klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, …. jesenovcevi dnevi_vsebina z...

Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana

Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani

7. JESENOVČEVI DNEVI

Raziskovalni dnevi

laboratorijske biomedicine v okviru "Tedna

laboratorijske medicine – LABMEDFEST" bodo

posvečeni spominu prof. dr. Nika Jesenovca

30. september 2015 ~ Klinični inštitut za klinično kemijo in

biokemijo, Univerzitetni Klinični Center, Zaloška 2, Ljubljana.

ZBORNIK PREDAVANJ

7. JESENOVČEVI DNEVI – RAZISKOVALNI DNEVI LABORATORIJSKE BIOMEDICINE 30. september 2015 ~ Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni Klinični Center, Zaloška 2, Ljubljana.

Organizator srečanja: Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo (Univerzitetni klinični center Ljubljana) in Katedra za klinično biokemijo (Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani)

Znanstveni in organizacijski odbor: Aleš Jerin , Janja Marc, Darko Černe, Alenka France-Štiglic, Nataša Karas Kuželički, Milan Skitek

Recenzenti: Janja Marc, Alenka France Štiglic, Nataša Karas Kuželički

Urednika: Milan Skitek in Darko Černe

Oblikovanje in prelom: Monika Skitek

Izdal: Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo (Univerzitetni klinični center Ljubljana) in Katedra za klinično biokemijo (Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani)

Založnik: Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo (Univerzitetni klinični center Ljubljana)

Naklada: 100 izvodov

Tisk: Birografika Bori d.o.o., Ljubljana

Donator raziskovalnega srečanja:

Hermes Analitica

CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana

616-074(082) 616.61-074(082)

JESENOVČEVI dnevi (7 ; 2015 ; Ljubljana) Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine : zbornik predavanj / 7. Jesenovčevi dnevi, 30. september 2015, Ljubljana ; [organizator srečanja Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana in Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani ; urednika Milan Skitek in Darko Černe]. - Ljubljana : Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center, 2015

ISBN 978-961-6442-67-1 1. Gl. stv. nasl. 2. Skitek, Milan 3. Univerzitetni klinični center (Ljubljana). Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo 4. Fakulteta za farmacijo (Ljubljana). Katedra za klinično biokemijo 281334528

PROGRAM SREČANJA Programme of meeting

Registracija

Uvodni nagovor Milan Skitek (Univerzitetni klinični center Ljubljana)Darko Černe (Univerza v Ljubljani)

08:00

09:00

Farmakogenetika v laboratorijski mediciniKoordinatorica: Nataša Karas Kuželički

Pharmacogenomics, a new partner of TDM in clinical practiceMarja-Liisa Dahl (Division of Clinical Pharmacology, Department of Laboratory Medicine, Karolinska institutet, Švedska)

Farmakogenomika v personalizirani laboratorijski mediciniJanja Marc (Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljana)

Pomen farmakogenetke in TDM pri zdravljenju z zaviralci TNF-alfa pri kronični vnetni črevesni bolezniDavid Drobne, Gregor Novak, asist. Dr. Alojz Šmid (Klinični oddelek za gastroenterologijo in hepatologijo, Interne klinike, Univerzitetni klinični center Ljubljana)

Novi pristopi pri genotipizaciji polimorfizmov v genu za CYP2D6Irena Prodan Žitnik (Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza vLjubljana)

Genetske preiskave pri spremljanju uspeha zdravljenja bolnikov s kronično levkemijoTadej Pajič (Klinični oddelek za hematologijo, Interne klinike, Univerzitetni klinični center Ljubljana)

Proteolizni encim katepsin K in njegov vpliv na rakave in matične celice možganskega tumorja gliobalstomaUrška Verbovšek (Oddelek za genetsko toksikologijo in biologija raka, Nacionalni inštitut za biologijo):

09:20

09:45

10:10

10:35

10:50

11:05

Okvara ledvic - vrednotenje in izziv za laboratorijsko medicinoMilan Skitek, Aleš Jerin (Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetniklinični center Ljubljana)

Spremljanje akutne ledvične okvare po operacijah na srcu z novejšimi biooznačevalciJurij Matija Kališnik (Klinični oddelek za kirurgijo srca in ožilja, Kirurška klinika,Univerzitetni klinični center Ljubljana)

Kronična ledvična bolezen – kje smo in kako naprejJelka Lindič (Klinični oddelek za nefrologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana)

