Impatto dell’eritropoietina e della riossigenazione su cellule tumorali

testa collo irradiate in ipossia

Scuola di Specializzazione in Biochimica Clinica

Presentata dalla Dott.ssa

Monica MaffiCo-relatore Prof.

Gianpiero Pescarmona

Marur and Forastiere, 2008

HNSCC • gruppo di tumori solidi localizzati della linea epiteliale della cavità orale, faringea e della laringe

• fattori di rischio: fumo, alcool, HPV, EBV

• over-espressione di EGFR associata a radioresistenza

• trattamento antiblastico: radio-chemio terapia integrata, causa di comparsa di anemia

Modello ideale per studiare l’impatto dell’anemia e dell’ipossia tumorale in risposta alla radioterapia

• proprietà patofisiologica di molti tumori solidi localmente avanzati: pO2 ≤ 2.5mmHg

• necrosi tumorale causata da scarsa vascolarizzazione

• adattamento del tumore all’ipossia: modifica del fenotipo cellulare e promozione del metabolismo anaerobico

• ipossia induce over-espressione di EGFR

• risposta in vivo di tale adattamento all’ipossia: perdita controllo apoptosi, proliferazione tumorale, angiogenesi e radioresistenza

IPOSSIA E TUMORI

L’anemia associata ai tumori contribuisce allo sviluppo dell’ipossia e alla radioresistenza

Eritropoietina (EPO)

• ormone glicoproteico essenziale di circa 30.4 kDa

• fam. di citochine di classe I

• struttura: 4-α eliche

• gene: 5 esoni sul cromosoma 7 (uomo)

• fattore di crescita eritroide

• in ipossia aumenta di circa 1000 volte l’m-RNA di EPO

EPO ricombinante (rHuEPO) è utilizzata per trattare pazienti enemici

Uno dei geni transattivati dal legame di HIF1 all’HRE è il gene che codifica per l’EPO

Recettore nucleare

ipossia

+

HIF1

nucleo

Gene EPO

HIF1

p300

HNF4

Adattatore trascrizionale

EPO

EPOR

Omodimerizzazione di due mol di EPOR

Tirosine fosforilate che fungono da ponte e attivano prot Src homology come STA5 e PI3K

Pathways attivati da EPO/EPOR:

JAK2/STAT5: si formano dimeri di STAT che traslocano nel nucleo dove attivano trascrizione di geni target che inducono differenziazione eritroide

RAS/PI3K: pathways che attiva AKT e P70 che inducono trascrizione genica e progressione del ciclo cellulare

Segnale spento da feedback – indotto da fosfatasi cells ematopoietiche SH1 che deP JAK2 e inattiva EPOR

L’effetto biologico di EPO è mediato dal suo legame con EPOR espresso sia sulla superficie delle cells progenitrici della linea eritroide sia su molti tipi cellulari non ematopoietici tra cui cells tumorali.

EPO e tumore

Henke M, Laszig R, Rube C, Schafer U, Haase KD, Schilcher B, Mose S, Beer KT, Burger U, Dougherty C, Frommhold H. Erythropoietin to treat head and neck cancer patients with anaemia undergoing radiotherapy: randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 2003; 362: 1255-60.

• dati clinici ottenuti da trial effettuati da diversi centri su pazienti affetti da tumore testa collo evidenziano un impatto negativo di EPO sul controllo tumorale e sulla sopravvivenza in pazienti affetti da SCCHN trattati con EPO e radioterapia

• up-regolazione di EPO in differenti cellule tumorali tra cui HNSCC

Scopo del progetto

• esaminare la relazione esistente tra ipossia, livello di espressione di EPO/EPOR e di EGFR e i loro effetti sulla risposta cellulare a RT

• la causa della proliferazione cell e dello sviluppo tumorale in pazienti anemici può essere la somministrazione di rHuEPO?

Disegno sperimentale in vitro studiato per approfondire l’impatto della riossigenazione e di EPO sulla sopravvivenza cellulare in ipossia dopo RT (cells esprimono EPOR)

± RT

0 h 144 h48 h 72 h 120 h96 h

MTT

per l’analisi di espressione di m-RNA e di proteine.

