1

TEKNIK ISOLASI DNA BENIH TANAMAN TEH (Camellia sinensis L.)

Oleh:

GATI WINDIASTIKA, SP. MP (Calon Pengawas Benih Tanaman)

Balai Besar Perbenihan dan Proteksi Tanaman Perkebunan Surabaya

DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan berfungsi

untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara seluler.

DNA pada organisme tingkat tinggi seperti manusia, hewan dan tumbuhan terdapat

di dalam inti sel dan beberapa organ lain di dalam sel seperti mitokondria dan

kloroplast. Sehingga penyebutan nama DNA juga didasarkan pada lokasi asalnya.

DNA genome inti (nuclear DNA genome) berasal dari inti sel, DNA genom

mitokondria (mitochondrial DNA genome) berasal dari mitokondria serta DNA genom

kloroplast berasal dari kloroplast.

Perbedaan diantara ketiganya adalah DNA nukleus berbentuk linear dan

berasosiasi sangat erat dengan protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan

kloroplas berbentuk sirkular dan tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu,

DNA mitokondria dan kloroplas memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat

yang berasal dari garis ibu. Hal ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang

memiliki pola pewarisan sifat dari kedua orang tua. Dilihat dari organismenya,

struktur DNA prokariot berbeda dengan struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak

memiliki protein histon dan berbentuk sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk

linear dan memiliki protein histon.

Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan materi genetik dan bersifat

herediter pada seluruh sistem kehidupan. Sehingga pada dasarnya isolasi DNA

dapat dilakukan dari berbagai sumber (semua sel yang mempunyai inti), antara lain

organ manusia (darah, rambut dan tulang); organ tanaman (semaian, daun,

kotiledon, biji, akar, batang, buah, endosperm, embrio, kalus, dan pollen); dan organ

hewan (darah putih, hepar, sisik, ekor). Pada individu yang sama, DNA yang

diperoleh dari berbagai sumber akan memiliki jenis, jumlah dan ukuran yang sama.

Pada isolasi DNA dari tanaman, kesulitan utama adalah proses destruksi

dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan karena tanaman memiliki

dinding sel yang kuat dan pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari

ekstrak asam nukleat. Selain itu DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali

2

terkontaminasi oleh polisakarida dan metabolit sekunder lainnya seperti tanin,

pigmen, alkaloid dan flavonoid. Sehingga pada tanaman dengan kandungan

polisakarida dan metabolit sekunder tinggi perlu dilakukan modifikasi pada saat

ekstraksi DNA.

Keberadaan polisakarida dan senyawa metabolit sekunder dalam sel

tanaman sering menyulitkan dalam isolasi asam nukleat. Struktur polisakarida yang

mirip dengan asam nukleat menyebabkan polisakarida dapat mengendap bersama

asam nukleat. Adanya polisakarida dalam tanaman ditandai dengan kekentalan

pada hasil isolasi DNA. Penambahan senyawa pereduksi seperti β-mercaptoethanol

dan dithiothreitol (DTT) dapat mencegah oksidasi senyawa fenolik sehingga

menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap

asam nukleat. Metabolit sekunder dan polisakarida juga dapat menghambat aktivitas

enzim, misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi dan dapat mengganggu

proses amplifikasi DNA dengan PCR akibat penghambatan aktivitas taq polymerase.

Oleh karena itu diperlukan suatu teknik isolasi DNA genom tanaman yang tepat

sehingga diperoleh kualitas DNA yang baik bagi proses amplifikasi PCR.

A. TAHAPAN ISOLASI DNA

Ada 5 (lima) tahap untuk melakukan isolasi DNA, yaitu:

1. Isolasi jaringan

Tahap pertama yang dilakukan yaitu mengisolasi jaringan yang ingin digunakan.

2. Pelisisan dinding dan membran sel

Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel dengan cara

penggerusan (homogenasi), sentrifugasi dengan kecepatan lebih dari 10.000

rpm atau dengan menggunakan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti sel

harus dilisiskan, karena substansi gen yang diinginkan ada didalamnya.

Penambahan larutan pelisis sel ini bertujuan untuk melisiskan sel yang tidak

mengandung DNA agar sel yang mengandung inti sel dapat diisolasi atau

dipisahkan dari komponen-komponen sel lainnya yang tidak berfungsi.

3. Pengekstraksian dalam larutan

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian dilakukan

ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar didapat ekstrak.

4. Purifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil ekstrak dari zat-zat lainnya. Pada

larutan tersebut kemudian diberikan RNAse dan diinkubasi selama 10 menit

pada suhu 65°C. Hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang

sangat dipengaruhi oleh temperatur. Penambahan RNAse berguna untuk

menyingkirkan kontaminasi RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh.

