ingegneria genetica a.s. 2009-10. nascita e sviluppo dell'ingegneria genetica 1928...
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INGEGNERIA GENETICA
a.s. 2009-10
Nascita e sviluppo dell'ingegneria genetica
1928 Dimostrazione che il DNA può trasformare geneticamente (Griffith)
1944 Si dimostra che l'informazione genetica è contenuta nel DNA (Avery)
1953 Si pubblica la struttura del DNA (Watson e Crick)
1966 Decifrazione del codice genetico
1970 Isolamento dei primi enzimi di restrizione
1972 Sintesi chimica di un gene (Khorana)
1973 Primi clonaggi in batteri (Boyer e Cohen)
1976 Conferenza di Asilomar sulle ricadute tecniche del DNA ricombinante
1976 Metodo di sequenziamento del DNA (Maxam e GiIbert)
1978 Si commercializza la prima insulina umana
1980 Si brevettano in USA i primi organismi ricombinanti
1983 Si ottengono le prime piante transgeniche
1988 Viene pubblicato il metodo della PCR (Mullis)
1990 Si inizia la sperimentazione sull'uomo della terapia genica
1996 Viene completata la prima sequenza di un gene eucariotico
1997 Viene clonata una pecora (Dolly) da un nucleo di cellula differenziata
2001 Viene pubblicata la sequenza del genoma umano
La tecnologia del DNA ricombinante
Mediante l’introduzione dei plasmidi si possono modificare i batteri e indurli a svolgere funzioni utili
– La maggior parte dei metodi utilizzati per studiare e manipolare il DNA utilizza i batteri e in particolare Escherichia coli.
– Per manipolare i geni in laboratorio i biologi usano spesso i plasmidi batterici, che possono portare a duplicare all’interno di un batterio qualsiasi gene.
– I plasmidi sono gli strumenti chiave della clonazione genica, ossia la produzione di molte copie identiche di tratti di DNA.
– I ricercatori possono inserire in un plasmide un pezzo di DNA contenente un gene dando origine a DNA ricombinante.
– Il plasmide viene poi introdotto nella cellula batterica.
– Il batterio geneticamente modificato è messo in coltura e si riproduce per formare un clone di cellule (un gruppo di cellule identiche alla cellula madre da cui derivano).
– Ogni cellula possiede una copia del gene.
Batterio
Cromosoma batterico
Plasmide
2
Cellula contenente il gene prescelto
DNAGene prescelto
DNA ricombinante (plasmide)
Batterio ricombinante
Copie di proteine
Copie di geni
Clone della cellula
Il gene per la resistenza alle malattie è inserito nelle piante
Il gene modifica i batteri e li rende in grado di eliminare i rifiuti tossici
La proteina viene usata per sciogliere i coaguli nella terapia contro gli infarti
La proteina consente alla neve di formarsi anche a temperature maggiori
Si isola un plasmide1
Si isola il DNA
2
Si inserisce un gene nel plasmide
3
Si introduce il plasmide nella cellula prescelta
4
Si clona la cellula che possiede il gene prescelto
5
CLONAZIONE GENICA
Per «tagliare e incollare» il DNA si utilizzano particolari enzimi
Gli strumenti per ottenere DNA ricombinante sono:
enzimi batterici chiamati enzimi di restrizione che riconoscono brevi sequenze di nucleotidi del DNA e le tagliano in punti precisi;
l’enzima DNA-ligasi che incolla le estremità dei filamenti di DNA catalizzando la formazione di legami covalenti.
L’enzima di restrizione riconosce la sequenza
G A A T T CC T T A A GDNA
3
C T T A AA AT TC
A AT TCG
G A AT T CC T TA A G
G A AT T CC T TA A G
L’enzima DNA-ligasi incolla i frammenti
L’enzima di restrizione taglia il DNA in frammenti
DNA ricombinante
GG
Estremità coesiva
G
1
2
4
C T T A A
Aggiunta di un frammento di DNA di provenienza estranea
Due frammenti si attaccano tra loro appaiando le basi azotate
5
Produzione di DNA ricombinante tramite l’uso di enzimi di restrizione e dell’enzima DNA-ligasi:
I geni dei plasmidi ricombinanti si possono clonare
• I plasmidi entrano nei batteri per trasformazione.
