INSTRUCTIONS FOR USEGEBRAUCHSANWEISUNG ISTRUZIONI PER L’USO NÁVOD K POUŽITÍ POKYNY NA POUŽITIE 使用说明书

10-027

MonoTotal® ELISA

INTENDED USEMonoTotal® ELISA is an in vitro diagnostic assay intended for quantitative determination of soluble cytokeratin 19, 8 and 18 fragments in human serum. The primary use of MonoTotal® ELISA is in the management of non-small cell lung cancer (NSCLC) patients, as an aid in diagnosis, for prognosis and follow up. MonoTotal® ELISA is also useful for prognosis and follow up of other epithelial carcinomas. SUMMARY AND EXPLANATION OF THE ASSAYCytokeratins (CK) are intracellular proteins expressed in most epithelial cells. The cytokeratin pattern is usually preserved during transformation of normal cells into malignant cells. CK19, CK8 and CK18 are among the most abundant cytokeratins in simple epithelial cells. Soluble fragments of CK19, CK8 and CK18 are released into serum and other body fluids due to apoptosis or necrosis. The quantity of CK fragments in serum is correlated to cell growth and death. An elevated level of soluble cytokeratin fragments in patient samples is an indication of epithelial tumour cell activity. MonoTotal® ELISA uses specific monoclonal antibodies that bind to defined epitopes on soluble fragments of CK19, CK8 and CK18 in patient samples.Serial testing for patient MonoTotal® ELISA assay values shall be interpreted in conjunction with all available clinical informa-tion and diagnostic data for the patient.

PRINCIPLE OF THE ASSAYMonoTotal® ELISA is a one-step enzyme-linked sandwich im-munoassay. During incubation standards, controls and samp-les react simultaneously with solid phase monoclonal catcher antibodies and HRP-conjugated detector monoclonal antibodi-es. After incubation the plate is washed and TMB substrate is added. The reaction is stopped by addition of Stop Solution and absorbance is measured at 450 nm. The developed colour is directly proportional to the concentration of bound cytokeratin fragments.

SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE• Serum or plasma may be used. The required sample volume for duplicate measurement is 250 µl. • Specimens may be stored refrigerated (2-8 °C) up to 24h For longer storage the specimen should be kept frozen (<-18 °C). There is no indication of loss of activity if samples are freeze-thawed but it is recommended to avoid repeated thawing and freezing. • Do not use samples that are highly haemolysed.

PRECAUTIONS FOR USERS • MonoTotal® ELISA is for in vitro diagnostic use only.• Do not use the kit after the expiry date. • Do not mix reagents from different lots.• All patient specimens should be regarded as contagious and must be handled and disposed of according to appropriate regulations.• Wear protective gloves and eyewear.• Avoid microbiological contamination of reagents.• A Material Safety Data Sheet is available on request.

MATERIALS REQUIRED BUT NOT PROVIDED Routine laboratory equipment, e.g. precision pipettes and vortexShaker for incubation of microplates with a recommended oscil-lation of 450 rpmDeionised or distilled waterWashing equipment for microplatesMicroplate reader (wavelength 450 nm)

KIT CONTENTMaterials supplied for 96 determinations.MonoTotal® ELISA Coated Microstrips1 plate, 96 dry wells (12 strips), coated with monoclonal anti-bodies. Packed in an aluminium bag with desiccant. Ready for use.MonoTotal® ELISA HRP Conjugate 1 vial, 12 ml, monoclonal antibodies conjugated with HRP in protein stabilised buffer, pH 7.5. Colour blue. Preservative ad-ded. Ready for use.MonoTotal® ELISA Diluent (Standard 0 U/l)1 vial, 5 ml, sample diluent and standard 0 U/l, protein stabilised buffer, pH 7.5. Colour yellow. Preservative added. Ready for use.MonoTotal® ELISA Standard (60, 150, 600, 2600 U/l)4 vials, 1 ml/vial, MonoTotal® ELISA standard material in protein stabilised buffer, pH 7.5. Concentrations stated on vials. Colour yellow. Preservative added. Ready for use.MonoTotal® ELISA Control Low and Control High2 vials, 1 ml/vial, MonoTotal® ELISA control material in protein stabilised buffer, pH 7.5. Colour yellow. Preservative added. Ready for use.Wash tabletOne blister packed tablet, to be dissolved in 1 liter fresh deioni-sed or distilled water.TMB Substrate 1 vial, 22 ml. Protect from light and keep lid tightly closed. Ready for use. Do not use more than required for analysis. Stop Solution1 vial, 12 ml, 0.5 M sulphuric acid. Ready for use.Sealing Tape1 sheet Sealing Tape for Microstrips.MonoTotal® ELISA CertificateCertificate of lot content and release data.MonoTotal® ELISA IFU Instructions for use.

KIT AND REAGENT STORAGEThe kit should be stored at 2-8 °C. Do not freeze. Reagents should always be stored in their original containers. If not all strips are used at once, be sure to store remaining MonoTotal® ELISA Coated Microstrips in the aluminium bag with the desiccant device. The wash solution is stable for 4 weeks when stored at 2-8°C.

PREPARATION OF REAGENTSPreparation of the Wash Solution: Dissolve one wash tablet in 1 litre of deionised or distilled water.

ASSAY PROCEDUREThe assay should be performed at room temperature, 18-26 °C.Allow all reagents and samples to adjust to room temperature. Mix all reagents on a vortex prior to use. Steps 1 and 2 should be performed sequentially without inter-ruption.1. Pipette 100 µl standards, controls and samples per defi newells. Leave two empty wells (blank) for background absorbance measurement (optional). It is recommended to run duplicates of standards, controls and samples.2. Add 100 µl MonoTotal® ELISA HRP Conjugate in each well except the wells for blank. 3. Incubate for 2 h ± 10 min on a micro plate shaker at 450 rpm. Setting of the shaker at 450 rpm is important for correct results.4. Aspirate and wash the wells 3 times with 0.3 ml wash solu tion. Make sure there is no residual wash solution in the wells after washing.5. Add 200 µl TMB substrate per well, including the wells for blank.

INSTRUCTIONS FOR USE

6. Incubate in darkness for 15 ± 1 min.7. Add 100 µl Stop Solution per well. Agitate on a shaker for 1 min.8. Read the absorbance at 450 nm within 30 min after addition of the Stop Solution. 9. Calculate the concentration (U/l) of cytokeratin in the samp les.

Schematic assay procedure

CALCULATION OF RESULTSUse computer software to process the raw data. Recommen-ded curve fitting algorithms are spline smoothed, point to point or linear regression. For quality control and generation of valid data, ensure that included controls are within the range stated on the certificate.NOTE: Different curve fitting algorithms may give slightly diffe-rent patient sample concentrations; therefore it is important to always use the same algorithm when comparing data.

PERFORMANCE CHARACTERISTICS Measuring range: The measuring range is 15-2600 U/l. Samples showing concentrations > 2600 U/l should be diluted (1:2 or 1:4) with MonoTotal® ELISA Diluent (Standard 0 U/l) before repeated analysis.

Normal range: The 95%-ile was determined to 63 U/l with a 95% confidence interval of 52-83 U/l when serum samples from 169 apparently healthy Swedish blood donors were analysed.It is recommended that each laboratory establishes its own nor-mal range due to differences which may exist between countries and reference groups.

Detection limit: The minimum detectable concentration in MonoTotal® ELISA is ≤15 U/l, defined as the concentration of cytokeratin 8/18/19 that corresponds to the absorbance value being two standard deviations from the absorbance value of standard 0 U/l (LoD).

Interference: There was no detectable interference from bili-rubin (125 µg/ml) and lipids (12.5 mg/ml), defined as recovery within 85% to 115%.Interference from added haemoglobin, 100, 250 and 500 mg/dl, caused higher values than expected, >115% recovery. The interference from haemoglobin was more pronounced in low concentration samples.

Precision:Precision within lot: Data collected from seven to ten different runs, three replicates per sample and run. Within run variabi-lity CV 2.1%-13.8%, between run variability CV 3.0% - 12.3% depending on the different concentrations of the samples. Precision between lots: Data collected from three kit lots, three replicates per sample and run. Within run variability CV 2.8%- 6.3%, between lot variability 3.7-15.3%, depending on the different concentrations of the samples.

Recovery: Recovery of added specified quantities of MonoTotal® antigen to human serum specimens ranges within 90% to 110%.

Linearity: Within the test range (15-2600) U/L, the linear corre-lation coefficient R is ≥0.990.

High-dose hook effect: The assay does not show any high-do-se hook effect up to 20,000 U/l.

HAMA: Patient samples containing human anti mouse antibodi-es (HAMA) may occasionally give false elevated or decreased values. HAMA neutralising agents are added to MonoTotal® ELISA.

LIMITATIONS OF THE ASSAY• MonoTotal® ELISA is not intended to be used as a cancer screening test.• MonoTotal® ELISA test results should not be interpreted as absolute evidence for the presence or absence of epithelial carcinomas.• Elevated results may be found e.g. in cases of liver disease, renal failure, general infections, diabetes and pregnancy. • Samples which show turbidity, haemolysis, hyperlipidaemia, or contain fibrin may give misleading results.

WARRANTYAny change or modification in the procedure not recommen-ded by IDL Biotech AB may alter the results. In such an event, IDL Biotech AB disclaims all warranties expressed, implied or statutory, including the implied warranty of merchantability and the fitness for use.

