Immunology microRNA WebinarImmunology microRNA WebinarRecent Work & Current Methods

In Immunology microRNA Research

2013‐05‐07

Christoph Eicken, PhDHead of Technical Services – Microarrays

Agendag

Recent Studies

miRNA Intro

Current methods

Q & A

Case Studies

Q

microRNAs ‐What We Know

1. All miRNAs are small non‐coding RNAs, usually consisting of  20–22 nucleotides for animals and 20 24 nt for plantsnucleotides for animals and  20–24 nt for plants.

2. All miRNA precursors have a well‐predicted stem loop hairpin structure, and this fold‐back hairpin structure has a low free energy p gy

3. Many miRNAs are evolutionarily conserved, some from worm to human in animals, or from ferns to core eudicots or monocots in plants

4. Bind to complementary mRNA molecules and act as negative regulators of translation

5. High copy number

6. Expression is tissue (and developmental stage) specific

microRNAs ‐What We Know

1. Currently  ‐ 25,141 mature miRNAs across 193 plant, animal, and y , p , ,

virus species (miRBase 19, Aug. 2012).

2. Mechanism is far reaching and complex – each miRNA may control many g p y ygenes and it is estimated that miRNAs regulate expression of up to 1/3 of all human genes.

3 O t b f t h th i d h i3. Operate by one of two hypothesized mechanisms:

– Complete pairing mRNA is degraded ‐ predominant in plantsg p p

– Imperfect pairing translation is repressed but mRNA remains intact ‐ predominant in animals

Milestones1993 – Lin‐4 was shown to encode two small RNA molecules (not protein) 

• Small RNAs control developmental timing in C. elegans through negative regulation of lin‐14 gene. • Lee RC et al. 1993 The C. elegans heterochronic gene lin‐4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin‐14. Cell 

75(5):843‐54. [article] 5(5) 8 3 5 [a t c e]

1998 – RNAi is observed for the first time – leads to Nobel Prize (2006)• Fire A, Mello CC et al. 1998 Potent and specific genetic interference by double‐stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature 

1998; 391:806‐811. [article]

Challenge to the Central Dogma of BiologyDNA > transcription > RNA > translation > protein

2000 L t 7 id tifi d i h d D hil ( h l l k l )2000 – Let‐7 was identified in humans and Drosophila. (Reinhart et al., Slack et al.)

2001 – Bartel, Tuschl, Ambros ‐ Discover large class of small regulatory RNAs, name them microRNA (miRNA)( )

• Lau NC et al. 2001 An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans. Science 294(5543):858‐62. [abstract] 

• Lagos‐Quintana M et al. 2001 Identification of novel genes coding for small expressed RNAs. Science 294(5543):853‐8. [abstract] • Lee RC et al. 2001 An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans. Science 294(5543):862‐4. [abstract] 

2002 – Identification of Drosha reveals complete microRNA biogenesis pathway•pri‐miRNAs > Drosha > pre‐miRNAs (~70nt) > Dicer > mature miRNAs (~22nt) •Lee Y et al. (2002) The nuclear RNase III Drosha initiates microRNA processing. Nature 425(6956):415‐9. [abstract]

Milestones2004 – Microarrays are used to profile miRNA expression

• Several groups develop or modify existing gene expression microarrays for profiling miRNAs• Babak et al. 2004 [article], Barad et al. 2004 [article], Liu et al. 2004 [article], Nelson et al. [abstract], 2004, Thomson et al. 2004 

[article][article].

2005 – Next‐Gen Sequencing is used for small RNA discovery and analysis• Green Lab ‐ uses Solexa (now Illumina) sequencing to identify novel small RNAs in Arabidopsis plants• Lu C et al. 2005 Elucidation of the small RNA component of the transcriptome. Science, 309: 1567–1569. [abstract] 

2006 iRB li t S I tit t2006 – miRBase goes online at Sanger Institute• Depository for experimentally verified microRNAs: http://www.mirbase.org/• Griffiths‐Jones S et al. 2006 miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature. NAR 34(Database Issue):D140‐D144. 

[article] 

2008 – Circulating miRNAs detected in body fluids• miRNA signatures in serum and plasma provide cancer diagnosis / prognosis• Serum ‐ Chen X et al.(2008) Characterization of microRNAs in serum: A novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other ( ) g

diseases. Cell Res 18:997–1006. [article]• Plasma ‐Mitchell PS et al.(2008) Circulating microRNAs as stable blood‐based markers for cancer detection. PNAS USA 105:10513–

10518. [article]

Milestones ‐ Immunology

2004 ‐ miRNAs regulate haematopoietic‐cell lineage differentiation • Identification of miRNAs that are differentially expressed during haematopoietic‐lineage differentiation and shows that miR‐181a can modulate B‐ and T‐cell differentiation

Chen C Z, Li L, Lodish, HF, Bartel DP. (2004) MicroRNAs modulate hematopoietic lineage differentiation. Science 303, 83–86.[abstract]

• Distinct signatures of a group of miRNAs are correlated with specific types of leukaemias

Calin G A et al (2004) MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias PNAS USA 101Calin, G. A. et al. (2004) MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. PNAS USA 101, 11755–11760. [abstract]

2005 ‐ miRNAs have an important role in modulating innate immune system• Demonstration that the cellular miRNA miR‐32 can effectively limit replication of PFV1 and a suppressor proteinDemonstration that the cellular miRNA miR 32 can effectively limit replication of PFV1, and a suppressor protein encoded by the virus can counteract the repressive effect of miR‐32 in a plant system.