• I batteri, con i plasmidi ricombinanti, sono messi in condizione di riprodursi, dando origine a un clone di cellule con molte copie dei plasmidi e dei geni che trasportano.
E.coli
Plasmide DNA
Gene V
Estremità coesive
Gene V
Batterio ricombinante
Cellula umana
Plasmide con DNA ricombinante
Clone batterico in possesso di molte copie del gene umano
Clonazione di un gene in un plasmide batterico:
Si isola il DNA da due fonti diverse1
Si tagliano entrambi i DNA con un enzima di restrizione
2
Si mescolano le molecole di DNA che si uniscono mediante appaiamento di basi azotate
3
Si aggiunge DNA-ligasi per attaccare il DNA con legami covalenti
4
Si clona il batterio6
Si inserisce il plasmide in un batterio tramite trasformazione
5
Per ottenere molte copie di una specifica sequenza di DNA si utilizza comunemente la tecnica PCR
1 2 4 8
Molecola iniziale di DNA
Numero di molecole di DNA
Quando il campione di DNA è scarso o impuro, la reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction, o PCR) è un metodo più appropriato per ottenere un grande quantitativo di un particolare gene.
I geni clonati possono essere conservati in «librerie» genomiche
L’intera collezione di tratti di DNA clonati tramite shotgun, derivanti dalla frammentazione di tutto il genoma di una cellula, è chiamata libreria genomica.
Plasmide ricombinante
Genoma tagliato con l’enzima di restrizione
DNA fagico ricombinante
oppure
Clone batterico
Clone fagico
Libreria fagicaLibreria plasmidica
Si può produrre DNA da clonare anche mediante l’enzima trascrittasi inversa
L’enzima trascrittasi inversa può essere usato per ottenere librerie di DNA complementare (cDNA) contenenti solo i geni espressi da un particolare tipo di cellula.
Cellule e organismi ricombinanti sono utilizzati per ottenere prodotti genici su larga scala
• Le applicazioni della clonazione genica includono la produzione di prodotti genici su larga scala per usi medici e altri usi.
• I batteri si sono spesso dimostrati gli organismi migliori per sintetizzare un prodotto proteico.
• Alcune volte è preferibile o necessario utilizzare le cellule eucariotiche di lieviti e mammiferi.
La tecnologia del DNA sta cambiando l’industria farmaceutica e la ricerca biomedica
• La tecnologia del DNA ha avuto un enorme impatto sull’industria farmaceutica e sulla medicina umana.
• Le sue tecniche sono ampiamente utilizzate per produrre farmaci e per la diagnosi delle malattie.
Terapie ormonali
• L’insulina e l’ormone della crescita umani sono stati i primi prodotti farmaceutici ottenuti con l’uso della tecnologia del DNA ricombinante.
• Prima del 1982, le principali fonti di insulina erano i tessuti di suini e bovini prelevati nelle macellerie.
Diagnosi e cura delle malattie
• In campo medico la tecnologia del DNA sarà, probabilmente, sempre più usata per diagnosticare le malattie.
• Oltre alla sua evidente importanza nell’identificazione degli alleli associati alle malattie genetiche, si rivela infatti utile nel localizzare le infezioni.
Vaccini
• Grazie alla tecnologia del DNA i ricercatori sono in grado si sintetizzare anche nuovi vaccini.
• Un vaccino è una variante o un derivato innocuo di un agente patogeno (di solito un batterio o un virus) ed è utilizzato per prevenire una malattia infettiva.
L’analisi dei frammenti di restrizione e le impronte genetiche
Le sonde molecolari identificano i cloni che portano determinanti geni
– La tecnologia del DNA può essere usata per identificare specifici frammenti di DNA.
– I metodi utilizzati per individuare direttamente un gene si basano tutti sull’accoppiamento tra le basi azotate del gene in questione e quelle di una sequenza complementare appartenente a un’altra molecola di acido nucleico (DNA o RNA).
• Per trovare una specifica sequenza nucleotidica all’interno di un certo quantitativo di DNA si usa una molecola chiamata sonda.
• Le sonde di acidi nucleici sono brevi filamenti singoli di DNA o RNA marcati radioattivamente o fluorescente che possono legarsi a un determinato gene in una libreria.
