAF: factor activador de plaquetas, PG:prostaglandina, PGI2:

prostaciclina, TX: tromboxano. Adaptado de Rang y Dale (2009).

2.5.2. Las especies reactivas del oxgeno (ROS) y el estrs oxidativo.

El oxgeno molecular (O2) es necesario para producir el ATP requerido para

la actividad metablica. Sin embargo, durante los procesos de reduccin puede

formar mltiples intermediarios reactivos, agrupados comnmente bajo la

denominacin de especias reactivas del oxgeno (ROS). Las ROS y derivados

txicos del oxgeno, son los radicales libres de mayor relevancia en las clulas de

metabolismo aerbico y entre ellos podemos mencionar al radical superxido (O2.),

al perxido de hidrgeno (H2O2) y al radical hidroxilo (.OH).

Las ROS poseen importantes funciones fisiolgicas y patolgicas en el

sistema reproductor femenino. Numerosas investigaciones llevadas a cabo en

animales y humanos han demostrado la presencia de ROS en el tracto reproductor

Introduccin

- 32 -

femenino: en los ovarios (Sawada y Carlson 1991, Sugino y col. 1996), oviductos

(Cheong y col. 2009), tero (Salama y col. 2008) y embriones (Pandey y col. 2010).

Adems, se ha reportado que participan en la modulacin de diversas funciones

fisiolgicas como la maduracin oocitaria, la esteroidognesis ovrica, la

funcionalidad ltea y particularmente la lutelisis (Sawada y Carlson 1994, Tanaka

y col. 2000, Motta y col. 2001, Minegishi y col 2002).

En condiciones normales, las ROS son intermediarias transitorias de

reacciones reguladas enzimticamente que pasan a producto bajo condiciones

controladas, sin llegar a acumularse. Sin embargo, en el caso en el cul los sistemas

protectores del organismo no son capaces de neutralizar o inactivar las ROS, se

produce un desbalance denominado estrs oxidativo (Sabuncu y col. 2001). El

estrs oxidativo se encuentra implicado en la causa y progresin de diversas

enfermedades y desrdenes metablicos, entre los cuales se pueden nombrar:

sndrome del ovario poliqustico (SOP) (Victor et al. 2009), riesgo cardiovascular

aumentado (Ahmadi y col. 2010), diabetes de tipo 2 (Chang y Chuang 2010),

enfermedades neurodegenerativas (Darvesh y col. 2010), etc.

Con respecto a su participacin en la regresin ltea, se ha asociado la accin

antiesteroidognica de PGF-2 con un incremento de las ROS, ya que este prostanoide estimula su produccin tanto en clulas del ovario de la rata

(Minegishi y col. 2002, Pepperell y col. 2003) como en macrfagos peritoneales

durante la regresin del CL (Sugino y col. 1996), permitiendo la acumulacin de

H2O2, que inhibira la sntesis de progesterona (Behrman y Aten 1991). Sin embargo,

su rol ms relevante en la lutelisis lo ejercen a travs de los daos que ocasionan al

ADN, a las protenas y a los lpidos, promoviendo indirectamente la apoptosis

celular (revisado en Agarwal y col. 2003).

Los antecedentes mencionados hacen de las ROS una espada de doble filo,

ya que actan como molculas claves en la sealizacin de importantes procesos

fisiolgicos pero tambin poseen un rol determinante en muchas de las patologas

del tracto reproductor femenino (revisado en Agarwal y col. 2005).

Introduccin

- 33 -

2.5.3. Mecanismos antioxidantes del tejido.

Para evitar los daos producidos por la acumulacin de ROS, en la clula

existen numerosos mecanismos protectores, que actan como antioxidantes

endgenos. Estos pueden ser ejercidos por la accin de: i) enzimas como la

superoxido dismutasa (SOD) y la catalasa (CAT); ii) metabolitos como el glutatin

(GSH), o iii) vitaminas (revisado en Agarwal y col. 2005). Estos mecanismos pueden

ser regulados por la accin de hormonas (Tam y col. 2003).

2.5.3.a. Enzimas antioxidantes.