Lecellier, C H et al. (2005) A cellular microRNA mediates antiviral defense in human cells. Science 308, 557–560. [abstract]

Taganov K D, Boldin MP, Chang KJ, Baltimore D. (2006) NFκ‐ B‐dependent induction of microRNA miR‐146, an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses. PNAS USA 103, 12481–12486. [article]

Milestones ‐ Immunology

2007 ‐ miRNAs have an important role in modulating adaptive immune responses• Report shows that mice deficient in miR‐155 are immunodeficient, and have defects in the function of B and T cells, as well as dendritic cells.

Rodriguez A et al. (2007) Requirement of bic/microRNA‐155 for normal immune function. Science 316, 608–611. [abstract]

• Using gain‐of‐function and lost‐of‐function analyses in mice, this study demonstrates an important role for miRNA‐155 in the differentiation of T helper cells and the establishment of germinal centres.

Thai TH et al. (2007) Regulation of the germinal center response by microRNA‐155. Science 316, 604–608. [abstract]

• Study shows that miR‐181a can function as an antigen sensitivity rheostat to modulate T‐cell sensitivity to antigens during T‐cell development and maturation by downregulating the expression of multiple phosphatases in the TCR signalling pathway. 

Li QJ et al. (2007) miR‐181a is an intrinsic modulator of T cell sensitivity and selection. Cell 129, 147–161. [abstract]

• Genome‐wide analysis of miRNAs expression in psoriasis and atopic eczema, two common chronic inflammatory diseases, provided the first evidence of a link between altered levels of miRNAs and inflammatory diseases.diseases, provided the first evidence of a link between altered levels of miRNAs and inflammatory diseases. 

Sonkoly E, et al. (2007) MicroRNAs: novel regulators involved in the pathogenesis of Psoriasis? PLoS ONE 2(7), e610. [article]

miRNA Processing

pri‐miRNA = primary microRNA transcript

pre‐miRNA = precursor microRNA

miRNA* = antisense microRNA(now ‐3p or ‐5p)

miRISC = microRNA‐induced silencingmiRISC = microRNA‐induced silencing complex

F l i f i di iRNAFor latest information regarding miRNA nomenclature see the miRBase.org blog.

25000

miRNAs in miRBase20000

21,264 miRBase Entries ‐ 193 plant, animal, and virus species

miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature.Griffiths Jones S et al NAR 2006 34(Database Issue):D140 D144

15000

Griffiths‐Jones S et al. NAR 2006 34(Database Issue):D140‐D144 [article]

10000

Illumina Releases first small RNA Sample Prep Kit

50005000

0V6.1 V7.1 V8.0 V8.1 V8.2 V9.0 V9.1 V9.2 V10.0 V10.1 V11.0 V12.0 V13.0 V14.0 V15.0 V16 V17 V18 V19

Apr‐05 Oct‐05 Feb‐06 May‐06 Jul‐06 Oct‐06 Feb‐07 May‐07 Aug‐07 Dec‐07 Apr‐08 Sep‐08 Mar‐09 Sep‐09 Apr‐10 Sep‐10 Apr‐11 Nov‐11 Aug‐12

miRNAs in PubMed

6000

7000

5000

6000

3000

4000

2000

3000

1000

02001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012

Latest from the Funding Agencies

NIAMS to Fund Small Businesses for Inflammatory Disease yBiomarker Tools

Last week the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and SkinLast week the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases seeks to support small businesses that are developing potential biomarker platforms to predict the onset and progression of inflammatory diseases.

These new tools would be used to evaluate a range of complex diseases, including rheumatoid arthritis; systemic lupus erythematosus; scleroderma; psoriasis; rosacea; acne, and others. 

http://www.genomeweb.com/proteomics/niams‐fund‐small‐businesses‐inflammatory‐disease‐biomarker‐tools

Why Study miRNAs in the ?Immune System? 

1. Several miRNA genes are specifically expressed or highly enriched in key immune systems organs (ex thymus, bone marrow). 

2. Many miRNAs have been found to be important in the development, differentiation, survival, and function of B and T l h t d d iti ll h d th ilymphocytes, dendritic cells, macrophages, and other immune cell types.

3 miRNAs participate in the modulation of both the innate and3. miRNAs participate in the modulation of both the innate and adaptive immune responses.

4 miRNAs fine tune the inflammatory response4. miRNAs fine tune the inflammatory response.

Why Study miRNAs in the ?Immune System? 

1. Dysregulation of miRNAs can contribute to the development of immune related disease and disorders:

a. Inflammatory diseases – arteriosclerosis, rheumatoid arthritis, inflammatory bowel diseaseinflammatory bowel disease

b. Autoimmune diseases ‐ psoriasis/eczema, systemic lupus erythematosus (SLE) y ( )

c. Cancers ‐ leukemia

2. Circulating miRNAs may be novel2. Circulating miRNAs may be novel biomarkers for immune related diseases.

3. miRNAs are likely associated with other immune‐related diseases and are potential therapeutic targets. Ha TY. (2011) Immune Netw 11(1), 11‐41. [article]

MiRNAs of relevance to immune system

miRNAs and Immune l

MicroRNAs Site of expression Targets Functions Reference

MiRNAs of relevance to immune system development and function, their target genes and functions.System Development

Mir 155Activated B cells and monocytes/macrophages

PU1, IKKɛ, FADD, c‐MafRegulates T cell differentiation and germinal centre B‐cell responses.

