implementación de un biosensor colorimétrico de flujo
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Implementación de un biosensor colorimétrico de flujo lateral a partir de los
derivados del capullo de Bombyx Mori y nanopartículas de oro para la detección
de Helicobacter Pylori
Yenny Carolina Jiménez Peña
Universidad de los Andes. Departamento de Ingeniería Química
2015
Resumen: Los derivados del capullo de Bombyx Mori como la fibroína tienen variadas
aplicaciones, entre las cuales se encuentra la creación de biosensores. Las propiedades
de este material tales como alta resistencia, bio-compatibilidad y bio-degradabilidad lo
hacen una buena alternativa para la creación de bio-dispositivos de detección de
sustancias. Por tanto, este proyecto busca la implementación de un biosensor
colorimétrico de flujo lateral a partir de los derivados del capullo de Bombyx Mori para
detectar Helicobacter Pylori. La metodología implementada permitió la obtención de
fibroína de los capullos, la construcción de primeros prototipos del dispositivo con
capullo sin tratar, capullo con sericina removida e hidrogeles derivados de fibroína.
Cabe resaltar que dichos prototipos fueron creados con el objeto de determinar cuál es la
mejor opción para que el flujo lateral se dé con mayor rapidez. El arreglo que se empleó
para la implementación del sensor fue aquel que estaba compuesto exclusivamente de
fibroína desgomada. Como resultado final de la implementación se observó un cambio
significativo de color en la zona de prueba y control. Sin embargo, no se puede
diferenciar con claridad las dos zonas probablemente debido a que los conjugados
nanopartículas-ADN no fueron obtenidos correctamente y no se fijaron a dichas zonas.
Por tanto, la implementación del dispositivo no fue satisfactoria.
Palabras clave: Capullo de Bombyx Mori, fibroína, flujo lateral, biosensor,
nanopartículas de oro, Helicobacter Pylori
1. INTRODUCCIÓN
Según datos estadísticos de la
Organización Mundial de la Salud
(OMS) el cáncer gástrico es la cuarta
causa de muerte entre las muertes por
cáncer. Colombia se encuentra
clasificado como un país con elevada
incidencia de ésta afección por lo que su
población está en alto riesgo de sufrir
cáncer gástrico (Herszényi, 2010). Un
dato que corrobora lo dicho es que éste
tipo de cáncer es el más frecuente a
nivel nacional, tanto en hombres como
en mujeres y la tasa de mortalidad es
elevada en comparación a otros países,
aunque se ha mantenido relativamente
constante entre el año 2000-2012, 10
muertes por cada 100 000 habitantes
(Así vamos en salud, 2013). Por otra
parte, el factor de riesgo más notorio
dentro de la patogenia de ésta
enfermedad es la infección por
Helicobacter Pylori, una bacteria de
crecimiento lento y forma helicoidal
con abundantes flagelos. Afecta
aproximadamente al 50% de la
población mundial y es la responsable
de causar la gastritis crónica. Como
consecuencia de tener esta bacteria y no
tratarla, se genera deficiencia en la
absorción de nutrientes y se vincula con
la aparición de enfermedades crónicas
(Alba, Toledo, & Viana, 2006). Por lo
anterior, es de suma importancia
encontrar una manera de detectar la
bacteria Helicobacter Pylori de forma
rápida para prevenir y tomar acciones
concretas contra el cáncer gástrico. Una
alternativa promisoria para lograr este
fin es el uso de biosensores, los cuales
son instrumentos analíticos que
transforman una respuesta biológica en
una señal eléctrica y permiten su
cuantificación. Dichos instrumentos se
caracterizan por ser altamente fiables y
específicos, son selectivos, estables en
condiciones normales de
almacenamiento, la respuesta generada
es rápida, precisa, exacta y por lo
general son portables. En la actualidad
existen muchas aplicaciones
importantes con respecto a estos
dispositivos electrónicos como
detección de oxígeno, sensores de pH,
conjunto de lentes, rejillas de
difracción, control de alimentos, control
de polución, monitoreo de procesos
industriales como la fermentación para
la producción de cerveza, control de
fertilidad y de enfermedades infecciosas
en animales, entre otras (Maquieira,
2010). Como las anteriores muchas de
las aplicaciones con biosensores se dan
en el sector biomédico por lo cual este
tipo de dispositivos requieren ser
diseñados a partir de materiales que
además de presentar propiedades
mecánicas y químicas adecuadas,
presenten ciertas características
especiales como una alta bio-
compatibilidad, un bajo tiempo de
biodegradación y excelentes
propiedades eléctricas. Es por esto que
para el presente proyecto se pretende
usar los derivados del capullo de
Bombyx Mori para la implementación
de un biosensor colorimétrico de flujo
lateral para la detección de Helicobacter
Pylori. Adicionalmente, al emplear
derivados del capullo de Bombyx Mori
se está buscando crear un producto de
valor agregado a partir de una materia
prima económica y disponible a nivel
nacional.
El capullo de Bombyx Mori está
compuesto principalmente por dos
proteínas, fibroína y sericina, la
primera de estas es la proteína
estructural de las fibras de seda y la
segunda es el adhesivo que mantiene las
fibras de seda juntas y tiene un carácter
alergénico. Adicionalmente, la fibroína
está conformado por polipéptidos
ligeros y pesados unidos por un enlace
disulfuro y requiere de tratamiento para
su purificación y extracción del capullo,
esto se consigue removiendo la sericina
(Preda & et.al, 2013). Características
de la seda como bio-degradabilidad.
bio-compatibilidad, tasas de
degradación controlables y versatilidad
para generar diferentes materiales desde
geles hasta fibras y esponjas, han
generado interés en el campo de los
biomateriales para obtener productos de
alto valor agregado. También, la
relativa facilidad con la que las
proteínas de la seda pueden ser
procesadas y convertidas en diferentes
materiales, opciones de
funcionalización química versátiles,
procesamiento en agua o solventes y
características mecánicas diversas hacen
del capullo de Bombyx Mori una
alternativa promisoria para la obtención
de productos con variada aplicabilidad
(Rockwood, 2011).