3

5. Presipitasi

Tahap terakhir, yaitu presipitasi bertujuan untuk mengendapkan protein histon,

sehingga untai-untai DNA tidak lagi menggulung (coiling) dan berikatan dengan

protein histon, yang menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi

dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi protein dan kemudian

divortex yang bertujuan untuk menghomogenkan larutan. Larutan presipitasi

protein terdiri atas amonium asetat yang jika berikatan dengan protein

mengakibatkan terbentuknya senyawa baru dengan kelarutan lebih rendah,

sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian

disentrifugasi kembali selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Prinsip

utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis

molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang

lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan

terletak di atas.

B. KOMPONEN EKSTRAKSI DNA DAN PENGARUHNYA

Pada umumnya isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan buffer ekstraksi

Cetyltrimetil Ammonium Bromide (CTAB) atau Sodium Dodecyl Sulfat (SDS). Berikut

ini komponen dari buffer ekstraksi yang sering digunakan untuk isolasi DNA:

Tabel 1. Komponen Ekstraksi DNA dan Pengaruhnya

KOMPONEN SIFAT PENGARUH

Bovin Serum Albumin (BSA)

AAbbssoorrbbeenn

ppoollyyffeennooll DDeennaattuurraassii eennzziimm ddeeggrraaddaattiiff

CCeettyyllttrriimmeettiill

AAmmoonnnniiuumm BBrroommiiddee

((CCTTAABB))

DDeetteerrggeenn kkaattiioonniikk MMeerruussaakk mmeemmbbrraann sseell,,

mmeennddeennaattuurraassii pprrootteeiinn,, mmeemmbbeennttuukk

kkoommpplleekkss ddeennggaann DDNNAA,,

mmeenngghhaammbbaatt aakkttiivviittaass nnuukklleeaassee

CChhlloorrooffoorrmm--IIssooaammyyll

AAllkkoohhooll ((CCIIAA)) EEkkssttrraakkssii pprrootteeiinn

CCyyaanniiddee

MMeelliinndduunnggii ddaarrii eennzziimm ookkssiiddaassee

llooggaamm bbeerraatt

DDiieettyyllddiittiiooccaarrbbaammiicc

aacciidd ((DDIIEECCAA)) IInnhhiibbiittoorr

ffeennoollookkssiiddaassee MMeennggkkeellaatt CCuu

22++

DDiieettyyllppyyrrooccaarrbboonnaattee,,

BBeennttoonniittee,, SSppeerrmmiinnee,,

SSppeerrmmiiddiinnee

PPoolliiaammiinn MMeelliinndduunnggii ddaarrii RRNNAAssee mmeenncceeggaahh

ookkssiiddaassii mmeettaabboolliitt sseekkuunnddeerr ddeennggaann

ccaarraa mmeennggiikkaatt sseennyyaawwaa ffeennoolliikk..

EEtthhyylleennee DDiiaammiinnee

TTeettrraaaacceettaattee ((EEDDTTAA)) MMeennggkkeellaatt kkaattiioonn ((MMgg)),, mmeenngghhaammbbaatt

eennzziimm yygg mmeennggaanndduunngg llooggaamm

((nnuukklleeaassee,, DDNNAAssee))

GGaarraamm ((NNHH44++

,, NNaa++,,

NNaaOOAAcc,, NNaaCCll,,

NNHHOOAAcc))

PPrreessiippiittaassii aallkkoohhooll

4

KOMPONEN SIFAT PENGARUH

HHiiddrrookkssiikkuuiinnoolliinn,,

GGlluukkoossaa,, CCyysstteeiinn,, ββ--

mmeerrkkaappttooeetthhaannooll,,

GGlluuttaattiioonn,, NNaa22SS

22OO

55,,

DDiitthhiiootthhrreeiittooll,, AAssaamm

aasskkoorrbbaatt

AAggeenn ppeerreedduukkssii MMeenngghhaammbbaatt pprroosseess ookkssiiddaassii,,

mmeelliinndduunnggii DDNNAA ddaarrii qquuiinnoonnee,,

ddiissuullffiitt,, ppeerrooxxiiddaassee,,

ppoollyypphheennoollookkssiiddaassee,, mmeenncceeggaahh

ppeennccookkllaattaann oolleehh ppoolliiffeennoolliikk

Isoamil alkohol Membantu pemisahan fase, menurunkan jumlah material kontaminan yang terikut pada fase cair dan interfase serta membantu menurunkan busa

IIssoopprrooppaannooll PPrreessiippiittaassii kkoommpplleekkss CCTTAABB--DDNNAA,, sering digunakan untuk presipitasi pertama, tetapi tidak untuk tahap akhir karena cenderung mengendapkan garam dibanding ethanol