Sonda radioattiva (DNA)
DNA a filamento singolo
La sonda viene mescolata col DNA a filamento singolo prelevato da vari cloni batterici o fagici
Mediante l’appaiamento delle basi azotate si individua il gene prescelto
A T C C G A
A T G C G C T T A T C G
A G C
C T
T A
T G
C A
T
A T C C
G A
A G G
T A G G
C T A A
I microarray a DNA forniscono contemporaneamente informazioni sull’espressione di molti geni
• Per effettuare analisi su larga scala, per determinare quali geni sono attivi in una particolare cellula in un dato momento, si può usare la tecnica che impiega i microarray a DNA.
• Il microarray a DNA è un vetrino rettangolare, non più grande dell’impronta di un pollice, contenente uno strato di molecole a filamento singolo di DNA, che portano migliaia di geni noti e diversi.
L’elettroforesi su gel separa i frammenti di DNA in base alle loro dimensioni
+ +
Generatoreelettrico
Gel
Miscela di molecole di DNA di dimensioni diverse
Molecole più lunghe
Molecole più corte
Disposizione finale
- +
Il polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione permette di individuare le differenze tra sequenze di DNA
I marcatori genetici comprendono geni, siti di restrizione e tratti di DNA non codificante.
L’analisi dei frammenti di restrizione è un metodo per individuare le differenze nelle sequenze nucleotidiche tra campioni omologhi di DNA.
Il numero dei frammenti di restrizione e la loro lunghezza riflettono la sequenza specifica di nucleotidi nel DNA di partenza.
In che modo i frammenti di restrizione riflettono la sequenza del DNALe differenze tra i frammenti di restrizione che vengono prodotte sono dette poliformismi della lunghezza dei frammenti di restrizione (Restriction Fragment Length Polymorphisms o RFLP) e riflettono le differenze nelle sequenze del DNA di partenza.
Allele I(scena del crimine)
Allele II (indiziato)
w
x
y y
z
TaglioTaglio
Taglio
DNA prelevato dai cromosomi
CCGG
GGCC
ACGG
TGCC
CCGG
GGCC
CCGG
GGCC
–
+
Frammenti più lunghi
Frammenti più corti
x
w
y
z
y
1 2
Dopo il taglio con gli enzimi di restrizione, i frammenti vengono separati su un gel:
Per individuare gli alleli difettosi si possono usare le sonde a DNA
Un’importante applicazione dell’analisi dei frammenti di restrizione consiste nell’individuare alleli con alterazioni correlabili a patologie genetiche non manifeste.
Le sonde radioattive possono rivelare bande di DNA d’interesse su un gel.
1 Preparazione dei frammenti di restrizione
2 Elettroforesi su gel
3 Assorbimento
4 Sonda radioattiva
5Rilevamento della radioattività (autoradiografia)
I II III
I II III
Frammenti di restrizione
Carta da filtro
Sonda
Filamento singolo di DNA radioattivo (sonda)
Pellicola
IIIIII
III
III
Utilizzo dell’analisi dei frammenti di restrizione per individuare un allele dannoso:
Impieghi della tecnologia del DNA in campo legale
La tecnologia del DNA viene ampiamente utilizzata in medicina legale per analizzare le prove rinvenute sulla scena di un crimine.
Il test del DNA può consentire di individuare il responsabile con una certa sicurezza poiché la sequenza di basi azotate del DNA di ogni persona è unica (tranne nel caso dei gemelli identici).
Sangue dell’imputato
Sangue rinvenuto sui vestiti dell’imputato Sangue
della vittima
Un’impronta genetica (DNA fingerprint) può aiutare a risolvere in crimine:
Un giorno la terapia genica potrebbe fornire la cura per molte malattie
La terapia genica può correggere le malattie imputabili a un singolo gene difettoso, sostituendolo o integrandolo con un allele normale.
Gene clonato (allele normale) 1 Inserimento del gene normale nel virus
2 Le cellule del midollo osseo vengono infettate con il virus
3 Il DNA virale si inserisce nei cromosomi
4 Le cellule vengono iniettate nel paziente
Midollo osseo
Cellule di midollo osseo del paziente
Acido nucleico virale
Retrovirus
La terapia genica potrebbe un giorno essere usata per curare sia le malattie genetiche, sia le malattie non genetiche.