Vigorito et al., 2007; Costinean et al., 2006; Tili et al. (2007); [8] and [9]

R i d f i d i dRequired for innate and acquired immune responses

Mir 181aB cells and double positive T cells

SHP2, PTPN22, DUSP5 and DUSP6

Modulates T cell sensitivity in response to antigens.

[1]

Regulates T cell and B cell gdevelopment

Mir 17‐92Pre‐B cells and double positive T cells

Bim and PTENRegulates transition from pro‐B cell to pre‐B cell

Ventura A et al., 2008; [27]

Mir 146 Activated monocytes IRAK1 and TRAF6Negative regulator of TLR‐NF‐kBsignalling in response to bacterial [30] and [31]Mir 146 Activated monocytes IRAK1 and TRAF6 signalling in response to bacterial infections.

[30] and [31]

Th1‐effector cell specific

Mir 223 Granulocytes Mef2c and NFI‐AInvolved in regulation of granulocytic maturation and inflammatory  [34], [35], [36] and [37]response.

Carissimi C, Fulci V, Macino G. (2009) MicroRNAs: novel regulators of immunity. Autoimmun Rev 8(6):520‐4. [article]

miRNAs and Immune lSystem Development

Fig. 1   Schematic representation depicting miRNAs involved in hematopoietic differentiation and immune system function, as deduced from studies on mouse. HSC, Hematopoietic Stem Cell; CLP, Common Lymphoid Progenitor; CMP Common Myeloid Progenitor; DN Double Negative T cell precursors; DP, Double Positive T cell; SP, Single Positive (CD4+ and CD8+)T cells; EMP, Erythrocyte‐Megakaryocyte Progenitor; GMP, Granulocyte–Macrophage Progenitor.

Carissimi C, Fulci V, Macino G. (2009) MicroRNAs: novel regulators of immunity. Autoimmun Rev 8(6):520‐4. [article]

miRNAs and the Innate Immune Response 

1. Regulation of Toll‐like receptor signaling and cytokine responses  ‐miR‐155, miR‐146a and miR‐223

2. miRNA‐modulated pathways involved in the activation of mature innate immune cells (macrophages, dendritic cells and granulocytes)

3. Response to virus infection

a. Cellular miRs not only alter immune cell development and function, but are also able to directly affect viral replicationare also able to directly affect viral replication

b. Virus‐encoded miRs shape the host‐virus interactions and regulate the viral life cycle. y

miRNAs and the Innate Immune Response 

Table 1 . miRNAs in Innate Immunity

Liu G, Abraham E. (2013) MicroRNAs in immune response and macrophage polarization. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013 Feb;33(2):170‐7. doi: 10.1161/ATVBAHA.112.300068. [article]

miRNAs and the Adaptive Immune Response 

1. miRNAs regulate TLR and other signaling pathways. 

f f2. miR‐181a can function to modulate the strength and threshold of T‐cell receptor (TCR) signaling, thereby influencing T‐cell sensitivity to antigens.

3 Antigen presentation and T cell receptor signaling3. Antigen presentation and T cell receptor signaling.

4. Toll –like receptor stimulation identified three miRNAs that are induced by LPS in human macrophages, miR‐155, miR‐146a and miR‐132.

5. Important role in the differentiation, proliferation and activation of T and B cells.

miRNAs and the Adaptive Immune Response 

Table 2 . miRNAs in Adaptive Immunity

Liu G, Abraham E. (2013) MicroRNAs in immune response and h l i ti A t i l Th b V Bi l 2013macrophage polarization. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2013 

Feb;33(2):170‐7. doi: 10.1161/ATVBAHA.112.300068. [article]

miRNAs in the Immune System: Clinical Potential

Molecular Diagnostics / Biomarkers – Identification of specific miRNAs or miRNA expression based signatures that canspecific miRNAs or miRNA expression based signatures that can act as biomarkers for various diseases/pathologies. 

1 Bi k i b d fl id l & HDL ti l1. Biomarkers in body fluids: serum, plasma, exosomes, & HDL particles

2. Make accurate and detailed clinical diagnosis

3 Potential to determine prognosis and predict treatment efficacy3. Potential to determine prognosis and predict treatment efficacy

Rosetta Genomics' miRview Lung Assay:Rosetta Genomics  miRview Lung Assay:Assay Shown to Accurately Differentiate Between the Four Main Types of Lung Cancer

miRNAs in the Immune System: Clinical Potential

Drug Discovery / Therapeutics – Identification of miRNAs that play essential roles in disease to act as drugs or possible p y g ptherapeutic targets. 