Por otra parte, los dispositivos de flujo
lateral hoy en día se han convertido en
una alternativa para obtener resultados
de detección de diversas sustancias en
menos tiempo en comparación con los
laboratorios especializados. Estos
dispositivos se implementan para
realizar análisis tanto cualitativos como
cuantitativos (Sajid & et.al, 2014).
Algunas de las ventajas que tienen este
tipo de dispositivos son: Rápido análisis
en un solo paso, bajo costo operacional,
instrumentación simple, formato
amigable para el usuario, alta
especificidad, estabilidad a largo plazo
bajo diferentes condiciones ambientales
y portabilidad (Gao & et.al, 2014). La
Figura 1 ilustra los cuatro componentes
básicos de un dispositivo de flujo
lateral: Sample pad (almohadilla de
muestreo), conjugate pad (almohadilla
de conjugación), test pad (almohadilla
de prueba y adsorbent pad (almohadilla
de absorción).
La almohadilla de muestreo está hecha
generalmente de celulosa o fibra de
vidrio y su función es transportar la
muestra a los otros componentes del
dispositivo de manera suave, continua y
homogénea (Sajid & et.al, 2014). Para
este proyecto la muestra de ADN de
Helicobacter Pylori será suministrada
sobre esta almohadilla.
La almohadilla de conjugación es el
lugar donde las moléculas de bio-
reconocimiento son dispensadas, en este
caso los conjugados primer-
nanopartículas de oro. Su función es
transportar el conjugado de
nanopartículas con ADN hacia la
almohadilla de prueba. Él conjugado
debe ser estable a lo largo de toda la
prueba para asegurar resultados
correctos (Sajid & et.al, 2014).
La almohadilla de prueba generalmente
está conformado por membrana de
nitrocelulosa y sobre ella se realizan las
líneas de prueba y control. Debe
proveer soporte y buena unión para
capturar anticuerpos, aptámeros, etc.
(Sajid & et.al, 2014) Para éste proyecto
se probaran diferentes derivados del
capullo para determinar cuál es la mejor
para implementar dicha almohadilla.
La almohadilla absorbente actúa como
reservorio al final del dispositivo. Éste
también ayuda a mantener la tasa de
flujo del líquido sobre la membrana y
evita el flujo hacia atrás de la muestra.
La capacidad de adsorción de esta
almohadilla puede jugar un papel
importante en el desarrollo de las
pruebas (Sajid & et.al, 2014).
A continuación se muestra la estructura
general que debe tener un dispositivo de
flujo lateral y su funcionamiento.
Figura 2. Funcionamiento dispositivo de flujo
lateral (Sajid & et.al, 2014).
Figura 1. Estructura dispositivo flujo lateral (Assadollahi & et.al,
2009)
Almohadilla
de muestreo
Almohadilla
de
conjugación
Almohadilla de prueba
En la figura 2 se puede ver el
funcionamiento del dispositivo. En la
almohadilla de muestreo se deposita la
muestra con el analito objetivo y este
tiene que viajar a lo largo de este hasta
llegar a la almohadilla de conjugación
donde se forma el conjugado y por
capilaridad se llega a la almohadilla de
prueba donde aparece color dado que se
detectó la sustancia, si no se detecta
simplemente queda una línea de color
que corresponde a la línea de control.
Cabe resaltar que las cadenas de ADN
de la bacteria Helicobacter Pylori que
serán empleadas durante el desarrollo
de este proyecto son las
correspondientes a las secuencias:
𝑨𝑪𝑻 − 𝟏 ( 5′ − 𝐶𝑇𝑇 𝐺𝐶𝑇 𝐴𝐺𝐴 𝐺𝑇𝐺 𝐶𝑇𝐺 𝐴𝑇𝑇 𝐴 − 3′)
𝑨𝑪𝑻 − 𝟐 ( 5′ − 𝑇𝐶𝐶 𝐶𝐴𝐶 𝐴𝐶𝑇 𝐶𝑇𝐴 𝐺𝐴𝐴 𝑇𝐴𝐺 𝑇 − 3′)
Dichas cadenas corresponden a las
secuencias del ARNr 16S que son las
que permiten obtener información
filogenética y taxonómica de los
procariotas. El análisis de la secuencia
de los ARNr 16S de distintos grupos
filogenéticos revela la presencia de una
o más secuencias características que se
denominan oligonucleótidos firma, que
son aquellas secuencias específicas
cortas que aparecen en todos los
miembros de un determinado grupo
filogenético y nunca están presentes en
otros grupos, aún en los más próximos
(Bioted, 2013). En microbiología
clínica la identificación molecular
basada en la zona 16S se emplea para la
identificación de bacterias pues requiere
menos tiempo y la técnica es más
simple (Rodicio, 2004). Por estas
razones, se consultó en literatura cuáles
eran las secuencias de ADN que
correspondían a la zona 16S de la
bacteria Helicobacter Pylori para
garantizar en las pruebas que se
estuviera trabajando con dicho
microorganismo, y se encontraron las
cadenas mencionadas previamente. Para
corroborar que las cadenas
correspondían al microorganismo y a la
zona 16S se buscó en la base de datos
de NCBI (National Center for
Biotechnology Information) a través del
programa BLAST (Basic Local
Allignment Search Tool), las cadenas
mencionadas y se encontró coincidencia
en la búsqueda. En el anexo A se
encuentran las imágenes que permiten
comprobar lo dicho anteriormente.
