isolation and characterization of azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期:...
Post on 21-Dec-2015
239 views
TRANSCRIPT
![Page 1: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/1.jpg)
Isolation and characterization of Azospirillum spp.
學生:林宗正、林俊宇
報告日期: 2003.12.29
![Page 2: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/2.jpg)
前言• 固氮根瘤菌包括共生、協生及非共生固氮
根瘤菌, 可以將空氣中的氮素固定為氨,轉變成作物可以利用的氮化合物,此作用是直接增加土壤的氮素來源,可用作微生物肥料,並能替代或減少化學氮肥的施用。
• 目前農業使用化學肥料過度,造成土壤中有益微生物欠缺, 無有效固氮之根瘤菌,氮素養分失調,單位面積產量下降
![Page 3: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/3.jpg)
• 微生物肥料是指含有某種活微生物或酵素的固體或液體製劑,施用在種子、幼苗或土壤上, 可加強營養之有效性或增加土壤中營養份,補充土壤中有益微生物數量,使土壤維持在良好生態環境下發揮功能
![Page 4: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/4.jpg)
目的
從植物根部分離出 Azospirillum spp.
,並鑑定其特性
![Page 5: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/5.jpg)
實驗架構 以 Nfb medium 進行培養
以 BMS medium 進行培養
觀察菌落型態
進行生化測試
![Page 6: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/6.jpg)
材料方法
![Page 7: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/7.jpg)
1. 在大度路邊取玉米、水稻、落花生三種 植物根部。
玉米
水稻 花生
![Page 8: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/8.jpg)
2.Nfb 培養基的配製Nfb medium(g/liter): L-malic acid, 5.0 ; K2HPO4, 0.5 MgSO4·7H2O, 0.2 ; NaCl, 0.1 CaCl2, 0.02Trace element solution(NA2MoO4·2
H2O, 0.2g ; MnSO4·H2O, 0.235g ; H3BO3, 0.2
8g ;CuSO4·5H2O, 0.008g ; ZnSO4·7H2O, 0.024g ; distilled water, 1000ml)2.0ml
bromthymol blue(0.5% aqueous solution(dissolve in 0.2N KOH)) 2.0ml
Fe EDTA(1.64% solution) 4.0mlVitamin solution(biotin, 0.01g; pyrid
oxine, 0.02g; distilled water, 1000ml) 1.0ml
KOH 4.0PH adjusted to 6.8 with KOH
1.75g agar/liter
圖四 . 已配製好的 Nfb 培養基
![Page 9: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/9.jpg)
3.BMS 培養基之配製
• 新鮮 potato 去皮 , 200g 煮沸 30min in 1 liter, 取濾液
• L-malic acid, 2.5g• KOH, 2.0g• Raw cane sugar, 2.5g• Vitamin solution (biotin,0.
01g; pyridoxin,0.02g; distilled water,1000ml ),1.0ml
• Bromthymol blue(0.5% alcoholic solution), 2 drops
• Agar 15.0g
圖五 . 已配製好的 BMS 培養基
![Page 10: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/10.jpg)
3. 把根部切成數公厘的小段,放入 Nfb 培養基 表面,在 30℃ 下培養 3 天
玉米
花生水稻
![Page 11: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/11.jpg)
4. 在 Nfb 表面下 1~2mm 處,有一層白色物狀 產生
5. 以微量吸管吸起,進行 10 倍連續稀釋,取10-4 、 10-5 、 10-6 ,塗抹在 BMS 培養基上,在 30℃ 下培養 1 至 2 週,觀察表面是否有粉紅色菌落形成
6. 把有粉紅色菌落分離出來 , 接在 NB medium 上 ,做四區劃線,純菌保存
![Page 12: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/12.jpg)
7. 在 NB medium 上取單一粉紅色菌落 , 接置 SIM medium 上 , 進行移動性測試
8. 在 NB medium 上取單一粉紅色菌落 , 做革蘭氏染色及鏡檢
9. 生化測試
![Page 13: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/13.jpg)
結果 在 Nfb medium 上培養三天後,培養基上有
些變化 ( 綠→藍 ) ,可明顯發現在培養基表面底下 1~2mm 處有一層白色薄膜產生,根據 Bergy’s manual ,可以推測此部分菌株為 Azospirillum spp. 因為此屬菌為微好氧性,生長在試管中靠近表面部分。
如圖九所示
![Page 14: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/14.jpg)
圖九 . 水稻、 玉米、 落花生根部在 Nfb medium 上經過培養三天之後的顏色變化及白色薄膜產生
