JKK, tahun 2012, volume 1 (1), halaman 31-34 ISSN 2303-1077

31

PENGARUH TEMPERATUR TERHADAP AKTIVITAS ENZIM PROTEASE DARI DAUN SANSAKNG (Pycnarrhena cauliflora Diels)

Tri Noviyanti1*, Puji Ardiningsih1, Winda Rahmalia1

1Program Studi Kimia, Fakultas MIPA, Universitas Tanjungpura, Jl. Prof. Dr. H. Hadari Nawawi,

*email: trinoviyanti62@yahoo.com

ABSTRAK

Daun sansakng (P. cauliflora Diels) telah dimanfaatkan sejak lama sebagai penyedap rasa dan pengempuk daging oleh masyarakat pedalaman Kalimantan Barat karena mengandung enzim protease. Salah satu faktor yang mempengaruhi laju reaksi enzim protease adalah temperatur. Dalam penelitian ini dilakukan penentuan temperatur optimum reaksi enzimatis protease dari daun sansakng. Temperatur divariasi dari 30, 40, 50 dan 60oC. Aktivitas unit enzim ditentukan dengan substrat kasein menggunakan spektrofotometer. Hasil penelitian menunjukkan bahwa aktivitas ekstrak kasar mencapai optimum pada temperatur 50oC yaitu sebesar 1,1170 U/mL.

Kata Kunci: sansakng, P. cauliflora Diels, protease, temperatur optimum

PENDAHULUAN Perkembangan ilmu bioteknologi telah menempatkan penggunaan enzim sebagai salah satu alternatif untuk berbagai keperluan, misalnya bidang industri dan pengobatan. Salah satu enzim yang telah banyak dipelajari adalah enzim protease yang berfungsi mengkatalis hidrolisis ikatan peptida pada protein. Enzim protease merupakan enzim penting dan memiliki nilai ekonomi yang tinggi karena aplikasinya sangat luas. Contoh industri pengguna enzim protease antara lain industri deterjen, kulit, tekstil, makanan, pengolahan susu, farmasi, bir dan limbah (Moon and Parulekar, 1993). Protease yang digunakan mencapai 59% dari total enzim yang diperjualbelikan di seluruh dunia (Gaur and Wadhwa, 2008). Sumber enzim protease yang telah diketahui berasal dari hewan, mikroba, dan tanaman. Tanaman merupakan sumber enzim protease terbesar (43,85%) diikuti oleh bakteri (18,09%), jamur (15,08%), hewan (11.15%), alga (7,42%) dan virus (4,41%) (Mahajan dan Shamkant, 2010). Enzim protease dari tanaman memiliki spesifisitas substrat yang luas, aktivitas dan stabilitas yang tinggi pada berbagai variasi temperatur, pH, ion logam, inhibitor serta pelarut organik. Hal ini membuat protease dari tanaman merupakan pilihan yang sangat baik untuk industri makanan, medis, bioteknologi dan farmakologi (Mehrnoush et al., 2011). Sansakng merupakan salah satu tanaman yang diindikasikan mengandung enzim protease. Masyarakat suku Dayak dan Melayu di pedalaman Kalimantan Barat memanfaatkan daun sansakng sebagai pengempuk daging dan penyedap rasa. Kemampuan protease dalam mempercepat reaksi dipengaruhi

beberapa faktor yang menyebabkan enzim dapat bekerja dengan optimal dan efisien. Faktor-faktor utama yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah konsentrasi enzim, substrat, senyawa inhibitor dan aktivator, pH serta temperatur lingkungan (Muchtadi dkk., 1992).