TRADEMARKMonoTotal® is a registered trademark of IDL Biotech AB.

ENGLISH

100 µlStandard /Controlor sample

100 µl HRP-conjugate

Incubate2 h, 450 rpm

3 x 0.3 ml

200 µl TMB 15 min 100 µl Stop Solution

Read at450 nm

1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8.

GEBRAUCHSANWEISUNGBESTIMMUNGSGEMÄSSE VERWENDUNGMonoTotal® ELISA ist ein In-vitro-Diagnose-Assay zur quantitati-ven Bestimmung von löslichen Cytokeratin 19-, 8- und 18-Frag-menten in humanem Serum. Der primäre Verwendungszweck von MonoTotal® ELISA ist der eines diagnostischen Hilfsmittels für Prognose und Verlaufskontrolle beim Management von Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkarzinom (NSCLC). MonoTotal® ELISA ist außerdem hilfreich für die Prognose und das Follow-up bei anderen epithelialen Karzinomen.Verlaufskontrollen der Patientenwerte mit dem

ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG DES ASSAYSCytokeratine (CK) sind interazelluläre Proteine, die in den meis-ten epithelialen Zellen gebildet werden. Bei der Transformation normaler Zellen in maligne Zellen bleibt das Cytokeratin-Muster in der Regel erhalten. CK19, CK8 und CK18 gehören in ein-fachen epithelialen Zellen zu den am häufigsten vorhandenen Cytokeratinen. Aufgrund von Apoptose oder Nekrose werden lösliche Fragmente von CK19, CK8 und CK18 im Serum und anderen Körperflüssigkeiten freigesetzt. Die Menge an CK-Fragmenten im Serum steht in Korrelation zu Zellwachstum und Zelltod. Ein erhöhter Wert löslicher Cytokeratin-Fragmente in Patientenproben ist ein Anzeichen für die Aktivität epithelialer Tumorzellen. MonoTotal® ELISA verwendet spezifische mo-noklonale Antikörper, die sich an definierte Epitope auf löslichen Fragmenten von CK19, CK8 und CK18 in Patientenproben binden.MonoTotal® ELISA-Assay müssen im Zusammenhang mit allen verfügbaren klinischen Informationen und diagnostischen Daten des Patienten interpretiert werden.

ASSAY-PRINZIPMonoTotal® ELISA ist ein einschrittiger enzymgekoppelter Sand-wich-Immunoassay. Während der Inkubation reagieren Stan-dards, Kontrollen und Proben gleichzeitig mit bindungsstarken monoklonalen Festphase-Antikörpern und HRP-konjugierten monoklonalen Detektor-Antikörpern. Nach der Inkubation wird die Platte gewaschen und das TMB-Substrat hinzugegeben. Die Reaktion wird durch Hinzugabe von Stop Solution angehal-ten. Anschließend erfolgt die Extinktionsmessung bei 450 nm. Die entwickelte Farbe ist direkt proportional zur Konzentration gebundener Cytokeratin-Fragmente.

PROBENENTNAHME UND LAGERUNG• Es kann Serum oder Plasma verwendet werden. Das erforder liche Probenvolumen für eine Doppelmessung beträgt 250 µl. • Proben können gekühlt (bei 2 bis 8 °C) bis zu 24 Stunden auf bewahrt werden. Für eine längere Lagerung sollten die Proben eingefroren werden (<-18°C). Es gibt keine Hinweise auf Ak tivitätsverluste, wenn Proben eingefroren und wieder aufgetaut werden. Von einem wiederholten Einfrieren und Auftauen wird jedoch abgeraten. • Keine stark hämolysierten Proben verwenden.

VORSICHTSMASSNAHMEN FÜR ANWENDER • MonoTotal® ELISA ist ausschließlich für die Verwendung als In-vitro-Diagnostikum vorgesehen.• Das Testkit nach dem Ablaufdatum nicht mehr verwenden. • Keine Reagenzien aus verschiedenen Chargen mischen.• Alle Patientenproben sind als infektiös zu betrachten und müssen gemäß den einschlägigen Bestimmungen gehandhabt und entsorgt werden.• Schutzhandschuhe und Schutzbrille tragen.• Eine mikrobiologische Kontamination von Reagenzien vermei den.• Auf Anfrage ist ein Sicherheitsdatenblatt erhältlich.

ERFORDERLICHE, ABER NICHT ENTHALTENE AUSSTATTUNG Übliche Laborausstattung, z. B. Präzisionspipetten und Vor-tex-Schüttlerfür die Inkubation von Mikrotiterplatten bei einer empfohlenen Oszillation von 450 U/minVE-Wasser oder destilliertes WasserWaschvorrichtung für MikrotiterplattenMikrotiterplatten-Lesegerät (Wellenlänge 450 nm)BESTANDTEILE DES KITSEnthaltenes Material für 96 Bestimmungen.MonoTotal® ELISA Coated Microstrips1 Platte, 96 trockene Wells (in 12 Streifen), beschichtet mit monoklonalen Antikörpern. Verpackt in einem Aluminiumbeutel mit Trockenmittel. Gebrauchsfertig.MonoTotal® ELISA HRP Conjugate 1 Fläschchen, 12 ml, monoklonale Antikörper, konjugiert mit HRP in proteinstabilisiertem Puffer, pH 7,5. Farbe Blau. Konser-vierungsmittel enthalten. Gebrauchsfertig.MonoTotal® ELISA Diluent (Standard 0 U/l)1 Fläschchen, 5 ml, Probenverdünnungsmittel und Standard 0 U/I, proteinstabilisierter Puffer, pH 7,5. Farbe Gelb. Konservie-rungsmittel enthalten. Gebrauchsfertig.MonoTotal® ELISA Standard (60, 150, 600, 2600 U/l)4 Fläschchen, 1 ml/Fläschchen, MonoTotal® ELISA Standard in proteinstabilisiertem Puffer, pH 7,5. Konzentrationen auf den Fläschchen angegeben. Farbe Gelb. Konservierungsmittel enthalten. Gebrauchsfertig.MonoTotal® ELISA Control Low und Control High2 Fläschchen, 1 ml/Fläschchen, MonoTotal® ELISA Control in proteinstabilisiertem Puffer, pH 7,5. Farbe Gelb. Konservierung-smittel enthalten. Gebrauchsfertig.Wash TabletEine blisterverpackte Tablette zur Auflösung in einem Liter frisch demineralisiertem Wasser oder destilliertem Wasser.TMB Substrate 1 Fläschchen, 22 ml. Vor Licht schützen und Deckel fest versch-lossen halten. Gebrauchsfertig. Nur die für die Analyse erforder-liche Menge verwenden. Stop Solution1 Fläschchen, 12 ml, 0,5 M Schwefelsäure. Gebrauchsfertig.Dichtband1 Blatt Dichtband für Microstrips.MonoTotal® ELISA CertificateZertifikat für Chargeninhalt und Freigabedatum.MonoTotal® ELISA IFU Gebrauchsanweisung.

LAGERUNG VON KIT UND REAGENZIENDas Kit sollte bei 2 bis 8 °C aufbewahrt werden. Nicht einfrieren. Reagenzien sollten immer in ihren Originalbehältern aufbewahrt werden. Wenn nicht alle Streifen auf einmal verwendet werden, müssen die übrigen MonoTotal® ELISA Coated Microstrips im Aluminiumbeutel mit Trockenmittel aufbewahrt werden. Die Waschlösung bleibt vier Wochen lang stabil, wenn sie bei 2 bis 8 °C gelagert wird.

VORBEREITUNG DER REAGENZIENVorbereitung der Waschlösung: Eine Wash Tablet in einem Liter VE-Wasser oder destilliertem Wasser auflösen.

ASSAY-VERFAHRENDer Assay sollte bei Raumtemperatur, 18-26 °C, durchgeführt werden.Alle Reagenzien und Proben müssen Raumtemperatur ange-nommen haben. Vor der Verwendung alle Reagenzien in einem Vortex-Schüttler mischen. Die Schritte 1 und 2 sollten nacheinander und ohne Unter-brechung durchgeführt werden.

DEUTSCH1. Je 100 µl Standards, Kontrollen und Proben in die entspre chenden Wells pipettieren. Zwei Wells für die Messung der Hintergrundabsorption leer lassen (optionale Leerprobe). Es wird ein zweifacher Durchlauf von Standards, Kontrollen und Proben empfohlen.2. 100 µl MonoTotal® ELISA HRP Conjugate in jedes Well hinzu geben, ausgenommen die Wells für Leerproben. 3. Auf einem Mikrotiterplatten-Schüttler bei 450 U/min zwei Stunden ±10 Min. inkubieren. Die Einstellung des Schüttlers auf 450 U/min ist für korrekte Resultate entscheidend.4. Die Wells dreimal mit Waschlösung waschen und leeren. Sicherstellen, dass nach dem Waschen keine Reste von Waschlösung in den Wells zurückbleiben.5. 200 µl TMB Substrate pro Well (auch in die Wells für die Leerprobe) hinzugeben. 6. In Dunkelheit 15 ± 1 Min. inkubieren.7. 100 µl Stop Solution pro Well hinzugeben. Auf einem Schütt ler 1 min. schütteln.8. Innerhalb von 30 Min. nach Hinzugabe der Stop Solution die Extinktion bei 450 nm ablesen. 9. Die Konzentration (U/I) von Cytokeratin in den Proben be rechnen.