A continuación se expondrá la
metodología y resultados obtenidos del
trabajo realizado para lograr el objetivo
de la implementación del dispositivo
deseado.
2. METODOLOGÍA
REACTIVOS
Bromuro de litio (100g) con una pureza
mayor o igual al 99% de la empresa
Sigma-Aldrich sin pre tratamiento,
carbonato de sodio (100g) con una
pureza mayor o igual al 99% de la
empresa Merck sin pretratamiento ,
agua desionizada, agua ultrapura a 22°C
con una resistividad de 18.2 MΩ-cm,
Cloruro de sodio (100g) con una pureza
mayor o igual al 99% de la empresa
Merck sin pre tratamiento, azida de
sodio (1g) con una pureza mayor o igual
al 99% de la empresa Merck sin pre
tratamiento, monofosfato de sodio
(1.5g) con una pureza mayor o igual al
99% de la empresa Merck sin pre
tratamiento, difosfato de sodio (4g) con
una pureza mayor o igual al 99% de la
empresa Merck sin pretratamiento,
ácido tetracloroaúrico (0.02g) con una
pureza mayor o igual al 99% de la
empresa Sigma-Aldrich sin pre
tratamiento, carbonato de sodio (0.52g)
con una pureza mayor o igual al 99%
sin pre tratamiento de la empresa
Merck, primers ACT-1 y ACT-2 de la
empresa Gentech a una concentración
de 44nm con los grupos funcionales tiol
y biotin.
2.1 Extracción de fibroína a
partir de los capullos de
Bombyx mori
La metodología empleada se basa
en los procedimientos propuestos
por (Rockwood, 2011).
1. Cortar los capullos en pequeños
trozos y pesar 5g.
2. Pesar 4.24g de carbonato de sodio.
3. Llenar un beaker de vidrio de 2L con
2L de agua desionizada y calentar hasta
que el agua empiece a ebullir (T=92-93
°C).
4. Adicionar el carbonato de sodio al
agua hirviendo y disolver
completamente para obtener una
solución de carbonato de sodio de
0.02M.
5. Agregar los capullos en trozos (5g) a
la solución en ebullición durante 30
min. Ocasionalmente con una espátula
agitar para promover la dispersión de la
fibroína y la remoción de sericina.
6. Después de los 30 min hay que
descartar la solución carbonato/sericina
por el lavabo (usar guantes resistentes al
calor) y mover las fibras de seda
desgomadas en un beaker lleno con
aproximadamente 1L de agua
desionizada. Las fibras se enfriarán y se
enjuagarán a mano. Descartar el agua.
7. Adicionar 1.5 L de agua desionizada
y mantener las fibras en el beaker por
20 min. Enjuagar ocasionalmente a
mano.
8. Cambiar el agua y repetir el
procedimiento del punto anterior dos
veces.
9. Después de enjuagar 3 veces, sacar
las fibras, exprimir el agua y desligar las
fibras a mano.
10. Dejar secar al menos 12 h en una
cabina de extracción a temperatura
ambiente.
2.2 Solubilización de Fibroína en
LiBr
La metodología empleada se basa
en los procedimientos propuestos
por (Rockwood, 2011).
1. Preparar una solución 9.3M de LiBr
(Precaución por reacción exotérmica,
para grandes cantidades prepararla
sobre hielo).
2. Hacer una solución 20% w/v de
fibras de seda secas en la solución 9.3M
de LiBr. Colocar la cantidad calculada
de fibras de seda en un pequeño beaker
de vidrio (50mL aprox) y empacarlas de
tal manera que queden bien apretadas.
Luego verter el volumen calculado de
LiBr sobre las fibras y cubrir el beaker
con papel aluminio.
3. Ubicar el beaker en el horno a 60°C
durante 4h.
2.3 Diálisis y centrifugación
La metodología empleada se basa
en los procedimientos propuestos
por (Rockwood, 2011).
1. Hidratar los tubos de diálisis por unos
pocos minutos (2-3 min) llenando por
completo un beaker de 1L con agua (Se
requiere 1L de agua por tubo de diálisis
empleado).
2. Con una jeringa de 20 mL y una
aguja de calibre 18 insertar 12mL de la
solución fibroína/LiBr en los tubos de
diálisis.
3. Depositar los tubos de diálisis a un
beaker con 1L de agua.
4. Cambiar el agua después de: 1, 3, 5-6
h (tres cambios el primer día); en la
mañana siguiente y en la tarde (dos
cambios en el segundo día); y al día
siguiente cambiar el agua en la mañana.
5. Con una nueva jeringa de 20mL y
una aguja de calibre 18 remover
aproximadamente 20mL de la solución
de fibroína del tubo de diálisis.
Remover la aguja y depositar la
solución en un tubo de falcon. Repetir
este paso hasta remover en su totalidad
la solución de fibroína del tubo de
diálisis.
6. Centrifugar por 40 minutos a 4°C a
4500 rpm. Transferir la solución de
fibroína en un nuevo y limpio tubo de
falcon y repetir este paso.
7. Después de la segunda centrifugación
transferir la solución a un nuevo tubo de
falcon para almacenarla a 4°C.
2.4 Obtención de hidrogeles a
partir de fibroína
La metodología empleada se basa
en los procedimientos propuestos
por (Rockwood, 2011).
1. Preparar muestras de la solución de
fibroína en tubos Eppendorf
(1mL/tubo) ó 5mL de solución/tubo de
falcon. La concentración más usada es
4% w/v.
2. Sonicar por 30 s con una amplitud de
20%.
3. Transferir la solución sonicada a una
caja de Petri.
4. Incubar a 37°C y observar la
transición a gel,
5. Una vez la fibroína esté gelada
extraer muestras del tamaño deseado.