La primera lnea de defensa para neutralizar los radicales libres la constituye

la accin de las SODs. Las SODs son un grupo de enzimas que detoxifican ROS a

partir de la conversin de O2- en H2O2 y O2. Se ha demostrado la existencia de al

menos tres isoformas de SOD: la superoxido dismutasa de tipo 1, dependiente de

cobre y zinc (SOD1), la superoxido dismutasa de tipo 2, dependiente de manganeso

(SOD2) y la superoxido dismutasa de tipo 3, dependiente de hierro (SOD3). En el

cuerpo lteo del ratn se ha reportado la presencia de las tres isoformas (Foyouzi y

col. 2005).

An se desconoce la relevancia de la participacin de las isoformas de SOD

durante la regresin del CL, debido a que los resultados informados acerca de su

modulacin en este proceso han sido contradictorios. Garrel y col. (2007) reportaron

que la PGF2 no modificaba ni la expresin de SOD1 ni la de SOD2, mientras que Al-Gubory y col. (2005) encontraron la actividad de ambas isoformas

incrementadas durante la lutelisis. Por otro lado, se ha reportado que la

disminucin de la SOD1 promueve la liberacin de PGF2 (Sugino y col. 2004) y que se encuentra positivamente correlacionada con la secrecin de progesterona (Al-

Gubory y col. 2004).

Luego de la conversin de O2- en H2O2, el siguiente paso en la

neutralizacin de ROS lo constituye la reduccin de H2O2 en H2O. El H2O2

interviene en la funcionalidad del aparato reproductor masculino y femenino.

Introduccin

- 34 -

Cumple un rol fundamental durante la capacitacin del espermatozoide, adems de

intervenir en la unin del mismo a la zona pelcida (Aitken y col. 1989, Bize y col.

1991). Ms an, se ha reportado que el H2O2 se encuentra aumentado tanto en la

lutelisis espontnea como en la inducida por PGF2 (Riley y Behrman 1991). Mltiples enzimas pueden catalizar la conversin de H2O2 en H2O, entre

ellas la CAT. Muy pocas determinaciones se han realizando evaluando la actividad

de CAT durante la lutelisis, y los resultados informados son contradictorios. En un

trabajo realizado por Garrel y col (2007) en el cul se indujo la regresin del CL

mediante la aplicacin de PGF2 en ovejas, la actividad de la CAT aument significativamente. Sin embargo, en otra investigacin en la cual se administraron

SOD, CAT y capturadores de ROS simultneamente en el CL de ovejas, se

increment la secrecin de progesterona y se retras la lutelisis (Hayashi y col.

2003). Un efecto similar se encontr al administrar estos compuestos en CL de ratas

(Minegishi y col. 2002).

2.5.3.b. Metabolito antioxidante glutatin: -glutamil- L-cistein glicina.

El glutatin, es un compuesto tripeptdico de bajo peso molecular que

contiene grupos sulfhidrilos (SH), de amplia expresin en plantas, animales y el

hombre. Tiene numerosas y variadas funciones: modula la respuesta celular a

cambios redox asociados con ROS, detoxifica los metabolitos de drogas, regula la

expresin de genes y el proceso de apoptosis y est involucrado en el transporte de

solutos orgnicos (revisado en Jefferies y col. 2003). Ms an, es el principal

antioxidante en la clula. Esta ltima caracterstica se basa en la capacidad de

oxidacin de sus grupos sulfhidrilos, que pueden reducir disulfidos y otras

molculas, pasando de glutatin reducido (GSH) a glutatin oxidado (GSSG). Por

lo tanto, modula el estado redox de la clula directamente, neutralizando radicales

libres, e indirectamente, manteniendo los grupos tioles de otros antioxidantes y

actuando como cofactor de enzimas detoxificantes. El GSSG es reciclado a GSH por

accin de la enzima glutatin reductasa, y cuando disminuye la concentracin de

Introduccin

- 35 -

GSH, como sucede en condiciones de estrs oxidativo, se desinhibe su sntesis de

novo (Luperchio y col. 1996).

De acuerdo con la bibliografa, se ha encontrado una disminucin de la

concentracin de GSH ovrica durante el proceso de reabsorcin embrionaria

(Solano y col. 2006). Ms aun, el tratamiento con Butionin-SulfOxiamina (BSO),

inhibidor de la sntesis de glutatin, desencadena una inhibicin en la biosntesis de

progesterona (McNutt-Scott y Harris 1998) indicando que esta molcula

antioxidante contribuye en gran medida al mantenimiento de la integridad del CL.

