I. Judul : Pengambilan Spesimen dan Isolasi DNA Mamalia

dengan Metode Guanidin Isotiosianat

II. Tujuan : Mahasiswa mengetahui jenis spesimen dan dapat

mengisolasi DNA manusia.

III. Latar belakang :

DNA ( asam deoksiribonukleat ) merupakan materi genetik dari sebagian

besar organisme yang mempunyai fungsi sebagai pembawa sifat keturunan.

Setiap kromosom adalah suatu molekul DNA yang sangat panjang. Molekul

kimia penyusun DNA dinamakan nukleotida. Satu nukleotida terdiri dari satu

molekul gula dan satu molekul fosfat yang terikat pada salah satu basa DNA,

yaitu Timin, Adenin, Guanin, dan Sitosin1. Analisa DNA banyak digunakan

untuk menentukan karakteristik sifat genetik pada level molekuler yang

secara langsung mencerminkan sifat genotip yang dimiliki oleh organisme

tertentu. Analisis DNA terdiri dari tiga tahap yaitu ekstraksi / isolasi DNA,

PCR, dan elektroforesis.

Isolasi DNA adalah suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh

DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan2.

Metode – metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA adalah fenol :

kloroform, salting out, guanidin isotiosianat, dan silika gel. Pada praktikum kali

ini menggunakan metode guanidin isotiosianat, metode ini lebih cepat

dibanding metode fenol : kloroform dan salting out. Tiosianat yang bersifat

toksik berfungsi untuk melisiskan dinding sel, dalam metode ini juga

menggunakan kloroform yang berfungsi untuk mendenaturasi protein3.

Manfaat dari isolasi dna ini adalah untuk analisis genetik, skrining diagnosis,

monitoring obat, dan forensik4.

Hal 1 dari 8

IV. Metode

A. Bahan yang digunakan

Darah, spesies Homo sapiens

Red Blood Cell Lysis Buffer ( RBCLB ) pH 7,4

1550 mM NH4Cl 8,2 gram

100 mM KCO3 1 gram

10 mM EDTA 0,37 gram

Aquadest add 100 mL

Es

SE Buffer pH 8

750 mM NaCl 4,38 gram

250 mM EDTA 9,30 gram

Aquadest add 100 mL

Guanidin isotiosianat 4M

Kloroform

NaCl 6M

Etanol absolut

Etanol 70%

TE Buffer

Tris – HCl 10 mM pH 8

EDTA 1 mM

B. Alat yang digunakan

Spuit injeksi dan jarumnya

Falcon tube

Oven

Ependorf

Mikropipet

Blue tip

Yellow tip

Pipet voume

Sentrifuse

Tissue

Propipet

C. Cara Kerja

Hal 2 dari 8

Hal 3 dari 8

Dihomogenkan cairan tersebut secara hati - hati.

Ditambahkan 400 μL NaCl.

Ditambahkan 700 μL Kloroform.

Ditambahkan 100 μL Guanidin isotiosianat 4 M, dicampur menggunakan pipet.

Dipindahkan larutan pada tabung ependorf 1,5 mL.

Ditambahkan 100 μL SE Buffer ke dalam pelet, dikocok hingga larut.

Dibuang supernatan, dibersihkan dinding tube dengan cara membalik tube ke tissue.

Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit.

Apabila buffy coat masih berwarna merah, diulangi langkah ke - 2 dan diinkubasikan lagi pada suhu 4°C selama 30 menit.

Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit.

Ditambahkan 10 mL RBCLB lalu dihomogenkan, kemudian diletakkan pada es selama 20 menit.

Diambil 2 mL darah, dimasukkan dalam Falcon tube.

Hal 4 dari 8

Apabila benang DNA tidak muncul, dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10000 rpm selama 2 menit. DNA akan terbentuk

sebagai pelet.

Benang DNA yang muncul diambil dengan menggunakan mikropipet 1 mL dan dipindahkan ke tabung ependorf steril dan bersih.

Ditambahkan 1 mL etanol absolut, dicampurkan perlahan dengan membolak - balikkan tabung, DNA akan tampak dalam larutan sebagai

benang - benang atau endapan berkabut.

Dipindahkan lapisan atas ke dalam ependorf 1,5 mL menggunakan pipet, dicatat volume supernatannya.

Setelah sentrifugasi, akan tampak 3 lapisan pada larutan yaitu :Lapisan atas : Transparan mengandung DNALapisan tengah : Berwarna seperti susu mengandung proteinLapisan bawah : Transparan

Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit.

V. Hasil dan Pembahasan

Pada praktikum kali ini kita melakukan pecobaan pengambilan spesimen

dan isolasi DNA mamalia mengunakan metode guanidin isotiosianat. Tujuan

dari percobaan kali ini adalah mahasiswa dapat mengetahui jenis spesimen

biologi molekuler dan dapat mengisolasi DNA manusia.

Tahapan isolasi DNA adalah :

1. Isolasi jaringan

Tahap pertama yang dilakukan adalah mengisolasi jaringan yang

diinginkan. Spesimen biologi molekuler ini dapat diekstaksi dari kultur

sel, jaringan hewan atau tumbuhan, rambut, darah, parafin dan

bakteri6.

2. Pelisisan dinding dan membran sel

Tahap selanjutnya yaitu melisiskan dinding dan membran sel

dengan cara penambahan larutan pelisis sel atau buffer ekstraksi. Inti

sel harus dilisiskan karena substansi gen ( DNA ) yang diinginkan ada Hal 5 dari 8

Disimpan larutan sampel pada suhu -20°C.