Temperatur mempengaruhi aktivitas enzim. Pada temperatur rendah, reaksi enzimatis berlangsung lambat, kenaikan temperatur akan mempercepat reaksi, hingga suhu optimum tercapai dan reaksi enzimatis mencapai maksimum. Kenaikan temperatur melewati temperatur optimum akan menyebabkan enzim terdenaturasi dan menurunkan kecepatan reaksi enzimatis (Wuryanti, 2004). Oleh karena itu, pada penelitian ini dilakukan studi pengaruh temperatur terhadap aktivitas ekstrak kasar enzim protease daun sansakng.

METODOLOGI PENELITIAN Bahan dan alat

Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun sansakng segar yang di dapat dari Dusun Aping Desa Pasti Jaya Kecamatan Samalantan, Kalimantan Barat. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah akuades, ammonium sulfat ((NH4)2SO4), asam trikhloroasetat (TCA), kasein dan tirosin. Alat-alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, blender, mikropipet, penangas air, sentrifus, spektrofotometer Genesys, dan termometer. Preparasi ekstrak kasar enzim (El-Tanboly, 2001 dan Al-Sayed, 2003)

Sebanyak 200 gram daun sangsank dihomogenisasi dengan 1 L buffer fosfat pH 7 selama 15 menit pada temperatur ruang dan

JKK, tahun 2012, volume 1 (1), halaman 45-48 ISSN 2303-1077

32

disaring. Endapan dibuang, filtrat ditambahkan ammonium sulfat pada tingkat kejenuhan 50% dan distirer pada temperatur 4oC selama 20 menit sampai tercampur rata. Sampel lalu disentrifus pada temperatur 4oC dengan kecepatan 4000 rpm selama 15 menit. Endapan yang terbentuk setelah sentrifugasi, dilarutkan dalam 0,5 mL larutan 0,05 M buffer fosfat pH 7,0 dan digunakan sebagai ekstrak kasar enzim protease daun sansakng.

Pengujian aktivitas protease

Pengukuran aktivitas protease dilakukan menggunakan metode Enggel et al (2004). Sebanyak 0,1 mL larutan enzim ditambahkan dengan 0,1 mL larutan 0,05 M buffer fosfat pH 7, dipreinkubasikan pada temperatur 37C selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 0,1 mL substrat (2% kasein dalam 0,05 M larutan buffer fosfat pH 7), diinkubasikan pada temperatur 37C selama 10 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahan 0,2 mL asam trikhloroasetat (TCA) 0,4 M dan disentrifus. Sebanyak 0,2 mL filtrat hasil sentrifus ditambahkan dengan 1 mL natrium karbonat 0,5 M, dipreinkubasikan selama 10 menit, dan kemudian ditambahkan 1 mL reagen ninhidrin dan didiamkan selama 30 menit. Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 578 nm. Aktivitas proteolitik enzim dihitung dengan rumus:

Aktivitas protease = tirosin x V

p x q x Fp

Keterangan : [tirosin]: konsentrasi tirosin yang terbentuk v : volume total sampel pada tiap tabung q : waktu inkubasi p : jumlah enzim (mL) Fp: faktor pengenceran

Penentuan temperatur optimum enzim protease (El-Sayed, 2001)

Aktivitas enzim protease sansakng diukur pada variasi temperatur inkubasi 30, 40, 50 dan 60oC.

HASIL DAN PEMBAHASAN Preparasi ekstrak kasar enzim

Sansakng memiliki bunga-bunga aksilar yang tumbuh disepanjang tangkai berdaun atau tangkai tak berdaun, permukaan daun licin dan mengkilat.. Tumbuhan sangsakng disajikan pada Gambar 2. Sansakng biasanya hidup diantara pohon-pohon besar. Nama lain sansakng adalah sengkubak. Hasil determinasi daun sansakng di Lembaga Ilmu Pengetahuan

Indonesia Pusat Penelitian BIOLOGI Bogor Bidang Botani diketahui bahwa daun sansakng yang digunakan merupakan spesies: Pycnarrhena cauliflora Diels dari keluarga Menispermaceae (Ardiningsih dan Risa, 2010).