2.5.4. La peroxidacin lipdica.

Las ROS pueden interactuar con macromolculas como el ADN, las

protenas y los lpidos e interferir con las funciones vitales de la clula. El dao

previamente mencionado al ADN, puede provocar la aceleracin del proceso de

apoptosis (revisado en Agarwal y col. 2003).

El objetivo principal de la peroxidacin por ROS lo constituyen los cidos

grasos poliinsaturados ubicados en las membranas lipdicas, ocasionando la

formacin de perxidos lipdicos como el malondialdehdo (MDA). El

malondialdehdo, incluso, ha sido propuesto como un promotor tumoral y un

agente co-carcinognico debido a su alta citotoxicidad y accin inhibitoria sobre

enzimas protectoras (Gupta y col. 2009).

El proceso de peroxidacin lipdica ocurre en tres pasos; la iniciacin, la

propagacin y la terminacin. La iniciacin consiste en la abstraccin de un tomo

de hidrgeno a un grupo metileno. Esto se facilita si adems existe otra doble

ligadura en el carbono adyacente, como ocurre en los cidos grasos poliinsaturados

de membrana. El radical hidroxilo es un tpico iniciador. Ni el radical superxido,

ni el perxido de hidrgeno poseen la suficiente energa para actuar directamente

como iniciadores, aunque en presencia de iones de hierro, su conversin a radical

hidroxilo puede iniciar la peroxidacin lipdica. En la propagacin, los radicales

reaccionan nuevamente formando hidroperxidos lipdicos, que en una tercera

Introduccin

- 36 -

etapa de terminacin se escinden en pequeos derivados aldehdicos como el MDA

(Buege y Aust 1979).

El dao que provoca la peroxidacin lipdica a las membranas celulares se ha

encontrado asociado con la prdida de receptores de gonadotrofinas, y disminucin

en la formacin de AMPc, por ende, inhibira la capacidad esteroidognica del

ovario durante la regresin ltea (Wang y col. 1991).

2.5.5. Participacin de los leucocitos y sus productos de secrecin, las citoquinas

en la funcionalidad y regresin ltea.

La modulacin bidireccional entre las clulas del sistema inmune y las del

ovario ha sido objeto de estudio desde hace ms de 50 aos (Laqueur y col. 1955,

Girod 1960), siendo Lobel y Levy (1968) los primeros en demostrar la presencia de

leucocitos en el CL bovino. A partir de ese trabajo, numerosos grupos de

investigacin se dedicaron a caracterizar las interacciones entre ambos sistemas.

El ovario no es un sitio inmunologicamente privilegiado, por lo que existe un

trfico de clulas del sistema inmune desde y hacia este rgano, que acompaa los

cambios morfolgicos y funcionales durante el ciclo reproductivo (Brannstrom y

Norman 1993). Actualmente, mltiples estudios han podido confirmar que

distintas poblaciones de clulas del sistema inmune estn presentes en el CL de

numerosas especies, y que su infiltracin vara a lo largo de su desarrollo (Barnes y

col. 1978, Hume y col. 1984, Bagavandoss y col 1988, Takaya y col. 1997, Penny y col

1999, Bauer y col, 2001). En este contexto, se puede decir que una de las

caractersticas ms sorprendentes del CL consiste en su capacidad de organizar

rpidamente la gran heterogeneidad de poblaciones celulares que lo constituyen,

como una nica unidad funcional. Para ello, debe existir una fina sincronizacin en

la comunicacin entre los distintos tipos celulares, la que podr ser directa entre

dos clulas, o a travs de mediadores parcrinos. En este sentido, resulta cada vez

ms claro que la prdida de la funcionalidad ltea y la subsecuente involucin del

CL son procesos que estn mediados, al menos en parte, por el sistema inmune y

su gran red de molculas secretorias o citoquinas (Davis y Rueda 2002, Cannon y

Introduccin

- 37 -

col. 2007, Bukovsky y Caudle 2008). Entre los leucocitos, se ha propuesto que seran

los macrfagos (Paavola 1979, Bowen y col 1996, Penny 2000, Olson y Towson 2000)

y linfocitos T activados los que poseeran un rol fisiolgico durante la lutelisis

(Bauer y col. 2001, Komatsu y col. 2003, Cannon y Pate 2003, Davis y Pate 2007)

2.5.6. Contribucin de los macrfagos a la funcionalidad ltea.

Los macrfagos son clulas multifuncionales que desempean un rol clave

en la respuesta inmunolgica y que se encuentran presentes en los tejidos

reproductivos femeninos. Son capaces de realizar funciones muy diversas,

incluyendo la fagocitosis y degradacin de antgenos extraos, la disolucin de la

matriz extracelular y la remodelacin del tejido, y la produccin y secrecin de

citoquinas, agentes quimiotcticos y factores de crecimiento.

