1

Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Idegtudományi Program

Kismolekulájú „klasszikus” neurotranszmitterek a

korai idegi elköteleződés során: a glutaminsav és

GABA rendszer vizsgálatai a neuronképzés

folyamataiban, in vitro

doktori (PhD) értekezés

Varju Patrícia

Témavezető: Dr Madarász Emília

Készült a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti

Orvostudományi Kutató Intézetében

Budapest, 2002

2

Kismolekulájú „klasszikus” neurotranszmitterek a korai idegi elköteleződés során:

a glutaminsav és GABA rendszer vizsgálatai a neuronképzés folyamataiban, in

vitro

Készítette:Varju Patrícia

Témavezető: Dr Madarász Emília

Készült a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutató Intézetében

Budapest, 2002

ÖSSZEFOGLALÁS

A felnőtt idegrendszerben a glutaminsav és a GABA az idegsejtek közötti kommunikáció kémiai

mediátorai. Bebizonyosodott, hogy az idegrendszer korai fejlődése során ezek a neurotranszmitterek

befolyásolják a neurális progenitor sejtek osztódását és differenciációját, hatást gyakorolnak a fiatal

neuronok nyúlványosodására, migrációjára és fontos szerepet játszanak a szinaptogenezisben is. A

neuroektoderma sejtekben lezajló differenciálódás in vitro vizsgálatát olyan sejtvonalak megalapítása

tette lehetővé, melyek korlátlan osztódóképességük mellett megőrzik neurális fejlődési potenciáljukat.

Laboratóriumunk munkatársai transzgenikus, p53–deficiens, 9 napos egérembrió elő- és középagy-

hólyagjából izoláltak immortalizált neuroepiteliális progenitor sejtvonalakat, melyek közül az eddig még

nem jellemzett NE-7C2 sejtvonallal kezdtem el dolgozni. Az NE-7C2 sejtvonal korai fejlődési állapotot

reprezentáló neurális progenitor sejtekből áll, amelyek all-trans retinsav (ATRA) hatására jól

meghatározott lépéseken keresztül idegi irányba differenciálódnak.

Munkám célja az volt, hogy az in vitro neurogenezis jellemző stádiumaiban meghatározzam a

glutaminsav hatásait közvetítő ionotróp receptorok megjelenését és lehetséges szerepét az idegi

elköteleződés során, továbbá hogy feltérképezzem a glutaminsav - GABA átalakulásért felelős

enzimcsalád, a glutaminsav dekarboxiláz (GAD) embrionális és felnőtt formáinak expressziós mintázatát,

tanulmányozzam az idegsejt-fenotípus kialakításában esetlegesen betöltött szerepüket. Kísérleteim során

molekuláris biológiai, biokémiai és immuncitokémai módszerekkel meghatároztam az AMPA és NMDA

receptor alegységek expressziós mintázatát és sejtes lokalizációját, valamint vizsgáltam a funkcionális

receptorok megjelenését és szerepét az in vitro neurogenezis alatt. Az embrionális ill. felnőtt GAD

mRNS- és fehérje-formák expressziós mintázatát és sejtes lokalizációját molekuláris valamint

sejtbiológiai módszerekkel jellemeztem az in vitro idegsejt-képzés folyamán. Immuncitokémiai

vizsgálatokkal azonosítottam az in vitro differenciáció során megjelenő GABA-t tartalmazó sejteket és

vizsgáltam a GABA sejten belüli eloszlását .

Eredményeim megmutatták, hogy az NE-7C2 sejtek neurális differenciációja során a glutaminsav

ionotróp receptorokon át képes befolyásolni a progenitorok osztódását és a fiatal neuronok

nyúlványosodást. A GABA szintéziséért felelős GAD enzimek embrionális formái a korai idegi

elköteleződési folyamatokban juthatnak szerephez, míg a felnőtt formák a neuronok érése során

expresszálódnak.

3

Glutamic acid and GABA in the early stages of neurogenesis: studies in the course

of in vitro neural cell fate decision

Done by: Patricia Varju

Supervisor: Emília Madarász PhD

Institute of Experimental Medicine of Hungarian Academy of Sciences

Budapest, 2002

SUMMARY

In the adult nervous system glutamic acid and GABA are mediators of synaptic communication.

During embryonic development these neurotransmitters regulate mitotic division if neural progenitors and

influence migration, neurite elongation and synapse formation. Continuously proliferating cell lines

capable to differentiate into neural cells could serve as in vitro models for studies on neurogenesis by

early embryonic neuroectoderm.

Previous works from our laboratory demonstrated that immortalized neuroepithelial cell lines could

be established from the anterior vesicles of 9-day-old p53-/- mouse embryos. The NE-7C2 cell line was

one of the isolated p53-/- neuroectodermal clones. NE-7C2 cells represent neuroectodermal progenitors in

an early developmental stage. All-trans retinoic acid treatment of NE-7C2 cells elicited the establishment

first the neuronal and than the astroglial features during well-characterized developmental phases.

The aim of my work was to determine the time-schedule of the appearance of ionotropic glutamate

receptor subunit proteins and the fully active forms of these receptors in the course of in vitro neuron

formation and to study the expression pattern of embryonic and adult forms of glutamic acid

decarboxylases (GADs) during the establishment of neuronal phenotype. Molecular biological and

biochemical methods were used to describe the expression pattern of the AMPA and NMDA type

glutamate receptors. The possible roles of these receptors were investigated by Ca2+-imaging techniques

during the well-characterized stages of in vitro neurogenesis. The time-schedule of the expression of

embryonic and adult forms of GADs were also analyzed and some possible functions of the protein

isoforms have been suggested. The distribution of cells containing glutamate receptor subunit proteins or

GABA was analyzed by immunocytochemical methods.

The results demonstrate that the activation of ionotropic glutamate receptors can influence the

neuronal cell fate determination. AMPA-gated channel activation may alter the mitotic activity of

progenitors and the network formation of young neurons, while NMDA receptor functioning gets role in

later phases of neuronal cell differentiation. The increased responsiveness to glutamate indicates that both

AMPA and NMDA receptor mediated activities can influence the process elongation and network

formation by maturing neurons. The embryonic forms of GAD67 enzyme could play a role in early steps

of neuron formation while the full-length forms were detected at the period of neuronal maturation.

4

TARTALOMJEGYZÉK

ÖSSZEFOGLALÁS 2

TARTALOMJEGYZÉK 4

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK 7

BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS 9

I. KISMOLEKULÁJÚ NEUROTRANSZMITTEREK, MINT FEJLŐDÉSREGULÁLÓ

ANYAGOK 11

I./1 A glutaminsav 12

1.1 Az AMPA-vezérelt ioncsatornák 13

1.1.1 Szerkezet 13

1.1.2 Az AMPA receptorok farmakológiai sajátosságai 15

1.2 A kainát receptorok 16

1.2.1 Szerkezet 16

1.2.2 A kainát vezérelt receptorok farmakológiai jellemzése 17

1.3 NMDA receptorok 18

1.3.1 Szerkezet 18

1.3.2 Az NMDA receptorok farmakológiai jellemzése 21

1.4 Az ionotróp glutamát receptorok előfordulása és szerepe az idegrendszer embrionális

fejlődése során 22

I./2 A GABA 24

2.1 A GABA-szintézis szabályozása: GAD formák 26

2.2 Rövidített GAD fehérjék 28

II. AZ IDEGSEJT IRÁNYÚ ELKÖTELEZŐDÉS KORAI LÉPÉSEINEK

TANULMÁNYOZÁSA AZ EGYEDI SEJTEK SZINTJÉN 31

III. AZ ALL-TRANSZ RETINSAV SZEREPE AZ IDEGRENDSZER EMBRIONÁLIS

FEJLŐDÉSE SORÁN 33

IV. CITOSZKELETÁLIS ÁTRENDEZŐDÉSEK A NEURONÁLIS DIFFERENCIÁCIÓ

SORÁN 34

IV./1. A köztes filamentum fehérjék 35

IV./2 A mikrotubuláris rendszer 36

CÉLKITŰZÉSEK 38

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 39

I. AZ ALKALMAZOTT SEJTTENYÉSZTÉSI KÖRÜLMÉNYEK 39

I./1 Sejtek fenntartása, kezelése 39

I./2 Kromoszóma-preparátumok készítése 39

II. SZEMIKVANTITATÍV RT-PCR VIZSGÁLATOK 40

II./1 Ionotróp glutamát receptor alegységek kódoló RNS formáinak kimutatása 40

5

1.1 AMPA receptor alegységek mRNS-einek kimutatása 41

1.2 NMDA receptor alegységek mRNS-einek kimutatása 41

II./2 GAD65 és GAD67 transzkriptumok kimutatása 41

III. WESTERN BLOT ANALÍZIS 42

III./1 Fehérjeminták készítése szubcelluláris frakcionálással 42

III./2 Fehérjetartalom meghatározása 43

III./3 Western blot 43

3.1 NMDA receptor alegység fehérjéinek kimutatása 43

3.2 GAD fehérjeformák kimutatása 44

IV. IMMUNCITOKÉMIAI VIZSGÁLATOK 45

IV./1 Neuron-és gliaspecifikus fehérjék kimutatása 45

IV./2 NMDA receptor NR1 és NR2B alegységeinek kimutatása 46

IV./3 GAD fehérjeformák kimutatása 46

V. A TENYÉSZETEK SEJT ILL. IDEGSEJT-TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA 47

V./1 A tenyészetek sejtszámának meghatározása a tenyészetek életképességének mérésével 47

V./2 Idegsejtek számának meghatározása immuncitokémiával 47

V./3 Idegsejtek mennyiségi meghatározása in situ ELISA módszerrel 48

VI. SEJTEN BELÜLI SZABAD CA2+-SZINT MEGHATÁROZÁSA

MIKROFLUORIMETRIÁVAL 49

VII. AZ EXTRACELLULÁRIS GLUTAMÁT KONCENTRÁCIÓJÁNAK

FLUORIMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA SEJTEK FOLYADÉKKÖRNYEZETÉBŐL 50

2. TÁBLÁZAT 51

3. TÁBLÁZAT 52

EREDMÉNYEK 53

I. AZ NE-7C2 SEJTVONAL JELLEMZÉSE 53

I./1 Az p53 -/- NE-7C2 sejtvonal kromoszóma-készletének változása a sejtvonal

immortalizációja során 53

I./2 AZ NE-7C2 sejtvonal progenitor sajátságainak meghatározása 57

II. IONOTRÓP GLUTAMÁT RECEPTOROK SZABÁLYOZOTT IDŐBELI MEGJELENÉSE

AZ IN VITRO NEUROGENEZIS SORÁN 63

II./1 NMDA-vezérelt glutamát receptorok kimutatása NE-7C2 sejtek indukált

neurogenezise során 63

1.1 NMDA receptor alegységek expressziója NE-7C2 sejtekben 63

1.2 NMDA receptor alegységek fehérjeformáinak kimutatása Western blot és

immuncitokémia segítségével 67

1.3 Funkcionális NMDA-csatornák megjelenése NE-7C2 sejtek indukált

neurogenezise

során 71

6

II./2 AMPA receptorok kimutatása NE-7C2 sejtekben és szerepük a neuronális

differenciáció

korai szakaszában 78

2.1 AMPA receptor alegységek expressziós mintázata NE-7C2 sejtek idegi irányú

differenciációja során 78

2.2 Funkcionális Ampa-csatornák kimutatása NE-7C2 sejtek fejlődési stádiumaiban 78

2.3 Funkcionális AMPA receptorok szerepe folytonosan osztódó ill. neuronális

irányban differenciálódó NE-7C2 sejtekben 83

2.4 Az extracelluláris folyadék glutaminsav tartalmának vizsgálata NE-7C2 sejtek

felülúszó médiumából 85

III. GLUTAMINSAV DEKARBOXILÁZ FORMÁK EXPRESSZIÓJA ÉS A GABA-

SZINTÉZIS KAPCSOLATA NE-7C2 SEJTEK INDUKÁLT NEUROGENEZISE SORÁN

88

III./1 GAD mRNS formák expressziójának vizsgálata 88

III./2 Rövidített és teljes hosszúságú GAD fehérje-formák időbeli megjelenése NE-7C2

sejtek in vitro indukált neurogenezise során 92

III./3 GAD fehérjeformák sejtszintű lokalizációjának vizsgálata forma-specifikus

ellenanyagokkal 94

III./4 NE-7C2 sejtek GABA-tartalma az in vitro indukált neurogenezis különböző

stádiumaiban 98

LEGFONTOSABB EREDMÉNYEK 100

4. TÁBLÁZAT 101

MEGBESZÉLÉS 102

I. Az NE-7C2 sejtek korai neuroektodermális fejlődési állapotot reprezentáló progenitorok 102

II. Ionotróp glutamát receptorok az in vitro indukált neurogenezis alatt 108

II./1 Sejtfelszíni NMDA receptorok a fiatal neuronok nyúlványelongációs szakaszában

jelennek meg 108

II./2 Az NE-7C2 sejtek mind indukálatlan, mind indukált állapotban funkcionális AMPA

receptorokat expresszálnak 112

II./3 A Ca2+-tranziensek jelentősége az idegrendszer embrionális fejlődése során 115

III. Az NE-7C2 sejtek indukálatlan állapotban ill. az indukció korai szakaszában

embrionális

GAD fehérjéket expresszálnak, melyeket az érett neuronokban felvált a felnőtt GAD65

forma 118

LEGFONTOSABB KÖVETKEZTETÉSEK 123

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 124

IRODALOMJEGYZÉK 125

7

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK

AET – aminoethylthioammonium bromide

ATRA – all-trans retinsav

BCIP – 5-bromo-4-kloro-3-indolyl foszfát

BSA – borjú szérum albumin

[Ca2+]IC – intracelluláris Ca2+ -szint

cDNS – komplementer DNS szál

CNS – központi idegrendszer

CRABP – Cellular Retinoic Acid Binding Protein

DAB – DiAmino-Benzidine

DMSO – dimetil-szulfoxid

dNTP – dezoxinukleotid-trifoszfát

E1-21 – embrionális fejlődés napjai

EC – embrionális karcinóma

ELISA – Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay

ER – endoplazmatikus retikulum

ES – embrionális stem sejt

FCS – fötális borjú savó

FITC – Fluoreszcein IzoTioCianát

GAD – glutaminsav dekarboxiláz enzim

GAPDH – glicerin-aldehid-3-foszfát dehidrogenáz

GFAP – gliális fibrilláris savas fehérje

iGluR – ionotróp glutamát receptor

IP3R – inozitol trifoszfát receptor

IZ – intermedier zóna

KL – kortikális lemez

Map – mikrotubulus asszociált fehérje

MEM – Minimal Essential Medium

mGluR – metabotróp glutamát receptor

8

MTT – (3–(4,5 Dimethylthiazol–2–yl)–2,5diphenyltetrazólium–bromide,

NBT – nitro blue tetrazólium

N-CAM – neurális sejtadhéziós molekula

NFH – nehéz neurofilamentum fehérje

NFL – könnyű neurofilamentum fehérje

NFM – közepes neurofilamentum fehérje

N-tubulin – III β-tubulin

ORF – Open Reading Frame vagy nyitott leolvasási keretet

P0- – posztnatális fejlődés napjai

PBS – Phosphate Buffered Saline

PCR – polimeráz lánc reakció

PLL – poli–L–lizinnel

PLP – piridoxál-foszfát

RaIDH – retinal dehidrogenáz

RAR – retinsav receptor

RARE– Retinoic Acid Response Element

RT-PCR – reverz transzkripcióval kapcsolt polimeráz lánc reakció

RXR – retinoid X receptor

RXRE – Retinoid X Response Element

RyR – ryanodin receptor

SDS – Sodium-Dodecyl Sulfate

SVZ – szubventrikuláris zóna

TBS – Tris-pufferelt sóoldat

TM – transzmembrán

VDCC - feszültségfüggő Ca2+-csatorna

VZ – ventrikuláris zóna

9

BEVEZETÉS ÉS IRODALMI ÁTTEKINTÉS A megtermékenyített petesejt által hordozott genetikai anyag kódolja mindazt az

információt, ami a gerinces idegrendszert felépítő billiónyi idegsejt és gliasejt kialakításához lehetőséget ad. Azok, a minden gerinces élőlényben hasonló módon lejátszódó fejlődési folyamatok, genetikus és epigenetikus mechanizmusok, amelyek az idegsejtek nagyfokú fenotipikus variabilitását eredményezik, nagyrészt még ismeretlenek.

Az embriogenezis korai szakaszában a zigótából kialakul egy háromrétegű embrió, ami magába foglalja az elsődleges germinatív rétegeket, az ektodermát, a mezodermát és az endodermát. A neurális ektoderma (velőlemez) kialakulását a mezodermális és ektodermális sorsot indukáló faktorok gátlása eredményezi. Az így kialakuló velőlemezből (1. A ábra) fejlődik ki az idegszövet. A velőlemezt felépítő sejtek szaporodása és morfológiai megváltozása következtében kialakul a velőárok (1. B ábra) és a velőlemez szélein található velősáncok egymáshoz közelednek (1. C ábra), majd összeolvadnak, kialakítva a zárt velőcsövet (1. D és E ábra). Ezzel egyidőben a velőlemez szélein található sejtek leválnak a velőcsőről és létrehozzák a velőlécet (1. E ábra). A velőcső záródása nem egyidőben történik az embrió teljes hosszában, hanem a brachiális régióban megindulva terjed rostrális és caudalis irányokban. Végül mind az elülső, mind a farki neuropórus is bezáródik és a neuroektoderma teljes hossza mentén kialakul egy zárt cső. A velőcső elülső régiójának különböző mértékű növekedésével és tágulásával kialakul az idegrendszer anterior régiójának előagyi, középagyi és utóagyi szakaszokra való tagolódása (Gilbert, 1991).

A neuroepitéliumot kezdetben folytonosan osztódó idegi őssejtek építik fel és osztódásaikkal növelik a kamra falát. Az őssejtek közük sok időről időre - eddig még csak részben ismert szignálok hatására - az osztódást befejezve kilép a sejtciklusból és posztmitótikus neuronná alakul a korai fejlődés során. A posztmitótikus sejtek kapcsolata megszakad a kamrafallal és kivándorolnak a ventrikuláris zónából (VZ).

A neuronok képződése, majd idegsejtté való elköteleződése lejátszódhat akkor is, ha a progenitorokat kiemeljük eredeti környezetükből. A neuronok régió- és rétegspecifikus érése, „finom” elköteleződése azonban az embrionális agyszöveti

10

11

környezet függvénye. A pán-morfogenetikus fejlődés és a régióspecifikus érés lezajlásához olyan hatásokra van szükség, amelyeket összefoglalóan környezeti faktoroknak neveznek. A környezeti faktorok lehetnek nem-diffúzibilis jelmolekulák, amelyek a közvetlen kontaktusokon át megvalósuló sejtes kommunikáció mediátorai (delta/notch és ephrin/Eph receptor útvonalak), vagy diffúzibilis, nagyobb távolságokon át is ható jelmolekulák. A kialakult idegszövet klasszikus kismolekulájú neurotranszmittereiről feltételezik, hogy korai embrionális stádiumokban diffúzibilis jelmolekulák szerepét töltik be (LoTurco et al., 1991; Komuro and Rakic, 1993; Zheng et al., 1994; Behar et al., 1996).

I. Kismolekulájú neurotranszmitterek, mint fejlődésreguláló anyagok

A felnőtt idegrendszerben a neurotranszmitterek az idegsejtek közötti

kommunikáció kémiai mediátorai. Ez a speciális szerep valószínűleg ősibb, parakrin

funkcióból fejlődhetett ki, hiszen az alacsonyabbrendű élőlényekben ezek az anyagok a

sejtek közötti diffúziós szignalizáció feladatát töltik be. Ez az elgondolás olyan kísérleti

eredmények alapján született, melyek bebizonyították, hogy a „klasszikus”

neurotranszmitterek legtöbbje (serotonin, dopamin, norepinefrin, GABA, acetilkolin,

glutaminsav) megtalálható a primitív élőlényekben (csalánozók, laposférgek), nem idegi

szövetekben és olyan korai embrionális állapotokban is, ahol az idegrendszerre jellemző

kommunikációs formák még nem fejlődtek ki (Lauder, 1993). Farmakológiai kísérletek

sora mutatja, hogy a kismolekulájú aminosav-neurotranszmitterek morfogenetikus

aktivitással rendelkeznek és befolyásolják a proliferáció, sejtvándorlás és differenciáció

eseményeit primitív és evolúciósan fejlett élőlényekben (Lauder, 1993, LoTurco et al.,

1995; Behar et al., 1996; Ma et al., 1998; Haydar et al., 2000; Nguyen et al., 2001).

Ezek a filogenetikailag ősi funkciók – úgy tűnik - működnek az idegrendszer fejlődése

során is, ahol ezek a kismolekulájú neurotranszmitterek befolyásolják a neurális

progenitor sejtek osztódását és differenciációját, valamint hatást gyakorolnak a fiatal

neuronok nyúlványosodására és migrációjára.

Az alábbiakban a glutaminsav és GABA korai idegi elköteleződésben eddig

megismert szerepére, valamint a két aminosav hatásait közvetítő szignál transzdukciós

rendszerek ismertetésére térek ki.

12

I./1 A Glutaminsav

A glutaminsav a kifejlett gerinces élőlények idegrendszerében a legfontosabb

serkentő neurotranszmitter szerepét tölti be. Neuroexcitiátoros tulajdonságának

felfedezése (Curtis et al., 1959) óta eltelt 40 évben farmakológiai, elektrofiziológiai és

molekuláris biológiai kísérletek segítségével sikerült leírni a glutamát-közvetítette

szinaptikus jelátviteli folyamatok részleteit.

Mára két fő glutamát receptor típust különböztetünk meg: az ionotróp (iGluR) és

metabotróp (mGluR) receptorokat. A metabotróp receptorok közé olyan sejtmembránon

átívelő 7 transzmembrán (TM) szerkezettel jellemezhető fehérjék tartoznak, melyek a

sejtmembrán intracelluláris oldalán G-fehérjét kötnek. A mGluR receptorokat három

csoportba osztjuk szekvencia-homológia, agonista-szelektivitás és a sejten belül aktivált

szignál-transzdukciós útvonal alapján. Az mGluR receptorok az embrionális fejlődés

során már igen korai fejlődési stádiumokban kimutathatók és fontos szerepet játszanak a

fiatal neuronok Ca2+-homeosztázisának szabályozásában (McCool et al., 1998; Flint et

al., 1999). A felnőtt idegrendszerben főleg prae- ill. extraszinaptikus lokalizáció

jellemző rájuk és a neurotranszmitter-ürülés szabályozásában tulajdonítanak igen fontos

szerepet ezen receptoroknak. Mivel a mGluR-k neurogenezisben játszott szerepével

nem foglalkozom a dolgozatban, ezért további részletes jellemzésükre nem térek ki.

Az ionotróp receptorokat felépítő fehérjék a sejtmembránt áthidaló ioncsatornákat

alakítanak ki, melyeken keresztül glutamát kötődésének hatására ionáram indul meg a

membrán két oldala között. Az ionotróp receptorokon belül megkülönböztetünk

NMDA-vezérelt, AMPA-vezérelt és kainát típusú csatornákat, melyek specifikus

agonistáikról kapták elnevezésüket. Az elmúlt években azonban született néhány olyan

kísérleti eredmény, amelyek alapján valószínű, hogy mind az AMPA (Wang and

Durkin, 1995; Wang et al., 1997; Kawai and Sterling, 1999), mind a kainát típusú

receptorok (Ziegra et al., 1992; Rodriguez-Moreno and Lerma, 1998; Lee et al., 2000)

kapcsolódhatnak G-fehérjével és G-fehérje közvetített szignál-transzdukciós

útvonalakon keresztül is befolyásolhatnak sejtélettani folyamatokat.

13

1.1 Az AMPA-vezérelt ioncsatornák

1.1.1 Szerkezet

Az AMPA receptorok 4-féle alegységből GluR1-4 épülhetnek fel. Minden

alegység glikozilált, kb. 900 aminosav hosszúságú és 65-75% szekvencia-homológiát

mutat (Nakanashi et al., 1990; Sakimura et al., 1992). Az alegységek 3 TM régióból és

egy membránba ívelő hurokból (TM2) épülnek fel (2. A ábra, Bennett and Dingledine,

1995), az N-terminális régió extracelluláris, míg a C-terminális régió intracelluláris

orientációjú (2. B ábra). A funkcionális receptorok tetramer (Rosemund et al., 1998;

Madden, 2002) szerkezetűek és a TM2 domén vesz részt az ioncsatorna pórusának

kialakításában (2. C ábra). Az S1 és S2 extracellulárisan elhelyezkedő hurkok

tartalmazzák az agonista-kötő régiókat (2. B ábra; Keinänen et al., 1997). Az

intracellulárisan elhelyezkedő C-terminális farok szerepe az alegységek membránhoz

való szállítása majd kihorgonyzása (PDZ-doménen keresztül) és a jel továbbítása

citoplazma felé (Bigge, 1999). Az intracelluláris régió foszforilációs helyeket is

tartalmaz, melyek a receptor aktivitásának szabályozásában játszanak szerepet.

Az AMPA-vezérelt receptorok ionszelektivitását a receptorok alegység-

összetétele határozza meg. GluR2 alegység jelenlétében az ioncsatorna alacsony Ca2+-

permeabilitással és lineáris áram-feszültség görbével jellemezhető (Sommer et al., 1990;

Jonas and Burnashev, 1995), míg GluR2 hiányában az ioncsatorna nagymértékben

áteresztővé válik Ca2+-ra és kettősen rektifikáló áram-feszültség összefüggést mutat. A

GluR2 alegység ionszelektivitásáért egyetlen, a TM2 domén 586. pozíciójában

elhelyezkedő aminosav a felelős. Míg a GluR2 alegység ezen pozícióját egy pozitívan

töltött arginin (R) foglalja el (2. C ábra), a többi AMPA receptor alegység ezen

pozíciójában egy töltést nem hordozó glutamin (Q) található (2. C ábra). A Q/R

aminosav-csere a GluR2 alegységben az mRNS adenozinjának editálásával jön létre az

14

15

adenozin-deamináz enzim1 segítségével (Hume et al., 1991; Verdoorn et al., 1991;

Burnashev et al., 1992; Paupard M-C et al., 2000). A GluR2 mRNS editációja nagyon

hatékony és szinte 100%-a az agyi GluR2 alegységeknek editált formában van jelen a

patkányban (Sommer et al., 1991).

Az AMPA receptor alegységeket kódoló génekről “alternatív splicing”2

mechanizmusával kétféle típusú fehérje keletkezhet attól függően, hogy a Flip vagy a

Flop exon kerül be az érett mRNS-ekbe (2. A ábra). A Flip forma lassú

deszenzitizációjú, míg a Flop forma gyors deszenzitizációs kinetikával jellemezhető. A

Flip formák által kialakított receptorokon keresztül hosszan elhúzódó ionáram alakulhat

ki. A Flop formák AMPA receptorba épülése esetén rövid ideig tartó, nagy amplitúdójú

ionáram jön létre, melynek a szinaptikus jelátvitelben lehet jelentősége. A TM3 és TM4

domének között található egyik arginin RNS-editáció mechanizmusával glicinre

cserélődhet (3. A ábra), mely a deszenzitizáció utáni receptor “recovery” idejét

csökkenti le (Lomeli et al., 1994).

1.1.2 Az AMPA receptorok farmakológiai sajátosságai

Az AMPA receptorokat eredetileg mint quiskalát-vezérelt ioncsatornákat írták

le, és csak később sikerült megmutatni, hogy az AMPA a szelektív ligandumuk (a

1 Napjainkig két olyan enzimet azonosítottak emlősökben, amelyeknek adenozin-deamináz

aktivitása van: ADAR1 (dsRNS-specifikus adenozin-deamináz) és az ADAR2 (dsRNS-specifikus editáz

1, más néven RED1). A fehérjecsalád harmadik tagja a RED2, amely struktúrálisan ugyan nagyfokú

hasonlóságot mutat, de nem tudja deaminálni a kettős szálú RNS-t. Az ADAR1 és ADAR2 a legtöbb

szövetféleségben expresszálódik, míg a RED2-t eddig csak idegrendszerben írták le. Az ADAR2

enzimnek in vitro szubsztrátjai az AMPA/kainát típusú receptorokat és az 5HT-2C receptort kódoló

mRNS-sek. Az ADAR2 először az E17 embrionális korban sikerült kimutatni, amely időpontban az

AMPA-típusú receptor GluR2 alegysége 99% editált formában van jelen. Ez az eredmény azt

valószínűsíti, hogy vagy az ADAR1 vagy egy másik, eddig még nem karakterizált enzim a felelős a

GluR2 editációért.

2 Az alternatív hasítás kifejezést az angol „alternative splicing” magyar megfelelőjeként

használom a dolgozat során. A „splicing” vagy hasítás az mRNS érése során történik, amikor az intron

kivágódik és az exonok összekapcsolódnak. Mind az intronok, mind az exonok végein találhatók ún.

„splice site”-ok vagy hasitási szekvenciák, melyek megmutatják a spliceosoma-nak az exon/intron

határokat.

16

quiskalát a metabotróp receptoroknak is agonistája). 3[H]AMPA-kötés leszorítási

vizsgálata a következő agonista erősségi sorrendet adta GluR1, GluR2 és GluR3

alegységekből felépülő rekombináns receptorokon: quiskalát > AMPA = domoát >

glutamát > kainát.3 (Fletcher and Lodge, 1996). Az AMPA, quiskalát és glutamát által

kiváltott ionáramok gyorsan lecsengenek és a receptor deszenzitizálódik, míg a kainát

által aktivált receptor kevésbé érzékeny a deszenzitizációra

Az AMPA receptorok kompetitív antagonistái két vegyületcsoportból kerülnek

ki: a quinoxalinedion-típusú vegyületek (CNQX, NBQX, DNQX) és a

decahydroisoquinoline vegyületek (LY293558, YM90K; Fletcher and Lodge, 1996). Az

AMPA receptorokon egymással átfedő pozícióban található egy pozitív és egy negatív

alloszterikus modulációs hely is. A negatív modulációs helyre kötő 2,3 benzodiazepine

típusú vegyületek (GYKI52466, GYKI53655; Tarnawa et al., 1989) a receptor nem-

kompetitív antagonistái és szelektívek az AMPA receptorokra. A pozitív alloszterikus

modulátorok a pirrolidin típusú vegyületek közül (aniracetam, piracetam) ill. a

benzothiadiazid (ciklotiazid4, diazoxid) csoportból kerülnek ki és a receptor agonista

hatására bekövetkező deszenzitizációját csökkentik (Fletcher and Lodge, 1996). Mivel a

két alloszterikus modulációs hely egymással átfedő pozícióban található a receptoron, a

drogok együttes jelenléte és relatív koncentrációja befolyásolhatja e szerek hatását.

1.2 Kainát receptorok

1.2.1 Szerkezet A kainát receptor alegységeknek két csoportra osztjuk: az alacsony (GluR5-7) és

a magas (KA1, 2) kainát affinitással rendelkező alegységek csoportjára. Számos más

kainát-kötő fehérjét is leírtak alacsonyabbrendű gerincesekben (összefoglalja Ziegra et

al., 1992; Lerma et al., 2001), de ezek a fehérjék nem alakítanak ki funkcionális

3 Az AMPA receptorok további agonistái az ibotén sav (Hansen et al., 1995) és a különböző

willardiine származékok (Wong et al., 1994), valamint az AMPA terc-butil analóg vegyülete, az ATPA is

(Krogsgaard-Larsen et al., 1994).

4 A ciklotiazid a flip formák deszenzitizációját csökkenti szelektíven, míg egy másik vegyület, a

PEPA, a flop variánsok által képzett csatornák deszenzitizációját gátolja.

17

ioncsatornákat. A kainát receptor alegységeket is kb. 900 aminosav építi fel, 3 TM

domént és egy membránba ívelő hurokrégiót (TM2) különíthetünk el a fehérjében,

hasonlóan az AMPA receptor alegységekhez. A funkcionális receptor kialakításában 4

alegység vesz részt. GluR5-7 alegységek homomer és heteromer kombinációban is

kialakíthatnak funkcionális receptort, míg a KA1 és KA2 alegységek csak GluR5-7

alegységgel funkcióképesek. A GluR5 és GluR7 alegységek esetében több izoformát is

leírtak, amelyek „alternatív hasítás”-sal keletkeznek; hasonló variánsok a többi alegység

esetében nem ismertek. A szerkezeti variabilitás másik forrása lehet a GluR5 és GluR6

alegységek esetében (Egebjerg and Heinemann, 1993) az RNS editálás az alegységek

Q/R pozíciójában (TM2 szegmensben) , az editáció mértéke azonban alacsonyabb, mint

a GluR2 alegység esetében. Két további pozíciót azonosítottak még az alegységek TM1

szegmensében, amelyek szintén editálódhatnak: az I/V pozíció, ahol valinra cserélődhet

az izoleucin (Köhler et al., 1993); ill. a Y/C pozíció, ahol tirozin cserélhet le egy

ciszteint. Az RNS editálás az idegrendszer fejlődése során szabályozott folyamat

(Paschen et al., 1997) és az ioncsatorna Ca-permeabilitását szabályozza a kainát

receptorok esetében is.

1.2.2 A kainát-vezérelt receptorok farmakológiai jellemzése

A kainát receptorok általánosan használt agonistái a kainát és a domoát (az

általuk kiváltott válasz gyorsan deszenzitizálódik) annak ellenére, hogy mindkét

agonista képes aktiválni az AMPA receptorokat is (nem deszenzitizálódó válaszokat

létrehozva).5 További receptor agonisták a glutamát γ-szubsztitúciójával előállított

analógok (LY339434; Small et al., 1997; valamint a SYM2081, Zhou et al., 1997) és a

halogén-szubsztituált willardiine és azawillardiine származékok (Swanson et al., 1998).

A nagy affinitású kötőhelyeken (KA1 és KA2 alegységek) a kainát >domoát > glutamát

> AMPA, míg az alacsony affinitású kötőhelyeken a domoát > kainát > glutamát >

AMPA agonista-erősségi sorrend mérhető.

Az kainát receptorok egyetlen szelektív antagonistája az NS102 (Verdoorn et al.,

1994). További antagonistái a receptornak a quinoxalinedion vegyületek (DNQX,

CNQX, NBQX; Lerma et al., 2001) és a decahydroisoquinolinok (LY382884;

5 Az AMPA azonban nem, vagy csak nagyon kis mértékben képes aktiválni a kainát receptorokat.

18

Bleakman et al., 1996), melyek mindegyike mutat aktivitást AMPA receptorokon is. A

kainát receptorok deszenzitizációját csökkentő alloszterikus modulátorok a növényi

lektinek közül kerülnek ki (konkanavalin A; Mayer and Vyklicky, 1989).

Ismert alegység-összetételű, „tiszta” kainát receptorok kainát hatására gyorsan

deszenzitizálódnak, amely megkülönbözteti őket az AMPA receptoroktól (Bleakman

and Lodge, 1998). A receptorok aktivációjuk után egy átmeneti, nem aktiválható

állapotban kerülnek, melynek időtartama a receptor alegység-összetételétől is függ.

1.3 NMDA Receptorok

1.3.1 Szerkezet

Az NMDA receptorokat egyedinek tekinthetjük a glutamát-vezérelt receptorok

között, mivel kettős ligandumkötés (glutamát és glicin; Meguro et al., 1992) és

depolarizáció (a Mg2+-blokk feszültségfüggő felfüggesztése; Mayer, 1998) egyidejűleg

szükséges a csatorna kinyitásához. Az NMDA receptor alegységeket szekvencia-

homológia alapján három csoportba osztjuk: az NR1 alegység; az NR2A-D alegységek;

ill. az NR3A, B alegységek csoportjára (Monyer et al., 1992; Ciabarra et al., 1995;

Chatterton et al., 2002). Az NR1 alegység 8-féle izoformája ismert, melyek 3 exon (N1,

C1 és C2) alternatív jelenlétével keletkeznek (3. ábra; 1. táblázat; Hollmann et al.,

1993).

Variáns N1 C1 C2 C2’

NR1-1a - + + - NR1-1b + + + - Nr1-2a - - + - NR1-2b + - + - NR1-3a - + - + NR1-3b + + - + NR1-4a - - - + NR1-4b + - - +

1. táblázat

Az NR1 mRNS alternatív hasítása során keletkező formák elnevezése a Hollmann által

bevezetett nevezéktan alapján.