Das Testverfahren im Schema

ERGEBNISBERECHNUNGEine Computersoftware zur Verarbeitung der Rohdaten ver-wenden. Geeignete Algorithmen für die Kurvenanpassung sind Spline, Glättung, Punkt-zu-Punkt oder lineare Regression. Für die Qualitätskontrolle und Generierung gültiger Daten muss sichergestellt sein, dass die einbezogenen Kontrollproben inner-halb des im Zertifikat genannten Bereichs liegen.HINWEIS: Je nach dem für die Kurvenanpassung verwende-ten Algorithmus können die Konzentrationswerte der gleichen Patientenprobe geringfügig voneinander abweichen. Um die Vergleichbarkeit der erhaltenen Daten zu gewährleisten, muss darum immer derselbe Algorithmus verwendet werden.

LEISTUNGSDATEN Messbereich: Der Messbereich beträgt 15 bis 2.600 U/I. Proben mit einer Konzentration > 2600 U/l sollten vor der erneu-ten Analyse mit MonoTotal® ELISA Diluent (Standard 0 U/l) (1:2 oder 1:4) verdünnt werden.

Normalbereich: Das 95. Perzentil wurde bei 63 U/l mit einem Konfidenzintervall von 52-83 U/l anhand der Serumproben von 169 anscheinend gesunden schwedischen Blutspendern ermittelt.Es wird empfohlen, dass jedes Labor einen eigenen Normalbe-reich bestimmt, weil zwischen Ländern und Referenzgruppen Unterschiede bestehen könnten.

Nachweisgrenze: Die mit MonoTotal® ELISA nachweisbare Mindestkonzentration liegt ≤15 U/l. Sie ist definiert als die Kon-zentration von Cytokeratin 8/18/19, die einem Extinktionswert entspricht, der zwei Standardabweichungen vom Extinktions-wert des Standards 0 U/l (LoD) entfernt liegt.

Interferenzen: Es gab keine nachweisbare Interferenz von Bilirubin (125 µg/ml) und Lipiden (12,5 mg/ml), die als Wie-derfindung zwischen 85% und 115% definiert war.Interferenzen durch hinzugefügtes Hämoglobin (100, 250 und 500 mg/dl) führten zu höheren Werten als erwartet (> 115% Wiederfindung). Bei Proben mit niedriger Konzentration war die Interferenz von Hämoglobin ausgeprägter.

Präzision:Präzision innerhalb einer Charge: Die Daten stammen aus sieben bis zehn verschiedenen Durchläufen mit drei Replikaten pro Probe und Durchlauf. Die Variabilität innerhalb eines Ana-lysedurchgangs lag bei einem VK von 2,1% bis 13,8%, der VK zwischen Analysedurchgängen lag bei 3,0% bis 12,3%, je nach Probenkonzentration. Präzision zwischen Chargen: Die Daten stammen aus drei Kit-Chargen mit drei Replikaten pro Probe und Durchlauf. Die Variabilität innerhalb einer Charge lag bei einem VK von 2.8%- 6.3% bis 3.7-15.3%, je nach Probenkonzentration.

Wiederfindung: Die Wiederfindungsrate spezifizierter Mengen von MonoTotal® Antigen, die Proben humanen Serums hinzu-gefügt wurden, liegt zwischen 90% und 110%.

Linearität: Im Testbereich (15-2600) U/L, ist die lineare Korrela-tionskoeffizient R ≥0.990.

High-Dose-Hook-Effekt: Der Assay zeigt bis zu 20.000 U/l keinen High-Dose-Hook-Effekt.

HAMA: Patientenproben, die humane Anti-Maus-Antikörper (HAMA) enthalten, können gelegentlich fälschlich erhöhte oder geringere Werte ergeben. MonoTotal® ELISA enthält HAMA-neutralisierende Stoffe.

GRENZEN DES ASSAYS• MonoTotal® ELISA ist nicht zur Verwendung als Krebs-Früher kennungstest vorgesehen.• MonoTotal® ELISA Testergebnisse sollten nicht als absolu ter Beweis für das Vorhandensein oder Nicht-Vorhandensein epithelialer Karzinome interpretiert werden.• Erhöhte Werte können beispielsweise auch bei Lebererkran kungen, Nierenversagen, allgemeinen Infektionen, Diabetes und Schwangerschaft auftreten. • Proben mit erkennbarer Trübung, Hämolyse, Hyperlipidämie oder Fibringehalt können irreführende Resultate zur Folge haben.

GEWÄHRLEISTUNGJede Änderung oder Modifikation in der Verfahrensweise, die nicht von IDL Biotech AB empfohlen wird, kann die Ergebnisse verfälschen. In diesem Fall lehnt IDL Biotech AB alle ausdrück-lichen, stillschweigenden oder gesetzlichen Gewährleistungen ab, einschließlich der stillschweigenden Gewährleistung der Marktgängigkeit oder Eignung für einen bestimmten Zweck.

HandelsmarkeMonoTotal® ist eine eingetragene Handelsmarke von IDL Biotech AB.

100 µlStandard / Controloder Probe

100 µl HRP-conjugate

Inkubieren2 Std., 450 U/min

3 x 0.3 ml

200 µl TMB 15 min 100 µl Stop Solution

Ablesen bei450 nm

1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8.

ISTRUZIONI PER L’USOUSO PREVISTOMonoTotal® ELISA è un esame diagnostico in vitro volto alla determinazione quantitativa dei frammenti solubili delle citoche-ratine 19, 8 e 18 nel siero umano. L’utilizzo principale di MonoTotal® ELISA consiste nella gestione di pazienti affetti da carcinoma polmonare non a piccole cellule (NSCLC), come ausilio nella diagnosi, prognosi e follow-up. MonoTotal® ELISA è anche utile per la prognosi e il follow-up di altri carcinomi epiteliali.

RIEPILOGO E SPEGAZIONE DELL’ESAMELe citocheratine (CK) sono proteine intracellulari espresse nella maggior parte delle cellule epiteliali. Lo schema delle citoche-ratine è solitamente mantenuto durante la trasformazione di cellule normali in cellule maligne. CK19, CK8 e CK18 sono tra le citocheratine più abbondanti nelle cellule epiteliali semplici. I frammenti solubili di CK19, CK8 e CK18 vengono rilasciati nel siero e in altri fluidi corporei a causa di apoptposi o necrosi. La quantità dei frammenti di CK nel siero è correlata con la crescita e la morte cellulare. Un livello elevato di frammenti solubili delle citocheratine in campioni prelevati da pazienti è un’indicazione di attività cellulare di un tumore epiteliale. MonoTotal® ELISA utilizza specifici anticorpi monoclonali che si legano a epitopi definiti su frammenti solubili di CK19, CK8 e CK18 nei campioni dei pazienti.Test seriali per valori di esami dei pazienti MonoTotal® ELISA devono essere interpretati in correlazione con tutte le informazi-oni cliniche disponibili e i dati diagnostici del paziente.

PRINCIPIO ALLA BASE DELL’ESAMEMonoTotal® ELISA è un immunodosaggio monofase a sandwich legato ad enzimi. Durante gli standard di incubazione, i controlli e i campioni reagiscono simultaneamente con anticorpi recettori monoclonali su fase solida e anticorpi monoclonali rivelatori HRP-coniugati. Dopo l’incubazione, la piastra viene lavata e viene aggiunto il substrato TMB. La reazione viene arrestata aggiungendo Stop Solution, e l’assorbenza viene misurata a 450 nm. Il colore che si è sviluppato è direttamente proporzio-nale alla concentrazione di frammenti legati di citocheratina.

RACCOLTA E CONSERVAZIONE DEL CAMPIONE• È possibile usare siero o plasma. Il volume necessario per la misurazione dei duplicati è 250 µl. • I campioni possono essere conservati refrigerati (2-8 °C) fino a un massimo di 24 ore. Per tempi di conservazione più lunghi, il campione deve essere conservato congelato (<-18°C). Non vi è indicazione di perdita di attività se i campioni vengono congelati e scongelati, ma si consiglia di evitare ripetuti scong elamenti e congelamenti. • Non utilizzare campioni che risultano altamente emolizzati.

PRECAUZIONI PER GLI UTILIZZATORI • MonoTotal® ELISA è destinato unicamente all’utilizzo diagnos tico in vitro.• Non utilizzare il kit dopo la data di scadenza. • Non miscelare reagenti di lotti diversi.• Tutti i campioni dei pazienti devono essere considerati conta giosi e devono essere manipolati e smaltiti secondo appropria te normative.• Indossare guanti e occhiali protettivi.• Evitare la contaminazione microbiologica dei reagenti.• Una Scheda Tecnica di Sicurezza dei Materiali è disponibile su richiesta.