La variacin de la localizacin de estos leucocitos dentro del ovario en las

distintas etapas del ciclo reproductivo sugiere que estas clulas participan en

eventos como la foliculognesis, la ovulacin, y la formacin y regresin luteal (Wu

y col. 2004). Con respecto a este evento, se ha demostrado que los macrfagos son la

poblacin leucocitaria ms abundante en el cuerpo lteo (Petrovska y col. 1992); sin

embargo la etapa luteal en la que se los ha encontrado en mayor nmero difiere

segn los autores. Duncan y col. (1998) reportaron que el nmero mximo de

macrfagos en el CL se encuentra durante la fase ltea tarda, mientras que Gaytn

y col. (1998) encontraron que su nmero aumenta hacia el final de la fase ltea

temprana, se mantiene durante la fase ltea media y decrece en la fase ltea tarda.

Otro estudio, llevado a cabo por Castro y col. (1998) inform que la proporcin de

macrfagos no vara entre las fases lteas. Al evaluar las funciones de estas clulas

en el CL, se ha demostrado que durante la formacin del CL, los macrfagos

participan del proceso de angiognesis mediante la secrecin del factor de

crecimiento del endotelio vascular (VEGF) (Sunderkotter y col. 1994). En la

lutelisis estructural, la actividad de los macrfagos ha sido asociada

principalmente a la fagocitosis de los productos remanentes de la apoptosis de las

clulas lteas (Takaya y col. 1997, Pate y Landis Keyes 2001). Sin embargo, estas

Introduccin

- 38 -

clulas tambin ejerceran sus funciones a travs de sus productos de secrecin, los

cuales actan como mediadores luteolticos, entre los que se destacan la PGF2, el factor de necrosis tumoral (TNF-) y la interleuquina 1 (IL-1 ) (Benyo y Pate 1992, Wang y col. 1992). Por otro lado, tal como se ha mencionado previamente, los

linfocitos T activados tendran un rol fundamental en la lutelisis. Esta ltima

afirmacin involucra la accin indirecta de los macrfagos, en este caso actuando

como clulas presentadoras de antgeno.

2.5.7. Activacin de los linfocitos T y su rol en la lutelisis.

Los linfocitos T (LT) son clulas leucocitarias que pueden ser divididas en

subpoblaciones caracterizadas por su morfologa y funciones. Las subpoblaciones

ms importantes las constituyen la de los linfocitos T CD4+ (LT helpers, y en menor

proporcin, LT reguladores) y los linfocitos T CD8+ (LT citotxicos). Los LT helpers

(Th), una vez activados, se diferencian en funcin del perfil de citoquinas que

secretan en Th1 (citoquinas pro-inflamatorias) o en Th2 (citoquinas anti-

inflamatorias). Los linfocitos Th1 ejercen sus funciones principalmente

promoviendo la activacin linfocitos T CD8+, mientras que los Th2 interactan con

los linfocitos B para generar la produccin de anticuerpos. Los linfocitos T CD8+

activados, en cambio, promueven la activacin de los macrfagos e intervienen en

eventos clula-clula, mediando el proceso de apoptosis.

La activacin de los linfocitos T se da a partir de la unin entre el complejo

mayor de histocompatibilidad (MHC) presente en la clula presentadora de

antgeno (CPA) y el receptor de la clula T (TCR) (Altman y col. 1990). Esta unin

constituye la primera seal en el proceso de presentacin antignica. De no existir

una segunda seal, el linfocito T permanecer en un estado de inactividad

denominado anergia (Gimmi y col. 1993). Para promover la activacin del LT debe

existir una segunda interaccin entre la CPA y el LT. Este segundo contacto lo

constituye el proceso denominado coestimulacin, siendo el sistema receptor-

ligando CD28 (LT)/B7 (CPA) uno de los ms importantes que intervienen en l

(Lenschow y col. 1996). La coestimulacin, entonces, promueve la supervivencia de

Introduccin

- 39 -

la clula T mediante la induccin de su activacin y expansin clonal, dando lugar

a eventos mediados por la interaccin clula- clula y la secrecin de citoquinas.