19

20

Az NR1 alegység extracelluláris részén elhelyezkedő N1 kazetta jelenléte

csökkenti a receptor glutamát-affinitását, megnöveli az ionáram amplitúdóját és

befolyásolja a receptor Zn2+ és spermin érzékenységét (Zukin and Bennett, 1995;

Rumbaugh et al., 2000). A C1 kazetta olyan szekvenciákat kódol, melyek az

intracellulárisan elhelyezkedő fehérjékkel való kapcsolódást közvetítik. Ilyen fehérjék

pl. a könnyű neurofilamentum fehérje (NFL; Ehlers et al., 1998) vagy a yotiao (Lin et

al., 1998). A C1 exon területén azonosítottak protein kináz C által foszforilálódó

helyeket is (Tingley et al., 1997; Zheng et al., 1999). A C2 exon beépülése a fehérjébe

azt eredményezi, hogy a fehérje csak NR2 alegységek jelenlétében tud a

sejtmembránhoz szállítódni, NR2 alegység hiányában a citoplazmában raktározódik

(McIlhinney et al., 1996; Okabe et al., 1999). Amennyiben a C2 exon nem kerül bele az

NR1 fehérjébe, az exon végén található Stop kodon hiányában a transzláció

továbbmegy, és egy C2’ szakasz kerül a fehérje C-terminális végére (3. ábra). Azok a

variánsok, amelyek C2’ részletet tartalmaznak, kapcsolódni tudnak a PSD95 horgonyzó

fehérjéhez (Kornau et al., 1995).

Az NR2 alegységeknek nincs ismert splice-variánsuk. A receptor alegységek a

már korábban leírt 4 TM domén szerkezettel jellemezhetők, de az NR2 alegységek

intracelluláris C-terminális régiója jóval hosszabb, mint az AMPA és kainát receptor

alegységek esetében.

Az NR3 alegységek TM2 doménje és S1 ill. S2 ligandumkötő régiója eltér az

NR1 és NR2 alegységeknél megismert szerkezettől, részletes jellemzésükre nem térek

ki.

Az NR1 alegység önmagában is képes ioncsatorna kialakítására in vitro, de az

ionáram amplitúdója igen alacsony homomer NR1 csatorna esetében A funkcionális

ioncsatorna in vivo 4 alegységből áll össze, melyben minimum egy NR1 alegység és

bármilyen típusú NR2 alegységek vannak jelen (Monyer et al., 1992). Az NMDA

receptor TM2 doménjében a receptor ionszelektivitását meghatározó aminosav-

pozícióban (azaz a Q/R helyen) minden esetben aszparagin található (Mishina et al.,

1991), melynek következtében az NMDA receptorok Ca2+-t eresztenek át nagy

mennyiségben. Az NMDA receptorok pórusában nyugalmi állapotban Mg2+ ionok

találhatók (Mayer, 1998), melyek a környező membrán-területek depolarizációjával

21

kimozdíthatók. Tehát a receptor aktivációjához a két agonista (glutaminsav és glicin)

kötődése mellett egyidejű depolarizációra is szükség van a csatorna nyitásához.

Az NR1/NR2/NR3 összetételű ioncsatornák Ca2+-permeabilitása csökken a

beépülő NR3 alegység következtében, ami valószínűsíti, hogy ezen alegységek

domináns negatív formákként viselkednek (Das et al., 1998). Az NR1/NR3 alegység-

kombinációjú ioncsatornák Ca2+-impermeábilis, excitatórikus, glicin-vezérelt

receptorok (Chatterton et al., 2002).

1.3.2 Az NMDA receptorok farmakológiai jellemzése

Az NMDA receptorokon két agonista-kötő régiót azonosítottak: az egyik a

glutamát kötéséért felelős (az NR2 alegységek), míg a másik a koagonista glicint (az

NR1 alegység) köti (Madden, 2002). A receptor glutamát-helyre kötődő legfontosabb

szelektív agonistái az NMDA, quinolinsav és az RS-(tetrazol-5-yl)-glicin, míg a glicin-

helyen a glicin és a D-szerin tud kötődni (Mori and Mishina, 1995; Mothet et al., 2000).

A receptor szelektíven ható kompetitív antagonistái közül a glutamát helyre kötődő DL-

AP5 (DL-2-amino-5-foszfonovaleriánsav), DL-AP7 és LY 235959, valamint a glicin-

helyre kötődő 5,7-diklorokynurén sav, az L-655,708 benzodiazepin-származék és a

quinoxalindion típusú vegyületek közé tartozó MNQX érdemel figyelmet nagyfokú

szelektivitása miatt (Mori and Mishina, 1995). A receptor nem-kompetitív antagonistái

a nyitott csatornában kötődnek és gátolják a csatornán át történő ionmozgást. Ide

soroljuk a dizocilpinek közé tartozó MK-801-t, a fenciklidin-származékokat (TCP,

PCP), a ketamint és a memantint (Mori and Mishina, 1995).

Az NMDA-vezérelt ioncsatornák működését számos vegyület és ion is

befolyásolja, melyeket a recetor alloszterikus modulátorainak neveznek. Ide tartoznak a

szulfhidril-csoportot tartalmazó (redox) reagensek, amelyek erős oxidáló ill. redukáló

hatással bírnak (Lazarewicz et al., 1989), az etanol (Lovinger et al., 1989), a spermin és

spermidin (Araneda et al., 1999; Zhang et al., 1994), a nitrogén-monoxid (Manzoni et

al., 1992) és a proton (Traynelis and Cull-Candy, 1991).

22

1.4 Az ionotróp glutamát receptorok előfordulása és szerepe az

idegrendszer embrionális fejlődése során

Az idegrendszer embrionális fejlődése során az ionotróp glutamát receptor

alegységek expressziós mintázata változik. A patkány neurogenezise során az 5 kainát

receptor alegység mRNS-e már igen korán kimutatható (embrionális fejlődés 12. napján

[E12]; Gallo et al., 1995; Maric et al., 2000), de a [3H]kainát kötés és a fehérje

nagymennyiségű kifejeződése a funkcionális receptorok kialakulását követően, kb. két

nappal később (E14) indul (Bahn et al., 1994). Ebben az embrionális időszakban a

kainát receptor alegységeket a még nagyrészt osztódó progenitorok és frissen

differenciálódott migráló neuronok expresszálják (Gallo et al., 1995; Scherer and Gallo,

1998; Maric et al., 2000).

Az AMPA receptor alegységek az embrionális fejlődés során szintén igen korán

megjelennek és expressziójuk időben és térben is meghatározott mintázatot követ.

Legkorábban a GluR3 és GluR4 alegység mRNS-ket mutatták ki patkányban és egérben

az embrionális fejlődés 10. napján a neurális csövet felépítő, nestin-tartalmú idegi

progenitor sejtekben (Schererer and Gallo, 1998). A GluR1 és GluR2 alegység mRNS-

ek E12.5 embrionális korban voltak először kimutathatók teljes egér agyból készült

homogenátumokból (Simonian and Herbison, 2001). E14 kortól mind a négy AMPA

receptor alegység mRNS-e expresszálódott (Monyer et al., 1991). Amíg azonban a

GluR2 alegység a szürkeállomány teljes területén előfordult, addig a másik 3 alegység

expressziója kisebb területekre korlátozódott. Az embrionális fejlődés során az

expresszálódó GluR alegységeknek csaknem 100%-a Flip forma volt (Monyer et al.,

1991). A Flip forma expressziója a posztnatális fejlődés (P) során végig megmaradt, a

Flop forma expressziója azonban csak P9-P12 időszakban indult meg (Monyer et al.,

1991). A Flop forma viszonylag késői beépülése az AMPA receptorokba egybeesik a

nagymértékű szinaptogenezis idejével az előagyi területen (Aghajanian and Bloom,

1967). Az idegrendszer embrionális fejlődése során az NMDA receptor alegységek

közül a legkorábban az NR1, ill. az NR2 alegységek közül az NR2B és az NR2D

alegységek expresszálódnak patkányban és egérben (E13; Monyer et al., 1992;

Watanabe et al., 1992, 1993). Az NR3-s alegységek embrionális expressziója még nem

tisztázott. Azonban amíg az NR1 és NR2B alegységek szinte minden agyi régióban

előfordulnak, az NR2D alegység mRNS-e a köztiagy és agytörzs területeire

23

korlátozódik. Az NR2A és NR2C alegységek szintje a posztnatális időszakban válik

jelentőssé, mellyel egyidőben az NR2D alegység expressziója nagymértékben

visszaszorul (Monyer et al., 1992). A kifejlett idegrendszerben az NR2 alegység mRNS-

ek régió-specifikus eloszlást mutatnak, míg az NR1 alegység a teljes idegrendszer

területén expresszálódik (Monyer et al., 1992; Watanabe et al., 1992, 1993). Az NR2C

alegység főleg a kisagyban, az NR2D a talamusz és agytörzs területein, az NR2A az

agykéreg és a hippocampusz míg az NR2B az előagyi területen fordul elő.

Funkcionális glutamát receptorok már igen korán, a szinaptikus ingerület-átvitel

kifejlődése előtt megjelennek az idegrendszer embrionális fejlődése során. AMPA

receptorokat mutattak ki E13 korú patkány embrió előagyából disszociáltatott, BrdU-t

inkorporáló neurális progenitor sejtekben (Maric et al., 2000), ill. a VZ területét

elhagyó, már posztmitótikus neuronokban. Ez alapján feltételezhető, hogy az elsőként

kialakuló, Ca2+-permeábilis AMPA receptorok szerephez juthatnak a progenitorok

osztódásának szabályozásában és a posztmitótikus fiatal neuronok migrációjában (Métin

et al., 2000; Simonian and Herbison, 2001). Az embrionális fejlődés késői szakaszában

az AMPA receptorok Ca2+-permeábilitása lecsökken és előfordulásuk főleg a

szinaptikus területekre korlátozódik. E14 korból származó, disszociáltatott patkány

agytörzsi progenitorsejtek életképességét szintén befolyásolni lehetett AMPA/kainát

receptor agonistákkal és antagonistákkal (Bardoul et al., 1997), ami alapján valószínű,

hogy ezen receptorok fontos szerepet játszanak a neuronok túlélésének szabályozásában

az idegrendszer embrionális fejlődésének kritikus stádiumaiban.

Az első funkcionális NMDA receptorokat az E16 korból származó

szövetszeletekben sikerült kimutatni, a kortikális lemez területére bevándorolt

neuronokon (LoTurco et al., 1991). A funkcionális NMDA receptort expresszáló sejtek

aránya az embrionális fejlődés előrehaladtával folyamatosan emelkedik és a posztnatális

időszakban éri el expressziós maximumát. Az NMDA receptoroknak fontos szerepet

tulajdonítanak a neuronok túlélésének növelésében (Balázs et al., 1988), a nyúlványok

növekedésében (Brewer and Cotman 1989), a neuronok radiális migrációjának

irányításában (Komuro and Rakic, 1993), valamint a nyúlványhálózatok kialakulásában

és a szinaptikus kapcsolatok differenciálódásában (Vallano, 1998).

24

A sejtfelszíni ionotróp ill. metabotróp glutamát receptorok aktiválása a sejten

belül másodlagos hírvivők (Ca2+, ciklikus nukleotidok és foszfolipidek) felszabadulását

váltja ki. Az idegrendszer embrionális fejlődése során az intracelluláris Ca2+ -szint

változások ([Ca2+]IC) sokféle időbeli és térbeli mintázatot mutatnak és fontos szabályozó

szereppel rendelkeznek a progenitorok osztódása, a fiatal neuronok migrációja

(citoszkeletális átrendeződések mediálása), a programozott sejthalál és a trofikus

faktorok kiürítésének folyamataiban. Az [Ca2+]IC változások jellegzetes mintázatainak

kialakítása során a sejtek citoplazmájába kerülő Ca2+ legfontosabb forrásai az

extracelluláris tér és az intracelluláris Ca2+-raktárak (endoplazmatikus retikulum és

mitokondrium). Az intercelluláris közegből a Ca2+ az iGluR-k mellett a feszültségfüggő

Ca2+-csatornákon (VDCC) keresztül juthat a sejt belsejébe, míg az endoplazmatikus

retikulumból a metabotróp (glutamát ill. GABA) receptorok által aktivált IP3R

receptorokon valamint a RyR receptorokon keresztül ürül a citoplazmába a Ca2+.

GABAA receptorok aktivációja Cl- ionok kiáramlását okozza a citoplazmából az

extracelluláris tér irányába, ami depolarizálja a membránt és aktiválhatja a VDCC-kat.

Ezáltal indirekt módon szintén kiválthatja az [Ca2+]IC megemelkedését.

A Ca2+ szignál-transzdukciós szerepének vizsgálatát elősegítették azok a

módszerek, amelyek a Ca2+-érzékeny fluoreszcens festékek (indo-1; quin-2, fura-2), ill.

fehérjék (aequorin) sejtbe juttatásával az [Ca2+]IC dinamikus változásainak érzékeny

mérését tették lehetővé.

I./2 A GABA

A központi idegrendszer (CNS) legfontosabb gátló neurotranszmittere, a GABA

nélkülözhetetlen a legtöbb idegrendszeri funkció szabályozásában. A GABA a központi

idegrendszeren kívül előfordul a petefészekben, a herében, a hasnyálmirigy inzulin-

termelő β-sejtjeiben is (Erdö and Wolff 1990, Tillakaratne et al., 1995; Chessler and

Lernmark, 2000), a pontos szerepe ezekben a szövetekben és sejtekben azonban még

nem teljesen ismert. A GABA-közvetített szignalizáció szabályozásában többfajta

mechanizmust szerepel, melyek közül központi jelentőségű a GABA szintéziséért

felelős glutaminsav dekarboxiláz enzimek (GAD) expressziójának és aktivitásának

modulálása.

25

Az embrionális fejlődés során a GABA már jóval a szinaptogenezis előtt

megjelenik és trofikus faktorként szolgálhat a differenciálódó neuronok számára (Lipton

and Kater, 1989; Meier et al., 1991; Lauder, 1993; Katarova et al., 2000b). Egér és

patkány idegrendszer korai fejlődési szakaszában (E9-E13) a GABA-tartalmú

idegrostok olyan területek mentén nőnek, ahol aktív neurogenezis folyik (Lauder et al.,

1986; Del Rio et al., 2000; Katarova et al., 2000a). A GABAerg útvonalak kifejlődését

azonban megelőzi a GABAA receptor alegységek megjelenése (Laurie et al., 1992; Ma

and Barker, 1995). A korai embrionális stádiumokban (E9-E13) trofikus faktorként

szolgáló GABA-nak egy alternatív forrása lehet a szérumban jelen lévő GABA, amely a

vér-agy gát kifejlődése előtt be tud diffundálni az erek falából az idegszövet

intercelluláris terébe. A szinapszisok kialakulása előtt a GABA kiürülése a rostokból és

axonális növekedési kúpokból a membrán-kötött GABA-transzporterek

megfordulásával (Taylor and Gordon-Weeks, 1991) illetve exocitózissal is megtörténhet

(Gao and van den Pol, 2000). A neurális progenitorok fejlődése során jelentős

mennyiségű (≈ 10 µmol / 100 mg protein) GABA-t mutattak ki a szaglógumó ill. a

kisagy területén is (Miranda-Contreras et al., 1999, 2000) E13 kortól P0 stádiumig. A

GABAerg rostok, a GABA-szintetizáló enzimek, a GABA-ürítő mechanizmusok, a

GABA receptorok és a GABA együttes jelenléte a korai embrionális fejlődés során

megerősíti azt a feltételezést, hogy a GABA trofikus faktor a fejlődő neuronok számára.

A kifejlett idegrendszerben a GABA a posztmitótikus neuronok hiperpolarizációját

idézi elő és ezzel neuronális gátlást hoz létre. Az embrionális fejlődés során egészen az

első posztnatális hétig a GABAA receptor Cl- csatornák aktivációja depolarizációt idéz

elő és ezzel egyidőben megemeli a [Ca2+]IC-t (Cherubini et al., 1991; LoTurco et al.,

1995; Rivera et al., 1999; Owens et al., 1996, 1999). A depolarizáló hatás a

progenitorsejtek magas Cl- ion tartalmával magyarázható (Rivera et al., 1999), amely a

neuronális érés során fokozatosan lecsökken. Az aktivált GABAA receptorokon a Cl--

ionok kiáramlását membrán-depolarizáció követi aktiválva a VDCC-t, amelyeken

keresztül nagymennyiségű Ca2+ jut a sejt belsejébe (Reichling et al., 1994; Serafini et

al., 1998). Az embrionális fejlődés során a GABA trofikus hatásait nagy

valószínűséggel a Ca2+-ionok, mint másodlagos hírvivők közvetítik.

26

2.1 A GABA-szintézis szabályozása: GAD formák

A gerinces idegrendszerben a GABA szintézisét két enzim katalizálja, a 65 kD

és 67 kD molekulatömegű GAD enzimek (4. ábra; Martin and Rimwall, 1993). A két

gad gén génduplikációval keletkezhetett egy közös ősi gad génből kb. 400-560 millió

évvel ezelőtt (Bosma et al., 1999). A felfedezés, hogy a gerincesek GABAerg

idegsejtjeiben két gad gén (Erlander et al., 1991) és két eltérő funkciójú GABA-raktár

(szinaptikus és metabolikus) található adta az ötletet, hogy a GAD65 és GAD67

fehérjék különböző GABA-raktárak feltöltését végzik (Martin and Rimwall, 1993;

Martin et al., 2000). Megerősíti ezt a feltételezést, hogy a gad65 és gad67 gén-kiütött

állatok eltérő fenotípust mutatnak. A gad67-hiányos állatok farkastorokkal születnek és

születés után nem sokkal el is pusztulnak (Condie et al., 1997; Asada et al., 1997). A

gad67+/- heterozigóta állatokban a GABA szintje nagymértékben lecsökken, ami azt

mutatja, hogy a GAD65 jelenléte nem tudja kompenzálni a GAD67 fehérje részleges

elvesztését. Ezzel ellentétben a gad65 gén-kiütött állatok életképesek, de epilepszia

fejlődik ki bennük (Kash et al., 1997), szorongásos viselkedést mutatnak és a neurális

hálózatuk működése is károsul (Stork et al., 2000). Azok az állatok, amelyek genomja

sem a gad65-t sem a gad67-t nem tartalmazza, hasonló fenotípust mutatnak, mint a

gad67-/- állatok. (Ji et al., 1999). Érdekes megemlíteni, hogy bár ezekben az állatokban

az idegrendszer GABA-tartalma elhanyagolhatóan alacsony, az agykéreg, kisagy és

hippocampusz szöveti fejlődése nem sérül E14-P0 korig (Ji et al., 1999).

A két GAD enzimforma eltér kinetikai tulajdonságaiban (Martin et al., 2000),

intracelluláris eloszlásában (Kanaani et al., 1999) és a kofaktor piridoxál-foszfát (PLP)

kötésében is (Kaufman et al., 1991; Martin et al., 2000). Mindkét fehérjén belül

megkülönböztetünk egy N-terminális (a két fehérje ezen szakasza között kb. 23%-os a

szekvencia hasonlóság) és egy C-terminális domént (kb. 73%-os aminosav egyezés). Az

N-terminális domén szabályozza a fehérje sejten belüli célba juttatását, valamint a

GAD65 – GAD67 homo- és heterodimerek kialakítását. A C-terminális régió hordozza

a

27

28

kofaktor-kötő helyet és az enzimaktív régiót (Sheikh and Martin, 1996; Soghomonian

and Martin, 1998). A GAD67 fehérje nagyobb része a citoplazmában található és csak

kis százaléka kerül ki a membránba (Christgau et al., 1991; Kanaani et al., 1999), míg a

GAD65 fehérje főleg membránokhoz asszociálódik (Kanaani et al., 1999; Obata et al.,

1999; Hsu et al., 2000). A GAD65 fehérje sejtmembránhoz való kihorgonyzása

palmitoil-oldalláncok segítségével történik (Christgau et al., 1992), de a palmitoiláció

nem játszik szerepet a fehérje membránhoz való szállításban (Shi et al., 1994). A

GAD67 fehérje membránhoz való targetálása a GAD65 fehérjétől független folyamat

(Kanaani et al., 1999) és valószínűleg a nem-szinaptikus GABA-release-ben lehet

szerepe (Kanaani et al., 1999). A GAD65 fehérjék preszinaptikus lokalizációja és

szinaptikus vezikulákhoz való asszociációja (Hsu et al., 2000) alapján ezen forma

szerepe a GABAerg szinaptikus jelátviteli folyamatokban jelentős (Sheikh and Martin,

1996).

2.2 Rövidített GAD fehérjék

Az embrionális fejlődés során alternatív hasítással embrionális transzkriptumok

(I-80 és I-86; 4. ábra) keletkeznek a gad67 génről (a gad65 gén esetében ilyen termék

nem ismert). Ezek a transzkriptumok magukba foglalnak egy-egy embrionális exont

(7A és 7B), melyek szekvenciája majdnem teljesen azonos (5. ábra). Az embrionális

exonok tartalmaznak egy átfedő Stop/Start kodont (TGATG), mely a fő nyitott

leolvasási keretet (Open Reading Frame; ORF) megszakítja és két ORF-t alakít ki az

mRNS-n belül (5. ábra), így bicisztronikus – két polipeptidet kódoló - transzkriptum

keletkezik (Szabó et al., 1994). Az első leolvasási keret egy 25 kD fehérjét kódol (4., 5.

ábra; GAD25), míg a második leolvasási keretről átírt fehérje 44 kD molekulatömegű

(4., 5. ábra; GAD44; Szabó et al., 1994). Az I-86 transzkriptumban a 7B exon által

kódolt plusz 6 aminosav (GTG ATG) tartalmaz egy újabb Stop kodont (5. ábra), mely

megszakítja a második leolvasási keretet, így erről a transzkriptumról csak egy fehérje,

a GAD25 tud átíródni. Az I-86 mRNS expressziója az embrionális fejlődés korai

időszakára esik (Szabó et al., 1994), amikor az idegrendszert még főleg osztódó

progenitorok és frissen differenciálódott neuronok építik fel (E10.5 – E15.5). Az I-80

mRNS - mely mindkét fehérjét kódolja - expressziós maximuma későbbi fejlődési

29

stádiumokra esik (Szabó et al., 1994), amikor a már kialakult neuronok migrációja

zajlik (E12-E18).

A GAD25 fehérje a teljes hosszúságú GAD67 fehérje N-terminális 212

aminosavát tartalmazza, valamint még 11 aminosavat, amit az embrionális exonok

kódolnak (5. ábra). A GAD25 fehérje csak azokat a regulációs szekvenciákat hordozza,

amelyek a teljes hosszúságú GAD67 enzimen belül a fehérje-fehérje kapcsolatok

kialakítását közvetítik, így a GAD25 fehérje enzimatikus aktivitással nem rendelkezik.

A fehérje főleg korai embrionális stádiumokban fordul elő (E10.5-E12.5; Szabó et al.,

1994), de felnőtt agyban is kimutatható azokon a helyeken, ahol szinaptikus

átrendeződések történnek (Krizbai et al., 2000).

A GAD44 fehérje 15, embrionális exon által kódolt aminosavat hordoz az N-

terminális végén és 381 aminosavat a felnőtt GAD67 fehérje C-terminális régiójából (5.

ábra), magában foglalva a kofaktor-kötő régiót és az aktív centrumot is. In vitro

mérések megmutatták, hogy a fehérje enzimatikus aktivitással rendelkezik (Szabó és

munkatársai, nem közölt adat). A GAD44 fehérje E11 kortól egészen a posztnatális P11

időszakig detektálható, felnőtt állat idegrendszerében azonban nem mutatható ki (Szabó

et al., 1994). A teljes hosszúságú GAD67 fehérje expressziója fordított tendenciát

mutat: embrionális korszakban alig detektálható, mennyisége nagymértékben emelkedik

születés után és a posztnatális 4. héten eléri szintje a felnőttre jellemző értéket. A

fejlődő telencephalon területén az embrionális transzkriptumok átmeneti expressziót

mutatnak az osztódó sejteket tartalmazó VZ és a szubventrikuláris zóna (SVZ) területén

ill. azokon a területeken, ahol migráló neuroblasztok találhatók (Behar et al., 1994;

Katarova et al., 2000a). Ez alapján feltételezhető, hogy az embrionális GAD formáknak

szerepe lehet a neuronblasztok osztódásának szabályozásában, a neuronális

differenciációban és a kialakuló neuronok migrációjában.

A GABA az idegrendszer embrionális fejlődése során sokrétű szereppel rendelkezik.

Korai embrionális stádiumban (E15) mikromoláris koncentrációban adott GABA

befolyásolja a neurális progenitor sejtek osztódását mind a VZ, mind a SVZ területén

(LoTurco et al., 1955; Haydar et al., 2000). Fiatal neuronok random ill.

30

31

irányított mozgását GABA fento- és mikromoláris koncentrációival befolyásolni lehetett

mind frissel izolált sejtek tenyészeteiben (Behar et al., 1996) mind organotipikus

szövetszeletekben (Behar et al., 1998). A neuronális nyúlványhálózatok kialakulása

során a differenciálatlan idegsejtekből érett neuronok fejlődnek és az aktívan mozgó

axonális növekedési kúpok átalakulnak helyhez kötött szinaptikus elemekké. Az

idegsejtek ezen fejlődési stádiumában a GABA receptor agonisták megnövelik a sejtek

metabolikus aktivitását (Hansen et al., 1987; Spoerri, 1988), megemelik adott GABAA

receptor alegységek expresszióját, növelik a már jelen lévő receptorok GABA-kötését

(Kim et al., 1994), valamint indukálják neuron-specifikus fehérjék szintézisét is

(neuron-specifikus enoláz, neurális sejtadhéziós molekula, Belhage et al., 1988).

II. AZ IDEGSEJT IRÁNYÚ ELKÖTELEZŐDÉS KORAI LÉPÉSEINEK

TANULMÁNYOZÁSA AZ EGYEDI SEJTEK SZINTJÉN

A neurogenezis molekuláris- és sejtbiológiai folyamatai in vivo csak korlátozott

mértékben tanulmányozhatóak. Az embriókban a sejtkapcsolatok tetszés szerint nem

változtathatók, fejlődésreguláló anyagok hatásainak mechanizmusa csak részben

tesztelhető. Azonos fejlődési potenciállal rendelkező, neurális progenitor sejtekből álló

primer tenyészetet nem lehet létrehozni, mert az embrionális idegrendszer területén a

progenitorok differenciációja térbeli és időbeli eltéréseket mutat – azaz egy adott

fejlődési stádiumban a jelenlévő sejtek eltérő differenciáltsági állapotokat képviselnek.

A korai fejlődési stádiumban lévő embrionális agyhólyagból izolált primer

sejttenyészetek összetétele és fejlődési potenciálja is heterogén, a primer progenitorok

osztódóképeségüket in vitro hamar elveszítik, fejlődési potenciáljuk megváltozhat. Az

eredményes és ismételhető kísérletekhez sejtösszetétel, fejlődési potenciál és

indukálhatóság tekintetében egyforma sejttömegre lenne szükség.

A neurogenezis korai szakaszának in vitro vizsgálatait olyan folytonosan

osztódó (immortalizált), neurális progenitor sajátságokkal rendelkező sejteken

végezhetjük, amelyekből a differenciáció adott szakaszában jelentős homogén sejttömeg

állhat rendelkezésre. Perifériás idegrendszeri tumorokból előállított sejtvonalak (PC12;

Green and Tischler, 1976), ill. embrionális karcinómákból (EC) izolált multipotenciális

neurális progenitorok (P19, PCC-7, NTera-2) in vitro differenciáltatása széles

32

lehetőségeket kínál a neurogenezis egyes lépéseinek tanulmányozására. A mi

laboratóriumunk azonban olyan modell sejtvonalon kívánt dolgozni, amely nem tumor

eredetű és külső onkogéneket sem hordoz. Laboratóriumunk munkatársai transzgenikus,

p53–deficiens, 9 napos egér embrió (6. ábra) elő- és középagy-hólyagjából izoláltak

immortalizált neuroepiteliális progenitor sejtvonalakat (Schlett and Madarász, 1997). A

funkcionális p53 génnel nem rendelkező egértörzset Livingstone és munkatársai

állították elő (Livingstone et al., 1992). Kísérletek igazolják, hogy funkcionális p53 gén

hiányában az egerek normálisan fejlődnek, de korábban öregszenek (Tyner et al., 2002)

és idős korban megnő a tumorok gyakorisága is (Donehower et al., 1992). Ugyanakkor

a p53 gén hiánya elősegíti az izolált sejtek (pl. fibroblasztok, hematopoietikus őssejtek)

immortalizációját (Donehower et al., 1992; Harvey et al., 1993; Bond et al., 1994; Metz

et al., 1995).

A p53 gén a tumor szupresszor gének családjába tartozik és fontos szerepet

játszik a sejtciklus G1/S ill. G2/M átmenetének szabályozásában (Takimoto and El-

Deiry, 2001). A p53-/- állatok normális fejlődése azonban jelzi, hogy a fehérje hiányát a

sejtek és a szervezet kompenzálni tudja. Önálló transzkripciós faktorként aktiválja a p21

fehérje expresszióját, mely a cdk/cyclin komplexekhez kapcsolódva gátolja a DNS

szintézis megindulásához szükséges transzkripciós faktorok kialakulását (White, 1994;

Peters, 1994), így a sejtek a G1 fázisban megrekednek. A funkcionális p53 hiány másik

– feltételezhetően immortalizációt kiváltó – hatása egyes apoptótikus folyamatok

kiesése lehet (Hughes, et al., 1997; Bates and Vousden, 1996). A fehérje hiányában az

önpusztító program azokban a sejtekben, amelyek genetikai állománya károsodott, vagy

pedig olyan környezeti feltételek közé kerültek, amelyek nem permisszívek a sejt

túléléséhez (pl. növekedési faktorok hiánya) beindul. A p53–deficiens sejtvonalak

esetén a sejtek öregedését jelző telomera-rövidülés funkcionális p53 fehérje hiányában

egy kritikus telomera hossz elérése után nem tudja beindítani a p53-mediált apoptózist

6. ábra 9 napos egér embrió anterior régiójánakhosszmetszeti képe. A kettős nyilak az elő-,közép- és utóagy hólyagok határait jelzik.

33

(Kang and Park, 2001), így az elöregedett sejtek p53 hiányában tovább folytathatják az

osztódást. A p53-deficiens sejtvonalak esetében az immortalizáció több mechanizmus –

a sejtciklus–reguláció sérülése, a meghatározott környezeti feltételek mellett indukálódó

vagy telomera-rövidülés indukálta apoptózis kiesése – révén is kialakulhatott.

A laboratóriumunkban eddig vizsgált p53-deficiens sejtvonalak (NE-4C, NE-

4C/A, NE-4C/B) indukálatlan állapotban folytonosan osztódnak, míg all-trans retinsav–

kezelés (ATRA) hatására ideg– és gliasejteket alakítanak ki (Schlett and Madarász,

1997). A sejtciklusból való kilépésük, végdifferenciálódásuk tehát funkcionális p53 gén

hiányában is lehetséges.

III. AZ ALL-TRANSZ RETINSAV (ATRA) SZEREPE AZ IDEGRENDSZER

EMBRIONÁLIS FEJLŐDÉSE SORÁN

Régóta ismert tény, hogy mind az A–vitamin hiánya, mind többlete súlyos

fejlődési rendellenességek kialakulásához vezet az embrionális fejlődés során. Számos

adat utal arra, hogy ezekért a rendellenességekért nem az A-vitamin, hanem a belőle

kialakuló retinsav szintjének megváltozása a felelős (Durston et al., 1989; Agarwal and

Sato, 1993). Sok multipotenciális sejtvonal esetében bizonyították, hogy retinsav–

kezeléssel szöveti differenciáciálódásra késztethetők (pl. embrionális stem sejtek; PCC-

7, P19, NTera-2, NE-4C). A retinsav fejlődést szabályozó hatása régóta ismert és a

sejtvonalak segítségével in vitro is vizsgálható (Imrik and Madarász, 1981; Jones-

Villeneuve et al., 1982; Henion and Weston, 1994; Schlett and Madarász, 1997).

Számos előnye mellett azonban, az idegrendszeri elköteleződés vizsgálatánál hátrányt

jelent az embrionális karcinóma eredetű sejtek ill embrionális stem sejtek széles

fejlődési potenciálja: a P19 sejtvonal a differenciáltatásra használt retinsav

koncentrációjának függvényében mind fibroblasztok, mind izomsejtek, mind idegi

elemek kialakítására is képes (Jones-Villeneuve et al., 1982; McBurney et al., 1982;

Edwards and McBurney; 1983).

A gerinces embriókban a fejlődés korai szakaszában termelődik retinsav:

madaraknál a Hensen–csomóban, emlősőknél pedig a primitív árok mentén. A retinsav

koncentráció-grádienst alkot az antero-poszterior testtengely mentén, így koncentráció-

34

függő módon képes aktiválni a testtengelyek szerinti (anterior-poszterior, dorzális-

ventrális, mediális-laterális) polarizációt kialakító régió-speifikus (pl. Hox, Otx, Lim,

Emx, En, Pax) gének expresszióját (Simeone et al., 1995; Bally-Cuif and Boncinelli,

1997; Lumsden and Krumlauf, 1996). RXRE– (Retinoid X Response Element) és

RARE–szekvenciák (Retinoic Acid Response Element) találhatók fejlődésreguláló

gének (Hox–géncsalád, Otx–2), illetve a retinsav saját receptorainak (RXRβ)

szabályozó régiójában (Marshall et al., 1994; Chambon, 1996).

Az elülső neuropórus záródása előtti (közép- és késő-gasztruláció) szakaszban

exogén úton bejuttatott retinsav az elülső idegrendszeri struktúrák különböző mértékű

redukciójához, illetve a gerincvelő és a nyúltagy különböző mértékű előreterjedéséhez

vezet (Corcoran, 1998). Molekuláris biológiai vizsgálatok megmutatták, hogy a

retinsav–függő morfológiai változások jól korrelálnak néhány régió–specifikus

transzkripciós faktor expressziós mintázatának megváltozásával (Conlon, 1995;

Simeone et al., 1995; Bally-Cuif and Boncinelli, 1997; Lumsden and Krumlauf, 1996).

Az, hogy az exogén úton bejuttatott retinsav súlyos fejlődési rendellenességek

kialakulásához vezet és hatása koncentrációfüggő, bizonyítja, hogy a retinsav

morfogenetikus hatású anyag. A retinsav nemcsak az idegrendszer fejlődésében játszik

fontos szerepet, hanem a csontrendszer és a végtagok kialakításában is (Simeone et al.,

1995).

IV. CITOSZKELETÁLIS ÁTRENDEZŐDÉSEK A NEURONÁLIS

DIFFERENCIÁCIÓ SORÁN

A retinsav-indukálta idegsejt irányú elköteleződés együtt jár a sejtalak

jellegzetes megváltozásával, melyet a citoszkeletális fehérjék expressziójának

változásában is nyomon követhetünk. A neuronok differenciációja és érése során

megindul a neuron-specifikus enzimrendszerek expressziója, megjelennek a

neurotranszmisszióban szerepet játszó átvivő-anyagok sejtfelszíni receptorai, kialakul

metabolizmus-rendszerük, valamint a szinaptikus komplexek differenciációja is elindul.

A sejtváz dinamikus átépülésre képes alkotói sejt-specifikus, illetve fejlődési

állapot függő összetételben és elrendezésben találhatók a fejlett gerincesek sejtjeiben.

35

Az idegrendszert kialakító progenitorsejtek fenotípus determinációja során a sejtvázban

is mélyreható változások lépnek fel a sejtek osztódása, vándorlása és nyúlványosodása

során. A kialakuló idegsejtek érése folyamán jellegzetesen és reprodukálhatóan

megjelenő vagy eltűnő molekulák kimutatása így jelentősen megkönnyíti egyes

sejtcsoportok ill. elköteleződési lépések azonosítását.

IV./1 Az köztes filamentum fehérjék

Az eukarióta sejtváz főbb komponensei a köztes filamentumok (10nm átmérő), a

mikrofilamentumok és a mikrotubulusok. A köztes filamentumokra a többi

citoszkeletális vázelemnél nagyobb sejttípus-specifitás jellemző. A köztes filamentum

szupercsaládba tartozó hat molekulacsaládra egyaránt jellemző, hogy az egyes

családokon belüli nagyfokú homológia ellenére a molekulcsaládok között csak

korlátozott hasonlóságot találtak. Az idegi progenitor sejtek jellegzetes, átmenetileg

expresszálódó köztes filamentum fehérjéje a nesztin6 (Lendhal et al., 1990).