Gambar 2. Tumbuhan sangsakng

Ekstrak kasar enzim protease dari daun sansangk diperoleh melalui pemecahan sel-sel secara mekanis dengan cara memblender daun sansakng yang telah dicampur dengan buffer fosfat pH 7. Penggunaan buffer pH 7 dalam proses ekstraksi enzim bertujuan untuk menjaga pH lingkungan sehingga diharapkan mampu meminimalkan denaturasi dan inaktivasi protein enzim yang terekstrak (Astuti, 2008).

Filtrat yang diperoleh kemudian ditambahkan ammonium sulfat dengan konsentrasi 50%. Pada pemurnian enzim kitinase dari jamur Scleroderma columnare dan Trichoderma harzianum oleh Wijaya (2002) menggunakan ammonium sulfat, aseton dan alkohol sebagai presipitat diperoleh bahwa enzim memiliki aktivitas tertinggi dengan menggunakan ammonium sulfat sebagai presipitat. Sebagaimana yang diketahui bahwa ammonium sulfat merupakan garam yang umum digunakan dalam metode pemurnian dan pemekatan enzim. Hal ini disebabkan ammonium sulfat memiliki beberapa kelebihan antara lain kelarutannya yang tinggi, murah, rendahnya toksisitas terhadap sebagian besar enzim dan mempunyai efek menstabilkan pada beberapa enzim (Mutiah, 2005). Kumanaung dan Vanda (2011) telah menggunakan ammonium sulfat untuk mengekstrak enzim bromelin dari kulit nanas (Ananas comosus L.merr) dengan variasi konsentrasi 10-60%, sedangkan Witono, dkk (2006) menggunakan ammonium sulfat pada variasi konsentrasi 35, 50, 65 dan 80% untuk pemurnian parsial enzim protease getah tanaman biduri (Calotropis gigantae). Selain itu El Sayed (2001) telah menggunakan ammonium sulfat dengan variasi konsentrasi 30-80% untuk

JKK, tahun 2012, volume 1 (1), halaman 45-48 ISSN 2303-1077

33

memurnikan enzim rapanin dari daun lobak putih (Raphanus sativus).

Penambahan ammonium sulfat dilakukan secara perlahan-lahan pada temperatur 4oC sambil di-stirrer karena peningkatan temperatur akibat proses pelarutan yang dibantu magnetic stirrer dapat menyebabkan denaturasi dan perubahan kelarutan. Pemilihan temperatur 4oC dilakukan untuk mencegah kerusakan enzim. Supernatan yang diperoleh kemudian dipisahkan dari endapan enzim dengan cara sentrifugasi pada temperatur 4oC kecepatan 4.000 rpm selama 15 menit. Sentrifugasi merupakan sistem pemisahan berdasarkan ukuran dan berat. Hasil setrifugasi merupakan ekstrak kasar enzim protease. Partikel dengan berat, ukuran dan bentuk yang berbeda akan mengendap dengan kecepatan yang berbeda (Yuningsih, 2006 & Rachmadani, 2007).

Pada penelitian ini pengukuran aktivitas protease dilakukan dengan mengadopsi metode Enggel (2004). Prinsip kerja metode ini adalah pengukuran asam amino tirosin yang terhidrolisis dari substratnya. Enzim akan menghidrolisis substrat kasein dengan bantuan air menjadi asam amino dan peptida. Reaksi dihentikan dengan menambahkan Trichloroaceticacid (TCA). Filtrat dan endapan yang terbentuk dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Penambahan Na2CO3 bertujuan untuk mendapatkan pH sekitar 11,5 yang merupakan pH optimum untuk intensitas dan stabilitas warna. Warna yang terbentuk kemudian diukur serapannya pada panjang gelombang 578 nm.

Pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim protease

Uji pengaruh temperatur terhadap aktivitas enzim dilakukan untuk mengetahui kondisi optimum enzim dalam mendegradasi substrat. Setiap enzim memiliki aktivitas maksimum pada temperatur tertentu, aktivitas enzim akan semakin meningkat dengan bertambahnya temperatur hingga temperatur optimum tercapai. Kenaikan temperatur di atas temperatur optimum akan menyebabkan aktivitas enzim menurun (Baehaki, 2008). Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease ekstrak kasar daun sangsangk dapat dilihat pada Gambar 1 dan Tabel 1.

Gambar 1. Aktivitas relatif enzim protease pada variasi temperature Tabel 1.Pengaruh variasi temperatur terhadap aktivitas enzim

Temperatur (oC)

Aktivitas enzim (U/mL)

30 0,86600,0556

40 0,99860,0059

50* 1,11700,0105 60 0,94390,0028

Nilai adalah rata-rata standar deviasi. * Aktivitas enzim tertinggi

Aktivitas enzim optimum pada temperatur

50oC dan menurun 15,5% pada temperatur 60oC, hal ini dikarenakan sebagian protein telah mengalami kerusakan atau terdenaturasi. Temperatur lingkungan yang meningkat di sekitar enzim akan menyebabkan putusnya ikatan hidrogen, ikatan ion atau interaksi hidrofobik sehingga struktur tersier enzim berubah, yang menyebabkan struktur lipatan enzim membuka pada bagian permukaan sehingga sisi aktif enzim berubah mengakibatkan terjadi penurunan aktivitas enzim (Whitaker, 1994). Aktivitas enzim di bawah temperatur optimum yaitu pada temperatur 30 dan 40oC aktivitas enzim secara berurutan sebesar 0,8660 dan 0,9986 U/mL. Rendahnya aktivitas enzim pada kedua temperatur tersebut dibandingkan temperatur optimum, disebabkan rendahnya energi aktivasi yang tersedia. Energi aktivasi dibutuhkan untuk menciptakan kondisi tingkat kompleks aktif, baik molekul enzim maupun molekul substrat. Peningkatan energi molekul substrat akan meningkatkan laju reaksi enzim. Kenaikan temperatur menyebabkan aktivitas enzim meningkat, karena temperatur yang semakin tinggi akan meningkatkan energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi dan rotasi enzim dan substrat, sehingga menambah intensitas tumbukan antara substrat dan enzim. Tumbukan yang sering terjadi akan mempermudah pembentukan kompleks enzim-

JKK, tahun 2012, volume 1 (1), halaman 45-48 ISSN 2303-1077

34

substrat, sehingga produk yang terbentuk semakin banyak. Pada temperatur optimum, tumbukan antara enzim dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan kompleks enzim-substrat makin mudah dan produk yang terbentuk meningkat. Peningkatan temperatur mengakibatkan enzim mengalami denaturasi dan substrat mengalami perubahan konformasi sehingga sisi aktif substrat tidak dapat lagi atau mengalami hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim dan menyebabkan turunnya aktivitas enzim (Kosim & Surya, 2010).

SIMPULAN

Berdasarkan hasil penelitian ini, maka dapat disimpulkan bahwa ekstrak kasar enzim protease daun sansakng mencapai aktivitas optimum pada temperatur 50oC yakni sebesar 1,1170 U/mL. DAFTAR PUSTAKA Al-Sayed Al-Tanboly, 2003, Production of Plant

Proteinase from Jack Fruit (Artocarpus integrifolis) as a Source of Dairy Enzyme I. Isolation, Partial Purification and Some Properties, J. Bio. Sci., 6(16): 1435-1441.

Ardiningsih, P., dan Risa, N., 2010, Eksplorasi Daun Sangsakng sebagai Enhancer Flavour Alamiah, Laporan Penelitian. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Pontianak.

Astuti, W., 2008, Suhu Optimum Protease dari Jahe Merah (Zingiber officinale Rosc), J. Kimia Mulawarman, Vol. 5 No. 2, ISSN: 1693-5616.