Existen numerosas molculas coestimuladoras pertenecientes a la familia B7,

entre las que se destacan CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) como los dos ligandos

principales de CD28 (Bluestone 1995). Ambas molculas slo poseen 25% de

homologa en su secuencia aminoacdica, aunque son capaces de unirse a CD28 con

la misma afinidad. Actualmente existe una gran controversia respecto de si CD80 y

CD86 cumplen funciones similares o median procesos diferentes. Respecto de este

punto, se ha informado que aunque CD80 y CD86 son capaces de estimular la

secrecin de interleuquina (IL) 2 e interferon (IFN-), as como la expresin de las cadenas y del receptor de IL-2 (Freeman y col. 1995), algunos estudios han sugerido que CD80 se encontrara relacionada con la diferenciacin de las clulas T

helper (Th) hacia un perfil Th1, mientras que CD86 estara involucrada con la

diferenciacin T hacia un perfil Th2 (Lu y col. 1995, Kuchroo y col. 1995).

Tal cmo fue mencionado previamente, se ha postulado que los linfocitos T

estaran muy involucrados en la regresin del CL. De acuerdo con esta hiptesis, se

ha demostrado que existe una mayor infiltracin linfocitaria T CD8+ (linfocitos T

citotxicos) al iniciarse la lutelisis en CLs de caballos (Lawler y col. 1999), ratas

(Bauer y col. 2001) y conejos (Krusche y col. 2002). Esta mayor infiltracin

linfocitaria podra estar asociada al incremento caracterstico de PGs o ROS en la

regresin del CL, dado que ambas sustancias poseen actividad quimiotctica

(Minegishi y col. 2002, Weller y col. 2007). La accin de los linfocitos T CD8+ en la

lutelisis podra ser indirecta, mediante la produccin de ROS (Brannstrom y

Friden 1997), secrecin de citoquinas y la activacin de macrfagos, o bien directa,

promoviendo la apoptosis de las clulas esteroidognicas, a travs de la accin de

perforinas (revisado en Bukulmez y Arici 2000).

La presencia de una mayor infiltracin T en el CL durante la lutelisis genera

el interrogante acerca del estado de activacin o anergia en el cual dichas clulas

puedan encontrarse. Mltiples trabajos han abordado la posibilidad de que exista

presentacin antignica en el ovario en la regresin luteal. Es as que se ha

reportado que las clulas del CL de diversas especies expresan MHC de tipo II

Introduccin

- 40 -

(MHCII) en su superficie (Bukovsky y col. 1995, Lawler y col. 1999, Bowen y Landis

Keyes 2000, Cannon y col. 2006). Adems, se demostr que en el CL bovino existen

clulas que expresan los requerimientos mnimos para funcionar como CPA

(Cannon y col. 2006), que estas clulas son capaces de estimular a clulas T in vitro

(Cannon y col. 2003, Davis y Pate 2007) y que la PGF2 estimula su capacidad como CPA (Petroff y col. 1997). Por otro lado, se report que las clulas del CL bovino

expresan el ARNm de los genes que codifican las molculas coestimuladoras CD80

y CD86, y que las clulas lteas parenquimticas poseen molculas coestimuladoras

funcionales que facilitaran la interaccin con las clulas T (Cannon y col. 2007). En

este sentido, se ha demostrado recientemente que la progesterona acta como un

potente inmunosupresor, inhibiendo la expresin de CD80 en CPA estimuladas con

lipopolisacridos (LPS) (Butts y col. 2007).

A pesar de las evidencias surgidas de las investigaciones realizadas durante

los ltimos aos, an es muy poco lo que se conoce acerca del rol de la presentacin

antignica durante la regresin ltea.

2.5.8. Actividad secretora de los leucocitos: produccin de citoquinas y su rol en

la lutelisis.