Expressziója az idegsejtek korai fejlődése során lecsökken és érett neuronokból teljesen

el is tűnik (Schlett and Madarász, 1997). Az idegsejtek fejlődése során a

neurofilamentum (NF) fehérjék közül elsőként a NFL és a közepes neurofilamentum

fehérje (NFM) expressziója indul meg, melyet csak késéssel követ a nehéz

neurofilamentum fehérje (NFH) expresszió (Shaw and Weber, 1982; Riederer et al.,

1992). A neurofilamentumok in vivo obligát heteropolimerek, amelyek NFL és NFM

vagy NFH formát tartalmaznak. A három alegység hozzájárulása a heteropolimer

kialakításához jelentősen változik a neuronális differenciáció különböző szakaszaiban.

A neurofilamentumok dinamikus átrendeződése az alegységek foszforilációja révén

szabályozódik mind in vivo, mind in vitro (Lee and Cleveland, 1996). A neurális

nyúlvány-növekedés korai szakaszában a neurofilamentumok csak kis mennyiségben

fordulnak elő a növekvő nyúlványokban, de a nyúlványok stabilizálódása, a szinaptikus

6 Nesztin tranziens expresszióját szintén megfigyelték embrionális és újszülött állatok

izomszövetében (Lendhal et al., 1990; Zimmerman et al., 1994). NFM és NFL ektopikus expressziója volt

megfigyelhető éretlen Schwann sejtekben (Kelly et al., 1992; Roberson et al., 1992) ill. NFH expresszió

T-lymphocitákban és embrionális szívizom-sejtekben (Murphy et al., 1993). Ezen fehérjék

idegrendszeren kívüli expressziójának jelentősége még nem tisztázott.

36

struktúrák differenciációja és a mielin-hüvely kialakulása után a neurofilamentum

fehérjék meghatározó citoszkeletális elemmé válnak az axonokban (Lee and Cleveland,

1996), fenntartva a nyúlvány-rendszer alakját és az axon átmérőjét (Lee and Cleveland,

1996).

A gliális fibrilláris savas fehérje (GFAP) az asztrociták sejtvázának jellegzetes

köztes filamentum fehérjéje (Dahl and Bignami, 1986).

IV./2 A mikrotubuláris rendszer

A mikrotubuláris rendszert α és β tubulin fehérjék építik fel, melyek

heterodimerekként fordulnak elő. Gerincesekben hat különböző α és hat különböző β

tubulin gén ismert (Sullivan, 1988; Wang et al., 1986), melyek közül 5-5 variáns

expresszióját az idegrendszerben is leírták (Villasante et al., 1986). A β típusú tubulin

fehérjék közül a neuronális differenciáció során a III β-tubulin (N-tubulin) az elsőként

megjelenő izotípus és az egyetlen, amely főleg neuronokban (Asai and Remolona, 1989;

és kismértékben a testis sertoli sejtjeiben (Lewis and Cowan, 1988) expresszálódik.

Jelenlétét kimutatták már a neuronok utolsó osztódása alatt (Dráberová et al., 1998,

Menezes and Luskin, 1994). A N-tubulin elsőként E8 embrionális korban sikerült

kimutatni (Fanarraga et al., 1999), mennyisége nagymértékben emelkedett E13-tól

egészen postnatális P5 korig. A differenciálódó idegsejtekben korábban megjelenő

foszforilálatlan N-tubulin forma a sejtváz plaszticitását biztosítja a nyúlvány-növekedés

korai szakaszában (Ferreira and Caceras, 1992), míg a foszforilált formák a kialakuló

nyúlványokat stabilizálják.

Az idegsejtek fejlődése során a sejtvázat felépítő fehérjék expressziója

fejlődéstanilag meghatározott és függ az expresszáló sejt típusától és a sejt fejlődési

állapotától. Két fő expressziós csoportot különítünk el: a korai és késői expressziójú

fehérjéket. Az első csoportba a Map5 (mikrotubulus-asszociált fehérje; Riederer et al.,

1986), Map2b és Map2c (Binder et al., 1984; Riederer and Matus, 1985) valamint a

juvenilis τ fehérje (Brion et al., 1988) tartozik. Ezek a fehérjék a sejtvázba épülve

biztosítják a sejtváz nagyfokú plaszticitását, mely nélkülözhetetlen a

nyúlványnövekedés és differenciáció során. A késői komponensek, mint az NFL, NFM

(Dahl and Bignami, 1986), Map1a és Map2a (Riederer and Matus, 1985), felnőtt τ

37

fehérje (Binder et al., 1985) és agyszövet-specifikus spektrin (Riederer et al., 1987) a

neuronális struktúrák fenntartása és stabilizálása során döntő jelentőségűek.

38

CÉLKITŰZÉSEK

1. A klasszikus neurotranszmitterek (glutaminsav és GABA) korai neurogenezisben

betöltött szerepének vizsgálatára olyan in vitro modellrendszert kívántam

kialakítani, amely alkalmas a neurogenetikus folyamatok sejtbiológiai és

molekuláris biológiai vizsgálatára. A modellrendszer felhasználásával az idegi

irányú elköteleződés folyamatának biztosan reprodukálható fázisait anatómiai,

citokémiai sajátságok alapján szerettem volna jellemezni.

2. Az in vitro neurogenezis különböző stádiumaiban vizsgálni kívántam a glutaminsav

hatásait közvetítő ionotróp glutamát receptorok megjelenését és lehetséges szerepét

az idegi elköteleződés során. A célok között szerepelt:

a/ az NMDA receptor alegységek mRNS- és fehérje-formáinak kimutatása

b/ funkcionális NMDA receptorok kimutatása

c/ AMPA receptor alegységek expressziójának vizsgálata

d/ Funkcionális AMPA receptorok kimutatása és neurogenezisben betöltött

szerepük vizsgálata

az NE-7C2 sejtek in vitro idegi fejlődése során

3. Feladatul tűztem ki a glutaminsav - GABA átalakulásért felelős enzimcsalád, az

embrionális és felnőtt GAD formák in vitro expressziós mintázatának

feltérképezését és esetleges szerepük tanulmányozását az idegsejt-fenotípus

kialakításában:

a/ az embrionális és felnőtt GAD mRNS- és fehérje-formák expressziós

mintázatának és sejtes lokalizációjának tanulmányozását

b/ GABA-tartalmú idegsejtek azonosítását és eloszlásuk vizsgálatát

az NE-7C2 sejtek in vitro idegi fejlődése során

39

ANYAG ÉS MÓDSZER

I. AZ ALKALMAZOTT SEJTTENYÉSZTÉSI KÖRÜLMÉNYEK

I./1 Sejtek fenntartása, kezelése

Az NE-7C2 sejtvonalat az Idegi Sejtbiológia laboratórium munkatársai állították

elő (Schlett and Madarász, 1997) és fagyasztva különböző passzázsok állnak

rendelkezésre. Az NE-7C2 sejteket 5% CO2 tartalmú, 37°C–os termosztátban poli–L–

lizinnel (PLL) bevont szövettenyésztő petricsészében (Greiner), Minimal Essential

Mediumban (MEM, Sigma) növesztettem, melyhez 10% FCS–t (Fötális Borjú Savó,

Sigma), 4mM glutamint, 40 µg/ml gentamicint és 1.25µg/ml amphotericinB-t adtam. A

sejteket 105 sejt/cm2 sűrűségig engedtem nőni, majd 0.05% tripszin–PBS (Phosphate

Buffered Saline) oldattal felpasszáltam és 5x higításban újra kiültettem őket.

Immuncitokémiai festések során 24 lyukú szövettenyésztő edényeket használtam

üveglemezekkel és 105 sejtet tettem minden lyukba, míg az in situ ELISA mérésekhez

96 lyukú szövettenyésztő tálcákra ültettem ki 104 sejtet minden lyukba. Az [Ca2+]IC

mérésekhez 35mm átmérőjű petricsészékben UV fényt áteresztő üveglemezeken nőttek

a sejtek meghatározott időtartamokig.

All-transz retinsav (Sigma) 0.01M-os, dimetil-szulfoxidban (DMSO, Sigma)

oldott törzsoldatát folyékony nitrogénben tároltam. Ennek 10-4M MEM-ben oldott

munkahigításával közvetlenül állítottam be a 10-6- 10-8 M-os végkoncentrációt a sejtek

folyadékkörnyezetében.

I./2. Kromoszóma-preparátumok készítése

A növekedés log fázisában lévő tenyészeteket 10-7 M végkoncentrációban

kolcemiddel kezeltem 1,5 órán keresztül. A sejteket tripszines kezeléssel felszedtem az

aljzatról és 1000g - n 10 percig tartó centrifugálással összegyűjtöttem. A sejtcsapadékot

0.56% KCl-al 10 percig hipotonizáltam, majd a duzzadt sejteket és citoplazma-mentes

sejtmagokat frissen készített metanol-ecetsav 1:3 arányú keverékével 3-4x fixáltam. A

preparátumot krómkénsavval zsírtalanított tárgylemezre csöppentettem és 24–48 óráig

száradni hagytam. A feldolgozást megelőzően a lemezeket 2% Giemsa–tartalmú (0.66

40

M Na2HPO4, 0.66 M KH2PO4) oldattal 10 percig festettem és 1250x nagyítás mellett

számoltam le a kromoszómákat.

Az NE-7C2 sejtvonal kromoszómaszám-változásait 81 passzázs során követtem.

A vizsgált passzázsokból 50-50 mitózisban megszámoltam a kromoszómákat és

grafikusan ábrázoltam a kromoszómaszámok megoszlását egy-egy passzázson belül (7.

ábra). A vizsgált passzázsokban összeadtam azokat a kromoszómaszámokat, amelyek az

50 és 80 értékek közé estek és elosztattam az összeget az ezen tartományba eső

mitózisok számával. Az így meghatározott értéket a kromoszómaszámok súlyozott

átlagának neveztem.

II. SZEMIKVANTITATÍV RT-PCR VIZSGÁLATOK

II./1 Ionotrop glutamát receptor alegységek kódoló RNS formáinak

kimutatása

A munka a Stuttgarti Egyetem Sejt- és Immunbiológiai Laboratóriumában Dr

Ulrich Eisel-el való kollaboráció keretében készült.

Kontroll és ATRA-kezelt NE-7C2 sejtek tenyészeteiből Trizol-LS reagens

segítségével (Gibco BRL) totál RNS-t izoláltam és a mintákat kiküldtem a Stuttgarti

Egyetem laboratóriumába (két független mintasorozat), ahol a kísérlet további lépéseit

Dr Schlett Katalin végezte el. Az RT-PCR reakciók során felhasznált pozitív kontroll

RNS-eket 30 napos egér kisagyi és előagyi régióiból PeqGold RNAPure (PEQLAB

Biotech., Erlangen, Germany) felhasználásával készítette. Az RNS-mintákat DNázI-el

kezelte 37°C-on 15 percig, majd az így kapott genomiális szennyezéstől mentes RNS-

ből 3µg-t átírt komplementer cDNS-re a First Strand cDNA Synthesis Kit (MBI

Fermantas, St. Leon-Rot, Germany) valamint random hexamer vagy. oligodT primerek

felhasználásával. A PCR-reakciókhoz PTC-200 Peltier Thermal Cycler berendezést (MJ

Research Inc., Watertown, MA, USA) és HotStarTaq polimerázt (Qiagen, Hilden,

Germany; 1U / 50µl reakciótérfogat) használt. Az mRNS expresszió mennyiségi

kiértékelése céljából ugyanabban a reakcióelegyben a glicerin-aldehid-foszfát

dehidrogenázt (GAPDH, 11. primer pár) kódoló mRNS-t is felszaporította

párhuzamosan az AMPA és NMDA receptor alegység mRNS-kel. A negatív kontrollok

ugyanazt a reakcióelegyet tartalmazták de templátként RNS szolgált, a pozitív

41

kontrollok esetében pedig előagyi és kisagyi (az NR2C detekció esetén) cDNS-ről

történt az amplifikáció. A PCR termékeket 2%-os, etidium-bromiddal megfestett agaróz

gélen futtatta meg és értékelte ki.

A PCR analízisekhez tervezett primer-párok szekvenciáját az 2. Táblázat

tartalmazza. Az RT-PCR analízisek mindkét mintasorozatból többször lettek

megismételve, az ábrákon egy-egy reprezentatív eredmény szerepel.

II./1/1 AMPA receptor alegység mRNS-einek kimutatása

A PCR reakciómix 1.5 mM MgCl2-t, 0.2 mM dNTPs-t (PEQLAB Biotech.;

Erlangen, Germany) és 0.2 µM primert tartalmazott az 1-3 primer párokkal (2. táblázat)

történő amplifikálás esetén. A PCR reakció egy 15 percig tartó aktiválással indult 95ºC-

on, majd 35 ciklus következett az alábbi hőmérsékleteken: 94ºC 60 sec, 60ºC 60 sec és

72ºC 60 sec. Az amplifikációk egy 72ºC-on 10 percig tartó elongációs szakasszal

zárultak.

II./1/2 NMDA receptor alegységek mRNS-einek kimutatása

A PCR reakciókeverék 2.5 mM MgCl2-t és 0.4 mM dNTP mixet tartalmazott az

4. és 11. primerekkel (2. táblázat) történő cDNS amplifikáció során, illetve 1.5mM

MgCl2-t és 0.2 mM dNTP mixet a 5-10. primerekkel (2. táblázat) való láncreakció

esetén. A PCR reakció egy 15 percig tartó aktiválással indult 95ºC-on, majd ezt követte

egy 40-szer ismétlődő hőmérsékleti ciklus: 94ºC 60 sec, 72ºC 120 sec (a 4., 6. és 10.

primer párok); 94ºC 60 sec, 62ºC 45 sec, 72ºC 120 sec (5. primer pár); 94ºC 45 sec,

67ºC 60 sec, 72ºC 60 sec (7. és 8. primer pár); 94ºC 60 sec, 63ºC 60 sec, 72ºC 60 sec (9.

primer pár); ill. 30 ciklus 94ºC 60 sec, 55ºC 60 sec, 72ºC 60 sec a 11-es primer pár

esetén. A reakciók egy 10 percig tartó elongációs szakasszal zárultak 72ºC-on.

II./2 GAD65 és GAD67 transzkriptumok kimutatása

A vizsgálatokat a Dr Szabó Gábor által vezetett Genetikai és Molekuláris

Biológiai Laboratóriumban készítettem az MTA-KOKI-ban.

Totál RNS-t izoláltam kontroll és ATRA-kezelt NE-7C2 sejtek tenyészeteiből

(két független mintasorozat) Trizol-LS reagens segítségével (Gibco BRL). 2µg RNS-t

átírtam komplementer cDNS-é a GeneAmp RNA-PCR Kit (Perkin-Elmer) segítségével

42

random hexamer primerekkel. A PCR-reakciókhoz Hybaid Thermal Cycler berendezést

(Thermo Hybaid, UK), Perkin-Elmer vagy Promega Taq polimerázt (1U / 30µl

reakciótérfogat) használtam és a reakció-elegyhez radioaktívan jelölt [32P]dCTP-t

(3000Ci/mmol; Izotóp Intézet, Budapest) is adtam. PCR analízisekhez tervezett primer-

párok szekvenciáját az 2. Táblázat tartalmazza (12 – 15 primer párok). A PCR

amplifikációt egy 95ºC-on 5 percig tartó denaturációval indítottam, majd 31 ciklus

következett az alábbi hőmérsékleteken: 94ºC 45 sec, 58ºC 45 sec, 72ºC 60 sec (12. és

14. primer párok); 94ºC 45 sec, 62ºC 45 sec, 72ºC 90 sec (13. primer pár). A reakció

egy 10 percig tartó elongációs szakasszal zárult 72ºC-on. A negatív kontrollok ugyanazt

a reakcióelegyet tartalmazták de templátot nem adtam a rendszerhez. Az mRNS

expresszió mennyiségi kiértékelése céljából a β-aktint kódoló mRNS-t is

felszaporítottam (15. primer pár) párhuzamosan a GAD mRNS-kel 16-20 cikluson

keresztül ugyanabban a reakcióelegyben. Az amplifikált radioaktív termékeket 1.5% ill.

1.6% etidium-bromiddal festett gélen futtattam és nylon membránra vittem át

(GeneScreen Plus, NEN). Az autoradiogrammok denzitometriás kiértékelését a Scion

Image programmal (Scion Corp.) végeztem el és a GAD-csíkok denzitását β-aktin-ra

vonatkoztatva normalizáltam. A GAD mRNS-ek kimutatását mindkét mintasorozaton

kétszer végeztem el és egy-egy reprezentatív eredményt kiválasztva készítettem el az

ábrát.

III. WESTERN BLOT ANALÍZIS

III./1 Fehérjeminták készítése szubcelluláris frakcionálással

90mm átmérőjű petricsészén növő NE-7C2 sejteket 0.02% EDTA-t tartalmazó

Ca2+, Mg2+-mentes PBS oldattal összegyűjtöttem majd 800g-n centrifugálással

leülepítettem. A továbbiakban minden lépést +4ºC-on végeztem el. A sejteket

tartalmazó csapadékot a felhasználásig -80ºC-on tároltam. A szubcelluláris frakcionálás

céljából a sejteket kézi sejt-homogenizátorral (Sigma) feltártam 300 µl pufferben

(pH=7.4), amely 10 mM HEPES-t, 250 mM szacharózt [valamint 1 mM

aminoethylthioammonium bromide (AET) és 0.2 mM PLP-t a GAD fehérjeformák

esetében] és proteáz-gátlókat tartalmazott (100 mM phenylmethylsufhonyl fluorid, 10

mM benzamidine, 1 µg/ml leupeptin, antipain, pepstain, aprotinin). Ezután a

43

sejthomogenátumot lecentrifugáltam 2000g-vel 5 percig, hogy a sejtmagokat

eltávolítsam. A felülúszót és 16000g-vel centrifugáltam tovább 30 percig, hogy

elválasszam a nagyobb sejtalkotókat és membrán-darabokat (durva membrán-frakció).

A felülúszó citoplazmás frakció eltávolítása után a csapadékot feloldottam 100 µl

pufferben, amely 10 mM HEPES-t, 150 mM NaCl-t és az előzőekben felsorolt proteáz-

gátlókat tartalmazta. A durva membrán frakciót ezután jégen inkubáltam 1 órán

keresztül. A GAD fehérjeformák kimutatása esetében a durva-membrán frakciót 100µl

2% TritonX-114-t tartalmazó pufferben oldottam vissza, amely 10 mM HEPES-t, 150

mM NaCl-t, 1mM AET-t, 0.2 mM PLP-t és az előzőekben felsorolt proteáz-gátlókat is

tartalmazta. A membrán-mintákat elhomogenizáltam és lecentrifugáltam 16000g-vel 30

percig. A felülúszó frakció a TritonX-114 oldható durva-membrán frakció nevet kapta.

A keletkező csapadékot 50µl pufferben oldottam vissza, amely 150 mM NaCl-t, 10 mM

HEPES-t, 1 mM AET-t, 0.2 mM PLP-t és proteáz-gátlókat tartalmazott (TritonX-114

oldhatatlan durva-membrán frakció).

III./2 Fehérjetartalom meghatározása

A minták fehérjetartalmának meghatározását Bradford módszere szerint

végeztem (Bradford 1976) a Biorad Standard Protein Assay felhasználásával. A 0.1 N

NaOH-ban felvett mintákat Bradford reagenssel 10 percig inkubáltam. Az oldatok

abszorbanciáját ELISA-reader segítségével mértem 595 nm hullámhosszon (405 nm

referencia hullámhossz mellett). Kalibráláshoz borjú szérum albumin (BSA)

koncentráció-sort használtam (0.1-20 µg/µl koncentráció-tartományban). A minták

fehérjetartalmát 1µg/µl-re állítottam be Laemmli-puffer (Laemmli et al., 1970)

segítségével

III./3 Western blot

III./3.1 NMDA receptor alegység fehérjéinek kimutatása

A citoplazmás és durva membrán frakciókból vett mintákat 2x töménységű

minta-pufferben (125mM Tris-HCl, pH 6.8; 6% glicerin; 4% SDS; 10% β-

merkaptoetanol és 0.0025% brómfenol kék) felvettem és 1 órán keresztül inkubáltam

37ºC-on. A mintákat ezután 12% poliakrilamid gél zsebeibe vittem fel (10 µg fehérje /

zseb NR1 és NR2B esetében valamint 10 és 60 µg fehérje / zseb NR2A esetében) és a

44

fehérjéket elektroforézissel elválasztottam. A fehérjék szeparálása BioRad Mini Protean

II készülék segítségével 50mA áramerősség mellet 1 órán át tartott (Futtató puffer: 192

mM glicin, 25 mM Tris bázis). A gélből a fehérjéket átblottoltam (blottoló puffer: 192

mM glicin, 25 mM Tris bázis, 20% metanol) nitrocellulóz membránra (Immobilon NC-

pure, Millipore) 80V-on 50 percig, majd 90V-on 10 percig. Az aspecifikus kötőhelyek

lefedésére a membránt 30 percig rázattam Tris-pufferelt sóoldatban (TBS; 50 mM Tris,

100mM NaCl; pH=7.4), amely 0.05% Tween-20-t és 2% BSA-t tartalmazott. A

membránokat egy éjszakán keresztül inkubáltam az I. réteg ellenanyagokkal. A kísérlet

céljától függően az alábbi ellenanyagokat használtam: anti - NR1 (0.5 µg/ml;

Chemicon), anti - NR1 (1 µg/ml; az ellenanyag M. Watanabe-tól származik, Watanabe

et al., 1998), anti - NR2A (1 µg/ml,; Upstate Biotechnology), anti - NR2A (1 µg/ml; az

ellenanyag M. Watanabe-tól származik) és anti - NR2B (1 µg/ml; Transduction

Laboratories). A membránokat ezután háromszor mostam TBS-oldattal, amely 0.05%

Tween-20-t tartalmazott (TBST), majd alkalikus foszfatázzal konjugált anti-nyúl vagy

anti-egér IgG (Jackson Immuno-Research Laboratories) 1:10000 higított oldatával

(TBST-ben) jelöltem a membránt 1 órán keresztül, szobahőn. A membránokat

háromszor mostam TBST oldattal, majd a kötött ellenanyagot 5-bromo-4-kloro-3-

indolyl foszfát (BCIP, 0.165 µg/ml; Sigma) és nitro blue tetrazólium (NBT, 0.33 µg/ml;

Sigma) alkalikus puffer-oldatában (0.1M Trizma-base, 5mM MgCl2 és 0.1M NaCl;

pH=9.5) tettem láthatóvá.

III./3.2 GAD fehérjeformák kimutatása

A GAD fehérjeformákat Katarova Zóya módszere alapján mutattam ki

(Katarova et al., 1990). A korábban leírt három szubcelluláris frakcióból

(citoplazmatikus frakció, TritonX-114 oldható és TritonX-114-oldhatatlan durva

membrán frakciók) vett mintákat Laemmli-pufferben forraltam 5 percig, majd 12%-os

gélen futtattam (15µg fehérje / zseb, BioRad Mini Protean II) 50mA áramerősség

mellett a már korábban említett futtató puffer felhasználásával. A fehérjéket ezután

átblottoltam nitrocellulóz membránra (Hybond-C, Amersham) lépcsősen növelve a

feszültséget. A kis molekulatömegű GAD25 és GAD44 fehérjéket 60V-on 20 percig,

majd 80V-on 30 percig blottoltam, a GAD65 és GAD67 fehérjéket 60V-on 10 percig,

80V-on 40 percig, majd 90V 10 percig transzferáltam. A membránokat ezután 2% BSA-

45

TBST oldatban inkubáltam 30 percig, hogy az ellenanyag aspecifikus kötődését

lecsökkentsem, majd egy éjszakán keresztül inkubáltam a következő I. réteg

ellenanyagok valamelyikével: # 6799 poliklonális szérum, mely az összes GAD-formát

felismeri (1/2000; Katarova et al., 1990), a GAD65 fehérje ellen termeltetett GAD6

monoklonális ellenanyag (1/500; Developmental Studies Hybridoma Bank, Chang and

Gottlieb, 1998) és # 8876 poliklonális szérum, amely az embrionális GAD25 fehérjére

specifikus (1/1000; Szabó et al., 1994). A membránokat ezután háromszor mostam

TBST-oldattal, majd alkalikus foszfatázzal kapcsolt anti-nyúl (Jackson Immuno-

Research Laboratories) vagy anti-egér (Promega) IgG 1:10000-re higított oldatában

(TBST-ben) rázattam 1 órán keresztül szobahőn. Az ellenanyaggal megjelölt fehérjéket

BCIP és NBT előbbiekben leírt oldatával festettem meg.

IV. IMMUNCITOKÉMIAI VIZSGÁLATOK

Az immuncitokémiai vizsgálatokhoz a sejteket 12 mm átmérőjű, PLL-el bevont

üveg fedőlemezen (Erie Scientific) tenyészettem 24-lyukú szövettenyésztő edényekben

(Greiner). Az immunfestések során felhasznált ellenanyagokat a 3. táblázat foglalja

össze.

IV./1 Neuron-és gliaspecifikus fehérjék kimutatása

A tenyészeteket PBS oldatával mostam, majd 4%-os paraformaldehid oldatban

(Taab; PBS-ben oldva) fixáltam 20 percig szobahőmérsékleten. A GABA

kimutatásához 4% paraformaldehid és 0.1% glutáraldehid frissen készített oldatával

fixáltam 10 percig. Háromszori mosás után TritonX-100 0.1%-os oldatával (5 percig,

szobahőn) átjárhatóvá tettem a sejtfelszíni membránokat. Ezt követően 1% BSA-PBS

vagy 5% FCS-PBS oldatban inkubáltam a tenyészeteket 1 órán keresztül, hogy az

aspecifikus kötődést megakadályozzam. Vizsgálataimban az alábbi ellenanyag-

higításokat alkalmaztam: N-tubulin (Dráberová et al., 1998) 1/1000, gliális fibrilláris

savas fehérje (GFAP, Sigma) 1/1000, szinapszin I (Chemicon Int.) 1/500, szinaptofizin

(Sigma) 1/500, neurofilament 68 kD (NFL, Sigma) 1/500, neurofilament 145 kD (NFM,

Sigma) 1/500, neurofilament 200 kD (NFH, Sigma) 1/500, Map2 (Sigma) 1/1000 és

nesztin (Pharmingen) 1/1000. A tenyészetek háromszori mosása (PBS) után biotin-

(Vector) ill. fluoreszcein izotiocianát-(FITC; Sigma) kapcsolt másodlagos antitesteket

46

adtam a tenyészetekhez 1/500 higításokban 1 órán keresztül. A fluoreszcens festékkel

jelölt preparátumokat Mowiol 4.88 (Polysciences) segítségével üveg tárgylemezekre

ragasztottam és Zeiss Axiophot fluoreszcens mikroszkóppal értékeltem ki. A normál

fénymikroszkópos vizsgálatokhoz harmadik rétegként avidin-biotin komplexet (Vector)

adtam 1/500 higításban 45 percig, majd az immunjelet 3-3’-diamino-benzidin (0.55

mg/ml TBS-ben; pH=7.6) és 0.3% H2O2 oldatával tettem láthatóvá.

IV./2 NMDA receptor NR1 és NR2B alegységeinek kimutatása

A tenyészeteket 4%-os paraformaldehid oldattal fixáltam 20 percig

szobahőmérsékleten, majd háromszori mosás után a tenyészetek egy részét TritonX-100

0.1 %-os oldatával permeabilizáltam a fent leírtak szerint. Ezt követően 1% BSA-PBS

oldattal 1 órán keresztül blokkoltam a nem-specifikus kötőhelyeket. Az ellenanyag

higítások a következők voltak: anti-NR1 (K21322, az ellenanyagot M. Herkert-től kapta

a munkacsoport, Herkert et al., 1998) 1/100, anti-NR1 (Pharmingen) 1/500, anti-NR2B

(K83084, az ellenanagot szintén M. Herkert-től kapta Madarász Emília, Herkert et al.,

1998) 1/100 és anti-NR2A (Upstate Biotochnology) 1/500. Az immunreakciót egyrészt

anti-egér IgG FITC-el hívtam elő, másrészt biotin, majd avidin-biotin komplex

segítségével amplifikáltam és DAB-csapadékkal tettem láthatóvá az előzőekben leírtak

alapján.

IV./3 GAD fehérjeformák kimutatása

A GAD fehérjeformák kimutatását 4% paraformaldehid fixálás előzte meg 20

percig, majd a fixált tenyészeteket 1% BSA-TBST oldattal permeabilizáltam és

blokkoltam. Első rétegként a következő ellenanyagokat használtam a felsorolt

higításokban: # 6799 (1/1000), N65 (1/500, a 65kD GAD fehérjeformát ismeri fel; az

ellenanyagot Szabó Gábor munkacsoportja kapta P. DeCamilli-től; Solimena et al.,

1993), # 8876 (1/1000, a 25 kD GAD fehérje ellen lett termeltetve) és affinitás-tisztított

# 8877 (GAD44 fehérjére specifikus poliklonális ellenanyag, melyet Szabó Gábor

munkacsoportja állítatott elő; 1/100). Az első réteg ellenanyagokat 48 óráig hagytam a

tenyészeteken +4ºC-on. A tenyészetek háromszori mosását követően biotinnal jelölt

anti-egér IgG vagy anti-nyúl IgG (1/1000, Vector) ellenanyagokkal inkubáltam 1 órán

keresztül, majd ezt követően sztreptavidin peroxidázzal (1/1000, Sigma) szintén 1 órán

47

át. Az immunjel további erősítéséhez biotinnal kapcsolt tyramidot (TSA Biotin System,

NEN) is használtam 1/100 higításban, majd az így megjelölt immunkomplexet

sztreptavidin-Cy3 (1/1000, Sigma) ill. avidin-FITC (1/500, Vector) segítségével tettem

láthatóvá. A festett tenyészeteket hordozó fedőlemezeket Mowiol 4.88-al

tárgylemezekre ragasztottam és az immunjelet BioRad konfokális lézer mikroszkóppal

valamint Zeiss Axiophot fluoreszcens mikroszkóppal vizsgáltam.

V. A TENYÉSZETEK SEJT- ILL. IDEGSEJT-TARTALMÁNAK

MEGHATÁROZÁSA

V./1 A tenyészetek sejtszámának meghatározása a tenyészetek életképességének

mérésével

A mérési módszer a sejtek anyagcsere-aktivitását határozza meg a redukáló

képesség mérése által. A sejteket 96 lyukú műanyag szövettenyésztő tálcán

növesztettem 100 µl tápfolyadékban. Az MTT (3–(4,5 Dimethylthiazol–2–yl)–

2,5diphenyltetrazólium–bromide, Sigma) reagens törzsoldatát (1.25 mg/ml) –20°C–on

tároltam. A sejttenyészetekhez 12.5 µg MTT reagenst adtam 60 µl tápfolyadékban

oldva. A sejtekben található NADH2 és NADPH2 a tetrazóliumsót kék színű

formazánkristállyá redukálja, így a sejtekben található kristályok mennyisége arányos

lesz a redukáló-kapacitással. A kék formazánkristályok megjelenése után 140 µl savas

izopropil–alkoholt (100 ml 2–propanol, 0.6 ml cc HCl) adtam a tenyészethez a

kristályok és a sejtek feloldása végett. 10 perc állás után optikai tisztaságig

szuszpendáltam az oldatot és ELISA készüléken kettős hullámhosszon lemértem

(referencia hullámhossz: 630 nm; mérési hullámhossz: 570 nm). A tenyészetekben mért

optikai denzitás adatok arányosnak mutatkoztak a tenyészetekben lévő élő sejtek

számával.

V./2 Idegsejtek számának meghatározása immuncitokémiával

Az egy fedőlemezen található összes idegsejtet sejtszámolással határoztam meg.

A neuronokat N-tubulin immunfestéssel azonosítottam (lásd korábban), majd 400x

nagyítás mellett látóterenként megszámoltam az idegsejtek számát.

48

Minden esetben három testvértenyészet adatait vettem fel (n=3) és kiszámítottam

a tenyészetekben átlagosan egy látótérre eső N-tubulin immunreaktív sejtek számát. Ezt

követően ezekből az átlagokból meghatároztam a három tenyészetben átlagosan egy

látótérre eső neuronok számát és kiszámítottam az ettől való eltéréseket is. A

szignifikanciát kettős T-teszt segítségével határoztam meg.

*: p<0.05; **: p<0.005

V./3 Idegsejtek mennyiségi meghatározása in situ ELISA módszerrel

A sejtek PLL-el bevont 96 lyukú műanyag szövettenyésztő tálcán nőttek

(Greiner). A fixálás és tritonozás az immuncitokémiai módszereknél leírtakkal

megegyezett. A fixált, permeabilizált sejteket N-tubulin specifikus ellenanyaggal

jelöltem (1:5000, egér IgG, monoklonális). Foszfát pufferes (PBS) mosások után anti-

egér IgG-HRPO (horse radish peroxidase, Sigma) ellenanyaggal inkubáltam a

tenyészeteket (1:10000 higítás, 1.5 óra), majd a peroxidáz szubsztrátjaként citrát

pufferben oldott (24 mM citromsav, 51 mM Na2HPO4 x 2H2O) orto-fenilén-diamint

(OPD, 2mg/ml; 10 µl cc H2O2 / 50ml puffer) használtam előre meghatározott ideig. Az

enzimreakciót 4.5 M kénsav oldatával állítottam le. A színreakciót ELISA fotométer

(SLT Labinstruments Company) segítségével detektáltam, melynek során a mérési

hullámhossz 492 nm, a referencia hullámhossz pedig 405 nm volt. A reakció

intenzitását a két hullámhosszon mért adszorpció különbsége adta (OD492 - OD402).

Az N-tubulin tartalmakat 9-9 párhuzamosan kezelt testvértenyészetben

határoztam meg minden egyes mérési időpontban ill. kezelési csoportban, és

kiszámoltam az egy tenyészetre átlagosan jellemző N-tubulin értéket és a hozzá tartozó

szórást is.

A szignifikanciát kettős T-teszt segítségével határoztam meg.

*: p<0.05; **: p<0.005

49

VI. SEJTEN BELÜLI SZABAD CA2+-SZINT MEGHATÁROZÁSA

MIKROFLUORIMETRIÁVAL

A vizsgálatokhoz felhasznált sejteket PLL-el bevont üveglemezen (22 mm

átmérő) növesztettem. A mérés előtt 1 µM Fura-2/AM-t (Molecular Probes, Eugene,

OR, USA) tartalmazó oldattal inkubáltam a sejteket 45 percig CO2-inkubátorban, Mg2+-

jelenletében (130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 10 mM glükóz és

10 mM HEPES; pH=7.4) vagy hiányában (140 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 2.6 mM CaCl2,

10 mM glükóz és 10 mM HEPES; pH=7.4). A mikrofluorimetriás vizsgálatok inverz

Nikon TDM Diaphot epifluoreszcens mikroszkóp fűthető tárgyasztalán történtek, 100x

objektív nagyítás mellett. A kalciumot kötött Fura-2 formát 340 nm, a kalciumot nem

kötő formát pedig 380 nm hullámhosszú fénnyel gerjesztettem. Az emittált fény

intenzitását 520 nm hullámhosszon detektáltam fotosokszorozó (D104 Microscope

Photometer, PTI, South Brunswick, NJ, USA) segítségével. Az intracelluláris Ca2+-

tartalom változásait a két intenzitás-érték hányadosából képzett arány (F1/F2) mutatta

meg (Felix program, Gryenkiewicz et al., 1985).

Az NMDA-t (Sigma; 100 µM), AMPA-t (Tocris; 100 µM), ω-conotoxin-

MVIIC-t (Tocris 1 µM) és nifedipint (Tocris; 1 µM) mikrokapilláris segítségével

nitrogéngáz túlnyomással a sejtek közvetlen környezetébe injektáltam, míg a D,L AP5-t

(Tocris; 500 µM), KCl-t (20 mM) és GYKI52466-t (100 µM, Tarnawa Istvántól kapta a

munkacsoport) közvetlenül a mérőoldatba higítottam. Az NMDA-hatásokat 10 µM

glicin, az AMPA-hatásokat 10 µM ciklotiazid jelenlétében mértem. A mérések során

kiválasztottam a tenyészetből egy-egy sejtet és a fotosokszorozó nyílását leszűkítettem a

kiválasztott sejt sejttestére. Ha a hatóanyagokat (D,L AP5 és GYKI52466) a

mérőoldatba adagoltam, az adott mérés befejeztével a tenyészetet nem használtam

tovább. A mikrokapilláris segítségével bejuttatott nifedipin és conotoxin esetében egy-

egy tenyészedényből három sejtet regisztráltam egymástól távol eső területekről, és

ezután a tenyészetet további mérésre nem használtam.