2.5 Obtención de nanopartículas de
oro
La metodología empleada se basa
en los procedimientos propuestos
por (Taton, 2002).
1. Tomar 0.02g de ácido
tetracloroaúrico (HAuCl4) y preparar
una solución acuosa hasta tener una al
1%.
2. Preparar una solución acuosa de
citrato de sodio 40mM.
3. Colocar en una plancha de
calentamiento un vaso de precipitado de
50mL con 10mL de agua y calentar
hasta que el agua empiece a ebullir.
4. Agregar 100µL de la solución de
ácido tetracloroaúrico al agua que está
en ebullición y esperar dos minutos.
Luego agregar 100µL de solución de
citrato de sodio y dejar en ebullición por
20min. Debe haber agitación constante
mientras se realiza este procedimiento.
5. Dejar enfriar y almacenar en un
recipiente de vidrio oscuro. La solución
de nanopartículas obtenida debe ser de
1mM de concentración.
2.6 Conjugación de nanopartículas-
ADN (ACT-1)
La metodología empleada se basa
en los procedimientos propuestos
por (Taton, 2002).
1. Agregar a la solución de
nanopartículas un 0.5 molar de exceso
de solución de ADN (1mM).
2. Rotar la solución obtenida 16 hr a
temperatura ambiente en un shaker a
baja velocidad (menor a 1Hz).
3. Adicionar 0.125 vol de 1M NaCl y
0.1 M de buffer de fosfato de sodio.
Rotar en un shaker a baja velocidad por
24 horas.
4. Centrifugar la solución a una
velocidad de 4500 rpm por 30 minutos.
5. Remover la parte flotante y suspender
el aceite restante en 0.125 vol de 1M
NaCl y 0.1 M de buffer de fosfato de
sodio.
6. Repetir la centrifugación y el paso
anterior.
7. Resuspender lo obtenido en 0.3M
NaCl/0.01% azida de sodio/10mM de
buffer de fosfato de sodio.
8. Guardar lo obtenido a 4°C en un lugar
oscuro.
2.7 Procedimiento para el ensamblaje
e implementación del dispositivo de
flujo lateral.
1. Fijar el complejo nanopartículas-
ADN (ACT-1) al material derivado del
capullo de seda, trazando dos líneas
sobre el material con ayuda de una
micropipeta de 100-1000µL y dejar
secar a 37°C por 2 horas. Dichas líneas
corresponden a la zona de prueba y
control del dispositivo.
2. Tomar un tubo de 40 µL de ADN de
la bacteria Helicobacter Pylori a
diferentes concentraciones en solución
acuosa y emplear el termociclador
C1000Touch Thermal Cycler (BIO-
RAD, Estados Unidos) para llevarlo a
una temperatura de 90°C-95°C de 5 a
10 minutos para desnaturalizar la
cadena de doble hélice y obtener una
cadena sencilla de ADN.
3. Depositar 10 µL de sonda (1ng/µL)
(Calle & Quiroz, 2012) sobre una
almohadilla del material derivado del
capullo de Bombyx Mori escogido.
4. Ensamblar manualmente las
siguientes almohadillas del material
derivado del capullo de Bombyx Mori: 1
almohadilla donde se va a situar la
muestra de 40 µL de ADN de cadena
sencilla de la bacteria, 1 almohadilla
para situar la sonda (10 µL) que es
complementarias a la cadena sencilla
del ADN de la muestra, 1 almohadilla
donde se encuentra la zona de prueba y
de control donde se deposita el ACT-1
con el grupo funcional bitoin y tiol (20
µL) y 1 almohadilla de absorción.
5. Agregar solución de PBS a 0.2 de
NaCl a la zona de prueba y control para
visualizar cambio de color.
3. RESULTADOS
En primer lugar siguiendo la metodología expuesta anteriormente para la extracción de
la fibroína del capullo de Bombyx Mori se obtuvo un total de 3g de fibroína desgomada
a partir de 5g de capullo. La Figura 3 muestra un registro fotográfico de lo obtenido.
La imagen A de la figura 3 muestra los
capullos sin tratar, estos fueron
obtenidos de la granja el Pílamo en
Pereira de la cría de aproximadamente
500 individuos de Bombyx Mori, para
sacar la pupa de los mismos se
calentaron en agua a 90°C durante 20
minutos y posteriormente se hizo un
corte para su extracción.
Para realizar el paso que se observa en
la imagen B de la figura 3 se esperó un
tiempo aproximado de una hora para
que el agua empezara a ebullir a una
temperatura de 92°C, se agregó poco a
poco el carbonato de sodio y se
promovía la separación de fibroína y
sericina por medio de agitación.
Después del tratamiento con carbonato
de sodio se realizó un lavado de la
fibroína desgomada obtenida con agua
desionizada durante una hora con
agitación en intervalos de 20 minutos
para cambiar el agua. Esto con el fin de
remover el reactivo de las fibras
obtenidas. Ver imagen C de la figura 3.
Figura 3. A) Capullos de Bombyx Mori sin tratar. B) Capullos en solución 0.2M Carbonato de sodio. C)
Capullos desgomados (fibroína). D) Fibroína desgomada (3g) después del tratamiento. E) Solución 9.3 M LiBr
con fibroína desgomada. F) Montaje proceso diálisis. G) Solución de fibroína 4%w/v después de diálisis y
centrifugación
Luego del lavado se separaron a mano
las fibras obteniendo de los 5g de
capullo sin tratar, 3g de fibroína
desgomada (imagen D, figura 3). Se
dejó secar durante una noche a
temperatura ambiente.
Respecto a la solubilización de la
fibroína desgomada en LiBr y el
proceso de diálisis y centrifugación,
después de realizar todo el
procedimiento se obtuvo una cantidad
de 15mL de solución de fibroína con
una concentración de 4 %w/v
(Imágenes D,E,F y G de la figura 3).