Acqua deionizzata o distillataAttrezzatura di lavaggio per micropiastreLettore di micropiastra (lunghezza d’onda 450 nm)

CONTENUTO DEL KITMateriali forniti per 96 determinazioni.MonoTotal® ELISA Coated Microstrips1 piastra, 96 pozzetti asciutti (12 strisce), rivestiti di anticorpi monoclonali. Confezionati in una busta di alluminio con essicca-tore. Pronti all’usoMonoTotal® ELISA HRP Conjugate 1 provetta, 12 ml, anticorpi monoclonali coniugati con HRP in soluzione tampone stabilizzata con proteine, pH 7,5. Colore blu. Con aggiunta di conservanti. Pronti all’uso.MonoTotal® ELISA Diluent (Standard 0 U/l)1 provetta, diluente campione e standartd 0 U/I, tampone stabilizzato con proteina, pH 7,5. Colore giallo. Con aggiunta di conservanti. Pronti all’uso.MonoTotal® ELISA Standard (60, 150, 600, 2600 U/l)4 provette, da 1 ml, materiale MonoTotal® ELISA standard in tampone stabilizzato da proteine, pH 7,5. Concentrazioni dichi-arate sulle provette. Colore giallo. Con aggiunta di conservanti. Pronti all’uso.MonoTotal® ELISA Control Low e Control High2 provette, da 1 ml, materiale MonoTotal® ELISA standard in tampone stabilizzato da proteine, pH 7,5. Colore giallo. Con aggiunta di conservanti. Pronti all’uso.Wash tabletUna tavoletta confezionata in blister da sciogliere in 1 litro di acqua deionizzata sterile o distillata.TMB Substrate 1 provetta, da 22 ml. Proteggere dalla luce e mantenere il coperchio chiuso a tenuta. Pronti all’uso. Non usare più di quan-to sia necessario per l’analisi. Stop Solution1 provetta, da 12 ml, acido solforico 0,5 M. Pronti all’usoNastro sigillante1 foglio di nastro sigillante per microstrip.MonoTotal® ELISA CertificateCertificato del contenuto del lotto e dati di rilascio.MonoTotal® ELISA IFU Istruzioni per l’uso.

CONSERVAZIONE DEL KIT E DEL REAGENTEIl kit deve essere conservato a una temperatura compresa tra 2 e 8 °C. Non congelare. I reagenti devono essere sempre conservati nei loro contenitori originali. Se le strisce non vengono usate tutte in una volta, assicurarsi di conservare le restanti MonoTotal® ELISA Coated Microstrips nella busta di alluminio con il dispositivo essiccante. La soluzione di lavaggio è stabile per 4 settimane se conservata a 2-8°C.

MATERIALI NECESSARI MA NON FORNITI Attrezzature di laboratorio di routine, ad es. pipette di precisione e miscelatoriAgitatore per l’incubazione di micropiastre con una oscillazione raccomandata di 450 rpm.

PREPARAZIONE DEI REAGENTIPreparazione della soluzione di lavaggio: Sciogliere una wash tablet in 1 litro di acqua deionizzata o distillata.

PROCEDURA DELL’ESAMEL’esame deve essere eseguito a temperatura ambiente, 18-26 °C.Lasciare che tutti i reagenti e i campioni si adattino alla tempe-ratura ambiente. Prima dell’uso miscelare tutti i reagenti su un miscelatore. Le fasi 1 e 2 devono essere eseguite in sequenza senza interru-zione.

ITALIANO1. Pipette 100 µl standard, controlli e campioni per pozzetti definiti. Lasciare due pozzetti vuoti per la misurazione dell’as sorbenza in background (facoltativo). Si consiglia di eseguire duplicati degli standard, dei controlli e dei campioni.2. Aggiungere 100 µl di MonoTotal® ELISA HRP Conjugate in ciascun pozzetto ad eccezione dei pozzetti lasciati vuoti. 3. Incubare per 2 ore ± 10 min. su un agitatore per micropiastra a 450 rpm. Per ottenere risultati corretti è importante l’im postazione dell’agitatore a 450 rpm.4. Aspirare e lavare i pozzetti per 3 volte con 0,3 ml di soluzione di lavaggio. Assicurarsi che dopo il lavaggio non ci siano residui della soluzione di lavaggio nei pozzetti.5. Aggiungere 200 µl TMB substrato per pozzetto, compresi quelli vuoti. 6. Incubare al buio per 15±1 min.7. Aggiungere 100 µl di Stop Solution per pozzetto. Agitare su un agitatore per 1 min.8. Leggere l’assorbenza a 450 nm entro 30 minuti dall’aggiunta della Stop Solution. 9. Calcolare la concentrazione (U/I) di citocheratina nei campi oni.

Procedura schematica dell’esame

CALCOLO DEI RISULTATIUsare software per computer per elaborare i dati grezzi. Gli algoritmi consigliati per il raccordo di curve sono smoothing spline, da punto a punto o regressione lineare. Per il controllo qualità e la produzione di dati validi, assicurarsi che i controlli inclusi rientrino nel range dichiarato sul certificato.NOTA: algoritmi diversi per il raccordo di curve potrebbero produrre concentrazioni leggermente diverse dei campioni dei pazienti, pertanto è importante usare sempre lo stesso algorit-mo quando si confrontano i dati.

Interferenza: Non c’è stata alcuna interferenza rilevabile dalla bilirubina (125 µg/ml) e dai lipidi (12,5 mg/ml), definiti come ripresa entro l’85% e il 115%.L’interferenza dall’emoglobina aggiunta, 100, 250 e 500 mg/dl, ha causato valori più elevati di quanto previsto, >115% di ripresa. L’interferenza dell’emoglobina è stata più pronunciata in campioni a bassa concentrazione.

Precisione:Precisione entro il lotto: dati raccolti da sette a dieci diverse sessioni, tre copie per campione e sessione. Entro la variabilità di sessione CV 2,1%-13,8%, tra variabilità di sessione CV 3,0% - 12,3% in base alle diverse concentrazioni dei campioni. Precisione tra i lotti: dati raccolti da tre lotti di kit, tre copie per campione e sessione. Entro la variabilità di sessione CV 2.8%- 6.3%, tra variabilità di sessione 3.7-15.3%, in base alle diverse concentrazioni dei campioni.

Recupero: Il recupero di specifiche quantità aggiunte di antige-ne MonoTotal® ELISA a campioni di siero umano è compreso fra 90% e 110%.

Linearità: All’interno della gamma di test (15-2600) U/L, il coeffi-ciente di correlazione lineare R è ≥0.990.

Effetto gancio a dose elevata: L’esame non mostra alcun effet-to gancio a dose elevata fino a 20.000 U/I.

HAMA: I campioni di pazienti contenenti anticorpi umani anti murini (HAMA) possono occasionalmente produrre falsi valori elevati o ridotti. Gli agenti neutralizzanti HAMA vengono aggiunti a MonoTotal® ELISA.

LIMITAZIONI DELL’ESAME• MonoTotal® ELISA non è previsto per l’uso come test di scre ening tumorale.• I risultati del test MonoTotal® ELISA non devono essere inter pretati come evidenza assoluta della presenza o assenza di carcinoma epiteliale.• Risultati elevati potrebbero aversi ad esempio in casi di pato logia epatica, insufficienza renale, infezioni generiche, diabete e gravidanza. • I campioni che mostrano torbidità, emolisi, iperlipidemia, o che contengono fibrina, potrebbero dare risultati fuorvianti.

CARATTERISTICHE DI PRESTAZIONE Range di misurazione: Il range di misurazione è 15-2600 U/I. I campioni che presentano concentrazioni > 2600 U/l devono essere diluiti (1:2 o 1:4) con MonoTotal® ELISA Diluent (stan-dard 0 U/l) prima di ripetere l’analisi.

Range normale: Il 95° percentile è stato determinato a 63 U/l con un intervallo di sicurezza del 95% di 52-83 U/l quando sono stati analizzati i campioni di siero di 169 donatori di sangue svedesi apparentemente sani.Si consiglia che ciascun laboratorio stabilisca il proprio range normale a causa di differenze che potrebbero esistere tra i pae-si e i gruppi di riferimento.

Limite di rilevamento: La concentrazione minima rilevabile in MonoTotal® ELISA è ≤15 U/l, definita come la concentrazione di citocheratina 8/18/19 che corrisponde al valore di assorbenza di due deviazioni standard dal valore di assorbenza dello standard 0 U/l (LoD).

GARANZIAQualsiasi modifica nella procedura non raccomandata da IDL Biotech AB potrebbe alterare i risultati. In tal caso, IDL Biotech AB farà decadere tutte le garanzie espresse, implicite o prescrit-te, compresa la garanzia implicita di commerciabilità e l’idoneità di utilizzo.

MARCHIO COMMERCIALEMonoTotal® è un marchio commerciale registrato di IDL Biotech AB.

100 µlStandard/controlloo campione

100 µl HRP-conjugate

Incubare2 ore, 450 rpm

3 x 0.3 ml

200 µl TMB 15 min 100 µl Stop Solution

Leggere a450 nm

1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8.

NÁVOD K POUŽITÍURČENÉ POUŽITÍMonoTotal® ELISA je diagnostický test in vitro sloužící ke kvan-titativnímu stanovení rozpustných fragmentů cytokeratinů typu 19, 8 a 18 v lidském séru. Test MonoTotal® ELISA se používá v prvé řadě v rámci diagnostiky, prognózy a následné léčby u pacientů s malobuněčným karcinomem plic (NSCLC). MonoTotal® ELISA je také vhodný k prognostice a následné léčbě jiných zhoubných epitelových nádorů.