50

VII. AZ EXTRACELLULÁRIS GLUTAMÁT KONCENTRÁCIÓJÁNAK

FLUORIMETRIÁS MEGHATÁROZÁSA SEJTEK FOLYADÉK-

KÖRNYEZETÉBŐL

A méréseket a Semmelweis Egyetem Biokémiai Intézetében, Dr Tretter László

irányításával, Környei Zsuzsa segítségével végeztem. A tenyésztő-médium

glutaminsav-koncentrációjának meghatározásához három-három párhuzamosan kezelt

sejtkultúra felülúszóját használtam fel minden mérési időpontban. A tenyészetek

tápfolyadékából 650 µl mintát vettem és 1000 rpm mellett 10 percig centrifugáltam. A

sejtes törmeléktől mentesített felülúszókból 600 µl-t a mérésig -20 Co-on, lefagyasztva

tároltam. A mérés megkezdése előtt a felolvasztott mintákat szérummentes táppal

(MEM, 900 µl) dializált glutamát-dehidrogenáz enzimmel (40 µl GDH, 60 U/ml,

Sigma) és NADP+-al (30 µl, 1mM végkoncentráció, Reanal) 1570 µl -re egészítettem ki.

Az elegyet 20 percig sötétben inkubáltam, majd Perkin-Elmer LS-50

spektrofluoriméteren 350 nm hullámhosszú fénnyel történő gerjesztés mellett 460 nm-

en mértem a keletkezett NADPH fénykibocsátását. A fluoreszcencia-intezitás adatokból

a glutaminsav-tartalmat ismert koncentrációjú glutamát oldatokkal készített kalibrációs

sor alapján számoltam ki.

51

Primer

Pár Primer szekvencia Pozíció

(bp) Termék mérete (bp)

Forward 5´ctccttctgtggggccctcc3’ 1 GluR1 Reverse 5´cccaggatggcgttgaggcg3’

557-576 904-885 347 bp

Forward 5´cggcgtgtaatccttgactgc3’ 2 GluR2 Reverse 5´cctctgcttccgaagattgcg3’

815-835 1156-1136 341 bp

Forward 5´ccaggttctgaaacacctcc3’ 3 GluR4 Reverse 5´gtgtcattgcccagagtaggc3’

1023-1042 1387-1367 364 bp

Forward 5´gacaagagcatccacctgagcttcc3´ 4 GluRζ1 N1 Reverse 5´agcgtcgtcctcgcttgcagaaagg3´

481-505 777-753

297 bp (N1 nem tart.) 360 bp (N1 tart.)

Forward 5´tgtgtccctgtccatactcaag3´ 5 NR1 C1 Reverse 5´gtcgggctctgctctaccactc3´

2406-2427 2712-2693 307 bp

Forward 5´atgcccctgccaccctcacttttg3´ 6 NR1 C2, C1 Reverse 5´gcagctggccctcctccctctca3´

2501-2524 2881-2859

381bp (C1 and C2 tart.) 270bp (C2 tart.)

Forward 5´ggagaagggtactccagcgctgaac3´ 81-105 7 NR2A Reverse 5´agtctgtgaggagataaaatccagc3´ 360-335 280 bp

Forward 5´gcaagcttctgtcatgctcaacatc3´ 456-480 8 NR2B Reverse 5´gctctgcagcttcttcagctgattc3´ 675-651 220 bp

Forward 5´actccttggtgcttgggcagg3´ 811-831 9 NR2C Reverse 5´cagcacctgcagctgctgctc3´ 1231-1211 421 bp

Forward 5´cttggctcctccacagagcaacagc3´ 481-505 10 NR2D Reverse 5´cctcttctgccgcccggaaaacagg3´ 778-754 298 bp

Forward 5´tgatgacatcaagaaggtggtgaag3´ 805-829 11 GAPDH Reverse 5´tccttggaggccatgtaggccat3´ 1044-1022 240 bp

Forward 5’gctggaaggcatggaaggtttta3’ 438-461 12 embGAD Reverse 5’tgagccccatcaccgtagca3’ 662-682 244 bp

Forward 5’gatacttggtgtggcgtagccc3’ 85-107 13 GAD67 Reverse 5’acgggtgcaatttcatatgtgaacata3’ 633-660 575 bp

Forward 5’ggctctggcttttggtccttc3’ 13-32 14 GAD65 Reverse 5’tgccaattcccaattatactcttga3’ 426-450 438 bp

Forward 5’agctgagagggaaatcgtgc3’ 569-588 15 aktin Reverse 5’gatggaggggccggactcat3’ 1048-1067 498 bp

Forward 5’ccaagcccggagcctaacgc3’ 263-282 16 GluR6 Reverse 5’ccagccaccccaagagacag3’ 621-640 337 bp

Forward 5’cacggagccccccaagctgc3’ 410-429 17 KA1 Reverse 5’cagccgtcacttgccagttc3’ 777-786 348 bp

Forward 5’gcccagtggactgccctctc3’ 142-161 18 KA2 Reverse 5’ccactctggccttggctggg3’ 480-498 317 bp

2. táblázat

Az RT-PCR vizsgálatok során felhasznált primerek szekvenciája, elhelyezkedésük a

vonatkozó cDNS-n és az általuk közrefogott szakasz hossza.

52

Ellenanyag IgG típus Forrás Higítás Felhasználásanti-nesztin egér IgG Pharmingen 1/1000 IC anti-N-tubulin egér IgG P. Dráber 1/1000 IC, ELISA anti-MAP2 egér IgG Sigma 1/1000 IC anti-NFM egér IgG Sigma 1/500 IC anti-NFH egér IgG Sigma 1/500 IC anti-synapsin I egér IgG Chemicon 1/500 IC anti-GFAP egér IgG Sigma 1/1000 IC anti-NR1 egér IgG Pharmingen 1/500 IC anti-NR1 nyúl IgG Chemicon 0.5 µg/ml WB anti-NR1 K21322 nyúl IgG M Herkert 1/100 IC anti-NR1 egér IgG M. Watanabe 1 µg/ml WB anti-NR2A nyúl IgG Upstate Biotechnology 1 µg/ml WB anti-NR2A egér IgG M. Watanabe 1 µg/ml WB anti-NR2B egér IgG Transduction Laboratories 1 µg/ml WB anti-NR2B K83084 nyúl IgG M Herkert 1/500 IC anti-panGAD 6799 nyúl IgG Z. Katarova 1/1000 IC, WB anti-GAD25 8876 nyúl IgG G. Szabó 1/1000 IC, WB anti-GAD44 8877 nyúl IgG G. Szabó 1/100 IC anti GAD65 GAD6 egér IgG Hibridóma Bank 1/500 WB anti GAD65 N65 nyúl IgG M. Solimena 1/500 IC anti-GABA nyúl IgG Sigma 1/1000 IC 3. táblázat

Az immuncitokémiai (IC), in situ ELISA és Western blot (WB) vizsgálatok során felhasznált ellenanyagok specifikációja és az alkalmazott ellenanyag-higítások.

53

I. Az NE-7C2 sejtvonal jellemzése

I./1 Az p53 -/- NE-7C2 sejtvonal kromoszóma-készletének változása a sejtvonal

immortalizációja során

Az NE-7C2 neuroektodermális sejtvonal p53-hiányos (Livingstone et al., 1992),

transzgenikus, 9 napos egér embrió elő- és középagyhólyagból kiültetett primer

tenyészetből nyert 1-sejt eredetű klón (Schlett and Madarász, 1997). A primer idegi

tenyészetben a tenyésztés 4. hetében megjelenő proliferáló gócok izolálásával NE9

„master” sejttenyészet, majd a „master” tenyészetben kialakuló, neurális sejtadhéziós

(N-CAM) fehérjét expresszáló epiteloid sejtcsoportokból egy-sejt klónozássa E9

vonalakat állított elő Dr Madarász Emília. Ezekből másodlagos klónozással Dr Schlett

Katalin több sejtvonalat (NE-4C, NE-7C2) hozott létre. A sejtvonalak külső onkogént

nem hordoznak, spontán immortalizációjuk a funkcionális p53 fehérje hiányában

következett be. Mivel a p53 fehérje fontos szerepet játszik a genetikai állomány

integritásának megőrzésében, megvizsgáltuk a sejtek kromoszóma-állományának

feltételezett ingadozásait az NE-7C2 p53-/- sejtvonal folyamatos fenntartása során.

A tenyészeteket a növekedés log-fázisában kolcemiddel kezeltem (10-7 M) 1.5

órán keresztül. A kolcemid a magorsó fonalak épülését megakadályozva gátolja a

kromoszómák két utódsejtbe való szétvándorlását, így a mitózis gátlásával egyrészt

felszaporodnak a metafázisban lévő sejtek, másrészt a kondenzálódott kromoszómák a

sejtmembránon belül maradnak. A kolcemid kezelést követően a sejtek duzzasztásával

izoláltam és fellazítottam a sejtmagokat, majd a kiszabaduló kromoszómákat Giemsa-

festéssel tettem láthatóvá („Anyag és Módszer” fejezet). Az NE-7C2 sejtvonal

kromoszómaszám-változásait 60 passzázs, azaz kb. 300 sejtduplikációs ciklus során

követtem. A vizsgált passzázsokból 50-50 sejtben számoltam meg a kromoszómákat és

grafikusan ábrázoltam a kromoszómaszámok megoszlását a vizsgált sejtpopulációban

(7. ábra). Meghatároztam a kromoszómaszámok súlyozott átlagát is vizsgált

passzázsokban az “Anyag és Módszer” fejezetben leírtak alapján (8. ábra).

54

55

A p53-hiányos, 9 napos egér embrió agyhólyagjából kiültetett primer tenyészetből 3

átültetés után nyert (NE9m) „master” vonalban a sejtek nagy része az egérre jellemző

40-es kromoszómaszámmal rendelkezett (7. ábra). Megfigyelhető azonban, hogy a

sejtek egy kisebb hányada az eredeti kromoszómakészlet kétszeresének megfelelő

kromoszómaszámmal jellemezhető. Az NE9m tenyészetből klónozással nyert E9

tenyészetben jelentősen megnőtt a kétszeres kromoszómaszámú sejtek állománya és

igen kis százalékban hexaploid kromoszóma-állományú sejtek is kimutathatók voltak

(7. ábra). A primer tenyészetben megjelenő proliferáló sejtek többsége, amelyek a

sorozatos átültetések során elszaporodtak, tehát a kétszeres kromoszómaszámmal

rendelkeztek.

A sejtvonal fenntartása során a kromoszómaszám a korai passzázsokban (10p - 35p)

a 70-es érték körül ingadozott. Az első 35 passzázs alatt (150 sejtosztódás) a

kromoszómaszám a kezdeti 70-es értékről fokozatosan csökkent. A kromoszómaszám

súlyozott átlagának vizsgálata alapján megállapítottam, hogy a sejtek kromoszóma-

készlete a sejtosztódások számával nem lineárisan csökken, hanem egy adott érték, a 60

kromoszóma felé tart (8. ábra). A különböző passzázsokból nyert kromoszóma-

preparátumokban folyamatosan jelen voltak 3x kromoszómaszámmal rendelkező sejtek

is (7. ábra), bár csak kis százalékát adták a teljes populációnak.

A diploid egér kromoszómaszámtól eltérő genom-méretű sejtek elszaporodása

jól mutatja, hogy a p53 fehérje fontos szerepet játszik a genom stabilitásának

fenntartásában. Hiányában megnő a rendellenes kromoszómaszámú sejtek aránya. A

megfigyelés azt is jelzi, hogy bizonyos többlet kromoszómával rendelkező sejtek

szelektív előnnyel rendelkezhetnek társaikkal szemben. Hasonló

kromoszómaduplikációs és kromoszómavesztési tendenciát mutatott egy másik p53-/-

sejtvonal is (NE-4C; Varju P., 1997; szakdolgozat), ahol a duplikált

kromoszómakészlettel rendelkező sejtek a sejtvonal fenntartása során fokozatosan

elveszítették a kromoszómaállomány egy részét és a sejtek kromoszómakészlete a 60-s

érték körül stabilizálódott. Az NE-4C és NE-7C2 esetében a szelektív előnyt biztosító

kromoszómaszám 1.5 x haladta meg a normál sejtek kromoszómaszámát (n=40).

A kromoszóma-készlet vizsgálata tehát megmutatta, hogy a sejtek kromoszóma-

készlete a p53 fehérje hiányában a „normálistól” eltérő értéket mutat, amely azonban

stabilizálódik a sejtvonal fenntartása során.

56

57

I./2 Az NE-7C2 sejtvonal progenitor sajátságainak meghatározása

Az NE-7C2 sejtvonal sejtjei 10% FCS-t tartalmazó tápoldatban epitél jellegű

sejtek monolayer tenyészeteként nőnek (9. A ábra). Növekedésük letapadásfüggő,

szaporodásuk mértéke a sejtszám növekedésével csökken (kontakt gátlás

mechanizmusa). A folytonosan osztódó sejtek a neurális progenitorok jellegzetes

marker fehérjéjét, az intermedier filamentum fehérjék családjába tartozó nesztint

expresszálják (9. B ábra). A sejtvonal sejtjei nagy sejtsűrűség mellett, kis gyakorisággal

spontán is képesek idegsejtté differenciálódni (kb. 1000 sejtből 1). A spontán

differenciálódott sejtek kisméretű sejttesttel és általában egy, el nem ágazó nyúlvánnyal

jellemezhetők (9. C ábra).

Asztroglia irányú sejtdifferenciációt indukálatlan tenyészetekben nem

tapasztaltunk.

A neurális progenitorsejtek idegi irányú differenciációját növekedési faktorok és

vitamin-származákok egyaránt elősegíthetik. Korábbi kutatási eredmények azt mutatták,

hogy a PCC7 (Pfeiffer et al., 1981; Imrik and Madarász, 1991), P19 (Jones-Villeneuve

et al., 1982) és NTera-2 (Damjanov et al., 1984) embrionális teratokarcinóma

sejtvonalak retinsav adására idegi irányban differenciálódnak. A laboratóriumunkban

már korábban jellemzett p53-/- sejtvonal, az NE-4C, ATRA hatására szintén

nagymértékű neuronális differenciációt mutatott (Schlett and Madarász, 1997). Az

irodalmi adatok és saját eredményeink alapján az NE-7C2 sejtvonalon a növekedési

faktorok közül az NGF, EGF, IGF-1 valamint az A-vitamin származék ATRA

neuronális differenciációt indukáló hatását vizsgáltam meg. A növekedési faktorok (1-

20 ng/ml) és az ATRA alkalmazott koncentrációit irodalmi adatok és saját

eredményeink alapján állapítottam meg. A neuronális differenciáció során az idegi

irányban elkötelezett sejteket N-tubulin tartalmuk alapján immuncitokémiával

azonosítottam és mennyiségüket in situ ELISA módszerrel határoztam meg a kezelések

7. napján. Az NE-7C2 sejtvonal sejtjeit a vizsgált növekedési faktorok nem késztették

idegi irányú differenciálódásra. ATRA 10-8 – 5x10-6 M koncentrációja növekvő mértékű

neuronális differenciációt indukált (10. ábra). A legmagasabb koncentráció esetében a

sejtek mintegy 50%-a idegsejtté fejlődött. Az NE-7C2 sejteket a továbbiakban 10-6 M

végkoncentrációjú retinsavval indukáltam, mivel ez a

58

59

koncentráció már igen jelentős differenciációt váltott ki, de még nem járt jelentős

mértékű sejtpusztulással.

ATRA 10-6 M koncentrációjának hatására az NE-7C2 sejtek jól meghatározott,

reprodukálható lépéseken keresztül differenciálódnak morfológiailag fejlett

idegsejtekké. Az első N-tubulin immunreaktív idegsejtek az ATRA-indukció 2. napján

jelennek meg a differenciálatlan sejtek tetején, általában csepp alakú sejttesttel és egy

rövid nyúlvánnyal jellemezhetők (11. A ábra). Az indukció 4. napjára a neuronok száma

jelentősen megemelkedik, a nyúlványok száma megnő és elágazásokat alakítanak ki

(11. B ábra). Az indukció 6. napjára a neuronális sejttestek kompakt aggregátumokba

tömörülnek és a nyúlványok kötegelődve hagyják el az aggregátumok területét (11. C

ábra). Az indukció 10. napjára szinte minden neuronális sejttest aggregátumba ágyazott

és közöttük a kapcsolatot nyúlványkötegek biztosítják (11. D ábra).

A neuronális differenciáció során jellegzetes módon változik a köztes

filamentum rendszer is. Az in vivo csak neuronokra jellemző neurofilamentum fehérjék

közül az NFL és NFM (12. A ábra) formákat sikerült kimutatnom az indukció 4.

napjától kezdve. Az immunpozitív sejtek száma fokozatosan nőtt a neuronális fejlődés

előrehaladtával. Az NFH jelenlétét csak az indukció második hetében tudtam detektálni

(12. B ábra) a sejttestekben és a nyúlványokban, illetve a nyúlványok növekedési

kúpjaiban (12. B ábra inszert). A köztes filamentum rendszer mellett a mikrotubuláris-

rendszer összetétele is változott a neuronális differenciáció során. Az N-tubulin, amely a

progenitorok utolsó osztódása után már jelen van, a posztmitótikus neuronok teljes

élettartama során kimutatható (11. ábra). A mikrotubulus-asszociált fehérjék közül a

Map2, melyet in vivo főleg dendritekben és sejttestekben sikerült kimutatni, az NE-7C2

sejtek indukciójának 6. napjától detektálható (12. C ábra).

Az indukció 8. napjától a morfológiailag fejlett neuronok teljes citoplazmájában

kimutatható a szinapszin-I (12. D ábra) és a szinaptofizin (12. E ábra), a preszinapszisok

működésében fontos fehérjék. Jelenlétük arra utal, hogy a sejtek közötti szinaptikus

kommunikáció kialakításában szerepet játszó komponensek szintézise is megindul a

tenyészetekben.

60

Az ATRA-indukció során megjelenik az idegszövet másik jellemző sejttípusa,

az asztroglia is (12. F ábra). Az első asztroglia típusú sejtek az indukció 10. napjától

61

62

azonosíthatók GFAP tartalmuk alapján. Számuk folyamatosan nő az indukció

előrehaladtával. Az asztrogliasejtek nem egyenletes eloszlásban jelentkeznek a

tenyészetekben, hanem szigetszerű kis csoportokban helyezkednek el. A GFAP

immunpozitív sejtek a neuronális gócok belsejében mutathatók ki először, majd

megjelennek az idegsejt-aggregátumok körül is. A megfigyelés arra utal, hogy az

asztroglia irányú differenciációhoz neuronok által szekretált faktorok jelenlétére lehet

szükség.

Immuncitokémiai módszerekkel az oligodendroglia sejtek által expresszált

fehérjék közül sem a galaktocerebrozid, sem a mielin bázikus fehérje jelenlétét nem

sikerült kimutatni hosszú – 10-30 napos – indukció során sem. Annak igazolására, hogy

az oligodendroglia sejtek valóban nem jelennek meg az NE-7C2 sejtek ATRA-

indukciója során, mindkét ellenanyaggal párhuzamosan festettünk primer gliális

tenyészeteket is, ahol pozitívan festődő oligodendroglia sejteket sikerült azonosítani.

Korábbi tanulmányok a P19 sejtvonalon igazolták, hogy retinsav meghatározott

koncentrációja mellet izomsejtek fejlődése indukálható (Manabe and Owens, 2001).

ATRA különböző koncentrációi mellett megvizsgáltam simaizom-specifikus α-actin

jelenlétét a tenyészetekben immuncitokémiai módszerrel. Sem morfológiai, sem

immuncitokémiai evidenciát nem találtam simaizom-sejtek differenciálódására a

tenyészetekben.

Az NE-7C2 sejtek in vitro indukált neurogenezise jól reprodukálja az in vivo

megfigyelt idegi sejtdifferenciálódás morfológiai jelenségeit. A továbbiakban a

tenyészetben lejátszódó idegsejt-képzést modellként használtam az idegi

sejtdifferenciáció során bekövetkező változások tanulmányozására és a biokémiai /

molekuláris biológiai jelenségek és sejtmorfológiai változások közötti korreláció

megállapítására.

63

II. Ionotrop glutamát receptorok szabályozott időbeli megjelenése az in vitro

neurogenezis során

II./1 NMDA-vezérelt glutamát receptorok kimutatása NE-7C2 sejtek indukált neurogenezise során

II./1.1 NMDA receptor alegységek expressziója NE-7C2 sejtekben

NE-7C2 sejtek neuronális differenciációja során vizsgáltuk az NMDA-vezérelt

ioncsatorna alegységeinek expresszióját. A Stuttgarti Egyetem Sejt és Immunbiológiai

Tanszékével kollaborációban Dr Schlett Katalin szemikvantitatív RT-PCR vizsgálatokat

végezett el az általam küldött RNS-mintákból.. A polimeráz láncreakciókban felhasznált

primereket a 2. táblázat tartalmazza. Vizsgáltuk az NR1 alegység különböző splice-

variánsainak (ábra) valamint az NR2A, NR2B, NR2C és NR2D alegységek

megjelenését és a transzkripció változásait az indukált neurogenezis során. A

transzkriptumok relatív expressziós szintjének meghatározásához belső viszonyítási

alapként a GAPDH (glicerin-aldehid-3-foszfát dehidrogenáz) mRNS 30 cikluson

keresztül amplifikált mennyisége szolgált.

Az NR1 alegység három olyan kazettát tartalmaz (N1, C1 és C2), amelynek a

kódoló exonjai az mRNS érése során kivágódhatnak a transzkriptumból (13. ábra). Ez a

folyamat az alternatív exon-használat, melynek eredményeként egy génről többféle

funkcionális fehérje keletkezhet. Hogy meghatározható legyen, hogy az NR1 alegység

mely variánsainak mRNS-e van jelen, a stuttgarti intézetben három primer párt (2.

táblázat; 4., 5. és 6. primer párok) terveztek a transzkriptum 5’ ill. 3’ végeire. A 4-es

primer pár az N1 kazettát (5. exon) határoló szekvenciát ismeri fel (13. ábra). Abban az

esetben, ha az exon bennmarad az érett mRNS-ben, egy 360 bp hosszúságú terméket

kapunk a PCR reakció eredményeként, ha azonban kivágódik, a termék mérete 297 bp

lesz. Az 5. primer pár (13. ábra) „sense” tagja a C1 kazettát (21. exon) határoló

szakaszra specifikus, míg „antisense” tagja a C1 kazettán belüli szekvenciát köti meg.

Így csak akkor keletkezik termék, ha a 21. exon bennmarad az érett mRNS-ben. A 6.

primer pár (2. táblázat, 13. ábra) egyik tagja a 21. exon 5’ határoló régióját ismeri fel, a

másik tagja a C2 kazettára (22. exon) specifikus. Amennyiben a 21. és a 22. exon is

bekerül az érett mRNS-be, a termék mérete 381 bp lesz. Ha az érett mRNS csak a 22.

exont tartalmazza,

64

65

270 bp hosszúságú terméket fogunk kapni. Abban az esetben, ha a 22. exont kivágódik

az RNS-ből, PCR termék nem keletkezik. A 22. exont kivágódása során az exon végén

található STOP szignál is kivágódik, így a transzláció során a riboszóma továbbhalad és

átírja a C2’ szekvenciát, amelynek a végén egy újabb STOP szignál helyezkedik el. Az

NR1 variánsok megnevezését Hollmann által megalapított nevezéktan (Hollmann et al.,

1993) alapján használom a dolgozat során (1. táblázat).

Az NR2A, B, C és D alegységek génjeiről csak egyfajta kódoló mRNS

keletkezik, így a 7-10. primer párok esetében egyfajta PCR termék szaporodik fel.

Az indukálatlan sejtek sokféle NR1 variánst expresszáltak. A transzkriptumok

jelentős része tartalmazta mind a C1, mind a C2 kazettát, de az N1 kazettát nem (14.

ábra, NR1-1a splice-forma). A csak C1-t vagy csak C2-t tartalmazó mRNS-ek szintén

expresszálódtak, de lényegesen alacsonyabb szinten (14. ábra, NR1-2a, -3a variánsok).

ATRA-indukálta neurogenezis során fokozatosan emelkedett az NR1 transzkriptum

összmennyisége, és az indukció 7. napjától N1 kazettát is tartalmazó mRNS formákat is

sikerült kimutatni (14. ábra, NR1-b variánsok). Az indukció korai szakaszában (0-4

napig) az NE-7C2 sejtek főleg olyan NR1 mRNS-t expresszáltak, amely tartalmazta

mind a C1, mind a C2 doméneket. Az indukció előrehaladtával megemelkedett azoknak

az mRNS-eknek a mennyisége is, amelyek csak az egyik - vagy a C1 vagy a C2 - exon

kazettát tartalmazták. A morfológiailag jól fejlett idegsejtek (indukció 10. napja)

minden NR1 splice-variánst expresszáltak.

Az NR2 alegységek közül az NR2A és NR2D alegységek transzkriptumait már

indukálatlan NE-7C2 sejtek is expresszálták. E két transzkriptum mennyisége a

neuronális differenciáció során az alapszinthez képest nem változott nagymértékben. Az

NR2B alegységet kódoló mRNS szinte alig volt detektálható az indukálatlan mintában

és az indukció korai szakaszában (0-4. napig, 14. ábra). Az indukció második hetében a

transzkriptum mennyisége nagymértékben nőtt (14. ábra). Az NR2C alegység nem volt

kimutatható sem a proliferáló, sem a neuronális irányban differenciálódó sejtek

tenyészeteiből (14. ábra).

66

67

Az mRNS-vizsgálatok azt mutatták, hogy az NE-7C2 in vitro neurogenezis során

elsősorban az NR1 mennyisége és variánsainak száma, valamint az NR2B

transzkriptum mennyisége nő.

II./1.2 NMDA receptor alegységek fehérjeformáinak kimutatása Western blot és immuncitokémia segítségével

Hogy meghatározzam, hogy az indukció egyes szakaszaiban mely alegységek

fehérjeformái fordítódnak le, továbbá hogy képet kapjak az egyes fehérjeformák sejten

belüli elhelyezkedéséről, szubcelluláris frakciókat (durva-membrán és citoplazma

preparátumokat) készítettem és azokban Western blot segítségével mutattam ki a

vizsgált NMDA receptor alegység fehérjeformákat.

Az NR1 alegység különböző variánsainak kimutatására kétféle ellenanyagot

használtam: pan-NR1 (Watanabe et al., 1998, 15. ábra) amely a fehérje N-terminálisán

elhelyezkedő, minden splice variánsban megtalálható 4. – 51. aminosavakat ismeri fel;

C2-NR1 (Chemicon) amely a C2 kazetta aminosav szekvenciájára specifikus (891. –

920. aminosavak, 15. ábra). Pozitív kontrollként felnőtt egér előagyból (EA) készített

homogenátumot vittem fel a gélekre.

A pan-NR1 ellenanyag a citoplazma és durva-membrán frakciókban egy 116 kD

méretű sávot festett mind az indukált, mind az indukálatlan mintákban (15. ábra). A

durva-membrán frakcióban egy kisebb molekulatömegű csík is azonosítható volt, mely

az előagyi mintában szintén festődött. A kettős csík arra utal, hogy legalább kétféle NR1

splice-forma van jelen NE-7C2 sejtekben, de nem kizárható a fehérje degradációja sem.

A C2-NR1 ellenanyag segítségével C2 kazettát tartalmazó fehérjeformát sikerült

kimutatni a citoplazma frakciókból az indukció minden stádiumában, és az indukálatlan

tenyészetek citoplazma és durva-membrán frakcióiban is (15. ábra). A citoplazma

frakcióban a fehérje mennyisége az indukció előrehaladtával csökkent.

Az NR2B alegységet a C-terminális 892. – 1051. aminosav-szekvenciát

felismerő ellenanyaggal (BD Transduction Laboratories) csak az indukció 10. napján

sikerült kimutatnom, akkor is csak a durva-membrán frakcióból (15. ábra). A fehérje kb.

180 kD-

68

69

nak megfelelő csíkot adott, ami az egér agyban megállapított 175 kD molekulatömeggel

jó egyezést mutat.

Az NR2A alegységet két, a fehérje C-terminális részére specifikus ellenanyag

(Upstate Biotechnology, Watanabe NR2A-C, Watanabe et al., 1998) segítségével is

megpróbáltam kimutatni. Mivel az Upstate Biotechnology által gyártott ellenanyag

érzékenyebbnek bizonyult, az ábrákon az ezzel kapott eredmények szerepelnek. Annak

ellenére, hogy a kódoló RNS jelentős mennyiségben expresszálódott (14. ábra), az

NR2A alegység fehérjét 10 µg fehérjemennyiségből - ami többi alegység kimutatására

elegendő volt – nem sikerült megbízhatóan kimutatnom (15. ábra) egyik ellenanyaggal

sem. Az előagyi mintából ugyanakkor az ellenanyagok egy 170 kD molekulatömegű

fehérjét festettek meg, amely megfelel a már korábban megállapított

molekulatömegnek. 60 µg fehérje futtatása után mindkét ellenanyag két csíkot festett

(15. ábra) a citoplazmás frakciók mindegyikében. A durva-membrán frakcióban az

indukció 6. és 10. napján két halványan festődő csík jelent meg, melyek valamivel

kisebb molekulatömegűek voltak, mint az előagyból kimutatott fehérje. Az eredmények

arra utalnak, hogy a fehérje degradálódik, vagy éretlen, poszttranszlációs

módosításoktól mentes formában van jelen NE-7C2 sejtekben.

Az NR2C alegységet kódoló mRNS-t nem tudtam kimutatni, így erre a fehérjére

Western blot analízist sem végeztem. Az NR2D alegységre specifikus ellenanyag a

kísérletek elvégzése idején nem volt kereskedelmi forgalomban, ezért ezt az alegységet

fehérjeszinten nem tudtam vizsgálni.

A Western blot analízist követően az NMDA receptor alegységek sejten belüli

eloszlását immuncitokémiai festéssel próbáltam meghatározni. Az NR1 alegység

sejtszintű lokalizációjának kimutatására egy poliklonális (K21322, Herkert et al., 1998)

és egy monoklonális (660. – 811. aminosav-szekvencia; Pharmingen) ellenanyagot

használtam. Mindkét ellenanyag a fehérje összes variánsát felismeri és a fehérje

extracellulárisan elhelyezkedő részleteire - az első TM domént megelőző szakasz ill. a

III. és IV TM domén közötti extracelluláris hurok régió - specifikus. Amennyiben a

sejtek membránját átjárhatóvá tettem TritonX-100-al, a sejten belül elhelyezkedő NR1

fehérjét is láthatóvá tudtam tenni. Ha a sejteket nem permeabilizáltam, akkor elsősorban

a

70

71

membránba kihorgonyzott receptor alegységek festődtek. Mindkét ellenanyag ugyanazt

a festődési mintázatot mutatta, de a festés erősebb volt a K21322 szérummal. A 16.

ábrán (A, B és C) a K21322 ellenanyaggal festett sejtek felvételei szerepelnek. Annak

ellenére, hogy Western blot segítségével a fehérje kimutatható volt már az indukálatlan

tenyészetekben ill. az indukció korai szakaszában is, indukálatlan tenyészetekben nem

sikerült specifikus festést bizonyítanom sem sejten belül, sem a sejtek felszínén. Az

első. háttérből kiváló - festődő idegsejtek az indukció 5. napján jelentek meg és számuk

folyamatosan nőtt az indukció előrehaladtával. Az ATRA-kezelés 8. napjától szinte

minden nyúlványos sejt festődött a nem-permeabilizált tenyészetekben (16. A, B ábra).

A festődés igen erős volt a sejttesten és a nyúlványok proximális régiójában (16. B

ábra). Ezekben a tenyészetekben az aljzatsejtek nem festődtek. Ha a tenyészeteket

permeabilizáltam, a neuronok mellett egyes kiterült, lapos aljzatsejtekben is erős

festődés jelentkezett (16. C ábra). A festődés mintázata alapján arra következtettünk,

hogy a fehérje intracelluláris vezikulákban található.

Az NR2A alegység a Western blot kísérletek alapján igen alacsony szinten van

jelen. A rendelkezésemre álló kétféle ellenanyag a fehérje C-terminális, intracellulárisan

elhelyezkedő régiójára specifikus, így a festéseket permeabilizált tenyészeteken

végeztem el. Háttér feletti festődést egyik ellenanyaggal sem kaptam (ábra nem szerepel

róla).

Az NR2B fehérjét olyan poliklonális szérummal (K83084, Herkert et al., 1998)

tettem láthatóvá, mely a fehérje extracellulárisan elhelyezkedő N-terminális 439. – 453.

aminosavaira specifikus. Immunjelölt sejteket az indukció 8. napjától sikerült

azonosítani (16. D ábra). A festődés igen erős volt a sejtmag körül ill. a nyúlványok

kezdeti szakaszain (16. E ábra).

Az NR2D alegységre specifikus ellenanyag nem állt rendelkezésünkre a

kísérletek elvégzése idején, így a fehérje sejten belüli lokalizációját nem vizsgáltam.

II./1.3 Funkcionális NMDA-csatornák megjelenése NE-7C2 sejtek indukált

neurogenezise során

A funkcionális NMDA-csatornák megjelenését NE-7C2 sejtek

plazmamembránjában az NMDA hatására bekövetkező [Ca2+]IC változásainak

72

73

detektálásával követtem nyomon Fura-2 mikrofluorimetriával. A sejtmembránon

átdiffundáló Fura2/AM Ca2+-indikátort az intracelluláris észteráz enzimek membrán-

impermeábilis formává alakítják át, így a töltési idő elteltével az inkubáló-médiumban

maradt felesleges festéket eltávolítva (3x mosás pufferrel) kizárólag a sejten belül

csapdába esett Fura-2 fluoreszcenciáját mérjük. Az [Ca2+]IC változásait úgy számoltam

ki, hogy az NMDA adása előtti szintet 100%-nak vettem és megállapítottam, hogy

NMDA hatására hány százalékkal emelkedett meg az [Ca2+]IC az alapszinthez

viszonyítva. Az NMDA alkalmazott koncentrációját dózishatás görbe (17. ábra) alapján

állapítottam meg.

Indukálatlan tenyészetek sejtjeiben 100 µm NMDA hatására az [Ca2+]IC nem

változott (18. A ábra). Az indukció korai szakaszában (3. nap) a sejtek szintén nem

adtak NMDA-indukálta Ca2+-választ (18. A ábra). A neurogenezis első hetének végére

jelentek meg az első olyan sejtek, melyek NMDA adására az [Ca2+]IC megemelésével

válaszoltak (18. A ábra). Az NMDA-reszponzív sejtek neuronális morfológiával

rendelkeztek, az aljzaton elhelyezkedő nem-neurális sejtek NMDA-specifikus Ca2+-

szint emelkedést nem mutattak. Az indukció 6 - 8 napja között a nyúlványos sejtek

közül kevés válaszolt NMDA adására, az indukció 10. napjától kezdve azonban minden

neuronális morfológiájú sejt szignifikáns [Ca2+]IC emelkedéssel válaszolt NMDA-ra (18.

A ábra). Ha a sejteket az NMDA-receptorok kompetitív antagonistájával inkubáltam

(DL AP5), az NMDA kiváltotta [Ca2+]IC-szint emelkedés elmaradt (18. B ábra).

Az NMDA-kiváltotta választ nagymértékben meghatározza a mérőoldat

összetétele (Monyer et al., 1994; Mayer, 1998). 2 mM extracelluláris Mg2+ jelenlétében

a neuronok csak 20 mM KCl jelenlétében mutattak NMDA-specifikus [Ca2+]IC

emelkedést (19. A ábra). 20 mM KCl önmagában kismértékben megemelte a sejtek

nyugalmi Ca-szintjét, de a jellegzetes Ca-csúcs elmaradt. Mg2+-mentes közegben

viszont az NMDA képes volt kiváltani a [Ca2+]IC-szint megemelkedését depolarizáció

nélkül is (19. B ábra). Az ábrákon az NMDA-kiváltotta válaszokat a Ca++-kötött és

szabad Fura-2 arányaként adtam meg és a tényleges Ca++-koncentráció változásokat

nem számoltam ki.