KKlloorrooffoorrmm MMeenngghhiillaannggkkaann lliippiidd ddaann ppaaddaa ttaahhaapp

aakkhhiirr eekkssttrraakkssii mmeemmbbaannttuu

mmeenngghhiillaannggkkaann ssiissaa ffeennooll

NNaa//KK GGaarraamm MMeennssttaabbiillkkaann iinnttii

NNHH MMeelliinndduunnggii ddaarrii HH

++

ppHH PPeenngghhaammbbaatt eennzziimm ddeeggrraaddaattiivvee

PPhheennooll PPeennddeennaattuurraassii pprrootteeiinn

PPhheennooll dan kloroform (1:1)

Deproteinasi lebih efektif jika digunakan 2 macam pelarut organik

Polyvinilpirolidon (PVP),

AAbbssoorrbbeenn

ppoollyyffeennooll MMeenngguurraannggii eeffeekk ppoolliiffeennooll,, qquuiinnoonn,,

ttaanniinn

PPrrootteeiinnaassee KK EEnnzziimm MMeennddiiggeesstt pprrootteeiinn

SSooddiiuumm DDooddeeccyyll SSuullffaatt

((SSDDSS)) DDeetteerrggeenntt aanniioonniikk MMeerruussaakk mmeemmbbrraann sseell,,

mmeennddeennaattuurraassii pprrootteeiinn,, mmeenngghhaammbbaatt

aakkttiivviittaass nnuukklleeaassee

TTrriiss BBuuffffeerr MMeennjjaaggaa ppHH

C. PROSEDUR ISOLASI DNA

Sampel tanaman yang akan digunakan untuk proses isolasi DNA berasal dari

daun tanaman teh yang terletak pada bagian kedua (Gambar 1). Sampel daun

dipetik lalu dimasukkan ke dalam plastik, diberi label dan siap untuk digunakan.

Sampel yang digunakan sebaiknya dalam bentuk segar. Namun, apabila kondisi

tidak memungkinkan, maka dapat digunakan sampel tanaman yang telah dibekukan

atau dikeringkan. Adapun tahapan isolasi DNA daun tanaman teh dengan

menggunakan Dneasy Plant Mini Kit produksi Qiagen adalah sebagai berikut:

1. Helai daun muda tanaman teh dibersihkan dari tulang daun kemudian dipotong-

potong dengan ukuran 1x1 cm dan ditimbang sebanyak 0,2 gram (Gambar 2).

5

Gambar 1. Bagian Tanaman Teh yang Digunakan Sebagai Sampel Isolasi DNA

2. Potongan daun dimasukkan dalam mortar dan ditambahkan nitrogen cair hingga

seluruh daun terendam. Selanjutnya daun teh ditumbuk secepatnya hingga

halus. Penumbukan dilakukan bersamaan dengan adanya nitrogen cair dalam

mortar (Gambar 3). Apabila selama berlangsungnya proses penumbukan

nitrogen cair habis dan daun teh masih belum halus, maka perlu ditambahkan

nitrogen cair agar daun teh dapat tertumbuk halus (Gambar 4).

Gambar 2. Persiapan Sampel Daun Teh

Gambar 3. Penumbukan Sampel Daun Teh

Pada Mortar dengan Penam-bahan Nitrogen Cair

3. Hasil tumbukan diambil setengah bagian dan dimasukkan ke dalam ependorf

cup 1,5 ml yang sudah berisi 400 μl buffer AP1 dengan menggunakan spatula

(Gambar 5). Buffer AP1 pada ependorf cup 1,5 ml sudah disiapkan sebelum

penumbukan, sehingga pada saat daun telah halus secepat mungkin

dimasukkan dalam buffer untuk mencegah oksidasi akibat menguapnya nitrogen

cair. Kemudian dikocok menggunakan tangan (tapping) hingga semua partikel

daun tercampur merata dengan Buffer AP1.

6

4. Selanjutnya ditambahkan RNase sebanyak 4 μl (100 mg/mL) untuk

menghilangkan kontaminan RNA agar dihasilkan DNA bebas RNA (Gambar 6),

kemudian divortex secepatnya (Gambar 7).

5. Larutan diinkubasikan pada suhu 65oC selama 10 menit, posisi ependorf cup

dibolak balik atau diinvert.

6. Selanjutnya ditambahkan 130 μl buffer AP2 dan dihomogenkan dengan cara

insersi atau dibolak-balik, setelah itu secepatnya homogenan diinkubasikan pada

pecahan es batu selama 5 menit.

7. Homogenan disentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm hingga

diperoleh supernatant (letak ependorf cup harus seimbang).

Gambar 4. Sampel Daun Teh yang Telah

Ditumbuk dan Siap Diguna-kan Untuk Isolasi DNA

Gambar 5. Hasil Tumbukan Daun Teh

Dimasukkan Ke Dalam Ependorf Cup 1,5 ml

Gambar 6. Penambahan Rnase

Gambar 7. Larutan Divortex

8. Supernatan (bagian berwarna bening) diambil dengan menggunakan mikropipet

secara hati-hati dan dimasukkan dalam QIA shreadder (warna ungu).