La reacción bromuro de litio con agua
es altamente exotérmica por lo que el
proceso de agregar el reactivo fue
cuidadoso y fue necesario emplear un
agitador magnético para que la reacción
se completara. Luego se aseguró que las
fibras desgomadas quedaran compactas
y sobre ellas se depositó la solución
9.3M obtenida. Al deshacerse las fibras
en la solución se observa un color
amarillo característico como el obtenido
en la imagen E de la figura 3.
Para el montaje de diálisis fue necesario
tener precaución de no rasgar con la
jeringa el tubo sobre el cual se iba a
ejecutar el procedimiento, pues
perjudicaría el proceso de remoción de
LiBr. Adicionalmente, se empleó agua
ultrapura con una resistividad de 18.2
MΩ-cm para obtener una mejor
remoción de la sal pesada. Los cambios
de agua se realizaron en los tiempos
establecidos en el protocolo para no
generar errores que afectaran la
purificación de la solución de fibroína.
La solución de fibroína obtenida
después de la diálisis se centrifugó hasta
que no quedaran residuos o impurezas a
4°C. Después de realizar este
procedimiento se obtuvo 15mL de
fibroína de 4%w/v de color transparente
con apariencia similar al agua pero con
una viscosidad aparente mayor a la
misma.
Por otra parte, para la posterior
construcción de estructuras del
dispositivo de flujo lateral se obtuvo
hidrogel de fibroína por sonicación
como fue descrito en la sección de
metodología. El resultado obtenido se
muestra en la Figura 4.
Figura 4. Hidrogel de fibroína por sonicación
Para corroborar que lo obtenido tiene
las características de un hidrogel, se
realizaron pruebas de cinética de
hinchamiento por gravimetría, es decir,
se tomó una muestra para pesarla y
luego se adicionó agua gota a gota y se
pesó de nuevo a diferentes tiempos. A
continuación se muestra la ecuación
empleada y los resultados obtenidos
para una muestra de 0.168g (Orozco &
et.al, 2011).
%𝐻𝑖𝑛𝑐ℎ𝑎𝑚𝑖𝑒𝑛𝑡𝑜 =𝑤−𝑤𝑜
𝑤0∗ 100 𝐸𝑐. 1
Dónde w es el peso de la muestra
después de agregar agua y w0 el peso
inicial de la muestra.
Tabla 1. Porcentaje de hinchamiento muestra
0.168g
Tiempo
(min)
w(g) %Hinchamiento
0.5 0.201 19.64
1 0.227 35.12
2 0.256 52.38
3 0.283 68.45
4 0.313 86.31
5 0.342 103.57
6 0.343 104.17
7 0.343 104.17
8 0.343 104.17
Para visualizar estos resultados de
manera más clara se obtuvo la gráfica
que se ilustra en la Figura 5.
Figura 5. Cinética de hinchamiento para un
hidrogel a base de fibroina.
Como se puede ver, el porcentaje de
hinchamiento crece de manera casi
lineal durante los primeros 6 minutos.
Sin embargo, se estabiliza en un tiempo
aproximado de 10 minutos lo cual
indica que el máximo porcentaje de
hinchamiento que se obtiene es de
104.17%.
Ahora bien, se realizaron prototipos de
la estructura del dispositivo de flujo
lateral sin tener las líneas de zona de
test y de control ni nanopartículas de
oro en la almohadilla de conjugación,
esto para observar la absorción y
capilaridad de los diferentes derivados
del capullo de Bombyx Mori. En la tabla
2 se puede visualizar cada una de las
configuraciones implementadas.
Para cada uno de los experimentos
planteados se utilizó colorante y agua
junto con tinta de marcador como
muestra para visualizar el
desplazamiento de flujo lateral.
Adicionalmente, el tamaño aproximado
de todo el dispositivo para cada
experimento fue de un ancho de 0.5cm
y un largo de 2cm ya que en pruebas
preliminares se observó que si se
superaba este largo, el tiempo que
tardaba la muestra en recorrer el
dispositivo superaba los 8 min. A
continuación se muestran los resultados
para el tiempo que tardó la muestra en
llegar de un extremo al otro de las
estructuras propuestas junto con el
montaje para cada una de las pruebas.
Experimento Material Sample Pad Conjugate Pad Test pad Absorbent Pad
Capullo sin
tratarx x x x
Fibroína
desgomada
Hidrogel de
fibroína
Capullo sin
tratar
Fibroína
desgomadax x x x
Hidrogel de
fibroína
Capullo sin
tratarx x x
Fibroína
desgomadax
Hidrogel de
fibroína
Capullo sin
tratarx x x
Fibroína
desgomadax
Hidrogel de
fibroínax
1
2
3
4
Tabla 2. Configuraciones dispositivo flujo lateral
Para cada uno de los montajes de la
figura 6 se empleó un portaobjetos
como soporte de las cuatro partes del
dispositivo, se aseguraron cada una de
las partes con cinta adhesiva y tanto
para las pruebas con agua como para las
de tinta la longitud del dispositivo fue
de 2cm. Cada experimento se realizó
con dos réplicas. La tabla 3 resume el
tiempo promedio que tardó cada uno de
los líquidos en recorrer el dispositivo.
Tabla 3. Tiempo promedio en recorrer dispositivo,
longitud de 2cm (agua/tinta)
Experimento Tiempo
con agua
(min)
Tiempo
con tinta
(min)
1 6.30 3.30
2 5.14 2.23
3 5.40 2.50
4 5.20 2.35
De los experimentos planteados y de
los tiempos obtenidos se puede ver que
la mejor opción es la estructura
propuesta en el experimento 2, pues con
ambos tipos de muestra se obtiene un
tiempo menor a las otras opciones.