Az [Ca2+]IC emelkedéséért az NMDA receptorok aktiválása mellett a VDCC

csatornák is felelősek lehetnek. Az NMDA-csatornákon beáramló Ca2+-ionok a

sejtmembrán depolarizációját okozhatják, amely aktiválhatja a sejtmembránban

74

75

76

elhelyezkedő VDCC-kat. Depolarizációt előidézhetünk mesterségesen is, az

extracelluláris K+ koncentráció megemelésével. Egy testvér sejtvonalon (NE-4C)

végzett elektrofiziológiai mérések (Herberth et al., 2002) megmutatták, hogy 30 mM

KCl jelenlétében az indukálatlan sejtek membránpotenciálja a Nerst egyenletnek

megfelelően változik. Indukálatlan tenyészetben az NE-7C2 sejtek 30 mM KCl adására

nem mutattak [Ca2+]IC emelkedést (20. A ábra). Az indukció során a differenciálódó

neuronok az indukció 7. napjától már válaszoltak KCl-ra, majd az indukció második

hetének végére jelentős [Ca2+]IC változással reagáltak a KCl adásra (20. B ábra). A

VDCC egyik típusa, az L-típusú Ca2+-csatorna (Catteral and Striessnig, 1992)

nifedipinnel, míg a főleg neuronális típusú N-, P- és Q-csatornák ω-conotoxin MVIIC-

vel blokkolhatók (Sather et al., 1993). Hogy megállapíthassam, hogy az NMDA-

kiváltotta [Ca2+]IC növekedést mennyiben okozhatta a különböző VDCC-k aktivációja,

az NMDA kiváltotta sejtválaszokat nifedipin és ω-conotoxin - irodalmi adatok alapján

meghatározott koncentrációinak – jelenlétében is mértem. Az ábrákon a Ca2+-beáramlás

mértékét a Ca2+-kötött és szabad Fura-2 emissziós hányadosaként adtam meg (F1/F2). A

nifedipin hatását 12 napig indukált NE-7C2 neuronokon vizsgáltam, a görbe 8 neuron

válaszának átlagát mutatja nifedipin jelenlétében és hiányában, Mg2+-mentes közegben.

Az NMDA kiváltotta [Ca2+]IC-szint emelkedést a nifedipin (1 µM) kb. 40%-al

csökkentette (21. A ábra). Az ω-conotoxin (1 µM) ennél kisebb mértékű, kb. 10%-os

csökkenést okozott az NMDA-kiváltotta Ca2+-válaszokban (21. B ábra). Ebből arra

következtettem, hogy az NMDA-csatornán át beáramló Ca2+-ionok mellett a

depolarizáció által aktivált VDCC-kon át beáramló Ca2+-ionok tovább emelik az

[Ca2+]IC szintet.

77

78

II./2 AMPA receptorok kimutatása NE-7C2 sejtekben és szerepük a

neuronális differenciáció korai szakaszában

II./2.1 AMPA receptor alegységek expressziós mintázata NE-7C2 sejtek

idegi irányú differenciációja során

Az AMPA receptor alegységek expresszióját - a Stuttgarti Egyetem Sejt és

Immunbiológiai Tanszékével végzett kollaborációs munka keretében Dr Schlett

Katalinnal, szemikvantitatív RT-PCR módszer segítségével vizsgáltuk az NE-7C2

sejtek in vitro indukált neurogenezise során. Az AMPA-típusú ionotróp glutamát

receptorok 4 alegységét kódoló gének (GluR1-4) közül a kísérletek végzése idején

három egér gén (GluR1, 2 és 4) szekvenciája volt ismert (NM_008165, NM_013540,

NM_019691). Az adatok hiányában a GluR3 alegység expresszióját nem tudtuk

vizsgálni.

Indukálatlan tenyészetekben (K) a három vizsgált alegység közül csak a GluR4

alegység expresszálódott (22. ábra). Az alegység mRNS szintje gyakorlatilag

változatlan maradt a retinsav- indukció teljes időtartama alatt, csak az indukció 10.

napján látszott kismértékű emelkedés a transzkriptum mennyiségében (22. ábra). A

GluR2 alegység transzkriptum az indukció 3. napjától volt detektálható és az mRNS

szintje folyamatosan emelkedett az indukció előrehaladtával (22. ábra). A GluR1

alegység az indukció 2.-4. napján igen alacsony szinten expresszálódott, az indukció

előrehaladtával azonban a transzkriptum mennyisége nagymértékben emelkedett és az

indukció 7. napjától már jelentős mennyiséget ért el (22. ábra).

II./2.2 Funkcionális AMPA-csatornák kimutatása NE-7C2 sejtek fejlődési

stádiumaiban

A funkcionális AMPA-csatornák jelenlétét NE-7C2 sejtek sejtfelszíni

membránjában az intracelluláris Ca2+-szint AMPA hatására bekövetkező változásának

detektálásával követtem nyomon Fura-2 mikrofluorimetriával. Az AMPA receptorok

Ca-permeabilitását a receptorok alegység-összetétele szabályozza. A GluR1, 3 és 4

79

80

alegységekből felépülő AMPA-csatornák nagymértékű Ca2+ ion áteresztő-képességgel

jellemezhetők (Bleakman and Lodge, 1998), míg a GluR2 alegység editált formájának

beépülése eltolja a receptor szelektivitását az egyértékű kationok irányába (Bleakman

and Lodge, 1998). Amennyiben a receptorok elveszítik Ca2+ -permeabilitásukat, az

81

[Ca2+]IC szintet a VDCC-k aktivációja emelheti meg, melyet az AMPA receptorokon

beáramló kationok által létrehozott membrán-depolarizáció aktivál. Ha azonban a sejtek

VDCC-ái nem aktiválódnak és csak Ca-impermeábilis AMPA receptorok találhatók

bennük, akkor ezzel a módszerrel nem tudjuk kimutatni a funkcionális AMPA

receptorokat. Mivel az AMPA-receptorok igen gyorsan deszenzitizálódnak, a méréseket

mindig 10 µM ciklotiazid (az AMPA receptor deszenzitizációját gátló szer; Bleakman

and Lodge, 1998) jelenlétében mértem. A mérések során a receptor agonistájaként

AMPA-t használtam, amely a kainát receptoroknak csak nagyon gyenge agonistája

(Bleakman and Lodge, 1998). Az AMPA és ciklotiazid alkalmazott koncentrációját

irodalmi adatok alapján állapítottam meg. A válaszok AMPA-specifikus voltát az

AMPA receptorok specifikus gátlószerének adagolásával igazoltam (23. B ábra).

Indukálatlan sejteken végzett mikrofluorimetriával az elkötelezetlen

progenitorsejtek kb. 40%-ában szignifikáns mértékű [Ca2+]IC emelkedést tapasztaltam

100 µM AMPA hatására (23. A ábra). A többi – látszólag azonos - sejtben nem láttam

ilyen irányú változást. Indukálatlan NE-7C2 sejtek a vizsgált AMPA-receptor

alegységek közül a GluR4-t expresszálták, mely homomer - egyféle alegységtípusból

felépülő - csatornák kialakítására is képes. Indukálatlan sejtekben tehát az AMPA

hatására bekövetkező [Ca2+]IC emelkedéséért a homomer GluR4 csatornák lehetnek a

felelősek. Mivel depolarizáló KCl hatására a sejtekben nem volt mérhető [Ca2+]IC-szint

emelkedés (20. A ábra), a VDCC-k szerepe a [Ca2+]IC-szint emelkedésben

elhanyagolható lehet.

Az indukció 8-10. napjain végzett mikrofluorimetriás mérések azt mutatták,

hogy nem minden neuronális morfológiájú sejtben emelkedik meg az [Ca2+]IC AMPA

hatására (23. A ábra), a nyúlványos sejtek egy jelentős részében az [Ca2+]IC nem

változott az alapszinthez képest. Az indukció előrehaladtával a GluR2 alegység

beépülése a receptorba a Ca2+-permeabilitás elvesztését jelentheti (ha az alegység

editálódik) és ebben az esetben az [Ca2+]IC emelkedésének forrása csak a VDCC-on át

beáramló Ca2+ ion lehet. Mivel a kísérletek végzése idején a laboratórium még nem

rendelkezett a VDCC-ra specifikus drogokkal, így az AMPA hatására bekövetkező

[Ca2+]IC emelkedést nem mértem a VDCC blokkolók jelenlétében. Mivel azonban a

fejlett NE-7C2 neuronokban az NMDA-kiváltotta [Ca2+]IC emelkedésének egy jelentős

részét a VDCC-on keresztül beáramló Ca2+ ionok okozták (21. ábra), ill. KCl hatására is

82

[Ca2+]IC-szint emelkedés volt mérhető indukált sejtekebn (20. B ábra), feltételezhetjük,

hogy az AMPA-indukálta Ca2+-válaszban szintén szerepet játszanak a VDCC-k

csatornák. További vizsgálatokkal kell eldönteni a VDCC-k és a GluR2 alegység

jelentőségét az AMPA-kiváltott [Ca2+]IC emelkedésben NE-7C2 sejtekben.

Az AMPA és ciklotiazid jelenlétében mért [Ca2+]IC-szint emelkedést az AMPA-

receptor nem-kompetitív gátlószerének jelenlétében is megvizsgáltam. A GYKI52466

irodalmi adatok alapján hasonlóan hatásos mind a 4-féle AMPA receptor alegységen.

GYKI52466-al 5 percig előinkubáltam a tenyészeteket, majd az AMPA-reszponzív

sejteken a GYKI52466 jelenlétében mért [Ca2+]IC-szint emelkedést a gátlószer adása

előtt mért [Ca2+]IC-szint emelkedéshez viszonyítottam (23. B ábra). Az ábrán szerepelő

reprezentatív eredmény azt mutatja, hogy a GYKI52466 nem tudta teljes mértékben

kivédeni az AMPA adására bekövetkező [Ca2+]IC-szint emelkedést. A GYKI52466

jelenlétében is fennmaradó Ca-szint emelkedést az esetlegesen expresszálódó kainát

receptorok* adhatják, amelyeket az AMPA magas koncentrációja aktiválhat.

*A kainát receptorok ötféle alegység homo- és heteromer kombinációiból épülhetnek fel. A GluR5-7

alegységek homo- és heteromer, míg a KA1 és KA2 alegységek csak heteromer kombinációban alkotnak

funkcionális receptort. Az kainát receptor alegységek közül specifikus oligonukleotid primerekkel Dr

Schlett Katalin vizsgálta a GluR6, KA1 és KA2 alegységek expressziós változásait az in vitro

neurogenezis során. Indukálatlan tenyészetekben a GluR6 és KA2 alegységek mRNS formái igen magas

szinten expresszálódtak és szintjük az indukció időtartama alatt nem növekedett tovább. A KA1 alegység

transzkriptum igen alacsony szinten volt detektálható mind az indukálatlan, mind a 2 napig retinsavval

indukált tenyészetekben. Az indukció 4. napjától szintje megemelkedett és az indukció teljes időtartama

alatt jelen volt a tenyészetekben. Mivel a kainát receptorok neurogenezisben betöltött szerepével a

továbbiakban nem foglalkoztam, az adatok csak kiegészítésként szerepelnek.

83

II./2.3 Funkcionális AMPA receptorok szerepe folytonosan osztódó ill.

neuronális irányban differenciálódó NE-7C2 sejtekben

A glutamát esetleges neurogenezist befolyásoló hatását úgy vizsgáltam, hogy

NE-7C2 sejtek indukálatlan, ill. neuronális irányban differenciálódó tenyészetét az

AMPA receptorok specifikus antagonistájával (GYKI52466, Tarnawa and Vizi, 1998)

kezeltem. A GYKI52466-t kétféle koncentrációban alkalmaztam (5 µM és 50 µM),

mivel ennél magasabb koncentrációkban már toxikusnak bizonyult. A szer toxicitását a

tenyészetekben lévő sejtek életképességének mérésével előzetesen ellenőriztem az

MTT-redukció módszerével (Mosmann, 1983). Az AMPA receptorok szelektív

gátlásának hatását a neurogenezisre a tenyészetekben található N-tubulin immunreaktív

sejtek mennyiségének meghatározásával vizsgáltam a tenyésztés 7. napján,

immuncitokémiai és in situ ELISA módszerrel.

Indukálatlan tenyészetekben a tenyésztés 7. napjára spontán módon is

differenciálódnak N-tubulint expresszáló sejtek (9. C ábra), számuk azonban mindig

igen alacsony (10 látótérben 1 N-tubulin pozitív sejt; 24. A ábra 1. oszlop).

GYKI52466-kezelés hatására a neuronális irányban differenciálódó sejtek száma

nagymértékben megemelkedett. Az antagonista 5 µM koncentrációja mintegy 15x - ére

emeli meg a neuronális irányban differenciálódó sejtek számát (2. oszlop), míg 50 µM -

ban közel 40x az emelkedés (3. oszlop). Ez azonban messze elmarad a retinsav által

előidézett neurogenezis mértékétől, ahol látóterenként átlagosan 29 neuron található (4.

oszlop). Az indukálatlan tenyészetekben GYKI52466 hatására bekövetkező neuronális

differenciáció mértékét in situ ELISA módszerrel is detektáltam. Kezeletlen

tenyészetekben a 7. napon mérhető relatív N-tubulin tartalom igen alacsonynak

mutatkozott (24. B ábra, 1. fekete oszlop). GYKI52466 5 µM koncentrációja nem

okozott változást a relatív N-tubulin tartalomban (2. fekete oszlop) a kezeletlen

tenyészethez viszonyítva.

84

85

Ennek oka az lehet, hogy az in situ ELISA módszer nem elég érzékeny ahhoz, hogy

különbséget tudjon tenni kismértékű eltérések között. Az 50 µM-ban alkalmazott

antagonista kezelés hatására bekövetkező neuronszám-emelkedést (3. fekete oszlop)

már sikerült kimutatnom ezzel a módszerrel is, bár a növekedés mértéke igen alacsony

volt és az értékek közötti különbség a nagy szórások miatt nem volt szignifikáns.

Mivel az indukált neurogenezis során igen nagyszámú neuron differenciálódik

és aztán aggregálódik, a pozitívan jelölt neuronok pontos leszámolása nehezen

megoldható. Retinsavval indukált tenyészetekben a GYKI52466-kezelés neurogenezisre

gyakorolt hatását így in situ ELISA méréssel detektáltam. A GYKI52466-al nem kezelt,

de retinsavval indukált tenyészetekben a relatív N-tubulin tartalom (24. B ábra, 1. fehér

oszlop) jóval meghaladta az indukálatlan tenyészetekben mért értéket. GYKI52466 5

µM koncentrációja a tenyészetekben mérhető N-tubulin tartalmat nem emelte jelentősen

(2. fehér oszlop). Ha azonban 50 µM-ban adtam a tenyészetekhez az antagonistát, az N-

tubulin tartalom csaknem kétszeresére emelkedett (3. fehér oszlop).

A GYKI52466 féléletideje igen rövid a rágcsálókban (Tarnawa and Vizi, 1998).

Kísérleteim során a sejteken a tenyésztő-médiumot, mely az antagonistát is tartalmazta,

24 óránként cseréltem. Ez alatt a 24 óra alatt nagy valószínűséggel teljes mértékben

lebomlott a hatóanyag és így – minden bizonnyal - csak részlegesen sikerült az AMPA

receptorokat gátolni. További kísérletek szükségesek, melyek során stabilabb AMPA

antagonistákat alkalmaznánk és így a kísérlet teljes időtartama alatt ki tudnánk védeni

az AMPA receptorok aktivációját.

Megállapítható, hogy az AMPA receptorok gátlása az indukálatlan

tenyészetekben neurogenezist indukál, a retinsavval indukált tenyészetekben pedig

fokozza a neurogenezist.

II./2.4 Az extracelluláris folyadék glutaminsav tartalmának vizsgálata NE-

7C2 sejtek tenyésztő médiumában

Az NE-7C2 sejtekben jelen lévő NMDA, AMPA és kainát receptorok

természetes agonistája a glutamát. A szervezetünket felépítő sejtek anyagcseréjük során

jelentős mennyiségű glutaminsavat használnak fel. A metabolikus glutaminsav-hatások

86

mellett azonban az idegsejtek és gliasejtek glutamát-felhasználása és érzékenysége

jelentősen eltér a nem-neurális sejtek glutamát anyagcseréjétől.

A neurális sejt-fenotípusok kialakulása során vizsgáltam az NE-7C2 sejtek

folyadékkörnyezetének glutamát-tartalmát. A vizsgálatokhoz két tenyésztési hét alatt

gyűjtöttem mintákat három-három párhuzamosan kezelt indukált, illetve indukálatlan

tenyészet tápközegéből, és az extracelluláris glutamát koncentrációját fluorimetriás

módszerrel határoztam meg a Semmelweis Egyetem Biokémiai Tanszékén, Dr Tretter

László és Dr Környei Zsuzsa segítségével.

Indukálatlan tenyészetekben az extracelluláris glutamát koncentrációja 7 µM és

12 µM között ingadozott (25. ábra). Az indukció első 3 napján a glutamát

koncentrációja kismértékben csökkent (25. ábra), de nem különbözött jelentősen az

indukálatlan tenyészetekben mért értékektől. Az indukció 4. napjától azonban a

glutamát szintje a 4 - 5 µM közé csökkent és ezen az alacsony értéken maradt az

indukció további szakaszában (25. ábra). Az indukált tenyészetek alacsony

extracelluláris glutamát szintje jelzi, hogy a neurális irányban elköteleződött sejtek

megnövekedett mértékben képesek környezetükből a glutamátot eltávolítani.

87

88

III. GAD FORMÁK EXPRESSZIÓJA ÉS A GABA-SZINTÉZIS KAPCSOLATA

NE-7C2 SEJTEK INDUKÁLT NEUROGENEZISE SORÁN

A glutaminsav extracelluláris szintjének aktív szabályozottsága jelezte, hogy a

glutaminsav felhasználás a neuronális érés során jelentősen változhat. Az idegsejtek

glutaminsav anyagcseréjének egyik fontos ága a glutaminsav → GABA átalakulás,

amelynek kulcsenzime a GAD. Megvizsgáltam, hogy az NE-7C2 sejtek neuronná

fejlődése során megjelenik-e a GAD, és a fejlődés melyik stádiumára tehető a fokozott

GABA szintézis kialakulása.

Az GAD mRNS ill. fehérje-formák kimutatását az MTA-KOKI Molekuláris

Biológiai és Genetikai Laboratóriumával kialakult közös munka keretében Dr Szabó

Gábor és Dr Katarova Zója szakmai irányítása mellett végeztem.

III./1 GAD mRNS formák expressziójának vizsgálata

Az NE-7C2 sejtek neuronális differenciációja a során a gad65 és gad67 gének

transzkripciós aktivitását szemikvantitatív RT-PCR módszer segítségével

tanulmányoztam olyan primer párok felhasználásával, amelyek különbséget tesznek az

embrionális és felnőtt korban expresszálódó GAD mRNS formák között. A gad67

génről két, majdnem teljesen egyforma embrionális transzkriptum keletkezhet (I-80, I-

86, 5. ábra; Szabó et al., 1994). Az I-80 mRNS a csak embrionális korban átíródó 7A

exont tartalmazza, míg az I-86 mRNS által kódolt transzkript a 7B embrionális exont

hordozza (5. ábra), melynek szekvenciája plusz 6 bázist tartalmaz a 7A exonhoz képest.

Mindkét exonban található egy átfedő STOP/START kodon, míg a 7B exonban a plusz

6 bázis egy extra STOP kodont kódol (5. ábra), mely meggátolja a transzlációt az

mRNS további szakaszáról. A 12. primer pár (2. táblázat) „antisense” tagja (26. ábra)

olyan szekvencia részletet ismer fel, amely mind a 7A mind a 7B exonban megtalálható,

míg a „sense” primer az embrionális exonokon kívül eső 5’ szekvenciára specifikus. Így

a 12. primer párral felszaporítható termék mind az I-80-ról, mind az I-86-ról

keletkezhet. A teljes hosszúságú GAD67 fehérjét kódoló transzkriptumban nincs jelen

egyik embrionális exon sem, így a 6. és 8. exonok egymás mellé kerülnek. A 13. primer

pár (2. táblázat)

89

90

„antisense” tagja a 6. és 8. exonok egymással szomszédos szekvencia-részleteit ismeri

fel (3 bp a 6. exonból és 24 bp a 8. exonból) és köti meg (tehát az embrionális formákat

nem), míg a „sense” primer a gad67 gén azon szakaszára lett tervezve, amely genom

által kódolt gad67 „pseudogén”-ben nincs jelen (26. ábra, Brilliant et al., 1990). A 14.

primer pár a GAD65 fehérjét kódoló mRNS-t ismeri fel (26. ábra). Belső standardként

β-aktint szaporítottam 16-20 cikluson keresztül a 15. primer pár segítségével. A β-aktin

gén expresszióját függetlennek tekintjük mind a sejtciklustól, mind a differenciációtól,

azaz mennyiségét állandónak vettük az indukció teljes időtartama alatt. A felhasznált

primerek szekvenciáját az 2. táblázat tartalmazza.

Az indukálatlan NE-7C2 sejtek alacsony szinten expresszálták az embrionális

transzkriptumokat (27. A, A’ ábra). Az ATRA indukálta neurogenezis során az

embrionális formák expressziós szintje átmeneti emelkedést mutatott. Az indukció 2.

napján a transzkriptum szintje nagymértékben megemelkedett és a 4. napra elérte

maximumát (27. A, A’ ábra). Ez az időszak egybeesik a neuronális nyúlványok

megjelenésének szakaszával. Az indukció előrehaladtával az embrionális mRNS-ek

szintje folyamatosan csökkent és elérte a kiindulási mennyiséget az indukció második

hetének végére (27. A, A’ ábra). A teljes hosszúságú GAD67 fehérjét kódoló mRNS-t

az indukálatlan, folytonosan osztódó sejtek nem expresszálták (27. B, B’ ábra). A

transzkriptum az indukció 2. napjától volt detektálható, szintje folyamatosan emelkedett

az indukció előrehaladtával, és az indukció 12. napjára jelentős mennyiségben volt jelen

(27. B, B’ ábra). Az embrionális ill. felnőtt GAD67 mRNS-formák expressziójának

időbeli mintázata alapján megállapítható, hogy az embrionális 7A és 7B exonok

expressziója a neuronális fejlődés szigorúan meghatározott szakaszaira korlátozódik.

A GAD65 fehérjét kódoló mRNS-formát csak indukált sejtekből sikerült

kimutatni (27. C, C’ ábra). A transzkriptum már az indukció korai szakaszában alacsony

szintű expressziót mutatott, de szignifikáns mennyiségben csak az indukció 7. napjától

expresszálódott. Az indukció későbbi szakaszában az mRNS szintje nem emelkedett

tovább (27. C, C’ ábra).

91

92

III./2 Rövidített és teljes hosszúságú GAD fehérje-formák időbeli megjelenése NE-

7C2 sejtek in vitro indukált neurogenezise során

Hogy meghatározzam, milyen GAD fehérje-formák transzlálódnak az ATRA-

indukció különböző szakaszaiban, Western blot analízist végeztem NE-7C2 sejtek

tenyészeteiből készített szubcelluláris frakciókból (lásd „Anyag és Módszer” fejezet). A

GAD fehérjeformák kimutatásához korábban már karakterizált ellenanyagokat

használtam: 1) # 6799 poliklonális szérum (Katarova et al., 1990), mely mind az

embrionális, mind a felnőtt GAD formákat felismeri, 2) # 8876 poliklonális szérum,

(Szabó et al., 1994) a 25 kD tömegű rövidített formát ismeri fel ill. 3) a 65 kD formára

specifikus GAD6 monoklonális ellenanyag, (GAD6 hibridóma sejtvonal felülúszó;

Hibridóma Bank; Chang and Gottlieb, 1988). Pozitív kontrollként 13 napos egér-embrió

(E13) ill. újszülött kisállat (P0) előagyából készített fehérje-mintákat futtattam a

géleken.

Alacsony feszültségtartományban végzett blottolás mellett (lásd „Anyag és

Módszer” fejezet) főleg a kis molekulatömegű embrionális formákat lehetett kimutatni.

Mind a 25 kD, mind a 44 kD embrionális forma a TritonX-114 oldhatatlan durva-

membrán frakcióban jelentkezett, más frakciókban jelenlétüket nem sikerült igazolni. A

# 6799 és a # 8876 ellenanyag igen hasonló GAD25 fehérje-expressziós mintázatot

mutatott, a 28. ábrán a # 8876 ellenanyaggal kapott blot szerepel. A GAD25 fehérje már

indukálatlan progenitorokban detektálható volt (28. A ábra). A viszonylag alacsony

mRNS szint mellett (27. ábra) meglepően magas volt a fehérje mennyisége. A fehérje

szintje az idegi indukció korai szakaszában kismértékben még tovább emelkedett, majd

az indukció 6. napjától igen alacsony szintre csökkent, de az indukció második hetében

is detektálható maradt (28. A ábra). Az indukció korai szakaszában valamint az

indukálatlan sejtekben a fehérje kettős csíkot adott a blottokon (28. A ábra), amely

(Szabó Gábor és mtsai adatai alapján) feltételezhetően posttranszlációs módosítások

során keletkeznek, de a fehérje degradációjának lehetősége sem kizárt.

A GAD44 fehérje nem volt detektálható az indukálatlan sejtekben (28. B ábra).

A fehérje a ATRA-indukció igen szűk időtartományában tranziens módon

transzlálódott. Az indukció 4. napján szintje még igen alacsony, a 6. napra

nagymértékben

93

94

megemelkedett és elérte maximumát (28. B ábra). A fehérje mennyisége a 10. napig

csökkent, majd tejesen el is tűnt az indukció második hetének végére (28. B ábra).

Fokozatosan emelkedő feszültség mellett végzett blottolás során a nagyobb

molekulatömegű tartományba eső GAD fehérje-formák kimutatása is lehetővé vált. A

teljes hosszúságú GAD67 fehérjét azonban nem sikerült kimutatnom egyetlen

szubcelluláris frakcióból sem, annak ellenére, hogy a kódoló mRNS szintje az indukció

második hetében már igen jelentős mennyiséget ért el. Ha a fehérje csak kis

mennyiségben van jelen a sejtekben, akkor elképzelhető, hogy a futtatás során felvitt

15µg totál fehérje nem tartalmazott kimutatható mennyiségű GAD67 fehérjét. Hogy

elkerüljem ezt a hibaforrást, megpróbálkoztam a fehérjét feldúsítani a mintákban

immunprecipitációval ill. ammónium-szulfát precipitációval is. A fehérjét azonban így

sem sikerült kimutatni, amiből arra következtettem, hogy vagy az mRNS nem

transzlálódik, vagy a fehérje életideje nagyon rövid az indukció általam vizsgált

szakaszában.

A GAD65 fehérjét a TritonX-114 oldható durva-membrán frakcióban tudtam

csak kimutatni. A fehérje az indukció 6. napján jelent meg alacsony szinten,

mennyisége az indukció 10. napjától emelkedett, párhuzamosan a neuronok érésével

(28. C ábra).

III./3 GAD fehérjeformák sejtszintű lokalizációjának vizsgálata forma-

specifikus ellenanyagokkal

Hogy meghatározzam, melyek azok a sejtek, amelyek a különböző GAD fehérjéket

expresszálják, immuncitokémiai vizsgálatokat végeztem az indukció különböző

szakaszaiban az egyes fehérjeformákra specifikus ellenanyagokkal. A festések során az

immunjelet tyramid szignál amplifikációval erősítettem és a festéseket normál

fluoreszcens ill. konfokális lézer mikroszkóppal értékeltem.

NE-7C2 sejtek indukálatlan tenyészetében a GAD25 fehérje alacsony szinten

majdnem minden sejtben detektálható volt a poliklonális 8876 szérummal. Az

immunreaktivitás a teljes sejttestet kitöltötte (29. A ábra). Az alacsony intenzitású

immunjelet specifikus festésnek tekintettem, mivel a Western blot analízis is

megerősítette a fehérje jelenlétét. A retinsav-indukálta idegi differenciáció a fehérje

95

expressziójának megemelkedését eredményezte a neuronális irányba elköteleződő

sejtekben (29. B, C ábra). Az ellenanyag mind a sejtmag körüli, igen kis kiterjedésű

sejttestben (29. B ábra), mind a hosszú nyúlványokban jól látható fluoreszcens jelet

adott (29. C ábra). A nem-neurális sejtek festődése a háttértől nem tért el.

A GAD44 fehérje kimutatására nyúl poliklonális szérumot használtam (# 8877),

melyet affinitás-tisztítottam bakteriálisan expresszáltatott GAD44 fehérje-szekvencián

(Szabó et al., 1994). Az indukálatlan sejtekben immunfestést nem láttam. Az első

immunreaktív sejtek az indukció 4. napján voltak azonosíthatók (30. A ábra) és az

immunjel a citoplazma marginális zónájában dúsult fel. Az indukció 7 - 10. napjára az

immunjelölt sejtek száma megnőtt (30. B és C ábra) és a festődés mind a perinukleáris

régióban mind a nyúlványok proximális szakaszán erős volt. A differenciáció későbbi

szakaszában a jelölt sejtek száma nagymértékben csökkent és az indukció 12. napjára

nem találtam jelölt sejtet a tenyészetekben.

A GAD65 fehérjére adott specifikus festődést (N65 ellenanyag, Solimena et al.,

1993) elsőként az indukció 7. napján detektáltam a neuronális morfológiával

jellemezhető sejtekben. Az indukálatlan aljzatsejtek nem festődtek GAD65-specifikus

szérummal. Az indukció 10. napjára az idegsejt legtöbbje jelölődött (31. A-F ábra) és a

fehérje mind a sejttestben, mind a nyúlványokban jelen volt.

Mivel nincs olyan ellenanyag, amely a teljes hosszúságú GAD67 fehérjét meg

tudná különböztetni rövidített szekvenciájú variánsaitól, szelektív festést erre a formára

nem tudtam elvégezni. A fehérjét sem Western blot, sem immunprecipitáció

segítségével nem tudtam detektálni, tehát nagy valószínűséggel nincs jelen az indukció

általunk vizsgált szakaszában.

96

97

98

III./4 NE-7C2 sejtek GABA-tartalma az in vitro indukált neurogenezis különböző

stádiumaiban

Az in vitro indukált neurogenezis során az NE-7C2 sejtek két olyan GAD

fehérjét (GAD65 és GAD44) is expresszáltak, amelyek a gluatminsavból GABA-t

tudnak előállítani. A GABA-t tartalmazó sejteket immuncitokémiai festéssel

azonosítottam retinsavval indukált ill. indukálatlan tenyészetekben. Az indukálatlan

sejtek, amelyek csak GAD25 formát expresszálnak, nem tartalmaztak

immuncitokémiailag detektálható mennyiségű GABA-t (32. A ábra). Immunreaktív

sejteket nem láttam az indukció 2. és 4. napján sem. Az indukció 6. napján (32. B ábra)

jelentek meg az első magas GABA-tartalmú sejtek és számuk folyamatosan nőtt az

indukció előrehaladtával (32. C-D ábra). A festődés kitöltötte a teljes citoplazmát és a

nyúlványokat, erősen megjelölve az axonális növekedési kúpokat (32. E és F ábra). Az

indukció későbbi szakaszában (8-10. nap) a nyúlványokon elhelyezkedő varikozitások

szintén erősen jelölődtek.

99

100

LEGFONTOSABB EREDMÉNYEK

1. Az NE-7C2 sejtvonal megalapítása során kezdeti genetikai instabilitást tapasztaltam,

mely fokozatos kromoszómaszám-vesztéssel járt. A sejtvonal

kromoszómaszáma a 30. passzázstól (kb. 100 sejtduplikációs ciklus eltelte után)

kezdve stabilizálódott, és a normál egér genomnál másfélszer több kromoszómát

tartalmazó vonal alakult ki.

2. Az NE-7C2 sejtvonal korai fejlődési állapotot reprezentáló neurális progenitor

sejtekből áll. A sejtvonal ATRA-indukálta neurogenezise jól karakterizált

progenitor stádiumok szukcessziós sorozata, mely megfelelő modellként

szolgálhat a korai neurogenezis meghatározott lépéseinek tanulmányozására.

3. Az in vitro neuronális differenciáció során az idegsejtek nyúlványnövekedésének

szakaszában megjelennek a sejtek felszínén funkcionális NMDA receptorok,

melyek aktivációja az [Ca2+]IC megemelkedését okozza.

4. Mind az indukálatlan, mind az indukált NE-7C2 sejtek funkcionális AMPA

receptorokat expresszálnak, amelyeken át a progenitor sejtek osztódása is

szabályozható.

5. A funkcionális NMDA és AMPA receptorok együttes jelenléte idején az

extracelluláris tér glutaminsav-tartalma lecsökken.

6. A glutaminsavból GABA-t előállító GAD67 fehérjecsalád embrionálisan megjelenő

fehérjéi (GAD25, GAD44) az indukálatlan sejtekben ill. a fiatal neuronokban

expresszálódnak. A teljes hosszágú GAD65 forma jelenléte a késői indukciós

periódust, a neurális érés időszakát jellemezi.

7. GABA-t akkumuláló idegsejteket csak azokban a stádiumokban sikerült kimutatni,

amikor a GAD44 és/vagy a GAD65 fehérje már jelen volt.

101

102

MEGBESZÉLÉS

Az agy fejlődése során az idegszövetet felépítő neuronok és gliasejtek

differenciálódása különböző progenitor-stádiumok térben és időben egymást követő

sorozataként valósul meg. A folyamat szabályozásában a genetikai tényezők mellett a

környezeti (sejtes és kémiai) faktorok is fontos szerepet töltenek be. Az elmúlt években

számos szekretált molekuláról (növekedési faktorok, hormonok és neurotranszmitterek)

bebizonyosodott, hogy szerepet játszik a proliferáció, differenciáció, migráció és

neuronális túlélés folyamatainak szabályozásában az idegrendszer kialakulása során. A

kifejlett idegrendszerben „klasszikus neurotranszmitterként” ismert molekulák az

idegrendszer érése alatt mindvégig jelen vannak a progenitorsejtek környezetében

(Miranda-Contreras et al., 1998; 1999; 2000) és jelfogó receptoraik is kifejeződnek a

sejtek felszínén jóval a szinaptogenezis megindulása előtt (Sah et al., 1997; Haydar et

al., 2000; Maric et al., 2000). Az utóbbi 10 évben számos olyan tanulmány jelent meg,

amely bizonyítja, hogy a neurotranszmitterek fejlődésreguláló anyagokként viselkednek

az idegrendszer embrionális fejlődése során (LoTurco et al., 1995; Behar et al., 1996;

Ma et al., 1998; Haydar et al., 2000; Nguyen et al., 2001).

Doktori munkám során vizsgáltam a glutaminsav ionotróp receptorainak

megjelenését és lehetséges funkcióit, ill. tanulmányoztam a glutaminsavból GABA-t

előállító GAD fehérjecsalád tagjainak expresszióját az in vitro neuronális elköteleződés

jól jellemzett stádiumaiban. A kísérleteket egy p53-/- immortalizált, neuroektodermális

sejtvonalon, az NE-7C2-n végeztem, melynek tenyészeteiben ATRA-kezelés hatására

neuronok, majd ezt követően asztrogliasejtek differenciálódnak.

I. Az NE-7C2 sejtek korai neuroektodermális fejlődési állapotot

reprezentáló progenitorok

Az idegrendszer embrionális fejlődése során a rövid távolságon - mindössze

néhány sejtet magába foglaló mikrokörnyezeten - belül érvényesülő hatások vizsgálata

és elemzése in vivo körülmények között nehezen megoldható feladat. A korai

embrionális (E9 - E13) fejlődési állapotok in vivo vizsgálatát megnehezíti az embriók

méhen belüli védettsége, a fejlődést szabályozó folyamatok nagyfokú összetettsége,

103

valamint az idegi progenitor sejtek térben és időben eltérő fejlettségi állapota – azaz

heterogenitása. Az embrionális idegszövetből izolált primer tenyészetekben a sejtek

közötti heterogenitás az in vitro tenyésztés során is fennmarad, a kiültetett sejtek csak

korlátozott mértékben őrzik meg progenitor sajátságaikat és néhány osztódás után

differenciálódnak.

A neurogenezis in vitro vizsgálatához olyan homogén sejtpopulációk

nyújthatnak ideális modellt, amelyekben a sejtek azonos fejlődési potenciállal

rendelkeznek és ezeket a tulajdonságaikat a fenntartás során megőrzik, de megfelelő

indukció hatására idegszöveti sejttípusokká differenciálódnak. Amennyiben ezek a

sejtek korlátlan osztódó-képességgel is rendelkeznek, a biokémiai és molekuláris

biológiai kísérletek elvégzéséhez elegendő mennyiségű kiindulási sejttömeget

produkálhatnak. Az idegi irányú elköteleződés tanulmányozására folytonosan osztódó

sejtvonalak állíthatók elő perifériás eredetű idegrendszeri tumorokból (PC12 sejtvonal),

ill. embrionális karcinómákból (P19, PCC-7, NTera-2) izolált sejtekből. Az embrionális

karcinóma eredetű sejtvonalakban azonban a neuronok és asztrogliasejtek kialakulása

mellett izomsejtek és fibroblasztok is differenciálódnak. A széles fejlődési potenciállal

rendelkező embrionális őssejtek is igen eltérő sejttípusok kialakítására képesek.