SHRNUTÍ A VYSVĚTLENÍ TESTUCytokeratiny (CK) jsou nitrobuněčné bílkoviny přítomné ve většině epitelových buněk. Při přeměně normálních buněk ve zhoubné zůstává vzorec cytokeratinu obvykle beze změn. K nejčastějším typům cytokeratinu v jednoduchých epitelových buňkách patří CK 19, CK 8 a CK 18, přičemž jejich rozpustné fragmenty se uvolňují do séra a jiných tělních tekutin v důs-ledku apoptózy či nekrózy. Množství fragmentů CK 19, CK 8 a CK 18 v séru koreluje s růstem a smrtí buněk. Zvýšená hladi-na rozpustných fragmentů cytokeratinů ve vzorcích pacientů naznačuje na aktivitu epiteliálních nádorových buněk. V rámci testu MonoTotal® ELISA se používají specifické monoklonální protilátky, jež se váží na definované epitopy na rozpustných fragmentech CK 19, CK 8 a CK 18 obsažených ve vzorcích.Hodnoty ze sériových testů pacientů MonoTotal® ELISA je třeba interpretovat společně s veškerými dostupnými klinickými informacemi a diagnostickými údaji týkajícími se konkrétního pacienta.

PRINCIP TESTUMonoTotal® ELISA je jednofázový sendvičový imunologický test na bázi imunoenzymatické reakce. Při inkubaci reagují stan-dardy, kontroly a vzorky současně s pevnými monoklonálními zachytávacími protilátkami a monoklonálními protilátkami detekčního konjugátu s obsahem avidin-peroxidázy (HRP Con-jugate). Po inkubaci se destička promyje a přidává se substrát obsahující tetramethylbenzidin (TMB Substrate). Reakce se zastaví přidáním zastavovacího roztoku (Stop Solution) a měří se absorbance při 450 nm. Vzniklý barevný odstín je přímo úměrný koncentraci vázaných fragmentů cytokeratinů.

ODBĚR A UCHOVÁVÁNÍ VZORKŮ• Lze použít sérum či plazmu a pro opakované měření se poža duje vzorek o objemu 250 µl. • Vzorky lze uchovávat v chladu (2–8 °C) až 24 hod., pro potře by delšího skladování by se měl vzorek uchovávat mražený (< –18 °C). V případě mrazení a rozmrazování nic nenaz načuje na zastavení aktivity, nicméně se doporučuje zamezit opakovanému zmrazení a rozmrazování. • Nepoužívejte velmi hemolyzované vzorky.

PREVENTIVNÍ OPATŘENÍ PRO UŽIVATELE • Test MonoTotal® ELISA je určen pouze pro diagnostiku in vitro.• Po překročení data spotřeby sadu nepoužívejte. • Nemiste reagencie z různých šarží.• Se všemi vzorky pacientů je třeba nakládat jako s infekčními a manipulace s nimi a jejich likvidace musí být v souladu s příslušnými předpisy.• Používejte ochranné rukavice a brýle.• Zamezte mikrobiologické kontaminaci reagencií.• Na požádání je k dispozici bezpečnostní list látky.

POŽADOVANÉ NEDODÁVANÉ MATERIÁLY Běžné laboratorní vybavení, např. dělené pipety a vortexová třepačkaTřepačka pro inkubaci mikrodestiček o doporučeném kmitání 450 ot./min.Deionizovaná nebo destilovaná vodaZařízení na promývání mikrodestičekČtečka mikrodestiček (vlnová délka 450 nm)

OBSAH SADYK dispozici materiály na 96 testů.MonoTotal® ELISA Coated Microstrips1 destička, 96 suchých jamek (12 proužků) potažených mo-noklonálními protilátkami. Zabaleny v hliníkovém sáčku s desi-kantem. K okamžitému použití.MonoTotal® ELISA HRP Conjugate 1 zkumavka (12 ml), monoklonální protilátky konjugované s avidin-peroxidázou v pufru stabilizovaném bílkovinami (pH 7,5). Modrá barva, s obsahem konzervantů. K okamžitému použití.MonoTotal® ELISA Diluent (Standard 0 U/l)1 zkumavka (5 ml), ředidlo vzorků a standard 0 U/l, pufr stabi-lizovaný bílkovinami (pH 7,5). Žlutá barva, s obsahem konzer-vantů. K okamžitému použití.MonoTotal® ELISA Standard (60, 150, 600, 2600 U/l)4 zkumavky po 1 ml, standardní materiál MonoTotal® ELISA v pufru stabilizovaném bílkovinami, pH 7,5. Koncentrace uvede-na na zkumavkách. Žlutá barva, s obsahem konzervantů. K okamžitému použití.MonoTotal® ELISA Control Low a Control High2 zkumavky po 1 ml, kontrolní materiál MonoTotal® ELISA v pu-fru stabilizovaném bílkovinami, pH 7,5. Žlutá barva, s obsahem konzervantů. K okamžitému použití.Wash tabletJedna tableta balená v blistru, k rozpuštění v 1 litru čerstvé deionizované nebo destilované vody.TMB Substrate 1 zkumavka (22 ml). Chraňte před světlem, uchovávejte dobře uzavřenou. K okamžitému použití. Nepoužívejte větší množství, než je pro analýzu potřeba.Stop Solution1 zkumavka (12 ml), 0,5 M kyseliny sírové. K okamžitému použití.Lepicí páska1 arch lepicí pásky na mikroproužky.MonoTotal® ELISA CertificateCertifikát s uvedením obsahu šarže a data vydání.MonoTotal® ELISA IFU Návod k použití.

UCHOVÁVÁNÍ SADY A REAGENCIÍSada se uchovává při teplotě 2–8 °C. Nezmrazujte. Reagencie by se měly vždy uchovávat v původním obalu. V případě, že se nepoužijí všechny proužky, uchovávejte zbývající potažené mikroproužky MonoTotal® ELISA v hliníkovém sáčku s desikantem. Promývací roztok je stabilní při teplotě 2–8 °C po dobu 4 dnů.

PŘÍPRAVA REAGENCIÍPříprava promývacího roztoku: Rozpusťte jednu promývací tabletu v 1 litru deionizované nebo destilované vody.

POSTUP PROVEDENÍ TESTUTest by se měl provádět při pokojové teplotě, 18–26 °C.Nechte všechny reagencie a vzorky ohřát na pokojovou teplotu. Před použitím všechny reagencie smíchejte ve vortexové tře-pačce. Kroky 1 a 2 by se měly provádět postupně bez přerušování.1. Aplikujte pipetou 100 µl standardů, kontrol a vzorků do stanovených jamek. Ponechte dvě jamky prázdné (čisté) pro referenční měření absorbance (není nutné). Standardy, kon troly a vzorky se doporučuje testovat zdvojené.2. Přidejte do každé jamky kromě prázdných jamek 100 µl kon jugátu, MonoTotal® ELISA HRP Conjugate. 3. Nechte inkubovat 2 h ± 10 min. v třepačce mikrodestiček rychlostí 450 ot./min. Nastavení třepačky na 450 ot./min. (rpm) je důležité pro získání správných výsledků.

ČEŠTINA4. Odsajte a vymyjte jamky 3krát 0,3 ml promývacího roztoku Po promytí ověřte, že v jamkách nezůstaly zbytky promývacího roztoku.5. Do každé jamky včetně prázdných přidejte 200 µl substrátu TMB. 6. Nechte inkubovat v temnu po dobu 15 ± 1 min.7. Do každé jamky přidejte 100 µl zastavovacího roztoku (Stop Solution). Nechte protřepat v třepačce po dobu 1 min.8. Do 30 min. od přidání zastavovacího roztoku odečtěte absor banci při 450 nm. 9. Spočítejte koncentraci (U/l) cytokeratinu ve vzorcích.

Schéma postupu testu

VÝPOČET VÝSLEDKŮHrubá data zpracujte pomocí počítačového softwaru. Doporuče-né algoritmy pro prokládání křivky jsou „spline smoothed“, „point to point“ nebo „linear regression“. Pro kontrolu kvality a získání platných dat dbejte na to, aby příslušné kontroly odpovídaly rozsahu uvedenému v certifikátu.POZNÁMKA: Z různých algoritmů prokládání křivky se mohou získat poněkud rozdílné koncentrace ve vzorcích pacientů, a proto je důležité data porovnávat vždy s využitím stejného algoritmu.TECHNICKÁ SPECIFIKACE Rozsah měření: Rozsah měření je 15–2 600 U/l. Vzorky s koncentrací > 2 600 U/l by se měly před opakováním analýzy ředit (1 : 2 nebo 1 : 4) pomocí rozpouštědla MonoTotal® ELISA Diluent (Standard 0 U/l).

Normální rozsah: Při analýze vzorků séra 169 evidentně zdravých švédských dárců krve byl stanoven 95. percentil na 63 U/l v 95% intervalu spolehlivosti 52–83 U/l.Doporučuje se, aby si každá laboratoř stanovila svůj normální rozsah s ohledem na možné rozdíly mezi jednotlivými zeměmi a referenčními skupinami.

Detekční limit: Minimální detekovatelná koncentrace je v testu MonoTotal® ELISA ≤15 U/l, což odpovídá koncentraci cytokera-tinů 8/18/19 o hodnotě absorbance dvou standardních odchylek od hodnoty absorbance standardu 0 U/l (LoD).