Las citoquinas comprenden un grupo heterogneo de molculas de bajo peso

molecular, que modulan la actividad de diversos sistemas. Son producidas y

secretadas por numerosos tipos celulares, entre los que se pueden mencionar a los

leucocitos, los adipocitos, las clulas endoteliales, las clulas esteroidognicas, etc.

En los ltimos aos se ha establecido que estas sustancias desempean un rol

crucial en distintas funciones reproductivas, como el desarrollo de la preez

(Luchetti y col. 2008) y la regresin del CL (revisado en Davis y Rueda 2002).

Entre las citoquinas involucradas en la lutelisis, se destacan la interleukina

1 (IL-1), el factor de necrosis tumoral (TNF-), el interferon (IFN- ) y el ligando de la molcula Fas (FasL). En la tabla 2 se resumen las clulas leucocitarias

principalmente implicadas en su produccin y secrecin, y los principales efectos

luteolticos de las mismas.

Introduccin

- 41 -

Citoquina Producida principalmente por

Accin en el CL

IL-1 Macrfagos activados Disminucin de la secrecin de progesterona (Donesky y col. 1990, Kohen y col. 1999, Estevez y col. 2002) Aumento de la produccin de PGF2 ( Nothnick y Pate 1999, Estevez y col. 2002, 2003) Asociacin con apoptosis incrementada de clulas ovricas (Rueda y col. 1997)

TNF- Clulas Th1 Clulas T CD8+ citotxicas Macrfagos y dendrticas Natural Killers (NK)

Disminucin de la secrecin de progesterona (Skarzynski y col. 2008, Korzekwa y col. 2008) Aumento de la produccin de PGF2 (Skarzynski y col. 2008, Korzekwa y col. 2008) Aumento de la apoptosis (Sasson y col. 2002, Skarzynski y col. 2008, Korzekwa y col. 2008) Aumenta la reactividad contra FasL (Komatsu y col. 2003)

IFN- Clulas Th1 Clulas T CD8+ citotxicas Macrfagos y dendrticas? Natural Killers (NK) + NKT

Disminucin de la secrecin de progesterona (Fairchild y Pate 1991, Fukuoka y col. 1992) Aumento de la apoptosis (Cataldo y col. 1998, Quirk y col. 2000)

FasL Linfocitos T (activados en general)

Aumento de la apoptosis celular (Kuranaga y col. 2000, Quirk y col 2000, Komatsu y col. 2003)

Tabla 2: Clulas leucocitarias implicadas en la secrecin de las principales citoquinas involucradas en la lutelisis. 2.6. Apoptosis de las clulas lteas.

El proceso de lutelisis estructural ha sido asociado a un incremento de la

apoptosis celular en varias especies, incluyendo la rata (Guo y col. 1998, Kurusu y

col. 2009), el ratn (Hasumoto y col. 1997), la vaca (Juengel y col. 1993, Nishimura y

col. 2008), la oveja (Sawyer y col. 1990), el caballo (Al-Zi'abi y col. 2002), primates

no-humanos (Young y col. 1997) y humanos (Shikone y col. 1996).

La apoptosis o muerte celular programada se distingue de la necrosis tanto

por parmetros morfolgicos como bioqumicos. En el proceso de apoptosis la

membrana celular permanece intacta y no se desencadenan eventos inflamatorios, a

diferencia de lo que sucede en la necrosis. Los mecanismos moleculares que

inducen la apoptosis son mltiples y an no se han establecido con certeza aquellos

Introduccin

- 42 -

que participan de este evento en el CL. Entre los que se han reportado encontramos

la activacin del sistema Fas-FasL por la estimulacin de la expresin de Fas en las

clulas lteas por: i) la disminucin en la secrecin de progesterona; ii) la accin de

IFN- y TNF- secretados por los macrfagos y linfocitos; iii) la accin del oxido ntrico; y la expresin de FasL en los linfocitos desencadenada por: i) la liberacin

de prolactina; ii) la liberacin de PGF2. El camino apopttico inducido por Fas-FasL se encuentra mediado por la caspasa-3 y la caspasa-8 (revisado en Sugino y

Okuda 2007).

3. Tratamiento del SOP y restablecimiento de la fertilidad.

Pero t has de venir, amor!, mi nio, porque el agua da sal, la tierra fruta, y nuestro vientre guarda tiernos hijos

como la nube lleva dulce lluvia.