Folytonosan osztódó sejtpopulációk előállíthatók virális onkogének (v-raf, T-antigén)

progenitorsejtekbe juttatásával, ám számolni kell azzal, hogy a beépülő onkogén

módosíthatja a progenitorok fejlődési sajátságait.

Immortalizált sejtek előállításának egy új módját kínálják azok a transzgenikus

állatok, ahol a sejtciklus vagy programozott sejthalál regulációjában szerepet játszó

gének működése kiesik. A p53 gén-kiütött egerekből izolált sejtek egy része spontán

immortalizációt mutat funkcionális p53 fehérje hiányában (Harvey et al., 1993; Metz et

al., 1995; Schlett and Madarász, 1997).

A p53-/- egér embrió primer neuroepitél sejtjeiből klónozással nyert master

tenyészetekben különböző kromoszóma-készletű sejtpopulációk voltak jelen. Eddigi

adataink szerint az immortalizált sejtvonalak a kétszeres kromszómaszámmal

rendelkező populációból származnak. A jelenség azt jelzi, hogy a kromatin-állomány

növekedése kezdetben szelektív előnyt jelenthet a primer neuroepiteliális sejtek

szaporodásában. Hasonló kromoszómális instabilitást figyeltek meg p53-/- embrionális

fibroblaszt sejtvonalak (Harvey et al., 1993), ill. hematopoietikus sejtek hosszú távú

104

fenntartása esetében is (Metz et al., 1995), megerősítve, hogy a p53 fehérje fontos

szerepet tölt be a kromoszómális integritás megőrzésében. A 100 feletti

kromoszómaszámmal rendelkező sejtek megjelenése NE-7C2 sejtek tenyészeteiben

szintén azt jelzi, hogy a sejtosztódást szabályozó folyamatok sérülnek funkcionális p53

gén hiányában. Az a tény, hogy a poliploid sejtek sosem válnak meghatározóvá a

tenyészetekben azt sugallja, hogy a génállomány egy határ fölötti növekedése hátrányos

lehet a sejtek szaporodása során. Hasonló poliploid megakariocitákat figyeltek meg egy

p53-/- eritroid sejtvonal esetében is (Metz et al., 1995), azonban ezen sejtek aránya

sosem haladta meg az 1%-t a tenyészetekben. Az NE-7C2 sejtvonal további tenyésztése

során a duplikált kromoszómaszám látszólag már nem jelentett előnyt a sejtek

növekedésében. A sejtvonal stabilizációja során a kromoszómaszám n ≈ 3 érték felé

közelít. Feltételezéseink szerint ez a genom-méret egyrészt biztosíthatja a szerzett

előnyök további megtartását, másrészt nem igényli a sejtciklus időtartamának hátrányos

megnövekedését. Hasonló kromoszómaszám csökkenést majd stabilizálódást figyeltünk

meg egy másik p53-/- sejtvonal esetében is (NE-4C; Schlett and Madarász, 1997), ahol

a kezdetben duplikált kromoszómaszámmal rendelkező sejtek kromoszóma-állománya

fokozatosan csökkent a sejtvonal fenntartása során. Érdekes megemlíteni, hogy mind az

NE-7C2, mind az NE-4C sejtvonal esetében a kromoszómaszám csökkenése lelassult az

átültetések számának emelkedésével, és mindkét sejtvonal esetében a kromoszómaszám

a 60-s érték körül stabilizálódott.

A folyamatos kromoszómaszám–vesztés ellenére a sejtek fenotípusa nem

változott és ATRA kezeléssel minden passzázsban indukálható volt a neuronok

kialakulása. Az általam alkalmazott módszerrel azonban csak a kromoszómák számának

csökkenését tudtam regisztrálni. Miután a változó kromoszómaszám nem befolyásolta a

neurális indukciót, fontos lenne megvizsgálni, hogy mely kromoszómák vesznek el,

illetve a neurális fejlődésben szerepet játszó géneket hordozó kromoszómák többszörös

kópiában maradnak-e fenn.

A további kísérletek során olyan passzázs-számú NE-7C2 sejtekkel dolgoztam,

amelyek kromoszómaszáma a 60-s érték körül már stabilizálódott (p30-p60).

Az NE-7C2 sejtvonal sejtjei indukálatlan állapotban epiteliális sejtekre jellemző

alakkal rendelkeznek és a neurális progenitorok markerfehérjéjét, a nesztint

105

expresszálják. Letapadásfüggő növekedésük azt mutatja, hogy a sejtvonal sejtjei p53

fehérje hiányában sem tumorosan transzformáltak. A tenyészetekben kis gyakorisággal

bekövetkező spontán neuronális differenciáció (> 1%) a sejtvonal idegrendszeri eredetét

támasztja alá és bizonyítja, hogy a sejtekben a terminális differenciáció folyamata p53

fehérje hiányában is bekövetkezik. Az indukálatlan tenyészetekben kis gyakorisággal

megjelenő neuronok fenotípusuk alapján (egy rövid, el nem ágazó nyúlvány és

lekerekedett sejttest) egy korai fejlődési stádiumot képviselnek és további

differenciációjukhoz valószínűleg sem a sejtes, sem a folyadékkörnyezet nem biztosít

megfelelő feltételeket. Indukálatlan tenyészetekben az idegszövet másik jellemző

sejttípusa, az asztroglia nem volt kimutatható. A megfigyelés arra utal, hogy az

asztroglia sejtek differenciációjához szükséges környezeti faktorok (sejtes és kémiai)

nem állnak rendelkezésre a differenciálatlan sejtek tenyészeteiben.

NE-7C2 sejtek tenyészeteiben neuronok nagyszámú differenciációját all-trans

retinsav kezeléssel tudtam indukálni. A retinsav neuronális differenciációt indukáló

hatását figyelték meg embrionális stem (ES) sejteken és embrionális karcinóma sejteken

is (P19, Ntera-2), de ezeken a sejtvonalakon nem-neurális fejlődési irányok is

indukálódtak. Az NE-7C2 sejtek tenyészeteiben ATRA kezeléssel csak idegszöveti

típusú fejlődési irány volt kimutatható, tehát az NE-7C2 sejtvonal beszűkült progenitor

potenciálja alapján már egy előrehaladottabb fejlődési stádiumot képvisel, mint az ES

sejtek ill. az embrionális karcinóma eredetű sejtvonalak. Hasonló indukciós sajátságokat

mutatott a laboratóriumunkban már korábban jellemzett p53-/- neuroektodermális NE-

4C sejtvonal is, amelyben ATRA kezelés hatására neuronok és asztroglia sejtek

differenciálódtak (Schlett and Madarász, 1997).

Felmerül a kérdés, hogy az általam használt ATRA koncentráció (10-6 M)

mennyire tekinthető fiziológiás koncentrációnak. Mivel az all-trans retinsav igen

instabil vegyület, mind fény, mind hőmérséklet hatására izomerizálódik, a retinsav egy

jelentős része lebomolhat, mire a sejtekkel kapcsolatba kerül. Így a ténylegesen jelen

lévő ATRA koncentráció az általam megadott értéknél jóval alacsonyabb lehet.

A retinsav-kezelés csak a sejtek egy részét (~ 50%) készteti neuronális ill. gliális

differenciációra. Az el nem kötelezett sejtek egy összefüggő monolayert hoznak létre a

petricsésze felszínén. A differenciálódási folyamat során a neuronális morfológiájú

sejtek nem egyenletesen oszlanak el a tenyészetekben, hanem kisebb csoportokat

106

alkotnak. A tenyészetekben in vitro megfigyelhető nagyszámú differenciálatlan sejt, ill.

neuronok esetében megfigyelt csoportos megjelenési mintázat alapján feltételezhető,

hogy a neuronális sejttípus-determináció folyamata során rövid hatótávolságú

szabályozó folyamatok jelentős szerephez juthatnak. Az idegrendszer embrionális

fejlődése során a részletesen tanulmányozott, közvetlen sejt-sejt kontaktuson alapuló

laterális gátlás (Rooke and Xu, 1998) mechanizmusa által szelektálódnak ki a

progenitorok közül azok a sejtek, amelyek idegsejtekké differenciálódnak. Laterális

gátláshoz hasonló folyamatok működését sikerült korábban kimutatnom NE-7C2 sejtek

ATRA-indukálta neurogenezise során (Varju P. szakdolgozat, 1997), mely valószínűsíti,

hogy az in vitro neurogenezis során a neuronális fenotípus determináció szabályozása

hasonló folyamatok által megy végbe.

A sejtvonal ATRA-indukálta neuronális differenciációja egymásra épülő

fejlődési stádiumok sorozata, melyek jól jellemezhetők a differenciálódó sejtek

alakjával és egyes neuron-specifikus fehérjék megjelenésével (4. táblázat). A neuronok

differenciálódása során elsőként az N-tubulin fehérje mutatható ki a kisnyúlványos

idegsejtek vázrendszerében, majd a NFL és NFM köztes filamentum fehérjék jelennek

meg, amelyeket a neuronok érése során az NFH alegységek megjelenése követ. A

mikrotubulus-asszociált fehérjék közül a Map2 formát mutattam ki NE-7C2

idegsejtekben.

A központi idegrendszer fejlődése során a neuronok egymással szinaptikus

kapcsolatok bonyolult hálózatát alakítják ki. A képződő szinapszisok felépítéséhez

szükséges fehérjék a sejttestben szintetizálódnak és onnan szállítódnak a pre– és

posztszinaptikus felszínekhez. A neurotranszmitterek raktározására szolgáló szinaptikus

vezikulumok membrán–asszociált fehérjéjéi közé tartozó szinapszin-I és szinaptofizin

fehérjék jelenléte jelzi, hogy az NE–7C2 sejtek indukált neurogenezise során a

szinapszisokra jellemző fehérjék expressziója is megindul.

Felvetődik a kérdés, hogy milyen fejlődési stádiumig differenciálódnak az in

vitro kialakuló neuronok. A hosszú ideig életben tartott tenyészetekben további

vizsgálatokkal kell eldönteni, hogy kialakulnak–e működő szinapszisok és

determinálódik-e az idegsejtek neurotranszmitter fenotípusa. A differenciált idegsejtek

egy részében kimutatható jelentős mennyiségű GABA ill. az előállításáért felelős

107

“felnőtt” GAD enzimformák tartós jelenléte arra utalhat, hogy ezen idegsejtek

GABAerg irányba differenciálódó neuronok.

Asztroglia–sajátságú sejtek a neuronális aggregátumok belsejében jelentek meg

elsőként az indukció második hetében, majd egyre nagyobb számban az

aggregátumokat övező területeken is. E megfigyelés alapján arra következtettem, hogy

az asztrogliasejtek kialakulásához neuronok jelenlétére van szükség. Az idegrendszer

embrionális fejlődése során az elsőként differenciálódó sejtek neuronális sajátságokat

mutatnak, a gliális fehérjéket expresszáló progenitorok csak az első neurogenetikus

hullám után jelennek meg. Megállapíthatjuk, hogy az NE-7C2 sejtvonal in vitro

differenciációja során a neuron ill. asztroglia típusú sejtek szekvenciális indukciója jól

követi az in vivo fejlődés időbeli mintázatát.

Az idegszövetben nagy mennyiségben előforduló oligodendroglia sejtek korai

ill. késői fejlődési stádiumaira jellemző fehérjéket (galaktocerebrozid ill. mielin) az NE-

7C2 sejtek indukálatlan és ATRA-al indukált tenyészeteiben nem tudtam kimutatni.

Valószínűsíthető, hogy önmagában az ATRA és a hatására in vitro kialakuló idegsejtek

és asztrogliális elemek nem biztosítanak megfelelő feltételeket az oligodendroglia sejtek

kifejlődéséhez.

Az NE-7C2 sejtek ATRA-indukálta neuronális differenciációja jól

meghatározott és reprodukálható lépéseken keresztül történik, amely lehetőséget ad a

sejtvonal in vitro modell-rendszerként való felhasználására a neurogenetikus folyamatok

lépéseinek tanulmányozására.

108

II. Ionotrop glutamát rceptorok az in vitro indukált neurogenezis alatt

II./1 Sejtfelszíni NMDA receptorok a fiatal neuronok nyúlványelongációs

szakaszában jelennek meg

Annak ellenére, hogy az NE-7C2 sejtek indukálatlan állapotban is expresszálnak

NMDA receptor alegységeket, funkcionális NMDA-csatornákat csak a már nyúlványos

idegsejteken sikerült kimutatni. Az NR2 alegységek közül az NR2A és NR2D mRNS-

eit már a proliferáló progenitorokban expresszálódtak és mRNS szintjeik az indukció

során lényegesen nem változtak. Az alegységek expressziójának mértékét az NR1

alegység expressziós változásai nem befolyásolták. Az NR2A alegység fehérje-formáját

ugyanakkor nem sikerült megbízható módon kimutatni. A Western blot analízis során a

felnőtt patkány agyhomogenizátumból kimutatott érett fehérjéhez képest az NE-7C2

sejtek fehérjemintáiban két kisebb molekulatömegű fehérje jelent meg, igen kis

mennyiségben. Az eredmény arra enged következtetni, hogy az NR2A alegység fehérje

gyorsan degradálódik (Huh and Wenthold, 1999) vagy egy éretlen, poszt-transzlációs

modifikációktól mentes (glikozilálatlan) formája termelődik (Portera-Caillau et al.,

1996; Hall et al., 1997; Laurie et al., 1997). NE-7C2 sejtek indukált neurogenezise során

az NR2C alegység mRNS-e nem volt kimutatható, mely utalhat a sejtvonal előagyi

eredetére. Az idegrendszer fejlődése során ugyanis az NR2C alegység igen behatárolt

expressziót mutat, főleg a kisagy területén és a talamuszban fordul elő (Monyer et al.,

1991). Mivel az NR2D alegységre specifikus ellenanyag nem volt kereskedelmi

forgalomban a kísérletek végzése idején, a fehérje jelenlétét nem tudtam igazolni.

Az NR2 alegységek közül az NR2B alegység expressziója időben egyezett a

neurális hálózatok kialakulásával. Az NR2B fehérje csak neuronális sejtekben volt

kimutatható és expressziós szintjének emelkedése jól korrelált a funkcionális NMDA

csatornával rendelkező neuronok nagyszámú megjelenésével. Az NMDA-vezérelt Ca2+-

csatornával rendelkező sejtek számának növekedése a nyúlvány-rendszerek

kialakulásának időszakában és az ezzel egyidőben emelkedő NR2B fehérjeszint azt

valószínűsíti, hogy az NR2B alegységet tartalmazó NMDA receptor komplexumok a

neuronális érési folyamatokban játszanak fontos szerepet. Funkcionális NMDA

109

csatornával rendelkező sejteket azonban már olyan fejlődési stádiumban is sikerült

kimutatni, amikor az NR2B alegység fehérje még nem volt jelen. Az adatok azt

valószínűsítik, hogy ezeknek a receptoroknak a felépítésében NR2D alegységek

vehettek részt.

NR1 alegységet mind a proliferáló, mind a differenciálódó NE-7C2 sejtek

expresszáltak. Az indukálatlan progenitorokban a legfőbb NR1 transzkriptum a C1 és

C2 kazettákat egyaránt tartalmazta. A csak C1-t ill. csak C2-t tartalmazó mRNS-k

indukálatlan NE-7C2 sejtekben igen alacsony szinten expresszálódtak, de mennyiségük

az indukció előrehaladtával emelkedett. A C2 kazetta tartalmú fehérje mennyiségi

változása ellentétes tendenciát mutat a transzkriptum szintjének változásával, ami arra

utal, hogy a C2 exont tartalmazó fehérje képződése transzkripciós és transzlációs

szinten is szabályozott folyamat. A C2 kazettát tartalmazó fehérje szinte kizárólag a

citoplazma frakcióban ülepedett, jelezvén, hogy a fehérje nem transzportálódik a

sejtfelszínre. Az immuncitokémiai festések alapján a sejten belül raktározott fehérje

valószínűleg az ER vagy a Golgi membránokon belül található. Hogy mi lehet a pontos

szerepe ezeknek a sejten belüli NR1 raktáraknak, és vajon a fehérje kikerül-e innen

valaha a sejtfelszínre, nem tudjuk megválaszolni. A funkcionális NMDA csatornák

hiánya az indukció első hetében azt sugallja, hogy az NR1 fehérje nem jut ki a felszínre

és nem épül be funkcionális receptorba annak ellenére, hogy az NR2D alegység mRNS-

e már expresszálódik ebben az indukciós periódusban. Az NR2 alegységek NR1

alegységhez viszonyított késői megjelenése azt jelezheti, hogy a funkcionális csatornák

kialakításának egyik tényezője az NR2 alegység limitált expressziója lehet (Hall and

Soderling, 1997; Pérez-Otaño et al., 2001). Az NMDA csatornák hiánya az indukció

első hetében azt mutatja, hogy az NE-7C2 neuronokban az NMDA receptorok

sejtfelszíni expresszióját szabályozó folyamatok meggátolják, hogy a neuronok egy

adott fejlődési stádium elérése előtt sejtfelszíni NMDA receptorokat fejezzenek ki.

Korábbi irodalmi adatok és saját eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a C-

terminális exonoknak fontos szerepe van az NR1 fehérje sejten belüli transzportjában

illetve a fehérje-fehérje kölcsönhatások kialakításában. Az elmúlt években több

kutatócsoport is arra a következtetésre jutott nem neurális eredetű expressziós

rendszerekben (HEK 293 sejtvonal, Xenopus oocyta), hogy az NR1 alegység sejtfelszíni

transzportjához és a funkcionális NMDA csatornák megjelenéséhez legalább egyféle

110

NR2 alegység koexpressziója szükséges (Blahos and Wenthold, 1996; McIlhinney et

al., 1996, 1998; Huh and Wenthold, 1999). Azonban a csak neuronokban kimutatható

NMDA receptorokat felépítő alegységek transzportját szabályozó folyamatok nem

neurális eredetű sejtekben nem feltétlenül működnek, így az NMDA receptor

alegységek sejten belüli lokalizációjának vizsgálatára ezek a rendszerek csak korlátozott

mértékben alkalmasak. A központi idegrendszeri eredetű NE-7C2 sejtvonal ATRA-

indukálta neurális differenciációja során megjelenő NMDA receptor alegység fehérjék

sejtfelszíni transzportját az idegsejtekre jellemező intracelluláris környezetben

tanulmányozhatjuk és a tapasztalt jelenségek jól közelítik az NMDA receptor

alegységek transzportját in vivo is szabályozó folyamatokat.

A nyúlványok stabilizációja és a neuronális hálózatok kialakulása idején NE-

7C2 sejtekben az NR1-a mRNS szintje tovább emelkedik és az N1 exont tartalamazó

(NR1-b) transzkriptumok expressziója is megindul. Az N1 exonok expressziójával

egyidőben jelennek meg az NMDA-indukált [Ca2+]IC emelkedések is, azaz az első

funkcionális NMDA-vezérelt csatornák. Az N1 exon késői megjelenése NE-7C2

sejtekben jó egyezést mutat az in vivo (Laurie and Seeburg, 1994; Prybylowski et al.,

2000) és in vitro adatokkal (Asahi et al., 1998), melyek szintén igazolják, hogy az N1

exon relatíve későn expresszálódik a hippocampusz, talamusz és a kisagy neurális

fejlődése során. Az extracellulárisan elhelyezkedő N1 kazetta beépülése az NR1

alegységbe megnöveli az ionáram amplitúdóját, lecsökkenti a receptor agonista-

affinitását és a receptor által deszenzitizált állapotban eltöltött időt (Zukin and Bennett,

1995; Rumbaugh et al., 2000), melyeknek fontos szerepe lehet a neurális hálózatok

alakulása és a szinaptogenezis folyamán.

Funkcionális NMDA receptorokat elsőként a neuronok nyúlvány-elongációja

idején sikerült kimutatni. Ennek alapján feltételezhető, hogy az NMDA receptorok

szerepet játszanak a neurit-növekedésben. Az indukció későbbi szakaszában, az

idegsejt-hálózatok kialakulásával párhuzamosan, egyre nő a sejtfelszíni NMDA

receptorokat tartalmazó sejtek száma. Irodalmi adatok szerint a receptorok fontos

szerepet játszanak a nyúlványok növekedésében (Lipton and Kater, 1989) valamint a

növekedési kúpok irányválasztásában (Zheng et al., 1996), azaz szabályozzák a

nyúlvány-hálozatok kialakulását. Az in vitro indukált neurogenezis során tapasztalt

időbeli egybeesés is ezeket a megfigyeléseket támasztja alá.

111

A NMDA csatornák folyamatos aktivitása megemelheti az [Ca2+]IC szintet,

amely neuronális halálhoz vezethet, ha az extracelluláris térben magas a glutaminsav

koncentráció. Az indukció 4. napjától az NE-7C2 sejtek folyadékkörnyezetében a

glutaminsav-tartalom nagymértékben csökkent (~ 5 µM). Ez a glutaminsav koncentráció

az NMDA receptorokat még teljes mértékben aktiválni tudja (5. táblázat; Mori és

Mishina, 1995), az AMPA receptorokat, amelyek telítéséhez 100-200 µM glutamát

szükséges, azonban már csak korlátozott mértékben aktiválja (5. táblázat; Nishimura et

al., 2000). Az indukció során a sejtek – nagy valószínűséggel a már kialakult neuronok

– jellegzetes glutaminsav transzporterek segítségével alacsony szintre állítják az

extracelluláris tér glutaminsav koncentrációját, megvédve a sejteket a glutaminsav

toxikus hatásaitól. Glutaminsav transzporterek jelenlétét már igen korai embrionális

stádiumokban sikerült kimuatatni a VZ és IZ területén található progenitorokban és a

KL területén található fiatal neuronokban (Sutherland et al., 1996; Furuta et al., 1997).

Ezek a glutaminsav transzporterek a környezet ion-összetételétől függően vagy

felveszik a glutaminsavat vagy éppen fordítva, a sejt belsejéből az extracelluláris térbe

ürítik (Soeda et al., 1997). Tehát a glutaminsav transzporterek egyrészt megvédik a

sejteket a glutaminsav toxikus hatásaival szemben, másrészt lehetővé teszik a

glutaminsav sejtekből való kiürítését még a szinapszisok kialakulása előtt (Sutherland et

al., 1996; Soeda et al., 1997; Métin et al., 2000). A laboratóriumban jelenleg folyó

vizsgálatok hamarosan tisztázzák, hogy mely glutaminsav transzporterek a felelősek a

glutaminsav csökkentett szintjének kialakításáért az indukált neurogenezis

meghatározott szakaszaiban. A tápfolyadék glutaminsav-koncentrációja azonban nem

NR2A NR2B NR2C NR2D

Glutamát affinitás EC50

~1.7 - 3.7 ~ 0.8 ~ 0.2 ~ 0.4

~ 78.6 ~ 92.7 ~232.1 ~132.9

Glicin affinitás EC50 (µM)

~ 2.1 ~ 0.3 ~ 0.2 ~ 0.1

GluR1flip GluR2flip GluR3flip GluR4flip

5. táblázat NMDA és AMPA receptorokglutamát affinitása, ill. aNMDA receptorok glicinaffinitsa homomer receptorokesetében.

112

ad felvilágosítást az egyes sejtek közvetlen környezetében valóban fenálló

koncentráció-viszonyokról. Az alacsony glutamát-szint azonban lehetővé teszi, hogy a

kibocsátott glutaminsav jelmolekulaként működjön a szomszédos sejtek

kommunikációjában.

II./2 Az NE-7C2 sejtek mind indukálatlan, mind indukált állapotban

funkcionális AMPA receptorokat expresszálnak

Az AMPA receptor alegység mRNS-k expressziója NE-7C2 sejtekben jól követi

az embrionális fejlődés során megfigyelt expressziós mintázatot (Monyer et al., 1991;

Schererer and Gallo, 1998; Herbison and Simonian, 2001). Indukálatlan, folytonosan

osztódó sejtekben csak a GluR4 alegység volt kimutatható, és mennyisége szinte alig

változott a neuronális indukció során. Korábbi irodalmi adatok alapján feltételezhető,

hogy az alegység homomer csatornák kialakítására is képes (Wenthold et al., 1996).

Xenopus oocitában expresszáltatott homomer GluR4 csatornák Ca2+-ionokra nézve

nagymértékű áteresztőképességet mutattak (Hollmann et al., 1991). AMPA hatására

indukálatlan NE-7C2 sejtek felszíni membránjában kimutatott [Ca2+]IC emelkedés jelzi,

hogy a GluR4 (ill. esetlegesen GluR3) alegységekből működőképes AMPA csatornák

épülnek fel indukálatlan NE-7C2 sejtekben. Mivel depolarizáló koncentrációjú KCl

hatására [Ca2+]IC emelkedést nem tudtunk detektálni indukálatlan NE-7C2 sejtekben,

továbbá az indukálatlan sejtek GluR2 alegységet sem expresszáltak, ezért a

citoplazmában mért Ca2+-szint emelkedését a GluR4 (és esetlegesen GluR3)

alegységekből felépülő AMPA csatornákon keresztül beáramló Ca2+ ionok okozhatták.

Az adatok alapján azonban az is megállapítható, hogy AMPA hatására nem

minden sejtben mérhető [Ca2+]IC emelkedés. A funkcionális heterogenitás jelzi, hogy az

eredetileg egy-sejt eredetű sejtvonalon belül különbségek alakulhatnak ki a sejtek

között, melyek megnyilvánulhatnak az eltérő AMPA receptor alegység expresszióban.

Lokális mikrokörnyezetek kialakulására lehetőség nyílhatott a tenyészetekben, mivel a

méréseket a sejtek kiültetésétől számított 48-72 óra után végeztem. Erre az időre –

véleményem szerint – szükség volt, hogy a sejtek tripszinezéssel történő kiültetése után

a sejtfelszíni receptorok regenerációja teljes mértékben megtörténjen. A tenyészeten

belül 2-3 nap eltelte után kialakuló eltérő mikrokörnyezetek befolyásolhatták az egyes

sejtcsoportok GluR4 expresszióját.

113

Az indukció korai szakaszában (0-2 DIV) a domináns AMPA receptor alegység

még mindig a GluR4 volt. Az indukció előrehaladtával a GluR4-t először a GluR2,

majd a GluR1 alegység expressziója követte. Az indukció első hetének végére már mind

a három alegység mRNS szintje jelentős mennyiséget ért el. Mint ahogy azt láthattuk az

NMDA receptor alegységek ill. a GAD67 fehérjeforma esetében is, a transzkriptum

jelenléte nem egyértelmű bizonyíték a fehérjeforma jelenlétére. Mivel a kísérletek

végzése idején a laboratórium még nem rendelkezett AMPA receptor alegységekre

specifikus ellenanyagokkal, az ATRA-indukálta neurogenezis során kialakuló AMPA

receptorok lehetséges alegység összetételét nem tudtam vizsgálni.

Differenciáltatott tenyészetekben az indukció 7-10. napján a neuronok egy

részében sikerült AMPA receptor agonista hatására [Ca2+]IC emelkedést detektálnom.

Ebben a fejlődési stádiumban a GluR2 alegység mRNS-e már igen jelentős mennyiséget

ért el. Miután a GluR2 alegység editációja nagy hatékonysággal lezajló folyamat

(Sommer et al., 1991), ezért az alegység beépülése a receptorba nagymértékben

csökkentheti annak Ca2+-áteresztő képességét (Hollmann et al., 1991). Ebben az esetben

egyrészt akkor emelkedhet meg az [Ca2+]IC, ha I/ a sejtek felszínén vannak olyan AMPA

receptorok is, amelyek nem tartalmaznak (editált) GluR2 alegységet, II/ ha az AMPA

receptorok aktivitása által depolarizált membránban elhelyezkedő VDCC-kon keresztül

Ca2+ ionok tudnak beáramlani a sejt belsejébe. Amennyiben a sejtek Ca2+-impermeábilis

AMPA receptorokat expresszálnak és nem tartalmaznak VDCC-t, ezzel a módszerrel

nem tudjuk kimutatni a funkcionális AMPA receptorokat. Az NE-7C2 sejtek

tenyészetében differenciálódó neuronok KCl-al történő depolarizációját Ca2+ ionok

beáramlása követte, bizonyítva a VDCC-k jelenlétét a vizsgált neuronok felszínén.

További kísérletes bizonyíték a VDCC-k csatornák jelenlétére, hogy az NMDA-által

kiváltott [Ca2+]IC emelkedést nifedipinnel és conotoxinnal is csökkenteni lehetett, ami az

L-típusú ill. neuron-specifikus VDCC-k jelenlétét, és az AMPA-kiváltott [Ca2+]IC

emelkedésben játszott szerepüket igazolja. Ezen mérések alapján azonban még nem

tudjuk megállapítani, hogy a jelen lévő AMPA receptorok tartalmaznak-e editált GluR2

alegységet vagy nem. Ennek az igen fontos kérdésnek az eldöntéséhez további

kísérletek elvégzésére van szükség.

E13 korból származó előagyi progenitorokon végzett vizsgálatok megmutatták,

hogy a folytonosan osztódó, még elkötelezetlen idegi progenitorok nem rendelkeznek

114

funkcionális AMPA receptorokkal (Maric et al., 2000). Az első Ca2+-permeábilis

AMPA receptorok a progenitorok utolsó osztódása idején detektálhatók a ventrikuláris

zónában található ill. az onnan kilépő sejteken (Maric et al., 2000), és úgy gondolják,

fontos szerepük lehet a proliferáció – differenciáció átmenet szabályozásában a VZ

területén. E13.5 embrionális korból származó szeletekben a KL és IZ sejtjei

funkcionális AMPA receptorokat expresszálnak, de NMDA receptorokat nem (Metin et

al., 2000). Amíg azonban az IZ sejtjei Ca2+-permeábilis AMPA receptorokkal

rendelkeznek, addig a KL területén Ca2+-permeábilis és impermeábilis receptorok

egyaránt előfordulnak (Maric et al., 2000). A differenciálatlan NE-7C2 sejtek AMPA

receptor expresszió tekintetében egy igen korai fejlődési állapotot – az utolsó osztódás

időszakát - reprezentálnak (Ca2+-permeábilis AMPA receptorokat expresszálnak), és az

AMPA receptor alegységek indukció során megállapított expressziós mintázata is jól

megfeleltethető az in vivo neurogenezis során megfigyelt alegység-expressziók időbeni

lefutásával.

A tenyésztés során használt tápközeg glutaminsav-tartalma (8-12 µm) elegendő

ahhoz, hogy aktiválja a GluR4 csatornákat. Az indukálatlan AMPA csatornáinak gátlása

a neuronszám egyértelmű emelkedését eredményezte, jelezve, hogy a mitótikusan aktív

progenitor sejteken jelenlévő AMPA receptorok egyik szerepe a differenciálatlan

állapot fenntartása, az osztódóképesség megőrzése lehet. A hatás kismértékűnek

mutatkozott az ATRA által előidézett neuronszám-változáshoz képest, ami jelzi, hogy

ezen folyamatok szabályozásában az AMPA receptorok által közvetített hatás csak

egyike a szabályozó mechanizmusoknak. Az AMPA receptorok gátlása a neuronális

indukció teljes időtartama alatt az alkalmazott magasabb koncentrációban képes volt

jelentős mértékben fokozni az ATRA által előidézett neurogenezist. A hatás jelentősnek

mutatkozott, mivel a tenyészetekben mért N-tubulin összmennyisége majdnem a

duplájára emelkedett. A redukciós-kapacitás mérések alapján a tenyészetekben a

sejtszám a kezelésektől függetlenül egyformának mutatkozott, így valószínűsíthető,

hogy a neuronok arányának növekedése és nem az összsejtszám változása a felelős a

mért magasabb értékért.

Ezen kísérletek bebizonyították, hogy mind az indukálatlan sejtek, mind az

indukált neuronok által expresszált AMPA receptorok aktiválódnak a tenyésztés során

és fontos szabályozó szerepet játszanak a differenciáció folyamatának szabályozásában.

115

A szignál-transzdukciós útvonal, amelyen keresztül az AMPA receptorok szabályozó

funkciója érvényesül, azonban nem ismert. Nagy valószínűséggel a receptorokon vagy a

VDCC-n keresztül beáramló Ca2+-ion, mint másodlagos hírvivő aktiválja a sejten belüli

jelátvivő kaszkádot és ezáltal kapcsolódhat olyan jelátviteli pályákhoz (MAP-Kináz

kaszlád), melyek a proliferáció / differenciáció szabályozását végzik (Hayashi et al.,

1999). Az NE-7C2 sejtek fenntartása során az AMPA receptorok extracelluláris

glutaminsav által történő aktivációja az osztódó / elkötelezetlen progenitor állapot

fenntartásában játszhat szerepet, mely az ATRA-kezelés által felülírható program.

Mivel azonban funkcionális AMPA receptort csak a sejtek egy részén sikerült

kimutatni, valószínűleg más folyamatok is nagy jelentőséggel bírnak ezen események

szabályozásában. Az indukált sejtek által expresszált AMPA receptorok egyik szerepe

lehet az egyidejűleg jelen lévő NMDA receptorok aktivációjához szükséges

depolarizáció megteremtése, mely eltávolítja a Mg2+-ionokat a receptor pórusából és

ezáltal az átjárhatóvá válik Ca2+-ionok számára.

II./3 A Ca2+-tranziensek jelentősége az idegrendszer embrionális fejlődése

során

Mára széles körben elterjedt az a tudományos felfogás, hogy az elektromos

aktivitás központi szerepet játszik az idegrendszer embrionális fejlődése során (Moody

et al., 1998). A fejlődés korai szakaszában ezt az aktivitást „spontán” elektromos

aktivitásnak nevezzük, és kialakulásában fontos szerepet tulajdonítanak az [Ca2+]IC

dinamikus változásainak. A fejlődés korai szakaszában a neuronok intracelluláris Ca2+-

szintjében két típusú tranziens emelkedést írtak le: a Ca2+-tüskét és a Ca2+-hullámot. A

tüskék és hullámok nem egyedi jelenségek, hanem egymást követő Ca2+-szint

emelkedések sorozatából állnak, melyek funkcióját az ismétlődések frekvenciája és

amplitúdója kódolja (Spitzer and Ribera, 1998; Spitzer et al., 2000). Az Xenopus

(karmosbéka) idegrendszer kialakulása során a Ca2+-tüskék szerepét leírták a korai K+-

áramok kifejlődésében (Desarmenien and Spitzer., 1991), a GABA immunreaktivitás

kialakulásában (Spitzer et al., 1993) és a GABA-szintetizáló GAD67 mRNS

transzkripciójának szabályozásában (Watt et al., 2000) is. A tranziens Ca2+-hullámok

eddig leírt legfontosabb szerepe a neurit növekedés irányítása (Gu et al., 1994; Spitzer

et al., 2000) a növekedési kúp területén a citoszkeletális átrendeződések szabályozása

116

által (Silver et al., 1990; Gomez et al., 1995). Fontos szerepet tulajdonítanak a Ca2+-

tranzienseknek továbbá a gén-expresszió transzkripciós és transzlációs szintű

szabályozásában is (Barish et al., 1998). Rágcsálókban a szinaptogenezis előtti

időszakban kimutatták a Ca2+-tranziensek szerepét a neuronok migrációjának

szabályozásában (Komuro and Rakic, 1992; 1996), a neuronok differenciációjában (Itoh

et al., 1997) és a neurális hálózatok kialakulásában (Wong et al., 1995).

A Ca2+-tranziensek kialakításában részt vesznek mindazok a receptorok és

ioncsatornák, amelyek lehetővé teszik a Ca2+-ionok mozgását az extracelluláris térből

ill. az intracelluláris raktárakból a citoplazma irányába. Az NE-7C2 sejtek neuronális

differenciációja során NMDA receptorok az indukció 10. napjától minden idegsejten

kimutathatók voltak, AMPA receptorral az indukálatlan ill. az indukált sejtek 10-20%-a

rendelkezett. Az [Ca2+]IC mérései megmutatták, hogy az NMDA és az AMPA is

megemelte a citoszolikus Ca2+-szintet jelezve, hogy az ionotróp glutamát receptorok

szerepet játszanak a Ca2+-tranziensek kialakításában. [Ca2+]IC további emelkedését

idézik elő a membrán depolarizációja által aktivált VDCC-k is, melyek közül mind az

általánosan előforduló L-típusú, mind a neuron-specifikus expresszióval jellemezhető

(N, P és Q-típus) csatornák jelenlétét is sikerült farmakológiai módszerrel kimutatnom

az indukció során.