Interference: Nebyla zjištěna interference bilirubinu (125 µg/ml) a lipidů (12,5 mg/ml), definovaná jako obnova do 85 až 115 %.Interference přidaného hemoglobinu (100, 250 a 500 mg/dl) – vyšší než předpokládané hodnoty, obnova > 115 %. Interfe-rence hemoglobinu byla výraznější v případě vzorků s nízkou koncentrací.

Přesnost:Přesnost v rámci šarže: Data ze sedmi až deseti různých cyklů testu, tři opakování na vzorek a cyklus. Variabilita v rámci cyklu CV 2,1–13,8 %, variabilita mezi cykly CV 3,0–12,3 % v závislos-ti na různých koncentracích vzorků. Přesnost různých šarží: Data z tří šarží sady, tři opakování na vzorek a cyklus. Variabilita v rámci cyklu CV 2.8%- 6.3%, varia-bilita různých šarží 3.7-15.3% v závislosti na různých koncen-tracích vzorků.

Obnova: Obnova specifikovaného množství antigenu MonoTotal® ELISA přidaného ke vzorkům lidského séra se pohybuje v rozmezí 90 až 110 %.

Linearita: V rámci rozsah testu (15-2600), U/L, korelační koefi-cient lineární R je ≥0.990.

Tzv. high dose hook efekt (způsobený vysokou koncentrací): V rámci tohoto testu nedochází k high dose hook efektu až do koncentrace 20 000 U/l.

HAMA: Vzorky pacientů obsahující lidské „protimyší“ protilátky (HAMA) mohou někdy vykazovat falešné snížené či zvýšené hodnoty. V rámci testu MonoTotal® ELISA jsou přidána činidla neutralizující protilátky HAMA.

OMEZENÍ TESTU• Test MonoTotal® ELISA není určen k použití jako screeningový test rakoviny.• Výsledky testu MonoTotal® ELISA by neměly být chápány jako absolutní důkaz přítomnosti či nepřítomnosti epitelových nádorů.• Zvýšené hodnoty lze konstatovat např. v případě onemocnění jater, selhání ledvin, běžných infekcí, diabetu a těhotenství. • Výsledky mohou být zavádějící v případě zakalených, hemoly zovaných, hyperlipidemických vzorků či vzorků obsahujících fibrin.

ZÁRUKAJakékoli změny či úpravy postupu, které nejsou uvedeny v doporučeních společnosti IDL Biotech AB, mohou vést ke změně výsledků. V takovém případě se společnost IDL Biotech AB zříká veškerých záruk uvedených nepřímo či vyplývajících ze schválených předpisů včetně implicitní záruky vhodnosti pro prodej a použití.

OCHRANNÁ ZNÁMKAMonoTotal® je registrovaná ochranná známka společnosti IDL Biotech AB.

100 µlstandardu/kontrolyči vzorku

100 µl konjugátu HRP

Inkubace2 h, 450 ot./min.

3 x 0.3 ml

200 µl TMB 15 min 100 µl Stop roztok

Odečtení při450 nm

1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8.

POKYNY NA POUŽITIEÚČEL POUŽITIAMonoTotal® ELISA je in vitro diagnostický test určený na kvan-titatívne stanovenie rozpustných cytokeratínových fragmentov 19, 8 a 18 v ľudskom sére. MonoTotal® ELISA sa používa hlavne pri liečbe pacientov s nemalobunkovým karcinómom pľúc (NSCLC), ako pomôcka pri diagnóze, na určenie prognózy a pri sledovaní pacienta. MonoTotal® ELISA sa tiež používa na určenie prognózy a pri sledovaní pacienta v prípade iných epitelových karcinómov.

SÚHRN A VYSVETLENIE TESTUCytokeratíny (CK) sú intracelulárne proteíny exprimované vo väčšine epitelových buniek. Cytokeratínový profil sa zvyčajne zachováva počas premeny normálnych buniek na malígne bunky. CK19, CK8 a CK18 patria medzi najhojnejšie zastúpe-né cytokeratíny v jednoduchých epitelových bunkách. Roz-pustné fragmenty CK19, CK8 a CK18 sa uvoľňujú do séra a iných telových tekutín ako dôsledok apoptózy alebo nekrózy. Množstvo fragmentov CK v sére koreluje s bunkovým rastom a bunkovou smrťou. Zvýšená hladina rozpustných cytoke-ratínových fragmentov vo vzorke pacienta naznačuje karcinó-movú aktivitu epitelových buniek. MonoTotal® ELISA používa špecifické monoklonálne protilátky ktoré sa viažu na definované epitopy rozpustných fragmentov CK19, CK8 a CK18 vo vzorke pacienta. Periodické testovanie hodnôt testu MonoTotal® ELISA pacienta sa má interpretovať v spojení so všetkými dostupnými klinickými informáciami a diagnostickými údajmi pacienta.PRINCÍP TESTUMonoTotal® ELISA je jednokrokový imunotest typu ”sandwich” viazaný na enzým. Počas inkubácie reagujú štandardy, kontroly a vzorky súčasne s monoklonálnymi protilátkami - ”chytačmi” pevnej fázy a detekčnými monoklonálnymi protilátkami konjugo-vanými s HRP. Po inkubácii sa platnička prepláchne a pridá sa substrát TMB Subtstrate. Reakcia sa zastaví pridaním roztoku Stop Solution a absorpcia sa meria pri 450 nm. Vyvinutá farba je priamo úmerná koncentrácii viazaných cytokeratínových fragmentov.

ODBER VZORKY A SKLADOVANIE• Môže sa použiť sérum alebo plazma. Vyžadovaný objem vzor ky na dvojité meranie je 250 µl.• Vzorky sa môžu skladovať v chladničke (2-8 °C) až 24 h. Na dlhšie skladovanie sa majú vzorky zmraziť (<18°C). Neexistujú náznaky straty aktivity pri zmrazení a rozmrazení vzorky, ale neodporúča sa opätovné zmrazovanie a rozmrazovanie. • Nepoužívajte vzorky ktoré sú silne hemolyzované.

BEZPEČNOSTNÉ OPATRENIA PRE POUŽÍVATEĽOV• MonoTotal® ELISA je určený len na diagnostické použitie in vitro.• Súpravu nepoužívajte po dátume exspirácie.• Nemiešajte činidlá rôznych šarží.• Všetky vzorky pacientov je treba považovať za nákazlivé a manipulácia a likvidácia musí prebiehať podľa platných pred pisov. • Používajte ochranné rukavice a okuliare.• Zabráňte mikrobiologickej kontaminácii činidiel.• Na vyžiadanie je k dispozícii bezpečnostný list.POTREBNÉ MATERIÁLY KTORÉ NIE SÚ SÚČASŤOU SÚPRAVYŠtandardné laboratórne vybavenie, napr. pipety s presným meraním a centrifúga s vortexomLaboratórna trepačka - ”shaker” na inkubáciu mikroplatničiek s odporúčanou osciláciou 450 rpmDeionizovaná alebo destilovaná vodaZariadenie na premývanie mikroplatničiekČítačka mikroplatničiek (vlnová dĺžka 450 nm)

OBSAH SÚPRAVYDodaný materiál na 96 meraní.MonoTotal® ELISA Coated Microstrips1 platnička, 96 suchých jamiek (12 prúžkov), potiahnutých monoklonálnymi protilátkami. Zabalené v hliníkovom obale so sušidlom. Pripravené na použitie.MonoTotal® ELISA HRP Conjugate1 liekovka, 12 ml, monoklonálne protilátky konjugované s HRP v pufrovom roztoku stabilizujúcom bielkoviny, pH 7,5. Modrá far-ba. S pridanými konzervačnými látkami. Pripravené na použitie. MonoTotal® ELISA Diluent (Standard 0 U/l)1 liekovka, 5 ml, roztok na rozriedenie vzorky a štandardy 0 U/l, pufrový roztok stabilizujúci bielkoviny, pH 7,5. Žltá farba. S pridanými konzervačnými látkami. Pripravené na použitie.MonoTotal® ELISA Standard (60, 150, 600, 2600 U/l)4 liekovky, 1 ml/liekovka, MonoTotal® ELISA štandardy v pufrov-om roztoku stabilizujúcom bielkoviny, pH 7,5. Koncentrácia je uvedená na liekovkách. Žltá farba. S pridanými konzervačnými látkami. Pripravené na použitie.MonoTotal® ELISA Control Low a Control High2 liekovky, 1 ml/liekovka, MonoTotal® ELISA kontroly v pufrovom roztoku stabilizujúcom bielkoviny, pH 7,5. Žltá farba. S pri-danými konzervačnými látkami. Pripravené na použitie.Wash tabletJedna tableta balená v pretlačovacom balení, ktorá sa rozpustí v 1 litri čerstvej deionizovanej alebo destilovanej vody.TMB Substrate1 liekovka, 22 ml. Chráňte pred svetlom a viečko udržujte pevne uzavreté. Pripravené na použitie. Nepoužívajte viac substrátu ako je potrebné na analýzu. Stop Solution1 liekovka, 12 ml, 0,5 M kyselina sírová. Pripravené na použitie.Tesniaca páska1 list tesniacej pásky pre mikroprúžkyMonoTotal® ELISA CertificateCertifikát obsahu šarže a dátum vydania.MonoTotal® ELISA IFUPokyny na použitie

UCHOVÁVANIE SÚPRAVY A ČINIDIELSúprava sa má skladovať pri teplote 2-8°C. Nezmrazujte.Činidlá treba vždy skladovať v ich pôvodnom obale. Ak nepouži-jete všetky prúžky naraz, zaistite, aby sa zvyšné poťahované mikroprúžky MonoTotal® ELISA uskladnili v hliníkovom obale spolu so sušidlom. Premývací roztok je stabilný po dobu 4 týždňov pri skladovaní pri teplote 2-8°C.