Yerma, Federico Garca Lorca.

La gran prevalencia y heterogeneidad del SOP hacen que no pueda utilizarse

un nico tratamiento para evitar los trastornos que trae aparejados, sino que debe

ser ajustado segn el cuadro clnico y las necesidades de cada paciente. Sin

embargo, existen algunos lineamientos generales que deben tenerse en cuenta,

entre los que se destacan la educacin de la mujer afectada acerca de los efectos a

corto y largo plazo de la patologa, y el acompaamiento psicolgico que permita

evitar la ansiedad y depresin (revisado en Teede y col. 2010). Una vez atendidos

los aspectos psico-sociales de la patologa, debe apuntarse a cambios en el estilo de

vida de la persona afectada, lo cul constituye el tratamiento de primera lnea en las

mujeres con SOP, segn el Consenso Internacional Thessaloniki ESHRE/ASRM

(2007). Esta recomendacin se ve sustentada en el hecho de que en aquellas mujeres

en las cuales ste sndrome se presenta conjuntamente con obesidad, la prdida de

entre el 5-10% de su peso mejora alteraciones psicolgicas (Galletly y col. 1996),

metablicas y reproductivas (Huber-Buchholz y col. 1999). En cuanto a este ltimo

aspecto, debemos destacar que la prdida de peso se asocia con el aumento

espontneo de la tasa ovulatoria (Pasquali y col. 2003, Moran y col. 2006) y el

Introduccin

- 43 -

incremento de la tasa de embarazo en un 20% (Karimzadeh y Javedani 2010). Estos

resultados son an ms conspicuos si adems de dieta se realizan ejercicios fsicos

(Poehlman y col. 2000).

3.1. Terapias farmacolgicas para el tratamiento de SOP.

En muchas ocasiones el cambio en el estilo de vida de la paciente que padece

SOP no resulta suficiente para paliar este sndrome, por lo cual se administran

distintas terapias farmacolgicas. En aquellas pacientes que deciden evitar el

embarazo, la terapia de primera lnea en SOP se basa en la administracin de

anticonceptivos orales (Bruni y col. 2003, Cheang y Nestler 2004). Estos logran

reducir la secrecin de LH y la produccin de andrgenos, aunque sus efectos sobre

el metabolismo lipdico y glucmico an resultan controvertidos (revisado en

Krysiak y col. 2006). En aquellos casos en los cules la mujer desee la concepcin de

un hijo, existen distintas terapias que pueden aplicarse, entre las que se cuentan la

administracin de citratato de clomifeno (CC), la utilizacin de agentes

sensibilizantes a la insulina (metformina), la aplicacin de gonadotrofinas y

anlogos de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), la realizacin de

drilling ovrico y la implementacin de tcnicas de reproduccin asistida. Entre las

terapias mencionadas, la administracin de CC an contina siendo la primera

opcin para la induccin de la ovulacin en las mujeres que presentan el fenotipo

anovulatorio de SOP, debido su bajo costo, simple administracin y probados

efectos sobre el aumento de la tasa de embarazos y de nios nacidos vivos

(revisado en el Consenso Internacional Thessaloniki ESHRE/ASRM, 2007). Sin

embargo, la administracin de este anti-estrgeno reviste potenciales

inconvenientes, como ser: eventos de embarazos mltiples (Coughlan y col. 2010),

sndrome de hiperestimulacin ovrica e insuficiencia ltea (Homburg, 2005). Estos

factores, sumados al hecho de que entre el 20-25% de las mujeres a las que se les

administra CC no son capaces de responder al tratamiento (revisado en el Consenso

Internacional Thessaloniki ESHRE/ASRM, 2007), obligaron a los especialistas en

reproduccin a buscar terapias alternativas que posean beneficios comparables a

Introduccin

- 44 -

los del CC, sin sus efectos adversos. En este contexto, en el ao 1994 se public el

primer estudio que evalu la accin del agente sensibilizante a insulina metformina

en una mujer con SOP, y aunque el estudio estaba orientado a la investigacin de su

rol sobre parmetros metablicos y endocrinolgicos, los autores notaron que el

12% de las mujeres tratadas lograban ovular espontneamente (Velazquez y col.

1994), abriendo todo un nuevo campo de aplicacin para este tipo de drogas.