![Page 15: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/15.jpg)
在 BMS medium 上培養,培養初期的菌落型態。平板上出現為白色及黃色菌落,如下圖所示
玉米
水稻 花生
![Page 16: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/16.jpg)
約至一星期,水稻 BMS medium 上出現粉紅色菌 落,把此菌落再分離,接到 BMS medium 上四區劃線,再培養一星期,如圖十三所示
圖十三 . 水稻上粉紅色菌落在 BMS medium 上培養一星期後 再分離的四區劃線培養基菌落型態
![Page 17: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/17.jpg)
革蘭氏染色結果為陰性菌,在視野下為菌紅色,外型為微彎曲,桿狀
在 SIM medium 上,可以看見輻射狀的擴散,證明此屬菌有移動性,因此我們可以推測此屬菌是有鞭毛的
在 oxidase, urease 兩項生化測試中,測得 oxidase 為正反應, urease 也為正反應
![Page 18: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/18.jpg)
結論 根據 Bergy’s manual 所給我們的訊息,可
以得知此屬菌的特性是生長在微好氧的環境中,由實驗結果我們可以發現,在用 Nfb medium 培養時,此屬菌只會在表層出現一層白色薄膜,因此我們可以得知此屬菌是微好氧的。
![Page 19: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/19.jpg)
由文獻得知,在 BMS medium 上, Azospirillum spp. 會有粉紅色菌落產生,
我們在實驗當中也有看到這種現象,因此把它給純化出來做進一步分析。
根據文獻上得知, Azospirillum spp. 有移動性,代表有鞭毛。因此實驗當中利用 SIM medium 來測此屬菌是否有移動性,結果顯示有,證明了此屬菌是有鞭毛的。
![Page 20: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/20.jpg)
根據文獻可以得知,此菌為革蘭氏陰性菌、桿狀、螺旋菌屬。利用革蘭氏染色以及鏡檢後,我們觀察到此菌確實為陰性菌,桿狀,菌體有些微的彎曲。
經過生化測試之後,得知此屬菌有 oxidase 、 urease 兩種酵素。
Azospirillum spp. 在 malate 、 succinate 的有機酸培養基裡,生長良好,因此這實驗我們選用 Nfb medium 以及 BMS medium 兩種培養基。
![Page 21: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/21.jpg)
綜合以上幾點,以及跟表一當中其他屬菌做比較,可以得知 Azospirillum spp. 有著自己很獨特的特性是其他屬菌所沒有的,因此,我們更可以確定,此實驗所分離出來的這屬菌確實是 Azospirillum spp.
![Page 22: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/22.jpg)
Table1.Differerental characteristics of the genus Azospirillum and other morphologically or physiologically similar gegera( 出自 Bergy’s manual)
![Page 23: Isolation and characterization of Azospirillum spp. 學生:林宗正、林俊宇 報告日期: 2003.12.29](https://reader031.vdocuments.pub/reader031/viewer/2022013105/56649d625503460f94a443a8/html5/thumbnails/23.jpg)
參考文獻• Tarrand, krieg and Dobereiner (1979).Genus Azospirillum . Bergy’s manual,
section2.aerobic/microaerophlic,motile,helical/vibrioid gram-negative bacteria 94-103
• (1995) Dung, N., Kraut, M., Klingmüller, W.: Isolation and characterization of Azospirillum strains from soil and rice plants in North Vietnam NATO ASI Series, Azospirillum VI and related Microorganisms. I. Fendrik et al. (eds) Springer-Verlag Berlin, Heidelberg G 37, 559-566
• Mori E, Fani R, Fulchieri M, Gallori E and Bazzicalupo M (1995). Involvment of Lon Protease in iron uptake in Azospirillum. NATO ASI Series, Vol. G37. Azospirillum VI and Related Microorganisms.Genetics-Physiology-Ecology. IFendrik, M Del Gallo, J Vanderleyden and M de Zamaroczy Eds. Springer::137-141
• Bazzicalupo M, Fani R, Fantappiè O, Gallori E, Mori E and Polsinelli M (1990). Isolation and characterization of Azospirillum brasilense mutants altered in the production of siderophores. In: Nitrogen fixation. Polsinelli M, Materassi R, Vincenzini M eds, Kluver Academic:291-292