Por otra parte, para comparar los
resultados experimentales obtenidos se
empleó la ecuación de Washburn que
relaciona el ángulo de contacto con el
tiempo (𝜃), longitud (m), tamaño de
poro promedio del material (m),
viscosidad de la sustancia con la que se
hace la prueba de capilaridad (mPa.s) y
tensión superficial (mJ/m2). La ecuación
corresponde a (Neira, 2007):
𝐿2 =𝛾𝐿𝑉 𝑟∗ 𝑡 𝐶𝑜𝑠𝜃
2𝜂 𝐸𝑐. 2
Dónde 𝛾𝐿𝑉 es la tensión superficial en
la interfase líquido/vapor, r* es el
tamaño medio de poro del material a
caracterizar, t el tiempo transcurrido, L
la longitud recorrida, 𝜃 el ángulo de
contacto y 𝜂 la viscosidad del líquido
empleado.
Para emplear la ecuación en primer
lugar se determinó el ángulo de contacto
del agua y la tinta sobre los tres
materiales empleados en los
experimentos (capullo sin tratar,
fibroína desgomada e hidrogel),
haciendo uso del tensiómetro óptico
marca Attention modelo Theta con
cámara de 100 Hz. Los resultados para
el ángulo de contacto se muestran a
continuación. En el anexo A se
muestran las imágenes que evidencian
el ángulo de contacto medido.
Tabla 4. Ángulo de contacto experimental sobre
superficies de fibroína
Estos resultados indican que la tinta es
inmediatamente absorbida por el
Material 𝜽 Agua 𝜽 Tinta
Capullo 113 0
Fibroína
desgomada
34 0
Hidrogel 14 52
Figura 6. A) Montaje experimento 1. B) Montaje experimento 2.
C) Montaje experimento 3. D) Montaje experimento 4
Dirección del flujo
capullo sin tratar y la fibroína
desgomada mientras que el hidrogel
genera resistencia a absorber la tinta
pero no el agua, lo cual es coherente
pues la tinta tiene variedad de
compuestos y aditivos que lo llevan a
ser rechazados por un material hidrófilo.
Para los parámetros de tensión
superficial y viscosidad se consultó en
la literatura y se encontraron los valores
que se indican en la Tabla 5 (Neira,
2007) (Plasmatreat USA Inc).
Tabla 5. Tensión superficial y viscosidad para el
agua y tinta
Líquido 𝛾𝐿𝑉(mJ/m2) 𝜂(mPa.s)
Agua 72.8 1
Tinta 72 0.7
Cabe resaltar que las propiedades para
la tinta se tomaron como valores
promedio reportados y se asumió que el
principal componente de la tinta es el
xileno, esto para la viscosidad de la
tinta.
En cuanto al valor de r* se consultó en
la literatura y se encontró que para los
materiales derivados de la seda en
promedio el tamaño del poro se puede
tomar desde un valor de 10-300µm
(Mingzhong & et.al, 2000). Para el
presente se tomó un valor de 200µm
para los cálculos.
Ahora bien, con estos parámetros y
teniendo en cuenta que para cada una de
las secciones del dispositivo la longitud
fue de 0.5cm, el tiempo teórico que
tarda en recorrer cada una de las
configuraciones propuestas se muestra a
continuación (ver Tabla 6).
Tabla 6. Tiempos teóricos en recorrer el
dispositivo de flujo lateral, longitud 2cm
Experimento Tiempo
con agua
(min)
Tiempo
con tinta
(min)
1 10.8 6.5
2 5.8 6.5
3 9.4 6.1
4 7.2 4.1
Comparando estos resultados con lo
obtenido de manera experimental se ve
que los valores son muy diferentes, esto
debido a que el error puede estar
asociado a los valores de los parámetros
empleados en la ecuación de Washburn.
Sin embargo, se ve que las mejores
opciones son la estructura a base de
solamente fibroína desgomada, para las
pruebas con agua, y la que está
compuesta por capullo e hidrogel con
fibroína desgomada para las pruebas
con tinta. Cabe resaltar que los
resultados para el experimento 1 y 2
empleando tinta como muestra
resultados semejantes dado que no hay
ángulo de contacto entre la tinta y el
capullo ni hay ángulo de contacto con la
fibroína desgomada.
Con base a los resultados tanto teóricos
como experimentales se buscó la
manera de reducir el tiempo en recorrer
el dispositivo modificando las
características de la solución acuosa que
se usa como muestra empleando cloruro
de sodio y ácido cítrico a
concentraciones de 0.1M y 0.01M. Esto
con el fin que existiera mayor
compatibilidad entre los derivados del
capullo y la solución acuosa. Cabe
recalcar que se realizó énfasis en
modificar soluciones acuosas dado que
para las pruebas de implementación
finales del dispositivo el ADN de la
bacteria para su detección está en
solución acuosa. Se implementó la
estructura propuesta en el experimento
2 y se tomó el tiempo que tardaba en
recorrer el dispositivo cada una de las
soluciones acuosas preparadas. Cabe
resaltar que se realizaron dos réplicas.
Los resultados se pueden observar en la
tabla 7 como sigue.
Tabla 7. Tiempo promedio en recorrer el
dispositivo de flujo lateral, longitud 2cm. Solución
básica y solución ácida
Experimento Tiempo con
agua (min)
Solución NaCl
(0.1M)
5.4
Solución NaCl
(0.01M)
6.2
Solución ácido
cítrico (0.1M)
4.8
Solución ácido
cítrico (0.01M)
5.2
Agua pura 5.14
Como se ve en la tabla 7 la solución
acuosa de ácido cítrico es la que tarda
menos tiempo en recorrer el dispositivo
de flujo lateral. Sin embargo, la
diferencia obtenida respecto a las
pruebas en las que se empleó agua sin
ningún otro reactivo es mínima por lo
que se decidió emplear como muestra
para la implementación una solución
acuosa de ADN sin adición de otros
reactivos. Adicionalmente, al emplear
un ácido el pH varía, por lo que el ADN
puede verse afectado pues se altera su
estructura y como consecuencia
generaría ruido y errores al momento de
realizar las pruebas finales.