1. miRNAs as immune system regulating drugs

2. miRNAs as drug targets

3 St d f iRNA t d t d t i f ti t th ti li3. Study of miRNAs to understand response to infections, stress, other stimuli

MicroRNA Profiling Review:

MicroRNA profiling:approaches and considerations

Colin C. Pritchard, Heather H. Cheng & Muneesh TewariColin C. Pritchard, Heather H. Cheng & Muneesh TewariNature Reviews Genetics 13, 358‐369 (May 2012) .[abstract]

microRNA Research ToolsSeq‐Array

SM

Target  Determination

Bi i f ti T tS Pi T

miRNA Identification

ACGT101‐miR

• Bioinformatics – TargetScan, PicTar,PITA

• Gene / proteome expression analysis• Pull‐down assays• 5′ RACE analyses

• Genetic screening • Direct cloning, sequencing• Computational strategy –

MIRCheck, findMiRNA, MIRscan, MiRAlign

Stem‐Loop Specific 

f

y• Degradome Sequencing

MiRAlign• Tiling Microarrays• Next‐gen Sequencing

Pathway AnalysisDetection & Profiling

• Northern Blotting• In situ hybridization • Real‐time PCR

Degradsome Seq

• Bioinformatics – miRFocus, mirPath, MMIA

• Microarray analysis• Next‐gen Sequencing

Functional Analysis

• Lucifierase Assays• Gene knockout/overexpression  models• miRNA inhibition ‐ antagomirs Digital Gene Expressiong• miRNA mimicry

Pathway Network

3 M j St & T h l i3 Major Steps & Technologies

Discovery Profiling QuantitationValidation

miRNA qRT PCRcustom miRNA

Next Gen microarray qRT-PCRmiRNAmicroarray

Sequencing

Seq Array SMSeq‐Array

SamplePreparation

Cell LineFFPE Block

Fatty Tissue(Viscous Samples)

Norgen Biotek

Tissue PlantM t i l

(Viscous Samples)

Total RNA( )

Total RNA

BloodSerum Algea

Material(1‐4 µg)Qiagen

Total RNA Extraction Kit

Plasma

Ambion

miRNeasy KitUrine

• Select a kit designed to retain small RNA 

• Select kit based on your sample type

• Use the same kit for entire experimentmiRVana Kit

Customer Sample Quality Control

You can check the UV spectrum of your sample with a spectrophotometer. 

↑ 1 0 ↑ 1 8260nm 260nm

Customer Sample Quality Control

↑ 1.0  ↑ 1.8 230nm 280nm

Bioanalyzer or 1‐1.5% agarose gelBioanalyzer or 1 1.5% agarose gel 

• 28S rRNA band at 4.5kb  ‐ ~2X intensity

• 18S rRNA band at 1.9kb.

• For Average Cell Line or Tissue sample – RIN number must be  ↑ 7

• For other sample types such as Blood orFor other sample types such as Blood or Plant – RIN number does not apply

• Excessive smearing on the gel indicates degraded RNAdegraded RNA.

Customer Sample Quality Control

microRNA Microarray Expression ProfilingCustomer Sample Quality Control

Good              Poor Good              Poor Good              Poor

1 5% F ld h d A G l1.5% Formaldehyde Agarose Gel

Agilent BioAnalyzer Gel Image

Urea‐PAGE Gel

Failure in recovery of RNA <200 nt (including microRNA)

Agilent BioAnalyzer Gel Image

Images ©Norgen Biotek

Key Advantages of RNA Seq

Microarray vs RNA Sequencing

Key Advantages of Microarray Key Advantages of RNA‐Seq

• Provides a comprehensive view of the transcriptome. All transcripts can be 

l d ( RNA RNA RNA

Key Advantages of Microarray

• Robust, reliable method, proven over decades of use

analyzed (mRNA, ncRNA, snoRNA, lncRNA, miRNA, ...).

• Not necessarily dependent on any prior k l d

• High through‐put method – 100s of samples analyzed per month

• Streamlined handling – can be easily   sequence knowledge. 

• Increased dynamic range and tunable sensitivity. 

g yautomated

• Straightforward data analysis

Sh d i 5 d • Can detect structural variations such as gene fusions and alternative splicing events.

• Short turn‐around time – 5 days 

• Lower cost

• A truly digital solution (absolute abundance vs relative abundance).

microRNA Microarray Expression Profiling

Comprehensive Microarray Experiment

• Sample QC

Customer Total RNACustomer Total RNA

CustomerSequencesCustomerSequences

Sample QCSample QCmiRBasemiRBase

• Sample preparation

• Hybridization reactionsSmall RNA Isolation Small RNA Isolation

LabelingLabeling

Chip DesignChip Design

Chip SynthesisChip Synthesis

• Advanced data analysis

• High level customer supportChip QCChip QC HybridizationHybridization

Signal AmplificationSignal Amplification

Image AcquisitionImage Acquisition

Data ExtractionData Extraction

Data AnalysisData Analysis

CustomerAnalysis Report

CustomerAnalysis Report

Differentiated miRNAs of Biological & Statistical Significance ‐Multiple Chips

microRNA Microarray Expression Profiling

Control / TreatedBiological repeats Control       Treated

g g p p

p < 0.05

t‐Test

Array assay

p < 0.01

Multi‐array normalization and clustering analysis

Key Advantages of RNA Seq

Microarray vs RNA Sequencing

Key Advantages of Microarray Key Advantages of RNA‐Seq

• Provides a comprehensive view of the transcriptome. All transcripts can be 

l d ( RNA RNA RNA

Key Advantages of Microarray

• Robust, reliable method, proven over decades of use

analyzed (mRNA, ncRNA, snoRNA, lncRNA, miRNA, ...).

• Not necessarily dependent on any prior k l d

• High through‐put method – 100s of samples analyzed per month

• Streamlined handling – can be easily   sequence knowledge. 