Anche se è uno strumento molto promettente, esistono ancora poche prove scientifiche evidenti della sua efficacia.
La ricerca continua seguendo linee guida nuove e più sicure.
La terapia genica sull’uomo solleva problemi sia tecnici sia etici.
La genomica e gli OGMIl Progetto Genoma Umano
Lo scopo primario del Progetto Genoma Umano (PGU) è mappare l’intero genoma dell’uomo e determinare la sequenza nucleotidica completa del DNA umano.
Iniziato nel 1990, è oggi largamente completato: nel 2001 sono stati pubblicati i risultati del sequenziamento di oltre il 90% del genoma umano.
I dati ottenuti stanno fornendo informazioni su sviluppo, evoluzione e molte malattie.
I benefici che possono derivare dalla conoscenza del genoma umano riguardano essenzialmente la ricerca di base.
L’enorme numero di dati raccolti è depositati in un archivio accessibile in rete ai ricercatori di tutto il mondo.
La maggior parte del genoma umano non è costituito da geni Il genoma umano comprende circa 35 000 geni che codificano per varie
proteine, nonché per i tRNA e gli rRNA.
Oltre a questi geni, come quello della maggior parte degli eucarioti complessi, il genoma umano include un’enorme quantità di DNA non codificante (circa il 97% del totale).
Nella porzione di DNA non codificante sono comprese le sequenze regolatrici, come i promotori e gli enhancer.
Il restante DNA, che comprende gli introni, e il DNA non codificante localizzato tra i geni, è stato chiamato junk DNA, ossia «DNA spazzatura».
Grazie alla scienza della genomica sono stati sequenziati interni genomi
Oltre a mappare il DNA umano, ricercatori di tutto il mondo stanno lavorando anche sui genomi di altre specie.
Alcuni genomi sono stati completamente sequenziati. La maggior parte dei genomi in corso di studio
riguarda i procarioti, il gruppo include però anche una ventina di specie eucariotiche (tra cui vertebrati, invertebrati e piante).
Ogni singolo genoma è interessante di per sé, ma è utile in particolare ai fini dell’analisi comparativa con il genoma umano, che gli scienziati stanno tentando di interpretare.
La proteomica è lo studio sistematico degli insiemi completi di proteine (proteomi) codificati dai genomi.
Il numero delle proteine presenti negli organismi umani supera di gran lunga quello dei geni.
Gli organismi geneticamente modificati stanno trasformando l’agricoltura Gli scienziati che si occupano del fabbisogno
alimentare mondiale hanno cominciato a usare la tecnologia del DNA per produrre organismi geneticamente modificati (OGM), piante e animali, da utilizzare in agricoltura.
Un organismo geneticamente modificato è un organismo ottenuto grazie alla modificazione o all’aggiunta di uno o più geni.
Un OGM si può ottenere anche con i normali metodi di incrocio.
Agrobacterium tumefaciens
DNA contenente il gene prescelto
Plasmide Ti
1
Inserimento del gene di un plasmide mediante l’enzima di restrizione e la DNA-ligasi
Plasmide Ti ricombinante
2
Inserimento in cellule vegetali in coltura
3
Crescita della pianta
Pianta con caratteristiche nuove
Il T DNA inserito porta il nuovo gene
Cellula vegetale
T DNA
Sito di restrizione
Utilizzo del plasmide Ti (un plasmide che proviene dal batterio del suolo Agrobacterium tumefaciens) come vettore per modificare geneticamente le piante:
I genetisti molecolari sono in grado di produrre animali transgenici che hanno, inseriti nel proprio genoma, geni provenienti da altri organismi.
Anche molte colture e piante sono geneticamente modificate.
Gli organismi GM possono danneggiare l’ambiente o la salute umana?
Lo sviluppo di organismi GM richiede severe misure di sicurezza.
Gli organismi GM possono rappresentare un rischio per l’ambiente o la salute.
Il maggior pericolo per l’ambiente potrebbe essere rappresentato dal trasferimento di geni modificati dalle colture GM alle colture vicine.