Ahora bien, ya definido el material a
partir del cual se desea construir cada
una de las almohadillas del dispositivo
(fibroína desgomada) y el tipo de
muestra a emplear (ADN en solución
acuosa), se emplearon cassettes
elaborados por la empresa DCN
(http://www.dcndx.com/) para asegurar
el desplazamiento en flujo lateral a lo
largo del dispositivo y que no se
presenten derrames de líquido, pues
están especialmente diseñados para esta
tarea. A partir de las especificaciones de
diseño del dispositivo encontradas en la
literatura (Ver anexo A) se realizó un
ensamble a mano de las cuatro
almohadillas sobre una lámina soporte
hecha de capullo de Bombyx Mori y se
realizaron 3 ensayos para determinar el
tiempo promedio que tardaría la
muestra en recorrer el dispositivo. Cabe
resaltar que estas pruebas se realizaron
con agua y colorante como simulación
de la muestra final que es ADN en
solución acuosa. A continuación se
muestran los resultados obtenidos de los
ensayos (figura 7 y tabla 8).
Figura 7. Ensayos agua y colorante, cassettes
DCN
Tabla 8. Tiempo requerido para recorrer el
dispositivo en cassette DCN (longitud= 6cm).
Ensayo Tiempo (min)
1 14.8
2 15.3
3 15.6
Como se puede ver en la tabla 8, el
tiempo promedio requerido para
recorrer el dispositivo es de 15.2 min y
en la figura 6 se observa que la solución
acuosa con colorante sigue un flujo
lateral a lo largo de la fibroína
desgomada. Esto quiere decir que el
material empleado para los pads tiene
potencial para ser usado en los
dispositivos de flujo lateral. También, el
tiempo promedio que toma el líquido
usado en recorrer el dispositivo es
aceptable ya que en otro tipo de
dispositivos de ésta índole como la
prueba de embarazo tarda de 15 a 20
minutos (ACON, 2010).
Posteriormente, se prosiguió al montaje
e implementación del dispositivo con la
siguiente configuración: 1 almohadilla
donde se va a situar la muestra de 40
µL de ADN de cadena sencilla de la
bacteria, 1 almohadilla para situar las
sondas (10 µL) que se complementaran
a la cadena sencilla del ADN de la
muestra, 1 almohadilla donde se
encuentra la zona de test y de control
donde se deposita el ACT-1 con el
grupo funcional bitoin y tiol (20 µL) y 1
almohadilla de absorción. Cabe resaltar
que estos volúmenes se emplearon pues
en la literatura se reporta que son
suficientes para la implementación de
biosensores colorimétricos (Calle &
Quiroz, 2012) .No se empleó la
configuración estándar de un dispositivo
de flujo lateral, es decir, el diseño
mostrado en la figura 1 por problemas
con los grupos funcionales solicitados
para las cadenas de ADN
principalmente, por lo que se acudió a
una configuración secundaria para
cumplir el objetivo del presente trabajo.
Para lograr la implementación de esta
configuración se obtuvo en primer lugar
nanopartículas de oro siguiendo los
pasos de la metodología expuesta con
anterioridad. Se obtuvo una cantidad de
10mL de solución de nanopartículas de
oro de un color rojizo oscuro lo cual
indica que el tamaño de las mismas se
encuentra entre los 10nm y 15nm. Para
corroborarlo se hizo uso del
espectrofotómetro UV/Vis y se midió la
absorbancia de la solución obteniendo
0.391 lo cual indica que el tamaño de
las nanopartículas corresponde al rango
de 10nm a 15nm pues este resultado se
obtuvo a una longitud de onda de
524nm que es el valor característico
para nanopartículas de este tamaño
(Ortega, 2008). A continuación en la
figura 8 se observa la solución de
nanopartículas (1mM) obtenida.
Figura 8. Solución de nanopartículas 1mM
Posteriormente, se siguió la
metodología expuesta para realizar la
conjugación de nanopartículas con
ADN para obtener un complejo ADN
ACT-1-nanopartícula para
implementarlo en la zona de control y
zona de test para evitar que el flujo
arrastre la muestra acuosa de ADN y las
sondas de tal forma que no se puedan
percibir las líneas de prueba y control
de manera diferenciada. La figura 9
muestra la solución de conjugados
obtenida.
Figura 9. Solución ACT-1-Nanopartículas
La figura 9 muestra una solución de
conjugados con color rosa pálido y
micro gotas de color negro
imperceptibles. Este resultado no
concuerda con lo estipulado en el
protocolo mencionado por Taton pues
según la literatura se debería obtener un
aceite de color rojo. Esta diferencia en
lo obtenido puede deberse a que no es
un proceso estandarizado por lo que no
se puede garantizar un resultado
exactamente igual en el laboratorio.
Ahora bien, se prosiguió a realizar el
procedimiento para el ensamble e
implementación final del dispositivo
con la metodología expuesta con
anterioridad. Para las concentraciones
de ADN de 30 ng/µL, 90ng/µL y 20
ng/µL no se obtuvo un cambio de color
significativo en la zona de prueba y de
control como se observa en la figura 10.
Figura 10. Dispositivo implementado con
metodología propuesta concentración ADN 30
ng/µL, 90ng/µL y 20 ng/µL
Cabe resaltar que las concentraciones de
ADN empleadas fueron escogidas
porque sobrepasan el mínimo de
concentración requerido para la
detección de Helicobacter Pylori en
biosensores colorimétricos reportados
en literatura (Moreno, 2015).