PRÍPRAVA ČINIDIELPríprava premývacieho roztoku: rozpustite jednu tabletu wash tablet v 1 litri deionizovanej alebo destilovanej vody.

POSTUP TESTUTest sa má prevádzať pri izbovej teplote 18-26°C.Nechajte všetky činidlá a vzorky nastaviť na izbovú teplotu. Pred použitím premiešajte všetky činidlá vortexovou cen-trifúgou.Kroky 1 a 2 treba vykonať za sebou bez prerušenia.1. Naneste pipetou 100 µl štandárd, kontrol a vzoriek do každej vopred určenej jamky. Ponechajte dve prázdne jamky (čisté) na meranie absorpcie v pozadí (voliteľne). Odporúča sa prevádzať dvojité meranie štandárd, kontrol a vzoriek.2. Pridajte 100 µl MonoTotal® ELISA HRP Conjugate do každej jamky okrem prázdnych jamiek.3. Inkubujte 2 h ± 10 min na laboratórnej trepačke mikro platničiek pri 450 rpm. Nastavenie trepačky na 450 rpm je dôležité na zaručenie správnych výsledkov.

SLOVENČINA4. Nasajte a premyte jamky 3 krát s 0,3 ml premývacieho roztoku. Zaistite aby v jamkách po premytí nezostal žiaden premývací roztok.5. Pridajte 200 µl substrátu TMB Substrate do každej jamky, vrátane prázdnych jamiek.6. Inkubujte v tme 15 ± 1 min.7. Pridajte 100 µl roztoku Stop Solution do každej jamky. Nechajte potriasť 1 min na laboratórnej trepačke.8. Čítajte stupeň absorpcie pri 450 nm do 30 min po pridaní roztoku Stop Solution.9. Vypočítajte koncentráciu (U/l) cytokeratínu vo vzorkách.

Schématický postup testu

VYPOČÍTANIE VÝSLEDKOVPoužite počítačový softvér na spracovanie surových údajov. Odporúčané algoritmy na úpravu kriviek sú vyhladenie ”spline smoothed”, bod k bodu alebo lineárna regresia. Na kontrolu kvality a vytvorenie platných údajov zaistite, aby boli použité kontroly v rozmedzí stanovenom na certifikáte. POZNÁMKA: Rôzne algoritmy upravujúce krivky môžu mať za výsledok mierne rozličné výsledky koncentrácie zo vzorky pacienta. Z toho dôvodu je dôležité pri porovnávaní údajov používať stále ten istý algoritmus.

CHARAKTERISTIKA VÝKONURozsah merateľnosti: Rozsah merateľnosti je 15-2600 U/l. Vzorky ukazujúce koncentrácie > 2600 U/l treba rozriediť (1:2 alebo 1:4) s roztokom na rozriedenie MonoTotal® ELISA Diluent (Štandarda 0 U/l) pred opakovanou analýzou.

Normálny rozsah: 95% bolo stanovených na 63 U/l s 95% in-tervalom spoľahlivosti v hodnote 52-83 U/l pri analýze sérových vzoriek 169 očividne zdravých švédskych darcov krvi.Odporúča sa, aby si každé laboratórium zriadilo svoj vlastný normálny rozsah, kvôli rozdielom ktoré môžu existovať medzi krajinami a referenčnými skupinami.

Limit detekcie: Najnižšie detekovateľné koncentrácie pre MonoTotal® ELISA sú ≤15 U/l definovanou ako koncentrácia cytokeratínu 8/18/19 zodpovedajúca hodnotám absorpcie, ktoré sú dve štandardné deviácie od hodnôt absorpcie štandardy 0 U/l (LoD).

Interferencie: Nevyskytli sa žiadne interferencie bilirubínu (125 µg/ml) ani lipidov (12.5 mg/ml), definované ako vylúčenie od 85 % do 115 %.Interferencia pridaného hemoglobínu 100, 250 a 500 mg/dl spôsobila vyššie ako očakávané výsledky, > 115% vylúčenie. In-terferencia hemoglobínu bola výraznejšia pri vzorkách s nízkou koncentráciou.

Presnosť:Presnosť v rámci šarže: Údaje zo siedmich až desiatich rozličných prevedení, pri troch opakovaniach na vzorku a pre-vedenie. Variabilita v rámci prevedenia CV 2,1 %-13.8 %, medzi jednotlivými prevedeniami CV 3,0 %-12,3 %, v závislosti od rozdielnych koncentrácií vo vzorkách.Presnosť medzi šaržami: Údaje z troch šarží súprav, pri troch opakovaniach na vzorku a prevedenie. Variabilita v rámci prevedenia CV 2.8%- 6.3%, medzi jednotlivými šaržami CV 3.7-15.3%, v závislosti od rozdielnych koncentrácií vo vzorkách.

Vylúčenie: Vylúčenie pridaných špecifických množstiev pro-tilátok MonoTotal® proti vzorkám ľudského séra je v rozmedzí 90 % až 110 %.

Linearita: V rámci rozsah testu (15-2600), U/L, korelačný koefi-cient lineárnej R je ≥0.990.

Efekt pri vysokej koncentrácii (High-dose hook effect): Test nevykazuje tento efekt vysokej koncentrácie až do 20 000 U/l.

HAMA: Vzorky pacientov obsahujúce ľudské protilátky proti myším bielkovinám (HAMA) môžu v niektorých prípadoch viesť k falošným zvýšeným alebo zníženým hodnotám. Látky neutra-lizujúce HAMA sú pridané do MonoTotal® ELISA.

OBMEDZENIA TESTU• MonoTotal® ELISA nie je určený na rakovinový skríningový test.• Výsledky testu MonoTotal® ELISA sa nemajú interpretovať ako absolútny dôkaz prítomnosti alebo neprítomnosti epitelových karcinómov.• Zvýšené hodnoty výsledku môžu byť prítomné napr. v prípade ochorenia pečene, zlyhania obličiek, celkových infekcií, cukrovky alebo tehotenstva.• Vzorky ktoré sa vyznačujú zakalením, hemolýzou, hyperli pidémiou alebo ktoré obsahujú fibrín môžu viesť k zavádzajú cim výsledkom.

ZÁRUKAAkákoľvek zmena alebo modifikácia postupu, ktorá nie je doporučená IDL Biotech AB, môže ovplyvniť výsledky. V takom prípade sa IDL Biotech AB zrieka všetkých vyjadrených záruk, implicitných alebo štatutárnych, vrátane implicitnej záruky pre-dajnosti a vhodnosti na použitie.

OCHRANNÁ ZNÁMKAMonoTotal® je registrovaná ochranná známka IDL Biotech AB.

100 µlštandarda /Kontrolaalebo vzorka

100 µl konjugát HRP

Inkubujte2 h, 450 rpm

3 x 0.3 ml

200 µl TMB 15 min 100 µl Stop roztok

Čitajte pri450 nm

1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8.

用途MonoTotal® ELISA 是一种体外诊断试剂，用于定量检测血清中细胞角蛋白19、8和18可溶性片断。MonoTotal® ELISA 主要用于非小细胞肺癌(NSCLC)患者的辅助诊断、预后和追踪观察，也可用于其它癌症的预后和追踪观察。

实验基础概述细胞角蛋白（CK）存在于绝大多数上皮细胞内，细胞角蛋白19、8和18在单层上皮细胞中尤为丰富。在正常细胞转化为恶性瘤细胞过程中，细胞角蛋白结构形态保持不变。由于细胞凋亡或细胞坏死，细胞内的细胞角蛋白19、8和18的可溶性片断离开细胞进入血清或其他体液，血清中细胞角蛋白片断的量与细胞的生长和死亡相关。患者标本中细胞角蛋白可溶性片断水平的增高反应肿瘤细胞的活性。MonoTotal® ELISA 的实验基础是采用几个特异的单克隆抗体结合患者标本中细胞角蛋白19、8和18可溶性片断的特定表位。患者的 MonoTotal® ELISA 系列检测结果可结合全部临床信息和诊断数据进行综合分析。

实验原理MonoTotal® ELISA 是一步夹心法酶联免疫试剂盒。在孵育过程中，标准液、质控、待测标本同时和固相单克隆捕捉抗体与HRP（辣根过氧化物酶）标记的示踪抗体反应。孵育洗板后加入TMB底物孵育，加入终止液终止反应,在酶标仪450nm波长检测光吸收度。反应后的颜色与细胞角蛋白片断的含量直接相关。

标本和储存• 检测血清或血浆标本。检测双孔的标本量需要250 µl。• 冰箱（2-8℃）保存标本不得超过24小时。延迟检测，标本

应保存于冰冻状态（-18℃以下）。虽然没有证据显示冻融标本活性的丧失，但是仍然建议避免标本的反复冻融。

• 避免检测溶血严重的标本。

注意事项• MonoTotal® ELISA 试剂盒仅供体外使用。• 不要使用过期试剂盒。• 不同批号的试剂不宜混用。• 所有的患者标本应视为具有传染性的，应按实验室相关规定