Az [Ca2+]IC megemelkedése kiváltható a mGluR-ok aktiválásával is (Nakahara

et al., 1997). Ezen receptorok expresszióját nem vizsgáltam, de irodalmi adatok alapján

feltételezhető, hogy jelen vannak a korai neurális fejlődési stádiumokban (van den Pol

et al., 1998). [Ca2+]IC emelkedést idézhet elő továbbá a GABAA receptorok aktiválása is,

amelyek jelenlétét szintén igazolták VZ és IZ sejtjein (van den Pol et al., 1998; Métin et

al., 2000). Az extracelluláris térből beáramló Ca2+ ionok Ca2+-indukálta Ca2+-ürítést

idézhetnek elő az endoplazmatikus retikulumból (ER) RyR-on keresztül ill. a

metabotróp receptorok által aktivált InsP3R-n keresztül is. Az intracelluláris szabad

Ca2+-szintet befolyásoló receptorok és ioncsatornák valamint a sejten belüli Ca2+-

raktárak összehangolt működése alakítja ki azokat az [Ca2+]IC változási mintázatokat,

amelyek kódolják a neuronok számára a környezeti faktorok közvetítette szignálokat.

117

III. Az NE-7C2 sejtek indukálatlan állapotban ill. az indukció korai

szakaszában embrionális GAD fehérjéket expresszálnak, melyeket az érett

neuronokban felvált a felnőtt GAD65 forma

A gátló neurotranszmitter GABA és a szintéziséért felelős enzimek, a GAD

fehérjék, valamint a GABA szignalizációs útvonal egyéb komponensei (GABA

transzporterek és receptorok) már jóval a szinaptogenezis előtt jelen vannak a fejlődő

idegrendszerben. A GABA valószínűleg metabolikus komponensként és a sejtek közötti

kommunikáció paracrin/autokrin mediátoraként is működik (Varju et al., 2001a). In situ

hibridizációs vizsgálatok (Katarova et al., 2000a) alapján ma már tudjuk, hogy a

GAD65 és GAD67 mRNS-eket nagymértékben átfedő progenitor-populációk

szintetizálják és hasonlóan a fejlett idegrendszerhez, a két forma a sejten belüli

különböző GABA-raktárak feltöltésében juthat fontos szerephez az embrionális fejlődés

során is. A gerincvelő területén zajló neurogenezis legkorábbi fejlődési stádiumaiban

(Ma et al., 1992), de valószínűleg az idegrendszer más régióiban is (Behar et al., 1993;

Katarova et al., 2000a) az idegi progenitorok csak a rövidített, enzimatikusan inaktív

GAD25 fehérjét tartalmazzák és nincs bennük kimutatható mennyiségű GABA.

Technikai nehézségek miatt nem sikerült kimutatni GABA és különböző GAD formák

kolokalizációját, de eredményeim egyértelműen mutatják, hogy az in vitro neurogenezis

korai szakaszaiban csak az embrionális GAD formák vannak jelen, és expressziójuk

tranziens időbeni lefutást mutat.

A proliferáló NE-7C2 sejtek expresszálnak embrionális GAD mRNS formákat

és kimutatható bennük a GAD25 fehérje. A GABA-produkcióra képes fehérjeformák,

az embrionális GAD44, ill. a teljes hosszúságú GAD65 és GAD67 formák a folytonosan

osztódó, el nem kötelezett sejtekben nincsenek jelen. Indukálatlan sejtekben ill. a

differenciáció korai szakaszában immuncitokémiai módszerrel GABA-t nem sikerült

detektálni, amely alátámasztja az enzimatikus aktivitással rendelkező formák hiányát

ezekben a fejlődési stádiumokban. Az idegrendszer fejlődése során embrionális GAD

mRNS-t és GAD25 fehérje expressziót mutattak ki a VZ osztódó sejtjeiben (Ma et al.,

1992; Behar et al., 1993; 1994); pluripotens ES sejtekben (Bain et al., 1993) és

különböző sejtvonalakban is (Bain et al., 1993; Bond et al., 1990; Katarova Zóya nem

közölt eredményei). Mindezek alapján feltételezhető, hogy az embrionális GAD25

118

forma az idegsejtek elköteleződése és korai differenciációs folyamata során - ma még

nem ismert - szerepet játszhat.

Az enzimatikusan aktív GAD44 fehérje tranziens expressziót mutatott NE-7C2

sejtek indukciója során. A GAD44 expresszió időbeni eltolódása a GAD25 fehérjéhez

képest azt feltételezi, hogy az embrionális GAD transzkripció emelkedése során

elsőként az I-86 mRNS expresszálódik (GAD25 fehérjét kódolja), amelyet az I-80

mRNS expressziója követ, mely mind a két forma szintézisét lehetővé teszi. Az egér

idegrendszer embrionális fejlődése során hasonló szekvenciális expressziós mintázatot

figyeltek meg az I-80 és I-86 transzkriptumok esetében (Szabó et al., 1994).

Ellentétben a GAD25 formával, mely mind az elkötelezetlen, mind a

differenciálódott sejtekben jelen volt, a GAD44 fehérjeforma csak a neuron sajátságokat

mutató sejtekben expresszálódott. A konfokális mikroszkóp segítségével készített

felvételek alapján a sejtekben a GAD44 fehérje mind a sejttest marginális zónájában,

mind a nyúlványok proximális régiójában jelen volt. A GAD25 forma a neuronális

sejttestek mellett a nyúlványok teljes hossza mentén megtalálható volt, ami alapján

feltételezhetjük, hogy a két forma szubcelluláris lokalizációja nem teljesen átfedő.

A GAD25 és GAD44 fehérjék különböző régióit foglalják magukba a GAD67

fehérjének és valószínűleg különböző funkciókat látnak el a neuronális differenciáció

során. A GAD25 fehérje olyan szekvenciákat hordoz, amelyek a sejten belüli célba-

jutattását ill. a fehérje-fehérje interakciók kialakítását közvetítik a teljes hosszúságú

GAD67 fehérjén belül. A GAD44 fehérjétől függetlenül is tud szintetizálódni és

kódolására egy külön transzkriptum is specializálódott az embrionális fejlődés során.

Ennek alapján feltételezhető, hogy szabályozó szerepet játszik az idegi elköteleződés

során. A GAD44 fehérje a teljes hosszúságú GAD67 fehérjéből egy hosszabb régiót

tartalmaz, mely magába foglalja az enzim kofaktor-kötő régióját és enzimaktív

doménjét is. Korábbi in vitro mérési adatok alapján a fehérje képes a glutaminsavból

GABA-t előállítani (Szabó et al., 1994). Annak ellenére, hogy a GAD44 rendelkezik

enzimatikus aktivitással, fénymikroszkópos immuncitokémiai módszerrel nem sikerült

GABA-t kimutatni olyan korai differenciációs stádiumokban (4 DIV), ahol a GAD44

már expresszálódott. Igen alacsony (immuncitokémiai módszerrel nem kimutatható)

mennyiségű GABA (mikro- és fentomoláris) azonban már részt vehet biológiai

119

folyamatokban, és befolyásolhatja a progenitorok proliferációját (LoTurco et al., 1995)

és a fiatal neuronok migrációját (Behar et al., 1996; 1998).

A neurogenezis előrehaladtával mindkét embrionális forma expressziója

lecsökken és a teljes hosszúságú GAD67 fehérjét kódoló transzkriptum válik

meghatározóvá az indukció 10. napja után. Tehát – hasonlóan a fejlődő embrionális

idegrendszerhez – az in vitro neurogenezis során a GAD67 mRNS érési folyamata (az

embrionális 7-es exonok alternatív hasítása) a neuronális differenciáció során

szabályozott és meghatározott fejlődési stádiumokhoz köthető (Szabó et al., 1994).

Annak ellenére, hogy a GAD67 mRNS nagy mennyiségbn kimutatható volt az indukció

10. napjától, a teljes hosszúságú GAD67 fehérjét nem sikerült kimutatni egyetlen

fejlődési stádiumban sem. Valószínű, hogy transzlációs regulációs mechanizmusok is

befolyásolják a GAD67 fehérje mennyiségét. Eredményeink valószínűsítik, hogy a

GAD67 fehérje csak érett neuronokban ér el jelentős mennyiséget, amely állapot

azonban nem alakul ki az NE-7C2 sejtek in vitro neurogenezisének két hete alatt.

Xenopus embriókon végzett kísérletek megmutatták, hogy a kétéltűek

neurogenezise során a GABA immunreaktivitást (Spitzer et al., 1993) és az xGAD67

(Xenopus GAD67) mRNS expresszióját (Watt et al., 2000) a spontán kialakuló Ca2+-

tranziensek szabályozzák, és a mesterségesen előidézett Ca2+ -tranziensek hasonló

módon upregulálták a xGAD67 mRNS-t. A kísérletek azt is bebizonyították, hogy a

Ca2+-tranziensek frekvenciája a meghatározó az xGAD67 transzkripció szempontjából.

Hasonló változásokat az xGAD65 mRNS és fehérje esetében nem figyeltek meg (Pinal

et al., 1997), ami alátámasztja a két forma eltérő szerepét a neuronális fejlődés során.

Mai tudásunk alapján a gad65 génről egyféle transzkriptum íródik át. Igen

alacsony szintű GAD65 expresszió a neuronális differencició korai szakaszában (4-6

DIV) is kimutatható volt. Az mRNS expresszió a maximumát a 7. napon érte el, melyet

csak késéssel követett a GAD65 fehérje emelt szintje az indukció 10. napján. Az mRNS

és fehérje emelt expressziós szintje közötti eltolódás azt mutatja, hogy a fehérje

mennyisége mind transzkripciós, mind transzlációs szabályozó folyamatok kontrollja

alatt áll.

Az embrionális formák membrán-frakcióban való dúsulása azt feltételezi, hogy

ezen formák esetében a sejten belüli célba-juttatás mechanizmusa más, mint a teljes

hosszúságú GAD67 forma esetében, mely főleg citoplazmában lokalizált (Erlander et

120

al., 1991; Kaufman et al., 1991). Mivel az embrionális formák csak a 7-es exon által

kódolt aminosavakban térnek el a felnőtt formától, nagy valószínűséggel ezen fehérje-

részletek játszanak szerepet a fehérjék membránhoz való kiszállításában. A feltételezés

igazolásához további kísérletek szükségesek, melyek során a kérdéses aminosav-

részleteket más citoplazmatikus fehérjékhez kapcsolva vizsgálhatjuk azok sejten belüli

célba juttatását.

Annak ellenére, hogy mind a GAD65, mind az embrionális GAD formák a

durva-membrán frakcióval ülepedtek, a membránhoz való kötődésük módja eltért. Ezt

bizonyítja, hogy a GAD65 fehérje a TritonX-114 oldható membrán-frakcióban, míg az

embrionális GAD25 és GAD44 formák a TritonX-114 oldhatatlan membrán-frakcióban

dúsultak fel. Meg kell azonban említeni, hogy hasonlóan a GAD65 fehérjéhez, az

embrionális formák egy kis része a citoplazmában marad (immuncitokémiai

eredmények), ahogy azt eredetileg feltételezték a két fehérje szekvenciája alapján.

Hasonló eredményeket mutatott a két fehérje szubcelluláris lokalizációja transzfektált

sejtvonalakon és embrionális extraktumok esetében is (Katarova Z., publikálaltlan

eredmény).

A GABA jelenlétét immuncitokémiai módszerrel az indukció 6. napjától tudtam

kimutatni, amikor a domináns GAD forma a GAD44 volt. A GABA egyenletes eloszlást

mutatott a neuron alakú sejtekben és kirajzolta az axonális növekedési kúpokat is.

Hasonlóan az NE-7C2 sejtekhez, az idegrendszer korai fejlődési stádiumaiból izolált

fiatal idegsejtek is erősen GABA-immunreaktív nyúlványokkal és növekedési kúpokkal

jellemezhetők (Ganguly et al., 2001). Ezen adatok alapján feltételezhető, hogy a GABA

szerepet játszik a növekedési kúpok irányításában és ezáltal az axonok target-

szelekciójában is (Nguyen et al., 2001; Varju et al., 2001).

A GAD65 fehérje upregulációjával egyidőben a GABA megjelenik a

nyúlványok varikozitásaiban is, amelyek gyakorta jelzik a GABAerg sejtek axonjain a

szinapszisok differenciálódását (Umbriaco et al., 1995; Kanaani et al., 1999).

Feltételezhetően a varikozitásokban előforduló GABA előállításáért a GAD65 fehérje a

felelős, míg a GAD44 forma a sejttest és a proximális nyúlvány GABA-pozitivitását

okozza. További kísérletek szükségesek annak megállapítására, hogy milyen szintű

kolokalizációt mutatnak a különböző GAD formák és hogyan korrelál ezekkel a

mintázatokkal a GABA térbeli és időbeli megjelenése. Mindezen kísérletek közelebb

121

vihetnek bennünket annak a kérdésnek a megválaszolásához, hogy vajon milyen

szerepet játszanak az embrionális és felnőtt formák a különböző GABA-raktárak

feltöltésében. Az indukció késői szakaszában (10-12 DIV) a neuronális

nyúlványhálózatok stabilizálódásának idején az embrionális formák expressziója

nagymértékben lecsökken és a GAD65 forma lesz a domináns a sejtekben. A GAD65

fehérje upregulációjával egyidőben a sejtek GABA-tartalma is nő.

Az embrionális és felnőtt GAD mRNS és fehérje formák specifikus és időben

szabályozott megjelenése az embriogenezis során (Szabó et al., 1994) igen nagy

hasonlóságot mutat ahhoz a mintázathoz, amit az NE-7C2 sejtek in vitro

differenciációja során megállapítottam. Adataim azt jelzik, hogy a GAD fehérjék

expressziója és a GABA-akkumuláció megjelenése része az idegsejt fenotípus

kialakításának agyi környezetből kiszakított, regionális elköteleződés lehetőségével nem

rendelkező progenitor sejtek esetében is. A GABA termelés és akkumuláció korai

megjelenése azt sugallja, hogy a kismolekulájú aminosav-származék fontos szerepet

játszik az idegsejt képződésben. A molekuláris mechanizmus és a szerep tisztázása

további kísérleteket igényel, amelyekben az egysejt eredetű idegi progenitor vonalak

fontos modell-rendszert biztosíthatnak.

122

LEGFONTOSABB KÖVETKEZTETÉSEK

1. Az NE-7C2 sejtek ATRA-indukálta in vitro idegi elköteleződése során a

neurogenetikus folyamatok egyes lépései hasonló módon játszódnak le az in vivo

megfigyelt idegsejt fejlődés jelenségeihez. Az NE-7C2 sejtvonal tehát megfelelő in

vitro modell-rendszerként szolgálhat a glutaminsav és GABA neurogenezisben

játszott szerepének vizsgálatára.

2. Ionotróp glutamát receptorok az in vitro neurogenezis teljes időtartama alatt jelen

vannak. Funkcionális AMPA receptorok már elkötelezetlen progenitorsejteken is

megfigyelhetők és a progenitorok osztódásának szabályozásában is szerepet

játszanak, míg az NMDA receptorok később, a neuronok nyúlványosodásának

idején jelennek meg. A glutaminsav a neurogenezis folyamán mindvégig képes lehet

az intracelluláris Ca2+-szint szabályozására.

3. Annak ellenére, hogy a GABAerg fenotípus az indukció késői szakaszában jelenik

meg, a GABA-szintézisre képes enzimformák a neurogenezis korai stádiumaiban is

expresszálódnak. Ezen adatok alapján a korai GABA-szintézisnek a neurális

fenotípus kialakításában lehet jelentősége.

4. Az enzimatikus aktivitással nem rendelkező GAD25 forma jelenléte a még osztódó

progenitorokban és az újonnan kialakuló, fiatal neuronokban arra utal, hogy a

fehérje az idegi progenitorsejtek differenciációja során juthat fontos szerephez.

123

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Madarász Emíliának köszönöm, hogy irányítása mellet végezhettem

kutatómunkámat és hogy átsegített a szakdolgozat, majd a doktori fokozat megszerzése

során felmerülő nem kevés problémán. Az együtt töltött majd 8 év alatt nemcsak

felelősségteljes kutatót, de felnőtt embert is nevelt belőlem.

A laboratóriumban kialakult baráti légkör feledhetővé tette a sokszor

kudarcokkal járó kísérleteket és erőt adott a folytatáshoz. Köszönettel tartozom Környei

Zsuzsának, Schlett Katalinnak, Herberth Balázsnak, Jelitai Mártának, Tárnok

Krisztiánnak, Demeter Kornélnak, Koncz Péternek, Szlávik Vandának és Markó

Károlynak, amiért nemcsak munkatársaim, de barátaim is voltak az elmúlt időszakban.

Dr Schlett Katalinnak és Ulrich Eiselnek külön is szeretném megköszönni az elvégzett

PCR vizsgálatokat, amelyek jelentős mértékben hozzájárultak dolgozatom szakmai

színvonalának emeléséhez.

Köszönöm Dr Szabó Gábornak és Dr Katarova Zoyanak szakmai irányítását és

segítségét, az együtt végzett munka során lehetőségem nyílt molekuláris biológiai

módszerek elsajátítására. A munkacsoportjukkal közösen végzett kísérletek ill. publikált

cikkek doktori dolgozatom szerves részét képezik.

Köszönettel tartozom Dr Tretter Lászlónak és munkatársainak, valamint Dr

Környei Zsuzsának az extracelluláris glutamát-koncentráció fluorimetriás

meghatározásában nyújtott segítségükért.

Szeretném megköszönni Józsa Ildikónak, Csomor Zsuzsának, Vass Évának,

Barabás Liának, Vörös Erzsébetnek és Laczkó Ferencné Évi néninek a munkám során

nyújtott segítségüket.

Szeretném megköszönni Prof. Falus Andrásnak a lehetőséget, hogy konfokális

mikroszkópjukat a rendelkezésünkre bocsátotta és Dr Kovács Péternek pedig hálával

tartozom a képek elkészítése során nyújtott technikai segítségéért.

Családomnak nem tudom eléggé megköszönni feltétlen szeretetüket és

bizalmukat, amelyből mindig erőt tudtam meríteni.

124

IRODALOMJEGYZÉK

Agarwal V. R., Sato S. M. (1993) Retinoic acid affects central nervous system development of Xenopus

by changing cell fate. Mech. Dev., 44: 167-173.

Aghajanian G. K., and Bloom F. E. (1967) The formation of synaptic junctions in the developing rat

brain: a quantitative electron microscopic study. Brain Res., 6: 716-727.

Araneda R. C., Lan J-Y., Zheng X., Zukin S., and Bennett M. L. V. (1999) Spermine and arcaine block

and permeate N-methyl-D-aspartate receptor channels. Biophys. J., 76: 2899-2911.

Asada H., Kawamura Y., Maruyama K., Kume H., Ding R-G., Kanbara N., Kuzume H., Sanbo M., Yagi

T., Obata K. (1997) Cleft palate and decreased brain γ-aminobutyric acid in mice lacking the 67-

kDa isoform of glutamic acid decarboxylase. Proc. Natl. Acad. Sci. 94: 6496-6499.

Asahi M., Hoshimaru M., Hojo M., Matsuura N., Kikuchi H., and Hashimoto N. (1998) Induction of the

N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1 in the immortalized neuronal progenitor cell line

HC2S2 during neuronal differentiation into neurons. J. Neurosci. Res., 52: 699-708.

Asai D. J., and Remolana N. M. (1989) Tubulin isotype usage in vivo: a unique special distribution of the

minor neuronal-specific β-tubulin isotype in pheochromocytoma cells. Dev. Biol., 132: 398-409.

Bahn S., Volk B., and Wisden W. (1994) Kainate receptor gene expression in the developing rat brain. J.

Neurosci., 14: 5525-5547.

Bain G., Ramkumar T. P., Cheng J. M., and Gottlieb D. I. (1993) Expression of the genes coding for

glutamic acid decarboxylase in pluripotent cell lines. Mol. Brain Res., 17: 23-30.

Bally–Cuif L., Boncinelli E. (1997) Transcription factors and head formation in vertebrates. BioEssays,

19: 127–134.

Bardoul M., Drian M. J., and König N. (1997) AMPA/kainate receptors modulate the survival in vitro of

embryonic brainstem cells. Int. J. Dev. Neurosci., 15:695-701.

Barish M. E. (1998) Intracellular calcium regulation of channel and receptro expression in the

plasmalemma: potential sites of sensitivity along the pathways linking transcription, translation

and insertion. J. Neurobiol., 37: 146-157.

Bates S., and Vousden K. H. (1996) p53 in signaling checkpoint: arrest or apoptosis. Curr. Opin. Genet.

Dev., 6: 12-19.

125

Behar T., Schaffner A., Laing P., Hudson L., Komoly S., and Barker J. L. (1993) Many spinal cord cells

transiently express low molecular weight forms of glutamic acid decarboxylase during

embryonic development. Dev. Brain. Res., 72: 203-218.

Behar T., Ma W., Hudson L., and Barker J. L. (1994) Analysis of the anatomical distribution of GAD67

mRNA encoding truncated glutamic acid decarboxylase proteins in the embryonic rat brain. Dev.

Brain Res., 77: 77-87.

Behar T., Li Y-X., Tran H. T., Ma W., Dunlap V., Scott C., and Barker J. L. (1996) GABA stimulates

chemotaxis and chemokinesis of embryonic cortical neurons via calcium-dependent

mechanisms. J. Neurosci., 16: 1808-1818.

Behar T. N., Schaffner A. E., Scott C. A., O’Connell C., and Barker J. L. (1998) Differential response of

cortical plate and ventricular zone cells to GABA as a migration stimulus. J. Neurosci., 18:

6378-6387.

Belhage B., Hansen G. H., Elster L., Schousboe A. (1998) Effects of gamma-aminobutyric acid (GABA)

on synaptogenesis and synaptic function. Perpect. Dev. Neurobiol., 5: 235-246.

Bennet J. A., and DingledineR. (1995) Topology profile for a glutamate receptor: three transmembrane

domains and a channel lining reentrant membrane loop. Neuron, 14: 373-384

Bigge C. F. (1999) Ionotropic glutamate recptors. Curr. Opin. Chem. Biol. 3: 441-447.

Binder L. I., Frankfurter A., Kim H., Caceras A., Payne M. R., and Rebhun L. I. (1984) Heterogeneity of

microtubule-associated protein 2 during rat brain development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:

5613-5617.

Binder L. I., Frankfurter A., and Rebhun L. I. (1985) The distribution of tau in the mammalian central

nervous system. J. Cell. Biol., 101: 1371-1378.

Blahos J. and Wenthold R. J. (1996) Relationship between N-methyl-D-aspartate receptor NR1 splice

variants and NR2 subunits. J. Biol. Chem., 271: 15669-15674.

Bleakman D., Schoepp D. D., Ballyk B., Bufton H., Sharpe E. íf., Thomas K., Ornstein P. L., and Kamboj

R. K. (1996) Pharmacological discrimination of GluR5 and GluR6 kainate receptror subtypes by

(3S, 4aR, 6R, 8aR)-6-[2-(1(2)H-tetrazole-5-yl)ethyl)decahydroisoquinoline-3 carboxylic acid.

Mol. Pharmacol., 49: 581-585.

Bleakman D., and Lodge D. (1998) Neuropharmacology of AMPA and kainate receptors.

Neuropharmacology, 37:1187-204.

126

Bond R. W., Wyborsky R. J., and Gottlieb D. I. (1990) Developmentally regulated expression of an exon

containing a stop codon in the gene for glutamic acid decarboxylase. Proc. Natl. Acad. Sci., 87:

8771-8775.

Bond J. A., Wyllie F. S., and Wynford-Thomas D. (1994) Escape from senesence in human diploid

fibroblasts induced directly by mutant p53. Oncogene, 9: 1885-1889.

Bosma P. T., Blázquez M., Collins M. A., Bishop J. D., Drouin G., Priede I. G., Docherty K., and

Trudeau V. L. (1999) Multiplicity of glutamic acid decarboxylases (GAD) in vertebrates:

molecular phylogeny and evidence for a new GAD paralog. Mol. Evol. Biol., 16: 397-404.

Bradford M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein

using the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 72: 248-254.

Brewer G. J., and Cotman C. W. (1989) NMDA receptor regulation of neuronal morphology in cultured

hippocampal neurons. Neurosci Letters, 99: 268-273.

Brilliant M. H., Szabó G., Katarova Z., Kozak C. A., Glaser T. M., Greenspan R. J., and Housman D. E.

(1990) Sequences homologous to glutamic acid decarboxylase cDNA are present on mouse

chromosome 2 and 10. Genomics, 6: 115-122.

Brion J. P., Guilleminot J., Couchie D., Flament-Durand J., and Nunez J. (1988) Both adult and juvenile

tau microtubulue-associated proteins are axon specific in the developing and adult rat

cerebellum. Neuroscience, 25: 139-146.

Burnashev N., Khordorova A., Jonas P., Helm P. J., Wisden Q., Monyer H., Seeburg P. H., and Sakmann

B. (1992) Calcium permeable AMPA/kainate receptros in the fusiform cerebellar glial cells.

Science, 256: 1566-1570.

Catterall W. A. and Striessnig J. (1992) Receptor sites for Ca2+ channel antagonists. Trends Pharmacol.

Sci., 13: 256-262.

Chambon P. (1996) A decade of molecular biology of retinoic acid receptors. FASEB J., 10: 940–954.

Chang Y-C., and Gottlieb D. I. (1988) Characterisation of the proteins purified with monoclonal

antibodies to glutamic acid decarboxylase. J. Neurosci., 8: 2123-2130.

Chatterton J. E., Awobuluyi M., Premkumar L. S., Takahashi H., Talantova M., Shin Y., Cui J., Tu S.,

Sevarino K. A., Nakanashi N., Tong G., Lipton S. A., and Zhang D. (2002) Excitatory glycine

receptors containing the NR3 family of NMDA receptor subunits. Nature, 415: 793-798.

127

Cherubini E., Gaiarsa J. L., and Ben-Ari Y. (1991) GABA: an excitatory transmitter in early postnatal

life. Tends Neurosci., 14: 5115-519.

Chessler S. D., and Lernmark A. (2000) Alternative splicing of GAD67 results in the synthesis of a third

form of glutamic-acid decarboxylase in human islets and other non-neural tissues. J. Biol.

Chem., 275: 5188-92.

Christgau S., Schierbeck H., Aanstoot H. J., Aagaard L., Begley K., Kofod H., Hejnaes K., and

Baekkeskov S. (1991) Pancreatic beta cells express two autoantigenic forms of glutamic acid

decarboxylase, a 65-kDa hydrophilic form and a 64-kDa amphiphilic form which can be both

membrane-bound and soluble. J. Biol. Chem., 266: 21257-21264.

Christgau S., Aanstoot H. J., Schierbeck H., Begley K., Tullin S., Hejnaes K., and Baekkeskov S. (1992)

Membrane anchoring of the autoantigen GAD65 to microvesicles in pancreatic beta-cells by

palmitoylation in the NH2-terminal domain. J. Cell. Biol., 118: 309-320.

Ciabarra A. M., Sullivan J. M., Gahn L. G, Pecht G., Heinemann S., Sevarino K. A. (1995) Cloning and

characterization of χ-1: a developmentally regulated member of a novel class of the ionotropic

glutamate receptor family. J Neurosci., 15: 6498-508.

Condie B. G., Bain G., Gottlieb D. I., and Capecchi M. R. (1997) Cleft palate in mice with a targeted

mutation in the γ-aminobutyric acid-producing enzyme glutamic acid decarboxylase 67. Proc.

Natl. Acad. Sci., 94: 11451-11455.

Conlon R. A. (1995) Retinoic acid and pattern formation in vertebrates. Trends Genet., 11: 314–319.

Corcoran J. (1998) What are the molecular mechanisms of neural tube defects? Bioessays, 20: 6-8.

Curtis D. R., Phillis J. W., and Watkins J. C. (1959) Chemical excitation of spinal neurons. Nature, 183:

611-612.

Dahl D., and Bignami A. (1986) Neurofilament phosphorilation in development. A sign of axonal

maturation? Exp. Cell. Res., 162: 220-230.

Damjanov I., Clark R. K., Andrews P. W. 1(984) Cytoskeleton of human embryonal carcinoma cells. Cell

Differ. 15: 133-9.

Das S., Sasaki Y. F., Rothe T., Premkumar L. S., Takasu M., Crandall J. E., Dikkes P., Conner D. A.,

Rayudu P. V., Cheung W., Chen H-S. V., Lipton S. A., and Nakanashi N. (1998) Increased

NMDA current and spine density in mice lacking the NMDA receptor subunit NR3A. Nature,

393: 377-381.

128

Del Rio J. A., Martínez A., Auladell C., and Soriano E. (2000) Developmental history of the subplate and

developing white matter in the murine neocortex. Neuronal organisation and relationship with

the main afferent systems at embryonic and perinatal stages. Cereb. Cortex., 10: 784-801.

Desarmenien M. G., and Spitzer N. C. (1991) Role of calcium and protein kinase C in development of the

delayed rectifier potassium current in Xenopus spinal neurons. Neuron, 7: 797-805.

Donehower L. A., Harvey M., Slagle B. L., McArthur M. J., Montgomery C. A. Jr, Butel J. S., and

Bradley A. 1(992) Mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to

spontaneous tumours. Nature; 356: 215-221.

Dráberová E., Lukaš Z., Ivanyi D., Viklickỳ V., and Dráber P. (1998) Expression of class III β-tubulin in

normal and neoplastic human tissues. Histochem. Cell Biol., 109, 231-239.

Durston A. J., Timmermans J. P. M, Hage W. J., Hendriks H. F. J., de Vries N. J., Heideveld M.,

Nieuwkoop P. D. (1989) Retinoic acid causes an anteroposterior transformation in the

developing central nervous system. Nature, 340: 140-144.

Edwards M. K., S., and McBurney M. W. (1983) The concentration of retinoic acid determines the

differentiated cell types formed by a teratocarcinoma cell line. Dev. Biol., 98: 187-191.

Egebjerg J., and Heinmann S. F. (1993) Ca2+ permeability of unedited and edited versions of the kainate

selective glutamate receptror GluR6. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 755-759.

Ehlers M. D., Fung E. T., O´Brien R. J., and Huganir R. L. (1998) Splice variant-specific interaction of

the NMDA receptor subunit GluRζ1 with neuronal intermediate filaments. J. Neurosci., 18: 720-

730.

Erdö S. L., and Wolff J. R. (1990) γ-aminobutyric acid outside the mammalian brain. J. Neurochem., 54:

363-372.

Erlander M. G., Tillakaratne N. J. K., Feldblum S., Patel N., and Tobin A. J. (1991) Two genes encode

distinct glutamate decarboxylases. Neuron, 7: 91-100.

Fanarraga M. L., Avila J., and Zabala J. C. (1999) Expression of unphosphorilated class III β-tubulin

isotype in neuroepithelial cells demonstrates neuroblast commitment and differentiation. Eur. J.

Neurosci., 11: 517-527.

Ferreira A., and Caceras A. (1992) Expression of the class III β-tubulin isotype in developing neurons in

culture. J. Neurosci. Res., 32: 516-529.

129

Fletcher E. J., and Lodge D. (1996) New developments in the molecular pharmacology of AMPA and

kainate receptors. Pharmacol. Ther., 70: 65-89.

Flint A. C., Dammerman R. S., and Kriegstein A. R. (1999) Endogenous activation of metabotropic

glutamate receptors in neocortical development causes neuronal calcium oscilations. Proc. Natl.

Acad. Sci., 96: 12144-12149.

Furuta A., Rothstein J. D., and Martin L. J. (1997) Glutamate transporter protein subtypes are expressed

differentially during rat CNS development. J Neurosci., 17: 8363-75.

Gallo V., Pende M., Scherer S., Molne M., and Wright P. (1995) Expression and regulation of kainate and

AMPA receptors in uncommitted and committed neural progenitors. Neurochem. Res., 20: 549-

560.

Ganguly K., Schinder A. F., Wong S. T., and Poo M. (2001) GABA itself promotes the developmental

switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell, 105: 521-32.

Gao X-B., van den Pol A. N. (2000) GABA release from mouse axonal growth cones. J. Physiol., 523:

629-637.

Gilbert S. F. (1991) Developmental Biology. Third edition, Sinauer Associates, Inc. Sunderland,

Massachusettes; 155-200 oldalak.

Green L. A., and Tischler A. S. (1976) Establishement of a noradrenergic clonal line of rat adrenal

pheochromocytoma cells which respond to nerve growth factor. Proc. Natl. Acad. Sci., 73: 2424-

2428.

Gomez T. M., Snow D. M., and Letourneau P. C. (1995) Characterisation of spontaneous calcium

transients in nerve growth cones and their effect on growth cone migration. Neuron, 14: 1233-

1246.

Gryenkiewicz G., Poenie M., and Tsien R.Y. (1985) A new generation of Ca2+ indicators with greatly

improved fluorescence properties. J. Biol. Chem., 260: 3440-3450.

Gu X., Olson E. C., and Spitzer N. C. (1994) Spontaneous neuronal calcium spikes and waves during

early differentiation. J. Neurosci., 14: 6325-6335.

Hall R. A., and Soderling T. R. (1997) Differential surface expression and phosphorilation of N-methyl-

D-aspartate receptor subunits NR1 and NR2 in cultured hippocampal neurons. J. Biol. Chem.,

272: 4135-4140.

130

Hall R. A., Hansen A., Andersen P. H., and Soderling T. R. (1997) Surface expression of the AMPA

receptor subunits GluR1, GluR2, and GluR4 in stably transfected baby hamster kidney cells. J.

Neurochem., 68: 625-630.

Hansen G. H., Belhage B., Schousboe A., and Meier E. (1987) Temporal development of GABA agonist

induced alterations in ultrastructure and GABA receptor expression in cultured cerebellar

granule cells. Int. J. Dev. Neurosci., 5: 263-269.

Hansen J. J., Flemming J. S., Lund T. M., Nielsen B., Reinhardt A., Breum I., and Krogsgaard-Larsen P.

(1995) AMPA receptor agonists: structural, conformational and stereochemical aspects.

Krogsgaard-Larsen P. Hansen J. J. (Eds) Excitatory amino acid receptors: Design of agonists

and antagonists. Ellis Horwood, Chichester, UK.

Harvey M., Sands A. T., Weiss R. S., Hegi M. E., Wiseman R. W., Pantazis P., Giovanella B. C., Tainsky

M. A., Bradly A., and Donehower L. A. (1993) In vitro growth characteristics of embryo

fibroblasts isolated from p53-deficient mice. Oncogene, 8: 2457-2467.

Hayashi T., Umemori H., Mishina M., Yamamoto T. (1999) The AMPA receptor interacts with and

signals through the protein tyrosine kinase Lyn. Nature, 397: 72-6.

Haydar T. F., Wang F., Schwartz M. L., and Rakic P. (2000) Differential modulation of proliferation in

the neocortical ventricular and subventricular zones. J. Neurosci., 20: 5764-5774.

Henion P. D., and Weston J. A. (1994) Retinoic acid selectively promotes the survival and proliferation of

neurogenic precursors in cultured neural crest cell populations. Dev. Biol., 161: 243-250.

Herberth B., Pataki Á., Jelitai M., Schlett K., Deák F., Spät A., and Madarász E. (2002) Changes of KCl

sensitivity of proliferating neural progenitors during in vitro neurogenesis. J. Neurosci. Res., 67:

574-582.

Herkert M., Röttger S., and Becker C. (1998) The NMDA receptor subunit NR2B of neonatal rat brain:

complex formation and enrichment in axonal growth cones. Eur. J. Neurosci. 10, 1553-1562.

Hollmann M., Hartley M., and Heinemann S. (1991) Ca2+ permeability of KA-AMPA--gated glutamate

receptor channels depends on subunit composition. Science 252: 851-3.

Hollmann M., Boulter J., Maron C., Beasley L., Sullivan J., Pecht G., and Heinemann S. (1993) Zinc

potentiates agonist-induced currents at certain splice variants of the NMDA receptor. Neuron,

10: 943-954.

Hollmann M., and Heinemann S. (1994) Cloned glutamate receptors. Annu. Rev. Neurosci., 17: 31-108.