• Increased dynamic range and tunable sensitivity. 

g yautomated

• Straightforward data analysis

Sh d i 5 d • Can detect structural variations such as gene fusions and alternative splicing events.

• Short turn‐around time – 5 days 

• Lower cost

• A truly digital solution (absolute abundance vs relative abundance).

Small RNA Sequencing and Data AnalysisComprehensive RNA Sequencing ExperimentComprehensive RNA Sequencing Experiment

• Sample QC

• Sample preparationp p p

• Library preparation

• High‐throughput sequencing 

• Advanced bioinformatics analysis

• High level customer support

Sequencing Run

Small RNA Sequencing and Data Analysisq g

Instrument: Illumina Genome Analyzer GAIIx

Length of Reads: 35 bases

Number of Reads: ~20‐30 Million

Data Output: ~0.7‐1.0 Gb

d ( d ) lBar‐coding (Indexing) Samples:

• We recommend 3 per lane, Max 4 per lane

• The total number of reads does not change with bar‐coding

• Sacrifice sequencing depth for lower cost

Total Reads / LaneNumber of 

Samples / LaneReads/ Sample

Samples / Lane30 M 1 30 M30 M 2 15 M30 M 3 10 M30 M 4 7 5 M30 M 4 7.5 M30 M 5 6 M30 M 6 5 M

Reg. Experimental Design

Sample Replicates for Expression Studies

Biological Replicates – Still Very Important

Sample Replicates for Expression Studies

o og ca ep cates St e y po ta t

• For experiments performed with a small number of biological replicates, significant results may be due to biological diversity between individuals and may not be reproducible it is impossible to know whether expressionmay not be reproducible ‐ it is impossible to know whether expression patterns are specific to the individuals in the study or are a characteristic of the test condition.

f f ff• There is no statistical significance for a difference observed between 2 samples.

• There is no magic to RNA‐Seq. These ideas are widely accepted for DNA g q y pmicroarray experiments, where a large number of biological replicates are now required to justify scientific conclusions.

Hansen KD, Wu Z, Irizarry RA, Leek JT. 2011 Sequencing technology does not eliminate biological variability. Nat Biotechnol 29:572–573. [abstract] 

Data Flow

Small RNA Sequencing and Data Analysis

Mappable readsRaw reads

Reads mapped to Reads un-mappedReads mapped to mammalian mirs in miRBase

Reads un-mapped to mammalian mirsin miRBaseACGT101‐miR 

v3.5 Software 

mirs mapped to species genome

mirs un-mapped to species genome

Reads un-mapped to mRNA, Rfam, and repbase

Reads mapped to mRNA, Rfam, and repbase

othersGroup 1 othersKnown species miRNAs

Reads mapped to species genome

Reads un-mapped to species genome

Reads mapped to species genome

Reads un-mapped to species genome

Group 4 no hitGroup 2 Group 3 G oup o tG oup G oup 3

Known miRNAscandidate species

miRNAs

Candidate species miRNAs genome

inconsistent with miRBase

Potentially novel miRNAs

IsomiRs

Small RNA Sequencing and Data Analysis

IsomiRs

Can explain discrepancies array data vs qRT‐PCR validation

Immune System Development

Immune‐related MicroRNAs are Abundant in Breast Milk Exosomes

Exosomes are membranous vesicles of endocyticorigin that are found in various body fluids andorigin that are found in various body fluids and that can mediate intercellular communication. miRNAs are packaged inside exosomes in human breast milk.

Id tifi d 602 i iRNA i i ti fIdentified 602 unique miRNAs originating from 452 miRNA precursors (pre‐miRNAs) in human breast milk exosomes using deep sequencing technology. Found that, out of 87 well‐characterized immune‐related pre‐miRNAs, 59 p(67.82%) are presented and enriched in breast milk exosomes (P < 10‐16, χ2 test). In addition, compared with exogenous synthetic miRNAs, these endogenous immune‐related miRNAs are more resistant to relatively harsh conditions

Distribution of pre‐miRNAs in breast milk exosomes. Out of 1,424 pre‐miRNAs deposited in miRBase 17 0 (blue circle) 87 (6 11%) pre‐miRNAsmore resistant to relatively harsh conditions.

The authors tentatively propose that these exosomal miRNAs are transferable genetic material from mother to infant, and are essential 

miRNAs deposited in miRBase 17.0 (blue circle), 87 (6.11%) pre‐miRNAs have been designated as immune‐related pre‐miRNAs based on annotation in the Pathway Central database (SABiosciences, MD, USA). Immune‐related pre‐miRNAs (59 of 452, 13.05%) are enriched in breast milk exosomes (red circle). χ2 test: Number of immune‐related miRNAs and others detected in breast milk exosomes compared with the total entries in miRBase 17.0.

Zhou Q, Li M, Wang X, Li Q, Wang T, Zhu Q, Zhou X, Wang X, Gao X, Li X. (2012) Immune‐related microRNAs are abundant in breast milk exosomes. Int J Biol Sci 8(1):118‐23. [article]

for the development of the immune system in infants.

p

Immune System Development

miR‐142‐3p regulates monocyte differentiation into macrophages

The differentiation of human peripheral blood monocytes into macrophages can be reproduced y p g pex vivo by culturing the cells in the presence of colony‐stimulating factor 1 (CSF1). 