进行处理。• 建议配戴手套和护眼罩。• 避免试剂被微生物污染。• 根据需要可提供材料安全数据。

本试剂盒未提供的必需品实验室常规仪器设备，如：微量加样器，涡旋仪孵育用振荡器，振幅450rpm去离子水或蒸馏水洗板机酶标仪（波长 450nm）

试剂盒内容可供96孔检测。MonoTotal® ELISA 微孔板：1块96孔（12x8）板，由单克隆抗体包被。保存于置放干燥剂的铝箔袋中，备用。HRP标记 MonoTotal® ELISA 抗体：1瓶，12 mL,HRP标记的单克隆抗体溶于稳定的蛋白缓冲液中，pH7.5，呈蓝色，已加防腐剂，备用。MonoTotal® ELISA 标本稀释液（标准液0 U/L）：1瓶，5 mL，标本稀释液即标准液0 U/L，稳定的蛋白缓冲液，pH7.5，呈黄色，已加防腐剂，备用。MonoTotal® ELISA 标准液（60，150，600，2600 U/L）：共4瓶，每瓶1mL，标准物质溶于稳定的蛋白缓冲液中，pH7.5，呈黄色。浓度值分别标在瓶签上。已加防腐剂，备用。MonoTotal® ELISA 质控（低浓度和高浓度）：2瓶，每瓶1mL，质控标准物质溶于稳定的蛋白缓冲液中，pH7.5，呈黄色。已加防腐剂，备用。清洗液溶质片剂：泡罩封闭片剂1片，用1000mL新鲜去离子水或蒸馏水溶解。

使用说明书

TMB底物：1瓶，22mL，密闭避光，适量取用，备用。终止液：1瓶，12mL，0.5M硫酸，备用。避光膜：1张MonoTotal® ELISA 试剂盒合格证合格证标示各试剂及微孔板批号及放行数据MonoTotal® ELISA 试剂盒说明书使用说明书

试剂盒与试剂的储存试剂盒宜储存于2-8℃，不可冰冻。试剂应在原容器内储存。如果微孔板未能一次用完，剩余的须保存在放有干燥剂的原铝箔袋中。清洗液在 2-8℃ 可保存4周。试剂的制备配制清洗液：将一片清洗液溶质片剂溶于1000 mL去离子水或蒸馏水中。

操作步骤实验操作室温 18-26℃。实验前将试剂和待测标本恢复至室温，用前摇匀。实验步骤1和2应连续进行。1. 微孔中分别加入标准液、质控或待测标本 100µL，预留2个

空白孔作背景对照（任意选择），建议作双孔检测。2. 每孔加入 100µL HRP标记 MonoTotal® ELISA 抗体，空白孔

除外。3. 振荡孵育 2小时±10 分钟，振幅 450rpm。为获得准确结

果，振荡器设定振幅450rpm不可忽视。4. 用清洗液洗板3次，每次每孔约 0.3mL。洗板结束需确认微

孔中无残留液。5. 每孔加 200µL TMB底物溶液，包括空白对照孔。6. 避光孵育 15±1分钟。7. 每孔加 100µL 终止液，振荡1分钟。8. 加入终止液30分钟内在酶标仪450nm读值。9. 计算标本的细胞角蛋白浓度值(U/L)。

操作程序表

100 µl标准液、质控

100 µl HRP-conjugate

振荡孵育2h , 450 rpm

洗板 3x0.3 ml

加 200 µl TMB 避光孵育 加 100 µl 终止液

读值(450 nm)

1. 2. 3. 4.

5. 6. 7. 8.

结果的计算可用计算机软件处理原始数据。建议用光滑拟合曲线（Spli-ne Smoothed Curve）或点到点（Point to Point）或线性回归（Linear Regression）曲线计算。为确保数据的有效性，需确认质控在合格证书标示的范围内。注意：患者标本的浓度值用不同曲线计算可以导致微小的差异，因此，对比实验数据时始终采用相同的计算曲线是很重要的。

中文

产品性能指标检测范围：15-2600 U/L。高于2600U/L的标本可用标本稀释液（标准液0 U/L）稀释（1:2或1:4）后重复检测。 正常值范围: 95% 样本正态分布的平均值为63U/L,范围52-83U/L,可信区95%，169例血清标本来自瑞典健康献血者。由于国家不同和参照人群的差异，建议各实验室建立自己的正常值范围。

敏感性：MonoTotal® ELISA 试剂盒对细胞角蛋白8、18、19片断最低检测限 ≤15 U/L，此浓度值与标准液 0 U/L光吸收值的标准差2倍相对应。

干扰实验：分别加入胆红素(125μg/mL)或脂类（12.5mg/mL），未检测到干扰,回收率85%-115%。分别加入血红蛋白100,250和500mg/dL,可导致检测值增高，回收率 ﹥115%，来自血红蛋白的干扰在低浓度标本中更需注意。

精确性：批内精确性：数据来自同批号试剂盒的7-10次实验，每个标本重复检测3次，根据各标本不同浓度值同次实验的CV值2.1%-13.8%,非同次实验的CV值3.0%-12.3%。批间精确性：数据来自3个批号试剂盒，每个标本重复检测3次，根据各标本不同浓度值同次实验的CV值2.8%-6.3%,批间差异 CV值3.7%-15.3%。

回收率：特定量的 MonoTotal® 抗原加入人血清标本中，经检测回收率范围 90%-110%。

线性: 在检测范围（15-2600)U/L，线性相关系数R≥0.990。

倒钩效应：标本浓度值高达20 000U/L无倒钩效应出现。

人抗鼠抗体(HAMA)含人抗鼠抗体（HAMA）的患者标本有的可造成检测值升高或降低的假性结果。MonoTotal® ELISA 试剂中加入了HAMA中和试剂。

实验的局限性• MonoTotal® ELISA 试剂盒不宜用于癌症的筛选。• MonoTotal® ELISA 的实验结果不宜视为癌症存在与否的绝

对证据。 • 某些肝脏疾患、肾功能衰竭、一般感染性疾病、糖尿病和妊

娠妇女可见到检测值增高的结果。• 混浊、溶血、高脂血或含纤维蛋白的标本检测结果可能有

误。

声明本说明书中提供的实验数据来自特定的实验程序，对本公司说明书中操作程序的任何修改都将影响检测结果。对此，本公司声明不负任何责任，包括本文说明的或未明示的产品性能与适用范围。

商标MonoTotal® 是IDL Biotech AB 公司的注册商标。

EXPLANATION OF SYMBOLS, ERKLÄRUNG VON SYMBOLEN, SPIEGAZIONE DEI SIMBOLI, VYSVĚTLENÍ SYMBOL, VYSVETLIVKY K SYMBOLOM, 符号说明

Catalogue number BestellnummerNumero di catalogoKatalogové čísloKatalógové číslo目录编号

Batch codeChargennummerCodice del lottoČíslo šarže Číslo šarže 批代码

In Vitro Diagnostic Medical DeviceIn-Vitro-DiagnostikumDispositivo medico-diagnostico in vitro In Vitro diagnostický zdravotnický prostředek Zdravotnícka pomocka in vitro 体外诊断医疗器械

ManufacturerHersteller Fabbricante Výrobce Výrobca 制造商

Use by dateVerfallsdatumUtilizzare entro Použijte do Dátum exspirácie在此日期前使用

Contains sufficient for < n > testsInhalt ausreichend für <n> Prüfungen Contenuto sufficiente per ”n” saggi Lze použít pro <n> testů Obsah postačuje na <n> stanovení 含量足够 <n> 次测试使用

Consult instructions for useGebrauchsanweisung beachten Leggere le istruzioni per l’uso Viz pokyny k použití Viď návod na použitie 请参考使用说明书

Temperature limitationTemperaturbegrenzungLimite superiore di temperatura Nejvyšší přípustná teplota Najvyššia prípustná teplota 温度限制

REFERENCES/REFERENZLITERATUREN/BIBLIOGRAFIA/LITERATURA/LITERATÚRA/参考文献

n

1. Barak, V. et al. Clinical utility of cytokeratins as tumor markers. Clin Biochem 37 (2004), 529-540.2. Eriksson P. et al. Role of circulating cytokeratin fragments and angiogenic factors in NSCLC patients stage IIIa-IIIb receiving curatively intended treatment. Neoplasma 2006: 53, 4: 285 – 290. 3. Kim, D.W. et al. Evaluation of usefulness for MonoTotal in non small cell lnung cancer. Korean J Nucl Med Tech 2009; 13: 171-1744. Korse, C.M et al. Choice of tumour markers in patients with neuroendocrine tumours is dependent on histo-logical grade. A marker study of Chromgranin A, Neuron specific enolase, Prograstrin-releasing peptide and cytokeratin fragments. Eur. J. Cancer 2012; 48: 662-671.

DATE OF ISSUE/AUSGABEDATUM/DATA DI PUBBLICAZIONE/DATUM VYDÁNÍ/DÁTUM VYDANIA/发布日期

2015-12-15

IFU MonoTotal® ELISA 91-366-04

IDL Biotech ABVisiting adress: Karlsbodavägen 39, SE-168 67 Bromma, SwedenPostal adress: P.O. Box 111 51, SE-161 11 Bromma, Sweden +46 8 799 67 50 +46 8 799 93 20idlbiotech@idl.sewww.idl.se