Adly

J 500 110 013

ISOLASI DNA

TUJUAN

Mahasiswa memahami prinsip isolasi DNA genom.

DASAR TEORI

Sumber untuk mendapatkan atau mengisolasi DNA terdapat di seluruh bagian tubuh organisme. Namun ada teknik khusus untuk mendapatkan DNA di beberapa bagian pada tubuh karena tingkat kesulitan purifikasi yang berbeda-beda.

Prinsip-prinsip pokok dalam purifikasi DNA:

1. Penghancuran bagian tubuh atau organ

Untuk bahan seperti jaringan otot, organ, bulu/rambut, dan sebagainya menggunakan mortar atau bahan pengeras. Sedangkan untuk darah dengan cara sentrifugasi. Pada mamalia, DNA berada di sel darah putih dan pada reptil maupun aves, DNA berada di sel darah putih dan sel darah merah.

2. Penghancuran dinding sel dan lapisan pembungkus DNA

Penghancuran dapat dilakukan secara kimiawi maupun enzimatik atau kombinasi keduanya, tergantung sumber DNA. Bahan kimia yang biasa digunakan seperti deterjen, sukrose, triton X-100, CTAB, dan SDS. Untuk sel bakteri menggunakan deterjen dan enzim lisozim untuk memecah dinding sel.

3. Sentrifugasi untuk memisahkan DNA dengan debris sel

Untuk DNA mitokondria, sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan rendah (6.500 rpm), sedangkan untuk DNA total, sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan tinggi (13.000 rpm).

4. Ekstraksi dengan tujuan memisahkan DNA dari materi organik lain

Pemurnian dapat dilakukan dengan menggunakan fenol-kloroform-isoamil alkohol, amonium asetat, atau pemanasan.

5. Koagulasi dan pengendapan

Presipitasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan isopropanol maupun etanol absolut, keduanya bersifat sangat polar.

6. Pencucian

Pencucian menggunakan etanol 70% kemudian diendapkan dengan cara sentrifugasi. Setelah itu dilakukan dilakukan facum untuk membebaskan dari sisa etanol.

ALAT DAN BAHAN

-Mikropipet & tip

-Almari pendingin

-Setrifuge

-Vortex

-Darah

-Nuclei lysis solution

-Protein precipitation solution

-DNA rehydration solution

-Cell lysis solution

- Isopropanol

-Etanol 70%

CARA KERJA

1. 300 µl sampel darah + 900 µl cell lysis solution. Campurkan lalu inkubasi 10 menit.

2. Sentrifuge 20 detik pada kecepatan maksimum.

3.Buang supernatan, pelet divortex.

4. Tambahkan 300 µl nuclei lysis solution, campurkan.

5. Tambahkan 100 µl protein precipitation solution, vortex 20 detik.

6. Sentrifuge 3 menit pada kecepatan maksimum.

7. Pindahkan supernatan ke dalam tabung baru + 300 µl isopropanol, campurkan.

8. Sentrifuge 3 menit.

9. Buang supernatan + etanol 70%.

10. Sentrifuge 3 menit.

11. Buang supernatan, tarik sisa etanol dengan pipet. Keringkan pelet 10-15 menit.

12. Tambahkan 100 µl DNA rehydration solution, diamkan semalam (4⁰C).

13. Simpan hasil isolasi DNA.

TERIMA KASIH

ATAS PERHATIANNYA