Using microarray profiling, identified a dramatic decrease in the expression of the hematopoieticdecrease in the expression of the hematopoietic specific miR‐142‐3p. Up‐ and down‐regulation of this miRNA in primary human monocytes altered CSF1‐induced differentiation of monocytes, as demonstrated by changes in the expression of the cell surface markers CD16 and CD163. The expression of miR‐142‐3p is abnormally low in monocytes from patients with the most proliferative forms of chronic myelomonocyticleukemia (CMML) and miR‐142‐3p re‐expression

Fig 1. CSF1 induces down‐regulation of miR‐142‐3p in human primary CD14 + monocytes. (A) Heatmap representation of differentially regulated miRNAs in monocytes leukemia (CMML), and miR 142 3p re expression 

in CMML dysplastic monocytes can improve their differentiation potential. 

Found miR‐142‐3p which functions in a l l i i i h E 2 i f CSF1

before and after 6 days after CSF1 exposure (B) MiR‐142‐3p expression (quantitative real‐time PCR) in CSF1‐treated monocytes after 2, 4, and 6 days of treatment. 

Lagrange B et al. (2013) A role for miR‐142‐3p in colony‐stimulating factor 1‐induced monocyte differentiation into macrophages. BiochimBiophys Acta. [Epub ahead of print]. [abstract]

molecular circuitry with Egr2 is an actor of CSF1‐induced differentiation of human monocytes whose expression could be altered in CMML.

Innate Immune Response Regulation

Regulation of TREM2 expression by an NF‐kB‐sensitive miRNA‐34a

Genetic deficits and loss of function for the triggering receptor expressed in myeloid cells 2

Fig. 1 . Color‐coded cluster analysis showing microRNA triggering receptor expressed in myeloid cells 2 

(TREM2), a transmembrane spanning stimulatory receptor of the immunoglobulin/lectin‐like gene superfamily, have been associated with deficiencies in phagocytosis and the innate i t i Al h i ’ di

(miRNA) abundance in human hippocampal CA1. Fluorescent‐based miRNA array data for th fi timmune system in Alzheimer’s disease. 

A nuclear factor‐kB (NF‐kB)‐sensitive miRNA‐34a, upregulated in Alzheimer’s disease, was found to target the 299 nucleotide human TREM2 mRNA 

the five most significantly upregulated miRNAs in control and Alzheimer hippocampal CA1g

3'‐untranslated region (3'‐UTR) and downregulate the expression of a TREM2‐3'‐UTR reporter vector. 

The results suggest that an epigenetic

hippocampal CA1 samples are shown in (a); similar results were obtained from an LED‐northern dot blot assay (b)

The results suggest that an epigenetic mechanism involving an NF‐kB‐mediated, miRNA‐34a‐regulated downregulation of TREM2 expression may shape innate immune and phagocytic responses that contribute to 

Zhao Y, Bhattacharjee S, Jones BM, Dua P, Alexandrov PN, Hill JM, Lukiw WJ. (2013) Regulation of TREM2 expression by an NF‐kB‐sensitive miRNA‐34a. NeuroReport 24(6), 318‐323. [abstract]

inflammatory neurodegeneration

Fig. 2 . hsa‐miRNA‐34a‐TREM2‐mRNA‐3'‐UTR complementarity map. 

Innate Immune Response Regulation

microRNA 181 inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virusmicroRNA 181 inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication and has implications for controlling virus infection

Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) is one of the most important viralvirus (PRRSV) is one of the most important viral pathogens in swine industry. 

Report that miR‐181 can directly impair PRRSV infection. Results showed that delivered miR‐181 i i t l i hibit PRRSV li ti imimics can strongly inhibit PRRSV replication in 

vitro through specifically binding to a highly conserved region (over 96%) in the downstream of open reading frame 4 (ORF4) of the viral genomic RNA. The inhibition of PRRSV replication was pspecific and dose‐dependent. 

Highly pathogenic PRRSV (HP‐PRRSV) strain‐infected pigs treated with miR‐181 mimics showed substantially decreased viral load in blood and miR‐181c exhibits antiviral activity in vivo and relieves pigs from PRRSV‐substantially decreased viral load in blood and relief from PRRSV‐induced fever compared to negative control (NC)‐treated controls. 

These results implicate the important role of host 

miR 181c exhibits antiviral activity in vivo and relieves pigs from PRRSVinduced fever. (A) Rectal temperature curve of pigs from two groups after PRRSV JXwn06 infection. (B) Distribution of average rectal temperatures. (C) Viral growth curves in pigs of two groups. (D) Analysis of viral load in serum from 3 individuals with control (E) Survival curves of pigs treated with miR‐181c or NC mimics after PRRSV JXwn06 infection.

Guo XK et al. (2013) Increasing expression of microRNA 181 inhibits porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication and has implications for controlling virus infection. J Virol 87(2), 1159‐71. [abstract]

miRNAs in modulating PRRSV infection and viral pathogenesis, and also support the idea that host miRNAs could be useful for RNAi‐mediated antiviral therapeutic strategies. 

Innate Immune Response Regulation

Many microRNAs differentially expressed in infected Chinese Mitten CrabMany microRNAs differentially expressed in infected Chinese Mitten Crab haemocytes

The Chinese mitten crab Eriocheir sinensis is one of the most important freshwater aquacultureof the most important freshwater aquaculture crustacean species in China. 