Ipossia 48h

Ipossia 72h

± Epo

Raccolta cellule

Semina

NORMOSSIA

Ipossia 24h

± Epo

Reox 24h

± Epo

Ipossia 24h

± Epo

Ipossia 24h

± Epo

Reox10’

20’

196h

Disegno sperimentale

% SF= Percentage of survival fraction

Analisi di citotossicità

contro

lloep

o

Iposs

ia 24

h

Iposs

ia 24

h + e

po

Iposs

ia 24

h + re

ox 24

h

Iposs

ia 24

h + re

ox 24

h + e

po

iposs

ia 48

h

iposs

ia 48

h + e

po0

50

100

no radio

radio

% S

F

Espressione di EPOR a livello di m-RNA

L’ipossia incrementa l’espressione genica di EPOR.

Il trattamento con EPO aumenta m-RNA di EPOR, il livello di espressione diminuisce dopo RT.

La riossigenazione non ha alcun effetto su EPOR.

IpossiaEsposizione a EPO

Riossigenazione

Espressione della proteina EPOR

L’ipossia e l’esposizione a EPO inducono l’espressione di EPORRT amplifica l’espressione di EPOR ma non modifica l’effetto dell’ipossia.La riossigenazione amplifica l’espressione di EPOR.

Espressione di EPOR sulla membrana

Il livello basale di EPOR nelle cellule CAL166 è uguale a zero.Sia EPO che ipossia inducono una minima espressione di EPOR

sulla superficie cellulare (da 200 a 600 recettori per cell).

L’ipossia induce la trascrizione di EGFR, ma il suo livello ritorna basale dopo RT.

L’aggiunta di EPO non ha effetti sull’espressione di EGFR.

La riossigenazione sembra contrastare gli effetti delle RT.

Stimolo proliferativo: espressione dell’m-RNA di EGFR

Esposizione a EPO

Ipossia

Riossigenazione

Non si ha modulazione sulla quantità totale di EGFR, mentre il livello di fosforilazione incrementa ad ogni trattamento con un massimo dopo 24h di ipossia.

La somministrazione di EPO in normossia up-regola sia l’espressione sia l’attivazione.

Espressione e attivazione di EGFR

Il ruolo di AKT

AKT totale è indotto sia dall’ipossia sia da RT sia da EPO ma non dalla riossigenazione.

AKT è fortemente indotto da EPO dopo 24h di ipossia.

Apoptosi

Le caspasi 3 e 9 sono attivate sia da EPO che dall’ ipossia.

La riossigenazione, soprattutto a tempi brevi, induce un aumento dell’apoptosi.

Meccanismo di riparo del DNA

L’EPO, la RT e l’ipossia da sola up-regolano l’espressione di XRCC1. La somministrazione di EPO in ipossia annulla questo effetto.

La riossigenazione non ha effetti su cell trattate con EPO e RT ma amplifica l’effetto di XRCC1 in ipossia.

• EPOR, nella linea CAL166, è localizzato nel citosol e non sulla superficie cellulare, almeno in condizioni fisiologiche. L’espressione di EPOR nel modello cellulare analizzato non sembra essere essenziale per la loro crescita

• La riossigenazione abbatte la radioresistenza indotta dall’ipossia; al contrario la somministrazione di EPO dopo ipossia non compromette l’efficacia della RT

• L’amplificazione osservata del segnale di EGFR contribuisce alla radioresistenza inducendo la proliferazione cellulare, regolando il meccanismo di riparazione del DNA e attivando i pathways MAPK e PI3K

• Si può ipotizzare che l’attivazione di EGFR sia il meccanismo utilizzato da EPO per mediare la sopravvivenza cellulare in condizioni ipossiche in vivo

• L’attivazione del pathway apoptotico potrebbe essere un segnale indotto da EPO che si contrappone a quello proliferativo (EGFR/AKT)

• L’EPO nel nostro studio non stimola la proliferazione delle cells CAL166 né in normossia né in ipossia e non risulta nemmeno interferire con l’effetto antiproliferativo citotossico e/o apoptotico delle radiazioni

Conclusioni

• altre linee cell radioresistenti (in particolare HNSCC).

• Co-coltura con cellule endoteliali per studiare l’impatto di EPO sul microambiente circostante il tumore.

• EPO potrebbe anche attivare altri pathways della linea eritroide come TRPCs e il suo effetto potrebbe essere modulato da micro-RNAs.

• Inibitore di EGFR (anticorpi monoclonali o inibitori tirosina chinasici come Iressa o Erlotinib) somministrato in combinazione con EPO e RT: se diminuisce radioresistenza allora EPO induce over-espressione di EGFR e conseguente proliferazione cells tumorali.