Baehaki, A., dkk., 2008, Purifikasi dan karakterisasi protease dari bakteri patogen Pseudomonas aeruginosa, Jurnal Teknologi dan Industri Pangan, Vol. XIX No. 1: 80-87

Enggel, J.; Meriandini, A. dan Natalia, L., 2004. Karakterisasi Protease Ekstraseluler Clostridiun bifermentans R14-1-b. J. Mikrobiologi Indonesia, 9 (1): 912.

El-Sayed, S.T., 2001, Purification and Characterization of Rhapanin, A Neutral Protease, from Raphanus sativus Leaves, J. Bio. Sci., 4(5): 564-568.

El-Tanboly, E., 2001, The B-galactosidase System of a Novel Plant from Durian Seeds (Durio zibethinus). I, Isolation and Partial Characterization Pak. J. Bio. Sci., 12: 1531-1534.

Gaur, S. and Wadhwa, N., 2008, Alkaline protease from senesced leaves of invasive weed Lantana camara, African Journal of Biotechnology, 7 (24): 4602-4608.

Kosim, M., Surya, R.P., 2010, Pengaruh Suhu pada Protease dari Bacillus subtilis, Fakultas MIPA ITS, Surabaya.

Kumanaung, M., dan Vanda, K., 2011, Aktivasi Enzim Bromelin dari Ekstrak Kulit Nenas (Ananas comosus), Jurnal Ilmiah Sains, Vol. 11, No. 2: 198-201

Mahajan, R. T. dan Shamnkant, B.B., 2010, Biological aspects of proteolytic enzymes: A Review, India J. Pharm., research, 3(9), 2048-2068.

Mehrnous et al., 2011, Optimization of the Conditions for Extraction of Serine Protease from Kesinai Plant (Streblus asper) Leaves Using Response Surface Methodology, J. Mol., 2011, 16: 9245-9260.

Moon, S.H. and S.J., Parulekar, 1993, Some observation on protease producing in continuous suspention cultures of Bacillus firmus. Biotechnology and Bioengineering 41, 43-45.

Muchtadi, D., S.R Palupi dan M. Astawan, 1992, Enzim dalam Industri Pangan, PAU Pangan dan Gizi IPB, Bogor.

Mutiah, D., 2005, Ultrafiltrasi, Presipitasi Bertingkat dan Kromatografi Penukar Ion sebagai Tahapan Pemurnian Enzim Protease Bacillus megaterium MS-961, Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor. (Skripsi).

Rachmadani, D., 2007, Mempelajari Pemurnian Enzim Kitosanase Termostabil dari Isolat Bacillus licheniformis MB-2 asal Tompaso, Manado, Sulawesi Utara, Fakultas Teknologi Pertanian Institut Pertanian Bogor. (Skripsi).

Wijaya, S.K.S. 2002. Isolasi Kitinase dari Scleroderma columnare dan Trichoderma harzianum (Isolation of Chitinase From Scleroderma columnare and Trichoderma harzianum). J. Ilmu Dasar, 3 (1): 30-35.

Witono, Y., dkk., 2006, Pemurnian Parsial Enzim Protease dari Getah Tanaman Biduri (Calotropis gigantae) Menggunakan Ammonium Sulphat, Jurnal Teknologi Pertanian, Vol. 7 No. 1: 20-26.

Whitaker, J.,R., 1994, Principle of Enzymology for The Food Science, Second Edition. New York: Marcel Decker

Wuryanti, 2004, Isolasi dan Penentuan Aktivasi Spesifik Enzim Bromelin dari Buah Nanas (Ananas comosus L.,), Artikel: JKSA, Vol. VII No. 3: 83-87

Yuningsih, S., 2006, Isolasi dan Pencirian Protease dari Bakteri Isolat Natto, Fakultas MIPA Institut Pertanian Bogor, (Skripsi).