Used the Illumina/Solexa deep sequencing technology to sequence two small RNA libraries 

d f h t f E i i dprepared from haemocytes of E. sinensis under normal conditions and during infection with Spiroplasma eriocheiris. Bioinformatic analyses identified 735 unique miRNAs, including 36 that are conserved in crustaceans and 134 that are novel to crabs. Many miRNAs were differentially regulated when exposed to the pathogen, and these findings support the hypothesis that certain miRNAs might be essential in host–pathogen interactions

Fig. 2. Comparison of differentially expressed miRNAs between the normal and infected haemocyte samples. The Venn diagram displays the pathogen interactions. 

Results suggest that elucidation of the molecular mechanisms responsible for miRNA regulation of the host’s innate immune system should help 

distribution of 735 unique miRNAs between normal haemocyte (left, blue circle) and infected haemocyte (right, orange circle) libraries. The dashed circles indicate the miRNAs that were significantly differentially expressed (p < 0.0001, Bonferroni corrected) in the two haemocyte samples.

Ou J et al. (2012) Identification and comparative analysis of the Eriocheirsinensis microRNA transcriptome response to Spiroplasma eriocheiris infection using a deep sequencing approach. Fish Shellfish Immunol 32(2), 345‐52. [abstract]

with the development of new control strategies to prevent or treat S. eriocheiris infections in crustaceans.

Innate Immune Response Regulation

microRNA‐150 Regulates Mobilization and Migration of Bone Marrow‐DerivedmicroRNA 150 Regulates Mobilization and Migration of Bone Marrow Derived Mononuclear Cells

The interaction between chemokine receptor type 4 (CXCR4) and its ligand, stromal cell‐type 4 (CXCR4) and its ligand, stromal cellderived factor (SDF)‐1, plays an important role in stem cell mobilization and migration in ischemic tissues. 

A l i b i b d iRNA filiAnalysis by microarray‐based miRNA profiling revealed that the expression of miR‐150 which targets Cxcr4 gene as predicted was significantly downregulated in bone marrow‐derived mononuclear cells (BM‐MNCs) after ( )MI.

Demonstrates that ischemia mobilizes BM stem cells via miR‐150/CXCR4 dependent mechanism and miR 150 may be a novel therapeutic targetand miR‐150 may be a novel therapeutic target for stem cell migration to the ischemic tissue for neovascularization and repair.

Tano N, Kim HW, Ashraf M (2011) microRNA‐150 Regulates Mobilization and Migration of Bone Marrow‐Derived Mononuclear Cells by Targeting Cxcr4. PLoS ONE 6(10), e23114. [article] Figure 1. AMI increases the numbers of BM‐MNCs 

and CXCR4 positive MNCs.

Innate Immune Response Regulation

let‐7g regulates expression of inflammatory cytokines

Fetal sheep muscle was sampled and miRNA expression analyzed by miRNA microarray. Further analyzed tumor necrosis factor α and

Expression of microRNAs (miRNAs) and potential targets of miRNA let‐7g in fetal LD muscle of obese (OB) versus control sheep (Con). (a) Further analyzed tumor necrosis factor α and 

IL‐6 mRNA expression, both of which were higher in OB compared with Con tissue (P<0.05, Figure 1c), indicating inflammatory response in OB fetal muscle.

( ) p ( ) ( )Quantitative RT‐PCR showed higher expression of miR‐381, but less let‐7g and miR‐376d in OB fetal muscle than in Con muscle. (b) mRNA expression of TNFRSF4 and FST were increased in OB compared with Con fetal muscle, both are potential targets of hsa‐let‐7g. (c) mRNA expression of tumor necrosis factor α and IL‐6 were higher in OB compared with Con fetal 

Yan X, Huang Y, Zhao JX, Rogers CJ, Zhu MJ, Ford SP, Nathanielsz PW, Du M. (2013) Maternal obesity downregulates microRNA let‐7g expression, a 

Overexpressed let‐7g in C3H10T1/2 cells, resulting in a decrease in the expression of inflammatory cytokines TNFα, IL6 and TLR4. Thus it is highly possible that miRNA let‐7g

muscle.

possible mechanism for enhanced adipogenesis during ovine fetal skeletal muscle development. Int J Obes (Lond) 37(4):568‐75. [abstract]

Thus, it is highly possible that miRNA let 7g has a role in the development of chronic inflammation in fetal muscle of obese sheep.

Adaptive Immune Response Regulation

miRNAs related to immune regulation and inflammation processesmiRNAs related to immune regulation and inflammation processes differentially expressed in the early phase of Schistosoma japonicum infection

Schistosomiasis remains an important global public health problem that affects 200 million people in 76 countries. 

miRNA microarray was applied to investigate differences in miRNA expression in differentdifferences in miRNA expression in different tissues of mice before and 10 days post infection in various tissues. Gene Ontology (GO) and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) analysis of the differentially 

d iRNA l d th tFig. 1. Expression profiling of miRNAs in 

expressed miRNAs revealed that many important biological pathways are triggered by schistosome infection in BALB/c mice, such as the MAPK signaling pathway, insulin signaling pathway, Toll‐like receptor signaling 

different tissues of mice following S. japonicum infection. (A) Venn diagram outlining the number of observed miRNA in liver, spleen and lung of mice; (B) heat‐map of miRNAs expression profile in liver, l l f i f ll i S

Han H, Peng J, Hong Y, Zhang M, Han Y, Liu D, Fu Z, Shi Y, Xu J, Tao J, Lin J. (2013) MicroRNA expression profile in 

pathway and TGF‐β signaling pathway.