Adicionalmente, de esta prueba se
puede decir que al no existir un cambio
de color a morado en la zona de prueba,
las nanopartículas no se agregaron. Esto
pudo deberse posiblemente a que no
todo el volumen de muestra fluyó a lo
largo de todo el dispositivo y gran parte
se estancó en la almohadilla de muestra
por lo que no hubo suficiente ADN para
que se hibridara con la sonda y
posteriormente se agregara. Por otra
parte, al existir una almohadilla para la
muestra de ADN y otra para la sonda,
no se garantiza la hibridación pues la
temperatura a la cual está el ADN y la
sonda es distante a la de anillaje (56°C),
el ADN está a 95°C y la sonda a
temperatura ambiente.
Para tratar de solucionar estos
problemas, primero se realizó la
hibridación de la muestra de ADN con
la sonda antes de implementar el
dispositivo. Esto se llevó a cabo en un
termociclador C1000 Touch Thermal
Cycler (BIO-RAD, Estados Unidos)
desnaturalizando el ADN a 96°C y
posteriormente mezclándolo con la
sonda a 56°C que es la temperatura de
anillaje, es decir, la temperatura a la
cual se garantiza la hibridación del
ADN con la sonda. Con lo obtenido
luego de este proceso se prosiguió a
implementar el dispositivo siguiendo la
metodología propuesta con anterioridad.
Como resultado se obtuvo un cambio
notorio de color respecto a la prueba
anterior pero no se diferencia la zona de
prueba y la zona de control. Esto se
puede ver en la figura 11.
Figura 11. Implementación dispositivo usando
ADN hibridado con sonda como muestra
Lo que se observa en la figura 11 pudo
deberse a que los conjugados ADN-
nanopartículas no se obtuvieron
correctamente por lo que no se fijaron a
la zona de control y prueba. Como
consecuencia, al agregar la muestra y a
medida que fluía a lo largo del
dispositivo, todos los elementos
presentes en cada una de las
almohadillas se mezclaron. Por tanto, la
implementación del dispositivo no fue
satisfactoria.
4. TRABAJO FUTURO
Se planea implementar un sensor con la
configuración estándar con las cadenas
de ADN necesarias y suficientes, se
adherirán las cadenas de ADN de
Helicobacter Pylori con sus respectivos
grupos funcionales (tiol y biotinil) a la
almohadilla de muestra y a la
almohadilla de conjugación, en éste
último se depositarán las nanopartículas
de oro. También, para evitar el
estancamiento de ADN en la
almohadilla de muestra se planea tratar
la fibroína desgomada con soluciones
buffer que disminuyan la afinidad que
tiene este material con el ADN para
facilitar su fluidez a lo largo del
dispositivo. Adicionalmente, se requiere
trabajar en la obtención de conjugados
de ADN-nanopartículas de manera tal
que se llegue a un proceso
estandarizado que sea replicable en el
laboratorio para así garantizar buenos
resultados al momento de implementar
un sensor de flujo lateral. Finalmente, se
podría trabajar con nanopartículas de
diversos tamaños para encontrar cuál es
el más adecuado para la
implementación de este tipo de
dispositivos y a largo plazo se planea
diseñar un cassette hecho
completamente a base de capullo de
Bombyx Mori para reducir el impacto
ambiental que genera el uso del cassette
tradicional de plástico. De esta manera,
se espera obtener un biosensor
colorimétrico de flujo lateral estándar
para la detección de Helicobacter
Pylori.
5. CONCLUSIONES
Los derivados del capullo de
Bombyx Mori permiten el
desplazamiento en flujo lateral con
tiempos comparables a dispositivos
comerciales lo cual representa una
oportunidad para la obtención de
biosensores de flujo lateral.
La estructura que permite obtener
un menor tiempo para recorrer el
dispositivo de flujo lateral es la
compuesta por fibroína desgomada
en su totalidad.
Se debe minimizar el tiempo que
tarda la muestra de ADN en
solución acuosa en recorrer el
dispositivo hecho a base de fibroína
desgomada para garantizar un
producto rápido y eficaz para su
uso en la detección de Helicobacter
Pylori.
Posibles desviaciones de los
resultados en la obtención de los
derivados del capullo se pueden
asociar a que se debieron hacer
adaptaciones de los protocolos
reportados en la literatura por
disponibilidad de equipos y
capacidad de los mismos.
Se debe estandarizar el proceso de
obtención de conjugados de ADN-
nanopartículas para garantizar una
implementación adecuada de un
dispositivo de flujo lateral a base de
los derivados de capullo de Bombyx
Mori.
Los derivados del capullo de
Bombyx Mori pueden ser
empleados en este tipo de sensores
pues se demostró que tienen
potencial y que se debe seguir
investigando para llegar a una
funcionalización apropiada de estos
materiales para ser usados en este
tipo de dispositivos.
Se debe seguir investigando para
llegar a una funcionalización
apropiada de los materiales
derivados del capullo de Bombyx
Mori para ser usados en
dispositivos de flujo lateral.
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7. ANEXO A
Identificación zona 16 S Helicobacter Pylori
Figura 12. Identificación zona 16 S Helicobacter Pylori
Ángulo de contacto derivados del capullo de Bombyx Mori
Figura 13. Ángulo de 113° sobre Capullo. Agua
Figura 14. Ángulo de 34° Fibroina desgomada. Agua
Figura 15. Ángulo de 14° Hidrogel. Agua
Figura 16. Ángulo de 52° Hidrogel. Tinta
Figura 17. Diseño estándar dispositivo flujo lateral (O´Farrel, 2013)