9. Supernatan - QIA Shredder disentrifuse kembali pada 13.000 rpm selama 2

menit, untuk menyaring pengotor DNA pada supernatant dengan filter QIA

Shredder. Kemudian filter QIA Shredder warna ungu dibuang.

10. Selanjutnya ditambahkan buffer AP3 sebanyak 1,5 kali volume filtrat yang

dihasilkan dari saringan supernatant. Misal volume filtrat yang dihasilkan dari

saringan supernatant 400 μl (volume awal) x 1,5 = 600 μl. Jadi total volume filtrat

7

+ buffer AP3 = 1.000 μl. Pencampuran dilakukan dengan cara pipetting (Gambar

8).

11. Kemudian diambil 600 μl dari campuran (1.000 μl) dan dimasukkan ke dalam

tube Dneasy (warna putih) selanjutnya disentrifuse selama 1 menit dengan

kecepatan 8.000 rpm. Tube DNeasy tidak akan cukup untuk menampung semua,

maka dilakukan secara bertahap misalnya terlebih dahulu diambil sebanyak 600

μl, kemudian ditambahkan sisanya. Selanjutnya larutan disentrifuse selama 1

menit dengan kecepatan 8.000 rpm. Perlakuan ini berfungsi agar DNA tersaring

dalam filter. Filtrat dibuang karena filtrat tidak lagi mengandung DNA.

Selanjutnya dimasukkan lagi sisanya dari volume total, kemudian disentrifusi

pada 8.000 rpm selama 1 menit. Filtrat juga dibuang.

12. Pada tube Dneasy ditambahkan 500 μl buffer AW dan disentrifusi pada 13.000

rpm selama 2 menit. Filtrat dibuang kembali dan disentrifuge lagi supaya tuntas.

Buffer AW berfungsi mencuci sisa-sisa campuran cairan yang berada pada filter

agar DNA benar-benar bersih.

13. Cup bagian bawah (yang berisi buffer AW dan pengotor dibuang dan diganti

dengan cup baru (ependorf cup 1,5 ml) yang berfungsi sebagai penampung DNA

yang akan diluruhkan dari filter.

14. Pada bagian tengah filter Dneasy (warna putih) ditambahkan 100 μl buffer AE

(pH: 7,6-8,5) kemudian dibiarkan selama 5 menit.

Gambar 8. Homogenasi Dengan Cara

Pipetting

Gambar 9. Hasil Akhir Isolasi DNA

15. Selanjutnya larutan pada DNeasy disentrifuse pada 8.000 rpm selama 1 menit.

FILTRAT YANG DIHASILKAN JANGAN DIBUANG. Buffer AE berfungsi

meluruhkan DNA dari filter dan melindung DNA dari kerusakan atau degradasi.

16. Kemudian ditambahkan lagi 50 μl buffer AE (pH: 7,6-8,5) pada bagian tengah

filter Dneasy dan dibiarkan selama 5 menit. Selanjutnya larutan pada DNeasy

disentrifuse kembali pada 8.000 rpm selama 1 menit.

8

17. Filtrat yang dihasilkan merupakan hasil dari isolasi DNA tanaman teh. Pemberian

buffer AE secara bertahap bertujuan untuk menjamin semua DNA yang terjerap

dalam filter dapat luruh ke dalam ependorf cup 1,5 ml.

18. DNA dapat disimpan pada refrigerator dengan suhu –20oC untuk jangka panjang

atau siap digunakan sebagai bahan amplifikasi dalam reaksi PCR (Gambar 9).

DAFTAR PUSTAKA

Arumingtyas, EL. 2011. Isolasi DNA dan RAPD. Disampaikan pada Pelatihan

Analisis DNA Fingerprinting Tanaman dengan Metode RAPD Tanggal 4-6 Juli 2011. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya. Malang. p.1-12.

Fauziah, L. 2010. Isolasi DNA. Available on http://miss-purplepharmacy.blogspot. com/2010/01/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012.

Mustahib. 2012. Isolasi DNA metode “Kitchen Preparation”. Available on http:// biologi.blogsome.com/2012/02/11/isolasi-dna-metode-kitchen-preparation/. Diakses tanggal 22 Februari 2012.

Qiagen. 2010. RNeasy® Mini Handbook. www.qiagen.com. pp.79. Rizqy. 2011. Isolasi DNA. Available on http://duniasains-rizqy.blogspot.com/2011/

11/isolasi-dna.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012. Wane. 2011. Pengertian DNA dan Isolasi DNA kromosom, Isolasi DNA plasmid,

Isolasi RNA Available on http://wanenoor.blogspot.com/2011/06/ pengertian-dna-dan-isolasi-dna-kromosom.html. Diakses tanggal 15 Februari 2012.