Results may be helpful in the search for potential new drugs, and for biomarkers of early S japonicum infection applicable in the

spleen lung of mice following S. japonicum infection.

, , ( ) p pdifferent tissues of BALB/c mice in the early phase of Schistosoma japonicum infection. Mol BiochemParasitol 188(1), 1‐9. [abstract]

early S. japonicum infection applicable in the future control of schistosomiasis.

Adaptive Immune Response Regulation

The inflammatory microRNA‐155 is upregulated during acute myocarditis andThe inflammatory microRNA 155 is upregulated during acute myocarditis and contributes to the adverse inflammatory response to viral infection of the heart

Cardiac microRNAs were profiled in both human myocarditis and in Coxsackievirus B3‐injectedmyocarditis and in Coxsackievirus B3 injected mice, comparing myocarditis‐susceptible with nonsusceptible mouse strains longitudinally. 

Found that microRNA‐155 expression during fmyocarditis was localized primarily in infiltrating 

macrophages and T lymphocytes. Inhibition of microRNA‐155 by a systemically delivered LNA‐anti‐miR attenuated cardiac infiltration by monocyte‐macrophages, decreased T y p g ,lymphocyte activation, and reduced myocardial damage during acute myocarditis in mice. Beyond the acute phase, microRNA‐155 inhibition reduced mortality and improved cardiac f nction d ring 7 eeks of follo pcardiac function during 7 weeks of follow‐up.

Data show that cardiac microRNA dysregulation is a characteristic of both human and mouse viral myocarditis. The inflammatory microRNA‐155 is 

MicroRNA (miRNA) expression profiles of viral myocarditis in susceptible (C3H) or nonsusceptible (C57BL/6N) mice

Corsten MF et al. (2012) MicroRNA profiling identifies microRNA‐155 as an adverse mediator of cardiac injury and dysfunction during acute viral myocarditis. Circ Res 111(4),415‐25. [article]

upregulated during acute myocarditis, contributes to the adverse inflammatory response to viral infection of the heart, and is a potential therapeutic target for viral myocarditis.

Adaptive Immune Response Regulation

microRNA‐146a is a modulator of IL‐2 expressionmicroRNA 146a is a modulator of IL 2 expression and activation‐induced cell death in T lymphocytes

Activation of the T cell–mediated immune response has been associated with changes inresponse has been associated with changes in the expression of specific microRNAs (miRNAs). 

Used miRNA microarray to show that miR‐146a is low in human naive T cells and is abundantly expressed in human central memory CD4+ and CD8+ T lymphocytes ; consistently, miR‐146a is induced in human primary T lymphocytes upon T‐cell receptor (TCR) stimulation. Also identified NF‐kB and c‐ETS binding sites as required for g qthe induction of miR‐146a transcription upon TCR engagement. 

Results demonstrate that several signaling path a s other than inflammation are

MiR‐146a is expressed in T lymphocytes. (A) MiR‐146a levels were measured in human purified primary CD4+ and CD8+ cells by qRT‐PCR, using U6 levels to normali e expression (B) CD4+CD45RA+ human naive T lymphocytes werepathways, other than inflammation, are 

influenced by miR‐146a. Furthermore, miR‐146a enforced expression impairs both activator protein 1 (AP‐1) activity and interleukin‐2 (IL‐2) production induced by TCR 

normalize expression. (B) CD4+CD45RA+ human naive T lymphocytes were stimulated with PMA and ionomycin and miR‐146a levels were measured at different times by qRT‐PCR. (C) Jurkat cells were stimulated with anti‐CD3/CD28 Abs or with PMA and ionomycin and MiR‐146a levels were measured at different times by qRT‐PCR. Each bar is the mean of 3 independent experiments. 

Curtale G, et al. (2010) An emerging player in the adaptive immune response: microRNA‐146a is a modulator of IL‐2 expression and activation‐induced cell death in T lymphocytes. Blood 115(2), 265‐73. [article]

engagement, thus suggesting a role of this miRNA in the modulation of adaptive immunity.

CompanyOverview• Global ‐ Genomics & Proteomics Services Provider 

• Headquarters in Houston, Texas ‐ USA

• Offices in USA & ChinaOffices in USA & China 

• Representatives in Japan, Korea, & India

• Extensive Experience

• Providing services since 2005

• Processed > 12,000 samples

• Primary Technological Advantage

• μParaflo® Microfluidics Technology ‐ customizable

Results• Results

• Diverse customer base (> 1400 institutions, > 40 countries)

• ~600 customer publications 

• Excellent reputation in marketplace

• Worldwide sales40

Global Reach – Distribution Channels

United StatesLC Sciences, LLCHouston, TXinfo@lcsciences.comwww.lcsciences.com

ChinaLC BioHangzhou

JapanALLIANCE Technology, Inc.Kyoto City

KoreaYeBTSeoul

IndiaGenetix Biotech Asia (P) Ltdg

info@lc‐bio.comwww.lc‐bio.com

Kyoto Cityinfo@alliance‐technology.jpwww.alliance‐technology.jp

bdhan@yebt.netwww.yebt.net

tdNew Delhi www.genetixbiotech.com

49

Thank You!For Questions or Feedback: service@lcsciences.com

50