131

Hughes P. E., Alexi T., and Schreiber S. S. (1997) A role for the tumour suppressor gene p53 in

regulating neuronal apoptosis. Neuroreport. 8: 5-12.

Huh K-H., and Wenthold R. J. (1999) Turnover analyses of glutamate receptors identifies a rapidly

degraded pool of the N-methyl-D-aspartate receptor subunit, NR1, in cerebellar granule cells. J.

Biol. Chem., 274: 151-157.

Hume R. I., Dingledine R., and Heinemann S. F. (1991) Identification of a site in glutamate receptor

subunits that controls calcium permeability. Science, 253: 1028-1030.

Hsu C-C., Davis K. M., Jin H., Foos T., Floor E., Chen W., Tyburski J. B., Yang C-Y., Schloss J. V., and

Wu J-Y. (2000) Association of L-glutamic acid decarboxylase to the 70-kDa heat shock protein

as a potential anchoring mechanism to synaptic vesicles. J. Biol. Chem., 275: 20822-20828.

Imrik P., and Madarasz E. (1991) Importance of cell-aggregation during induction of neural

differentiation in PCC-7 embryonal carcinoma cells. Acta Physiol Hung.;78: 345-58.

Itoh K., Ozaki M., Stevens B., and Fields R. D. (1997) Activity-dependent regulation of N-cadherin in

DRG neurons: Differential regulation of N-cadherin , NCAM and L1 by distinct patterns of

action potentials. J. Neurobiol., 33: 735-748.

Ji F, Kanbara N, Obata K (1999) GABA and histogenesis in fetal and neonatal brain lacking both the

isoforms of glutamic acid decarboxylase. J. Neurosci. Res. 33:187-194.

Jones-Villeneuve E. M. V., McBurney M. W., Rogers K. A., and Kalnins V. I. (1982) Retinoic acid

induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. J. Cell Biol. 94:

253-262.

Jonas P., and Burnashev N. (1995) Molecular mechanisms controlling calcium entry through AMPA-type

glutamate channels. Neuron, 15: 987-990.

Kanaani J., Lissin D., Kash S. F., and Baekkeskov S. (1999) The hydrophilic isoform of glutamate

decarboxylase, GAD67, is targeted to membranes and nerve terminals independent of

dimerisation with the hydrophobic membrane-anchored isoform, GAD65. J. Biol. Chem., 274:

37200-37209.

Kang M. K., and Park N. H. (2001) Conversion of normal to malignant phenotype: telomere shortening,

telomerase activation, and genomic instability during immortalization of human oral

keratinocytes. Crit Rev Oral Biol Med, 12: 38-54.

Kash S. F., Johnson R. S., Tecott L. H., Noebels J. L., Mayfield R. D., Hanahan D., and Baekkeskov S.

(1997) Epilepsy in mice deficient in the 65-kDa isoform of glutamic acid decarboxylase. Proc.

Natl. Acad. Sci., 94: 14060-14065.

132

Katarova Z., Szabó G., Mugnaini M., and Greenspan R. J. (1990) Molecular identification of the 62 kd

form of glutamic acid decarboxylase from mouse. Eur. J. Neurosci., 2: 190-202.

Katarova Z., Sekerková G., Prodan S., Mugnani E., and Szabó G. (2000a) Domain-restricted expression

of two glutamic acid decarboxylase in midgestation mouse embryos. J. Comp. Neurol., 424:

607-627.

Katarova Z, McIlhinney JAR, Churchill G and Szabó G (2000b) Subcellular distribution and activity of in

vitro expressed glutamic acid decarboxylase (GAD) forms. Eur. J. Neurosci., 12: Suppl. 11, p.

42.

Kaufman D. L., Houser C. R., and Tobin A. J. (1991) Two forms of the gamma-aminobutyric acid

synthetic enzyme glutamate decarboxylase have distinct intraneuronal distribution and cofactor

interaction. J. Neurochem., 56: 720-723.

Kawai F., and SterlingP. (1999) AMPA receptors activates a G-protein that supresses a cGMP-gated

current. J. Neurosci., 19: 2954-2959.

Keinänen A., Arvola M., Kuusinen A., and Johnson M. (1997) Ligand recognition in glutamate receptors:

insights from mutagenesisof the soluble alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic

acid (AMPA)-binding domain of glutamate receptor type D (GluR-D). Biochem. Soc. Trans., 25:

835-838.

Kelly B. M., Gillespie C. S., Sherman D. L., and Brophy P. J. (1992) Schwann cells of the myelin-

forming phenotype express neurofilament protein NF-M. J. Cell. Biol., 118: 397-410.

Kim H. Y., Sapp D. W., Olsen R. W., and Tobin A. J. (1994) GABA alters GABAA receptor mRNAs and

increases ligand binding. J. Neurochem., 62: 2334-2337.

Komuro H., and Rakic P. (1992) Selective role of N-type calcium channels in neuronal migration.

Science, 257: 806-809.

Komuro H., and Rakic P. (1993) Modulation of neuronal migration by NMDA receptors. Science, 260:

95-97.

Komuro H., and Rakic P. (1996) Intracellular Ca2+-fluctuations modulate the rate of neuronal migration.

Neuron, 17: 275-285.

Kornau H. C., Schenker L. T., Kennedy M. B., and Seeburg P. (1995) Domain interaction between

NMDA receptor subunits and the postsynaptic density protein PSD-95. Science, 269: 1737-1740.

133

Köhler M., Burnashev N., Sakmann B., and Seeburg P. H. (1993) Determinants of calcium permeability

in bith TM1 and TM2 of high affinity kainate receptor channels: diversity by RNA editing.

Neuron, 10: 491-500.

Krizbai I. A., Katarova Z., Szabó G., Parducz A., and Wolff J. R. (2000) Modulation of the truncated

GAD25 by estrogen in the olfactory bulb of adult rats. Neuroreport, 11: 791-794.

Krogsgaard-Larsen P., Madsen U., Ebert B., and Hansen J. J. (1994) Krogsgaard-Larsen P. Hansen J. J.

(Eds) Excitatory amino acid receptors: Design of agonists and antagonists. Ellis Horwood,

Chichester, UK.

Laemmli U. K. (1970) Cleavage of stuctural proteins during the assembly of the head of bacteriophage

T4. Nature, 227: 680-685.

Lauder J. M., Han V. K. M., Henderson P., Verdoorn T., and Towle A. C. (1986) Prenatal ontogeny of

the GABAergic system in the rat brain: an immunocytochemical study. Neuroscience, 19: 465-

493.

Lauder J. M. (1993) Neurotransmitters as growth regulatory signals: the role of receptors and second

messengers. Trends Neurosci., 16: 233-240.

Laurie D. J., Wisden W., and Seeburg P. H. (1992) The distribution of thirteen GABAA receptor subunit

mRNAs in the rat brain. III. Embryonic and postnatal development. J. Neurosci., 12: 41511-

41172.

Laurie D. J., and Seeburg P. H. (1994) Regional and developmental heterogeneity in splicing of the rat

brain NMDAR1 mRNA. J. Neurosci., 14: 3180-3194.

Laurie D. J., Bartke I., Schoepfer R., Naujoks K., and Seeburg P. H. (1997) Regional, developmental and

interspecies expression of the four NMDAR2 subunits, examined using monoclonal antibodies.

Mol. Brain. Res., 51: 23-32.

Lazarewicz J. W., Wrob1ewski J. T., Palmer M. E., and Costa E. (1989) Reduction of disulfide bonds

activates NMDA sensitive glutamate receptors in primary cultures of cerebellar granule cells.

Neurosci. Res. Commun., 4: 91-97.

Lee M. K., and Cleveland D. W. (1996) Neuronal intermediate filaments. Annu. Rev. Neurosci., 19: 187-

217.

Lee Y-H., Fang K-M., Yang C-M., Hwang H-M., Chiu C-T., and Tsai W. (2000) Kainic acid induced

neurotrophic activities in developing cortical neurons. J. Neurochem., 74: 2401-2411.

134

Lendhal U., Zimmerman L., and McKay R. (1990) CNS stem cells express a new class of intermediate

protein. Cell, 60: 585-595.

Lerma J., Paternain A. V., Rodríguez-Moreno A., and López-García J. C. (2001) Molecular Physiology of

Kainate receptors. Pharmacol. Rev., 81: 971-998.

Lewis S. A., and Cowan N. J. (1988) Complex regulation and functional versatility of mammalian α− and

β-tubulin isotypes during differentiation of testis and muscle cells. J. Cell. Biol., 106: 2023-

2033.

Lin J. W., Wyszynski M., Madhavan R., Sealock R., Kim J. U., and Shang M. (1998) Yotiao, a novel

protein of neuromuscular junction and brain that interacts with specific splice variants of NMDA

receptor subunit GluRζ1. J. Neurosci., 18: 2017-2027.

Lipton S. A. and Kater S. B. (1989) Neurotransmitter regulation of neuronal outgrowth, plasticity and

survival. Trends Neurosci., 112: 265-270.

Livingstone L. R., White A., Sprouse J., Livanos E., Jacks T., and Tisty T. D. (1992) Altered cell cycle

arrest and gene amplification potential accompany loss of wild type p53. Cell, 70: 923-935.

Lomeli H., Mosbacher J., Melcher T., Hoger T., Geiger J. R. P., Kuner T., Monyer H., Higuchi M., Bach

A., and Seeburg P. H. (1994) Control of kinetic properties of AMPA receptor channels by

nuclear RNA editing. Science, 266: 1709-1713.

LoTurco J. J., Blanton M. G., and Kriegstein A. R. (1991) Initial expression and endogenous activation of

NMDA channels in early neocortical development. J. Neurosci., 11: 792-799.

LoTurco J. J., Owens D. F., Heath M. J. S., Davis M. B. E., and Kriegstein A. R. (1995) GABA and

glutamate depolarise cortical progenitor cells and inhibit DNA synthesis. Neuron, 15: 255-262.

Lovinger D. M., White G., and Weight F. F. (1989) Ethanol inhibites NMDA-activated ion current in

hippocampal neurons. Science, 243: 1721-1724.

Lumsden A., and Krumlauf R. (1996) Patterning the vertebrate neuraxis. Science, 274: 1109–1114.

Ma W., Behar T., Maric D., Maric I., Barker J. L. (1992) Neuroepithelial cells in the rat spinal cord

express glutamate decarboxylase immunoreactivity in vivo and in vitro. J. Comp. Neurol., 325:

257-270.

Ma W., and Barker J. L. (1995) Complementary expression of transcripts encoding GAD67 and GABAA

receptor α4, β1 and γ1 subunits in the proliferative zone of the embryonic rat central nervous

system. J. Neurosci., 15: 2547-60.

135

Ma W., Liu Q. Y., Maric D., Sathanoori R., Chang Y. H., and Barker J. L. (1998) Basic FGF-responsive

telencephalic precursor cells express functional GABA(A) receptor/Cl-channels in vitro. J

Neurobiol., 35:2 77-86.

Madden D. R. (2002) The structure and function of glutamate receptor ion channels. Nat. Rev. Neurosci.

31: 91-101-

Manabe I., and Owens G. K. (2001) Recruitment of serum response factor and hyperacetylation of

histones at smooth muscle-specific regulatory regions during differentiation of a novel P19-

derived in vitro smooth muscle differentiation system. Circ Res. 88: 1127-34.

Manzoni O., Prezeau L., Marin P., Bockaert J., and Fagni L. (1992) Nitric oxide-induced blockade of

NMDA receptors. Neuron, 8: 653-662.

Maric D., Liu Q-Y., Grant G. M., Andreadis J. D., Hu Q., Chang Y. H., Barker J., Pancrazio J. J., Stenger

D. A., and Ma W. (2000) Functional ionotropic glutamate receptors emerge during terminal cell

division and early neuronal differentiation of rat neuroepithelial cells. J. Neurosci. Res., 61: 652-

662.

Marshall H., Studer M., Pöpper H., Aparicio S., Kuroiwa A., Brenner S., Krumlauf R. (1994) A

conserved retinoic acid response element required for early expression of the homeobox gene

Hoxb-1. Nature, 370: 567-571.

Martin D. L., and Rimvall K. (1993) Regulation of gamma-aminobutyric acid synthesis in the brain. J.

Neurochem., 60: 395-407.

Martin D. L., Hongcheng L., Martin S. B., and Wu S. J. (2000) Structural features and regulatory

properties of the brain glutamate decarboxylases. Neurochem. Int., 37: 111-119.

Mayer M. L., and Vyklicky L. Jr. (1989) Concanavalin A selectively reduces desensitization of

mammalian neuroneal quisqualate receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1411-1415.

Mayer M. (1998) Ion-binding sites in NMDA receptors: classical approaches provide the numbers.

Nature Neurosci., 1: 433-434.

McBurney M. W., Jones-Villeneuve E. M., Edwards M. K. S., and Anderson P. J. (1982) Control of

muscle and neuronal differentiation in a cultured embryonal carcinoma cell line. Nature, 299:

165-167.

McCool B. A., Pin J-P., Harpold M. M., Brust P. F., Stauderman K. A., and Lovinger D. M. (1998) Rat

group I metabotropic glutamate receptors inhibit neuronal Ca2+ channels via multiple signal

transduction pathways in HEK 293 cells. J. Neurophysiol., 79: 379-391.

136

McIlhinney R. A. J., Molnár E., Atack J. R., and Whiting P. J. (1996) Cell surface expression of the

human N-methyl-D-aspartate receptor subunit 1a requires the co-expression of the NR2A

subunit in transfected cells. Neuroscience, 70: 989-997.

McIlhinney R. A. J., Le Bourdellés B., Molnár E., Tricaud N., Streit P., and Whiting P. J. (1998)

Assembly, intracellular targeting and cell surface expression of the human N-methyl-D-aspartate

receptor subunits NR1a and NR2A in transfected cells. Neuropharmacology, 37: 1355-1367.

Meguro H., Mori H., Araki K., Kushiya E., Kutsuwada T., Yamazaki M., Kumanishi T., Arakawa M.,

Sakimura K., and Mishina M. (1992) Functional characterization of a heteromeric NMDA

receptor channel expressed from cloned cDNAs. Nature, 357: 70-74.

Meier E., Hertz L., and Schousboe A. (1991) Neurotransmitters as developmental signals. Neurochem.

Int., 19: 1-15.

Menezes J. R. L., and Luskin M. B. (1994) Expression of neuron-specific tubulin defines a novel

population in the proliferative layers of the developing telencephalon. J. Neurosci., 14: 5399-

5416.

Metz T., Harris A. W., and Adams J. M. (1995) Absence of p53 allows direct immortalization of

hematopoietic cells by the myc and raf oncogenes. Cell, 82: 29-36.

Métin C., Denizot J. P., and Ropert N. (2000) Intermediate zone cells express calcium-permeable AMPA

receptors and establish close contact with growing axons. J Neurosci., 20: 696-708.

Miranda-Contreras L., Mendoza-Briceno R. V., and Palacios-Pru E. L. (1998) Levels of monoamine and

amino acid neurotransmitters in the developing male mouse hypothalamus and in histotypic

hypothalamic cultures. Int J Dev Neurosci., 16: 403-12.

Miranda-Contreras L., Benitez-Diaz P. R., Mendoza-Briceno R. V., Delgado-Saez M. C., and Palacios-

Pru E. L. (1999) Levels of amino acid neurotransmitters during mouse cerebellar neurogenesis

and in histotypic cerebellar cultures. Dev Neurosci., 21: 147-58.

Miranda-Contreras L., Ramirez-Martens L. M., Benitez-Diaz P. R., Pena-Contreras Z. C., Mendoza-

Briceno R. V., and Palacios-Pru E. L. (2000) Levels of amino acid neurotransmitters during

mouse olfactory bulb neurogenesis and in histotypic olfactory bulb cultures. Int J Dev Neurosci.,

18: 83-91.

Mishina M., Sakimura K., Mori H., Harabayashi M., Uchino S., and Nagahari K. (1991) A single amino

acid residue determinates the Ca2+ permeability of AMPA selective glutamate receptor channels.

Biochem. Biophys. Res. Commun., 180: 813-821.

137

Moody W. J. (1998) Control of spontaneous activity during development. J. Neurobiol., 37: 97-109.

Monyer H., Seeburg P. H., and Wisden W. (1991) Glutamate operated channels: Developmentally early

and mature forms arise by alternative splicing. Neuron, 6: 799-810.

Monyer H., Sprengel R., Schoepfer R., Herb A., Higuchi M., Lomeli H., Burnashev N., Sakmann B., and

Seeburg P (1992) Heteromeric NMDA receptors: molecular and functional distinction of

subtypes. Science, 256: 1217-1221.

Monyer H., Burnashev N., Lauri D. J., Sakmann B., and Seeburg H. (1994) Developmental and regional

expression in the rat brain and functional properties of four NMDA receptors. Neuron, 12: 529-

540.

Mori H, and Mishina M. (1995) Structure and function of NMDA receptor channel. neuropharmacology,

34: 1249-1237.

Mosmann T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation

and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 65: 55-63.

Mothet J-P., Parent A. T., Wolosker H., Brady R. O., Linden D. J., Ferris C. D., Rogawski R. A., and

Snyder S. H. (2000) D-serine is an endogenous ligand for the glycine site of N-methyl-D-

aspartate receptor. Proc. Natl. Acad. Sci., 97: 4926-4931.

Murphy A., Breen K. C., Long A., Feighery C., Casey E. B., and Kelleher D. (1993) Neurofilament

expression in human T-lymphocytes. Immunology, 79: 167-170.

Nakahara K., Okada M., and Nakanashi S. (1997) The metabotropic glutamate receptor mGluR5 induces

calcium oscillations in cultured astrocytes via protein kinase C phosphorylation. J. Neurochem.,

69: 1467-1475.

Nakanashi N., Shneider N. A.., and Axel R. (1990) A family of glutamate receptor genes: evidence for

the formation of heteromultimeric receptors with distinct channel properties. Neuron, 5: 569-581

Nishimura S., Hzuka M., Wakamori M., Akiba I., Imoto K., and Barsoumian E. L. (2000) Stable

expression of human homomeric and heteromeric AMPA receotir subunits in HEK293 cells.

Rec. Channels., 7: 139-150.

Nguyen L., Rigo J-M., Rocher V., Belachew S., Malgrange B., Rogister B., Leprince P., and Moonen G.

(2001) Neurotransmitters as early signals for central nervous system development. Cell Tissue

Res., 305: 187-202.

138

Obata K., Fukuda T., Konishi S,. Ji F-Y., Mitoma H., and Kosaka T. (1999) Synaptic localization of the

67,000 mol. Wt isoform of glutamate decarboxylase and transmitter function of GABA in the

mouse cerebellum lacking the 65,000 mol. Wt isoform. Neuroscience, 93: 1475-1482.

Okabe S., Miwa A., and Akado H. (1999) Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell

surface expression of the NMDA receptor GluRζ1 subunit. J. Neurosci. 19: 7781-7792.

Owens D. F., Boyce L. H., Davis M. B. E., Kriegstein A. R. (1996) Excitatory GABA responses in

embryonic and neonatal cortical slices demonstrated by gramicidin perforated-patch recording

and calcium imaging. J. Neurosci., 16: 6414-6423.

Owens D. F., Liu X., and Kriegstein A. R. (1999) Changing properties of GABA(A) receptor-mediated

signalling during early neocortical development. J Neurophysiol., 82: 570-83.

Paschen W., Schmitt J., Gissel C., and Dux E.. (1997) Developmental changes of RNA editing of

glutamate receptor subunits GluR5 and GluR6: in vivo versus in vitro. Dev. Brain Res., 98: 271-

280.

Paupard M-C., O'Connell M. A., Gerber A. P., Zukin R. S. (2000) Patterns of developmental expression

of the RNA editing enzyme rADAR2. Neuroscience., 95: 869-79.

Pérez-Otaño I., Schulteis C. T., Contractor A., Lipton S. A., Trimmer J. S., Sucher N. J., and Heinemann

S. F. (2001) Assembly with the NR1 subunit is required for surface expression of NR3A-

containing NMDA receptors. J. Neurosci., 21: 1228-1237.

Peters G. (1994) Stifled by inhibitions. Nature, 371: 204-205.

Pfeiffer S.E., Jakob H., Mikoshiba K., Dubois P., Guenet J.L., Nicolas J.F., Gaillard J., Chevance G., and

Jacob F. (1981) Differentiation of a teratocarcinoma line: preferential development of

cholinergic neurons. J Cell Biol, 88: 57-66.

Pinal C. S., Cortessis V., and Tobin A. J. (1997) Multiple elements regulate GAD65 transcription. Dev.

Neuroci., 19: 465-475.

van den Pol A. N., Gao X-B., Patrylo P. R., Ghosh P. K., and Obrietan K. (1998) Glutamate inhibits

GABA excitatory activity in developing neurons. J. Neurosci., 18: 10749-10761.

Portera-Cailliau C., Price D. L., and Martin L. J. (1996) N-Methyl-D-Aspartate receptor proteins NR2A

and NR2B are differentially distributed in the developing rat central nervous sytem as revealed

by subunit-specific antibodies. J. Neurochem., 66: 692-700.

139

Prybylowski K., Rumbaugh G., Wolfe B. B., and Vicini S. (2000) Increased exon 5 expression alters

extrasynaptic NMDA receptors in cerebellar neurons. J. Neurochem., 75: 1140-1146.

Reichling D. B., Kyrozis A., Wang J., MacDermott A. B. (1994) Mechanisms of GABA and glycine

depolarization-induced calcium transients in rat dorsal horn neurons. J. Physiol., 476: 411-421.

Riederer B., and Matus A. (1985) Differential expression of distinct microtubule-associate proteins during

brain development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6006-6009.

Riederer B., Cohen R., and Matus A. (1986) MAP5: a novel microtubule-associate protein under strong

developmental regulation. J. Neurocytol., 15: 763-775.

Riederer B., Zagon I. M., and Goodman S. R. (1987) Brain spectrin (240/235) and brain spectrin

(240/235E): differential expression during mouse brain development. J. Neurosci., 7: 864-874.

Riederer B. M., Monnet-Tschudi F., and Honegger P. (1992) Development and maintanance of the

neuronal cytoskeleton in aggregated cell cultures of fetal rat telencephalon and influence of

elevated K+ concentrations. J. Neurochem., 58: 649-658.

Rivera C., Voipio .J, Payne J. A., Ruusuvuori E., Lahtinen H., Lamsa K., Privola U., Saarma M., and

Kaila K. (1999) The K+/Cl- co-transporter KCC2 renders GABA hyperpolarising during

neuronal maturation. Nature 397: 251-255.

Roberson M. D., Toews A. D., Goodrum J. F., and Morell P. (1992) Neurofilament and tubulin mRNA

expression in Schwann cells. J. Neurosci. Res., 33: 156-162.

Rodriguez-Moreno A., and Lerma J. (1998) Kainate receptor modulation of GABA release involves a

metabotropic function. Neuron, 20: 1211-1218.

Rooke J. E., and Xu T. (1998) Positive and negative signals between interacting cells for establishing

neural fate. Bioessays, 20: 209-14.

Rosemund C., Stein-Bach Y., and Stevens C. (1998) The tetrameric structure of a glutamate receptor

channel. Science, 280: 1596-1599.

Rumbaugh G., Prybylowski K., Wang J. F., and Vicini S. (2000) Exon 5 and spermine regulate

deactivation of NMDA receptor subtype. J. Neurophysiol., 83: 1300-1306.

Sah D. W., Ray J., and Gage F. H. (1997) Regulation of voltage- and ligand-gated currents in rat

hippocampal progenitor cells in vitro. J Neurobiol., 32: 95-110.

Sakimura K., Morita T., Kushiya E., and Mishina M. (1992) Primary structure and expression of the γ2

subunit of the glutamate receptro channel selective for kainate. Neuron, 8: 267-274.

140

Sather W. A., Tanabe T., Zhang J.-F., Mori Y., Adams M. E., and Tsien R. W. (1993) Distinctive

biophysical and pharmacological properties of class A (BI) calcium channel α1 subunits. Neuron

11: 291-303.

Schererer S. E. and Gallo V. (1998) Expression and regulation of kainate and AMPA receptors in the rat

neural tube. J. Neurosci. Res. 52: 356-368.

Schlett K., and Madarász E. (1997) Retinoic acid induced neural differentiation in a neuroectodermal cell

line immortalised by p53-deficiency. J. Neurosci. Res. 47: 405-417.

Serafini R., Ma W., Maric D., Maric I., Lahjouji F., Sieghart W., and Barker J. (1998) Initially expressed

early rat embryonic GABAA receptor Cl- ion channel exhibit heterogeneous channel properties.

Eur. J. Neurosci., 10: 1771-1783.

Sheikh S. N., and Martin D. L. (1996) Heteromers of glutamate decarboxylase isoforms occur in rat

cerebellum. J. Neurochem., 66: 2082-2090.

Shi Y., Velt B., and Baekkeskov S. (1994) Amino acid residues 24-31 but not palmitoylation of cysteine

30 and 45 are required for membrane anchoring of glutamic acid decarboxylase, GAD65. J. Cell

Biol., 124: 927-934.

Shaw G., and Weber K. (1982) Differential expression of neurofilament triplet proteins in brain

development. Nature, 298: 277-279.

Silver R. A., Lamb A. G., and Bolsover S. R. (1990) Calcium hotspots caused by L-channel clustering

promote morphological changes in neuronal growth cones. Nature, 343: 751-754.

Simeone A., Avantaggiato V., Moroni M. C., Mavilio F., Arra C., Cotelli F., Nigro V., and Acampora D.

(1995): Retinoic acid induces stage–specific antero–posterior transformation of rostral central

nervous system. Mech. Dev. 51: 83–98.

Simonian X. S., and Herbison A. E. (2001) Differing, spatially restricted roles of ionotropic glutamate

receptors in regulating the migration of GnRH neurons during embryogenesis. J. Neurosci., 21:

934-943.

Small B. G., Baker S. R., Rubio A., Ballyk B. A., Hoo K. E., Mandelzys A., Kamboj R., Lodge D., and

Bleakman D. (1997) LY339434, a GluR5 selective kainate receptor agonist. Br. J. Pharmacol.,

122: p59.

Soeda H., Tatsumi H., and Katayama Y. (1997) Neurotransmitter release from growth cones of rat dorsal

root ganglion neurons in culture. Neuroscience, 77: 1187-99.

141

Sommer B., KeinänenK., Verdoorn T. A., Wisdwn W., Burnashev N., Herb A., Köhler M., Takagi T.,

Sakmann B., and Seeburg P. H. (1990) Flip and flop: a cell-specific functional switch in

glutamate-operated channels of the CNS. Science, 249: 1580-1585.

Sommer B., Köhler M., Sprengel R., and Seeburg P. H (1991) RNA editing in the brain controls a

determinant of ion flow in glutamate gated channels. Cell, 67: 11-19.

Soghomonian J. J., and Martin D. L. (1998) Two isoforms of glutamate decarboxylase: why? Trends

Pharmacol. Sci. 19: 500-505.

Solimena M., Aggujaro D., Muntzel C., Dirkx R., Butler M., De Camilli P., and Hayday A. (1993)

Association of GAD-65, but not of GAD-67, with the Golgi complex of transfected Chinese

hamster ovary cells mediated by the N-terminal region. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 90: 3073-7.

Spitzer N. C., de Baca R. C., Allen K. A., and Holliday J. (1993) Calcium dependence of differentiation

of GABA immunoreactivity in spinal neurons. J. Comp. Neurol., 337: 168-175.

Spitzer N. C., and Ribera A. B. (1998) Development of electrical excitability in embryonic neurons:

mechanisms and roles. J. Neurobiol., 37: 190-197.

Spitzer N. C., Lautermilch N. J., Smith R. D., and Gomez T. M. (2000) Coding of neuronal differentiation

by calcium transients. BioEssays, 22: 811-817.

Spoerri P. E. (1988) Neurotrophic effects of GABA in cultures of embryonic chick brain and retina.

Synapse, 2: 111-122.

Stork O., Ji F-Y., Kaneko K., Stork S., Yoshinobu Y., Moriya T., Shibata S., and Obata K. (2000)

Postnatal development of a GABA deficit and disturbance of neural functions in mice lacking

GAD65. Brain Res., 865: 45-58.

Sullivan K. F. (1988) Structure and utilization of tubulin isotypes. Annu. Rev. Cell. Biol., 4: 687-716.

Sutherland M. L., Delaney T. A., and Noebels J.L. (1996) Glutamate transporter mRNA expression in

proliferative zones of the developing and adult murine CNS. J Neurosci. 16: 2191-207.

Swanson G. T., Green T., and Heinemann S. F. (1998) Kainate receptors exhibit differential sensitivities

to (S)-5-iodowillardiine. Mol. Pharmacol., 53: 942-949.

Szabó G., Katarova Z., and Greenspan R. (1994) Distinct protein forms are produced from alternatively

spliced bicistronic glutamic acid decarboxylase mRNAs during development. Mol. Cell Biol. 14:

7535-7545.

142

Takimoto R., El-Deiry W. S. (2001) DNA replication blockade impairs p53-transactivation. Proc Natl

Acad Sci U S A. 98: 781-3.

Tarnawa I., Farkas S., Berzsenyi P., Pataki A., and Andrasi F. (1989) Electrophysiological studies with a

2, 3-benzodiazepine muscle relaxant: GYKI 52466. Eur. J. Pharmacol. 167: 193-199.

Tarnawa I., and Vizi E. S. (1998) 2,3-benzodiazepine AMPA antagonists. Restor. Neurol. Neurosci., 13:

41-57.

Taylor J., and Gordon-Weeks P. R. (1991) Calcium-independent γ-aminobutyric acid release from growth

cones: role of γ-aminobutyric acid transport. J. Neurochem., 56: 273-280.

Tillakaratne N. J., Medina-Kauwe L., and Gibson K. M. (1995) Gamma-aminobutyric acid (GABA)

metabolism in neural and non-neural tissues. Comp. Biochem. Physiol. A. Physiol., 112: 247-

263.

Tingley W. G., Ehlers M. D., Kameyama K., Doherty C., Ptak J. B., Riley C. T., and Huganir R. L.

(1997) Characterization of protein kinase A and protein kinase C phosphorylation of the N-

methyl-D-aspartate receptor NR1 subunit using phosphorylation site-specific antibodies. J. Biol.

Chem. 272: 51157-5166.

Traynelis S. F., and Cull-Candy S. G. (1991) Pharmacological properties and H+ sensitivity of excitatory

amino acid receptor channels in rat cerebellar granule neurons. J. Physiol (London), 433: 727-

763.

Tyner S. D., Venkatachalam S., Choi J., Jones S., Ghebranious N., Igelmann H., Lu X., Soron G., Cooper

B., Brayton C., Hee Park S., Thompson T., Karsenty G., Bradley A., and Donehower L. A.

(2002) p53 mutant mice that display early ageing-associated phenotypes. Nature, 415: 45-53.

Umbriaco D., Garcia S., Beaulieu C., and Descarries L. (1995) Relational features of acetylcholine,

noradrenaline, serotonin and GABA axon terminals in the stratum radiatum of adult rat

hippocampus. Hippocampus 5: 605-20.

Vallano M. L. (1998) Developmental aspects of NMDA receptor function. Neurobiology 12: 177-204.

Varju P. (1997) Neurogenezis in vitro vizsgálata p53-deficiens, immortalizált neuroepiteliális

sejtvonalakon. Szakdolgozat.

Varju P., Katarova Z., Madarász E., and Szabó G. (2001) GABA signalling during development: new

data and old questions. Cell Tissue Res. 305: 239-246.

Verdoorn T. A., Burnashev N., Monyer H., Seeburg P. H. and Sakmann B. (1991) Structural determinants

of ion flow through recombinant glutamate receptor channel. Science, 252: 1715-1718.

143

Verdoorn T., Johansen T., Drejer J., and Nielsen E. (1994) Selective block of recombinant GluR6

receptors by NS-102, a novel non-NMDA receptor antagonist. Eur J. Pharmacol, 269: 43-49.

Villasante A., Wang D., Dobner P., Dolph P., Lewis S. A., and Cowan N. J. (1986) Six mouse α-tubulin

mRNAs encode five distinct isotypes: Testis-specific expression of two sister genes. Mol. Cell.

Biol., 6: 2409-2419.

Wang D., Villasante A., Lewis S. A., and Cowan N. J. (1986) The mammalian β-tubulin repertoire:

Hematopoietic expression of a novel, heterologous β-tubulin isotype. J. Cell. Biol., 103: 1903-

1910.

Wang Y., and Durkin J. P. (1995) α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid, but not N-

methyl-D-aspartate , activates mitogen-activated protein kinase through G-protein βγ-subunits in

rat cortical neurons. J. Biol. Chem., 270: 22783-22787.

Wang Y., Small D. L., Stanimirovic D. B., Morley P., and Durkin J. P. (1997) AMPA receptor mediated

regulation of a Gi-protein in cortical neurons. Nature, 389: 502-504.

Watanabe M., Inoue Y., Sakimura K., and Mishina M. (1992) Developmental changes in distribution of

NMDA receptor channel subunit mRNAs. Neuroreport 3: 1138-40.

Watanabe M., Inoue Y., Sakimura K., and Mishina M. (1993) Distinct distribution of five N-methyl-D-

aspartate receptor channel subunit mRNAs in the forebrain. J. Comp. Neurol., 338: 377-390.

Watanabe M., Fukaya M., Sakimura K., Manabe T., Mishina M., and Inoue Y. (1998) Selective scarcity

of NMDA receptor channel subunits in the stratum lucidum (mossy fiber-recipient layer) of the

mouse hippocampal CA3 subfield. Eur. J. Neurosci. 10: 478-487.

Watt S. D., Gu X., Smith R. D., and Spitzer N. C. (2000) Specific frequencies of spontaneous Ca2+

transients upregulate GAD 67 transcripts in embryonic spinal neurons. Mol Cell Neurosci. 16:

376-87.

Wenthold R. J., Petralia R. S., Blahos J. II., and Niedzielski A. S. (1996) Evidence for multiple AMPA

receptor complexes in hippocampal CA1/CA2 neurons. J Neurosci 16: 1982-9.

Westmoreland J. J., Hancock C. R., and Condie B. G. (2001) Neuronal development of embryonic stem

cells: a model of GABAergic neuron differentiation. Biochem. Biophys. Res. Com. 284: 674-680.

White E. (1994) p53, guardian of Rb. Nature, 371: 21-22.

144

Wong L. A., Mayer M. L., Jane D. E., and Watkins J. C. (1994) Willardiines differentiate agonist binding

sites for kainate- versus AMPA-preferring glutamate receptors in DRG and hippocampal

neurons. J. Neurosci. 14: 3881-3897.

Wong R. O., Chernjavsky A., Smith S. J., and Shatz C. J. (1995) Early functional neural networks in the

developing retina. Nature, 374: 716-718.

Zhang L., Zheng X., Paupard M-C., Wang A. P., Santchi L., Friedman L. K., Zukin S. R., and Bennett M.

V. (1994) Spermine potentiation of recombinant N-methyl-D-aspartate receptors is affected by

subunit composition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 10883-10887.

Zheng J.Q., Wan J.J., and Poo M.M. (1996) Essential role of filopodia in chemotropic turning of nerve

growth cone induced by a glutamate gradient. J. Neurosci. 16: 1140-1149.

Zheng X., Zhang L., Durand G. M., Bennett M.V., and Zukin R. S. (1994) Mutagenesis rescues spermine

and Zn2+ potentiation of recombinant NMDA receptors. Neuron, 12: 811-818.

Zheng X., Zhang L., Wang A. P., Bennett M. L. V. and Zukin R. S. (1999) Protein kinase C potentiation

of N-methyl-D-aspartate receptor activity is not mediated by phosphorylation of N-methyl-D-

aspartate receptor subunits. Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 15262-15267.

Zhou L-M., Gu Z-Q., Costa A. M., Yamada K. A., Mansson P. E., Giordano T., Skolnick P., and Jones K.

A. (1997) (2S,4R)-4-methylglutamic acid (SYM 2081): a selective, high-affininty ligand for

kainate receptors. Pharmacol. Exper. Therap. 280: 422-427.

Ziegra C. J., Willard J. M., and Oswald R. E. (1992) Coupling of a purified goldfish brain kainate

receptor with a pertussis toxin-sensitive G protein. Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 89: 4134-4138.

Zimmerman L., Parr B., Lendhal U., Cunningham M., and McKay R. (1994) Independent regulatory

elements in the nestin gene direct transgene expression to neural stem cells or muscle precursors.

Neuron, 12: 11-24.

Zukin R. S,. and Bennett M. V. L. (1995) Alternatively spliced isoforms of the NMDAR1 receptor

subunit. Trends Neurosci. 18: 306-313.