3.2. La metformina

La metformina, N,Ndimetil biguanida, es la droga de mayor utilizacin en

el tratamiento de la diabetes de tipo 2 en todo el mundo. Su estructura molecular se

muestra en la figura 7. Su accin principal radica en inhibir la produccin de

glucosa heptica e incrementar la sensibilidad a insulina en los tejidos perifricos,

disminuyendo de esta manera la hiperinsulinemia (Nestler 2008).

En las mujeres con SOP, tanto diabticas como no diabticas, existe una

hipersensibilidad local ovrica a la insulina, que provoca la secrecin incrementada

de andrgenos (Baillargeon y Nestler 2006). La reduccin de la insulino resistencia

(Fedorcsak y col. 2003, Harbone y col. 2003, Lord y col. 2003) y la disminucin de la

insulina srica provocada por la administracin de metformina en pacientes SOP

(Nestler y Jakubowicz 1996) estara asociada con la disminucin de andrgenos

circulantes y sus efectos subsecuentes, resultando en beneficios metablicos,

reproductivos y clnicos (Harbone y col. 2003). Sin embargo, la accin de la

metformina sobre la esteroidognesis ovrica es an controversial, ya que no slo

ejerce sus acciones de manera indirecta al modular los niveles de insulina, sino que

es capaz de actuar directamente estimulando (Tosca y col. 2006b) o inhibiendo

(Attia y col. 2001, Tosca y col. 2006) la secrecin de esteroides, en funcin de las

condiciones metablicas y de maduracin en las que se encuentre el tejido sobre el

cual opera. Asimismo, la aplicacin de metformina ha mostrado tener efectos

inmunomoduladores, dado que es capaz de regular la proporcin de las

subpoblaciones linfocitarias T CD4+ y T CD8+, la secrecin de TNF- in vivo en ratones prepberes hiperandrogenizados (Sander y col. 2006) y la proliferacin de

Introduccin

- 45 -

linfocitos T in vitro (Solano y col. 2008). Adicionalmente, posee actividad de

aminoguanidina actuando como un agente capturador de especies reactivas del

oxgeno (ROS) (Bonnefont-Rousselot y col. 2003).

Figura 7- Estructura molecular de la metformina.

En lo que respecta particularmente a su accin sobre parmetros

reproductivos, se demostr que la administracin de metformina induce

incrementos en la tasa de ovulacin (Moll y col. 2007, Diamanti-Kandarakis y col.

2010). Asimismo, algunos reportes demostraron la capacidad de esta biguanida de

mejorar la vascularizacin uterina (Palomba y col. 2006), evitar la reabsorcin

embrionaria (Jakubowicz y col. 2004) e impedir complicaciones obsttricas durante

el embarazo (Vanky y col. 2004). Sin embargo, entre los estudios clnicos realizados,

muy pocos tuvieron en cuenta el nmero de embarazos logrados y el de nios

nacidos con vida (Diamanti- Kandarakis y col. 2010).

A pesar de los antecedentes expuestos, los mecanismos de accin por los

cuales la metformina ejerce sus acciones, ya sea sobre parmetros metablicos como

reproductivos, no se comprenden por completo. Dilucidar dichos mecanismos

permitira mejorar los resultados obtenidos en el tratamiento de SOP, en caso de ser

necesario, mediante la aplicacin conjunta de otros frmacos que complementen

sus efectos.

Introduccin

- 46 -

Hiptesis y objetivos.

El hiperandrogenismo, una de las caractersticas ms relevantes del

sndrome del ovario poliqustico (SOP), se halla asociado a desrdenes psicolgicos,

metablicos, inflamatorios y reproductivos. Entre los trastornos reproductivos

relacionados se encuentran: la prdida de la ciclicidad ovrica, evidenciada por la

oligo/amenorrea; fallas de la fase ltea; prdida de la preez temprana e

infertilidad (Lee y col. 1991, 1998, Ginsburg 1992, Henmi y col. 2001, Glueck y col.

2002, Lunn y col. 2002, Cocksedge y col. 2008). Todas estas alteraciones pueden ser

causadas, al menos parcialmente, por modificaciones en la funcionalidad o

involucin del cuerpo lteo (Meenakumari y col. 2004, Manikkam y col. 2006). Ms

an, en mujeres con SOP se