Ditambahkan TE Buffer sebanyak 150 μL.

Dikeringkan pelet DNA dalam oven pada suhu 55°C selama 5 menit.

Dibuang supernatan, dibersihkan cairan pada dinding tabung dengan kertas tissue, JANGAN MENYENTUH PELET DNA.

Dilakukan sentrifugasi campuran dengan kecepatan 10000 rpm pada suhu 4°C selama 5 menit.

Dibuang supernatan, ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 μL ke dalam pelet. Digojog berlahan.

didalamnya. Penambahan larutan pelisis ini bertujuan untuk melisiskan

sel yang tidak mengandung DNA agar sel yang mengandung DNA

dapat diisolasi atau dipisahkan dari komponen – komponen sel lainnya

yang tidak dibutuhkan. Larutan pelisis yang digunakan adalah Red

Blood Cel Lysis Buffer ( RBCLB ) yang befungsi untuk melisiskan

eritrosit, guanidin isotiosianat yang berfungsi untuk melisiskan

membran sel dan TE buffer5.

3. Pengekstraksian dalam larutan

Selanjutnya supernatan yang terbentuk dibuang dan kemudian

dilakukan ekstraksi di dalam larutan. Hal tersebut bertujuan agar

didapat ekstrak5.

4. Purifikasi

Tahap ini bertujuan untuk membersihkan hasil eksrak dari zat – zat

kimia lainnya. Larutan yang digunakan adalah kloroform yang

berfungsi untuk mendenaturasi protein, protein presipitasi buffer dan

NaCl yang berfungsi untuk membantu pengendapan DNA5.

5. Presipitasi

Tahap terakhir, yaitu presipitasi yang bertujuan untuk

mengendapkan protein histon, sehingga untai – untai DNA tidak lagi

menggulung dan diberikatan dengan protein histon, yang

menyebabkan DNA menjadi terlihat. Tahap presipitasi dilakukan

dengan cara penambahan larutan etanol. Etanol ini juga berfungsi

untuk mencuci DNA. Larutan tersebut kemudian disentrifugasi kembali

selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 rpm. Prinsip utama

sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasrkan berat jenis

molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi

yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih

ringan akan terletak di atas5.

Metode – metode yang digunakan dalam ekstraksi DNA adalah :

1. Fenol : kloroform

Metode ini menggunakan senyawa fenol – kloroform – isoamyl

alkohol. Metode ini sudah ditinggalkan karena sifat fenol yang toksik5.

Hal 6 dari 8

2. Salting out

Metode ini menggunakan garam kopnsentrasi tingi ( NaCl 6 M ).

Penambahan Proteinase K pada metode ini bertujuan untuk

mendenaturasi protein5.

3. Guanidin isotiosianat

Metode ini lebih cepat dari metode fenol : kloroform dan salting out.

Penambahan tiosianat pada metode ini bertujuan untuk melisiskan

dinding sel dan penambahan kloroform bertujuan untuk mendenaturasi

protein5.

4. Silika gel

Metode ini menggunakan silika gel yang berfungsi untuk mengikat

DNA dengan perantaraan garam / buffer tertentu. Metode ini cepat

tetapi recovery DNA kurang5.

Dari hasil praktikum dihasilkan cairan berwarna kekuningan dengan

gumpalan – gumpalan berwarna merah. Hasil ini dapat dikatakan belum

berhasil karena tidak terbentuk benang – benang DNA. Tidak terbentuknya

benang – benang DNA dimungkinkan kesalahan pada waktu pemipetan yang

kurang tepat dan tidak hati – hati saat memindahkan sampel atau larutan –

larutan ke dalam tempatnya. Pada saat pemindahan sampel darah dari

mikropipet ke falcon tube dan penggojogan falcon tube yang telah diberi

RBCLB tidak hati – hati mungkin salah satu penyebab sel darah lisis yang

mengakibatkan kegagalan dalam praktikum kali ini.

VI. Kesimpulan

Spesimen biologi molekuler adalah kultur sel, jaringan hewan atau

tumbuhan, rambut, bakteri, darah dan parafin. Hasil dari praktikum dapat

dikatakan belum berhasil karena benang – benang DNA tidak terbentuk.

Hal 7 dari 8

VII. Daftar Pustaka

1. Brookes, M., 1999, Genetics, The Ivy Press, United kingdom, 12.

2. Campbell, NA., Reece, JB., dan Mitchell, LG., 2002, Biologi, Jilid 1,

Erlangga, Jakarta, 115.

3. Surzycki, S., 2000, Basic Techniques in Molecular Biology, Springer –

Verlag Publisher, New York, 216.

4. Hue, NT., Chan, NDH., Phong, PT., Linh, NTT., and Giang NDT., 2012,

Extraction of Human Genomic DNA from Dried Blood Spots and Hair

Roots, International Journal of Bioscience, Biochemistry and

Bioinformatics, 2 ( 1 ), 21 – 26.

5. Wilson, K., and John, W., 2010, Principles and techniques of Biochemistry

and Molecular Biology, Cambridge University Press, New York, 115.

6. Wang, TY., Wang, L., Zhang, JH., and Dong, WH., 2011, A Simplified

Universal Genomic DNA Extraction Protocol Suitable for PCR, Genetics

and Molecular Research, 10 ( 1 ), 519 – 525.

Hal 8 dari 8