Progetti futuri

Lo Nigro C., Maffi M., Fischel JL., Monteverde M., Catarsi P., Tonissi F., Lattanzio L., Riba M., Etienne MC., Formento P., Milanò G., Merlano M.

Impact of erythropoietin on the effects of irradiation under hypoxia.

Journal of Cancer Research Clinical Oncology. 2009; 135:1615-1623.

Federica TonissiMartino MonteverdeFrancesca CavicchioliLaura LattanzioLo Nigro Cristiana Laboratorio Oncologia Translazionale

ASO S. Croce Cuneo

Marco Merlano SC OncologiaASO S. Croce Cuneo

Jean Louis FischelPatricia FormentòGerard Milanò Laboratoire d’Oncopharmacologie

Centre Antoine Lacassagne, Nice

Ringraziamenti

Effetto delle citochine sulla sintesi di EPO indotto in ipossia

• Neoplasie: linfociti T e monociti producono citochine che inducono aumento di sintesi epatica di proteina C reattiva, fibrinogeno.

• Ipossia da un lato induce eritropoiesi dall’altro down-regola epcidina (blocca assorbimento del ferro) tramite induzione di EPO.

• Le citochine (TNF-alfa, INF-gamma e IL-1) concorrono all’insorgenza dell’anemia inibendo EPO indotta in ipossia (in cells tumorali).

• In contrasto la citochina IL-6, in modelli cellulari tumorali, stimola la produzione di EPO in ipossia.

• Questi mediatori cell potrebbero essere degli importanti regolatori sulla produzione di EPO in vivo. Questo potrebbe spiegare i risultati discordanti osservati in pazienti trattati con EPO affetti da tumore.

• Nel nostro studio non ho approfondito lo stimolo di produzione di EPO da parte di IL6 o da altre citochine ma potrebbe essere interessante valutare il ruolo in vivo di IL6 come modulatore dell’espressione di EPO.

Esperimenti preliminari

Valutare la IC50 di differenti linee cellulari in rapporto a diverse dosi di raggi X e ad esposizione alle condizioni ipossiche

%SF hep2

CLEPO

HYP24

HYP24+E

PO

HYP24+R

IOX

HYP48

HYP48+E

PO

0

50

100

140

OD

%SFcal166

CLEPO

HYP24

HYP24+E

PO

HYP24+R

IOX

HYP48

HYP48+E

PO

0

50

100

NO RTRT

OD

%SF cal33

CLEPO

HYP24

HYP24+E

PO

HYP24+R

IOX

HYP48

HYP48+E

PO0

50

100

130

od

RTNO RTNO RT

RT

% SF under hypoxia

0 10 20 30 40 500

50

100

150 cal33 normossiacal33 ipossia

cal166 normossiacal166 ipossia

Hep 2 normossia

Hep2 ipossia

Durata ipossia

O.D

Radiation effect on OD

0 5 10 15 20 250

1

2

3

4CAL33

CAL166

Hep2

irradiation Gy

OD

Proteina Von Hippel Lindau

Interazione necessaria affinchè avvenga l’ubiquitinazione di HIF da parte del complesso E3-ubiquitina ligasi e la conseguente inattivazione proteolitica e degradazione da parte del proteasoma 26S

Catalizzata da un set di enzimi (tipo digossigenasi) che vengono attivati solo in presenza di O2

In ipossia non avviene idrossilazione, Hif è stabile e trasloca nel nucleo: eterodimero

HIF1 lega HRE di geni target (in promotore o enhancer) e ne promuove la trascrizione

(EPO,VEGF,NOS,enzimi glicolisi, tirosina idrossilasi)

Espressione m-RNA di HIF1α

L’espressione di HIF1α diminuisce in ipossia.

RT aumenta l’espressione di HIF1α.

EPO da solo e in combinazione con riossigenazione aumentano m-RNA di HIF1α.

La riossigenazione non ha effetto

L’ipossia non ha effetto sull’espressione della proteina HIF1α.

HIF1α è fortemente indotto da RT, riossigenazione e EPO.

Espressione della proteina HIF1α

Apoptosi

Nessun effetto evidenziabile sul livello di espressione di Bcl2 e Bax.

p21

Solamente l’ipossia induce una up-regolazione di p21.