Uporaba vitamina D pri zdravljenju pacientov z IgA nefropatijoJoško Osredkar, Tina Humar, Damjan Kovač (Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Klinični oddelek za nefrologijo, Interna klinika, Univerzitetni klinični center Ljubljana)

Vrednost urinskih kvantitativnih rezultatov v medicinskem laboratorijuMladen Krsnik (Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana)

Mikroskopski pregled sedimenta sečaMateja Šter (Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana)

12:00

12:20

12:40

13:00

13:20

13:40

Novejša dognanja pri odkrivanju in zdravljenju okvare ledvicKoordinatorica: Alenka France-Štiglic

Zaključna razpravaKoordinatorici: Nataša Karas Kuželički in Alenka France-Štiglic

14:00

KAZALO

9 BESEDA ORGANIZATORJA

15 FARMAKOGENETIKA V LABORATORIJSKI MEDICINI

16 Pharmacogenomics, a new partner of TDM in clinical practice

22 Farmakogenomika v personalizirani laboratorijski medicini

30 Pomen farmakogenetke in TDM pri zdravljenju z zaviralci TNF-alfa pri kronični vnetni črevesni bolezni

42 Novi pristopi pri genotipizaciji polimorfizmov v genu za CYP2D6

50 Genetske preiskave pri spremljanju uspeha zdravljenja bolnikov s kronično levkemijo

62 Proteolizni encim katepsin K in njegov vpliv na rakave in matične celice možganskega tumorja gliobalstoma

73 NOVEJŠA DOGNANJA PRI ODKRIVANJU IN ZDRAVLJENJU OKVARE LEDVIC

74 Okvara ledvic - vrednotenje in izziv za laboratorijsko medicino

84 Spremljanje akutne ledvične okvare po operacijah na srcu z novejšimi biooznačevalci

98 Kronična ledvična bolezen – kje smo in kako naprej

110 Uporaba vitamina D pri zdravljenju pacientov z IgA nefropatijo Kronična

130 Mikroskopski pregled sedimenta seča

9

7. Jesenovčevi dnevi Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine

Beseda organizatorja

Ali stroka potrebuje znanost?

Prof.dr. Darko ČerneKatedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana, Slovenija

Prizadevamo si, da bi Jesenovčevi dnevi postali tradicionalni dogodek slovenske medicinske biokemije. Zato se dobivamo zadnji dan septembra vsako leto. Toda s kakšnim namenom? O tem lani nismo spregovorili. Namen Jesenovčevih dnevov je poudariti in približati pomembnejše znanstvene dosežke stroki medicinske biokemije. Številni raziskovalci (od fizikov do molekularnih biologov) se danes deklarativno ukvarjajo z iskanjem novih bioloških označevalcev, ki naj bi pripomogli k učinkovitejši diagnostiki in/ali terapiji, kar kaže na veliko aktualnost naše discipline. Vendar Katedra za klinično biokemijo pri Fakulteti za farmacijo in stroka medicinske biokemije, organizirana v mrežo zdravstvenih laboratorijev institucijaliziranih na treh nivojih zdravstvene dejavnosti, ima s tem že desetletne izkušnje. Zato je prav, da to našo družbeno odgovornost na področju medicinske biokemije poudarimo in okrepimo.

Znanost ustvarja novo znanje, ki se lahko uporabi pri nadaljnjem razmišljanju ali vsakdanjem življenju. Razvoj, napredovanje neke discipline je zagotovo odvisen od temeljitega, izčrpnega in natančnega raziskovanja, brez predsodkov in etično utemeljenega (1) in raziskovanje je pomembna za izboljšanje zdravstvene oskrbe (2). Toda, ali stroka potrebuje znanost? Pri pripravi tega nagovora se mi je seveda porodilo tudi obratno vprašanje: ali znanost potrebuje stroko? Odgovor na slednje vprašanje je jasen: znanost nujno potrebuje stroko. Odnos znanosti do stroke pa je, zanimivo, dualen. Znanost (pri tem mislim na medicinsko biokemijo), ki ne dela za stroko, je je samó sáma sebi namen – izgubi smisel. Po drugi strani pa znanost preneha biti znanost, ko se uporabi (aplicira) v stroki.Medicinska biokemija in laboratorijska biomedicina sodi med tako imenovane operativne discipline, tako kot farmacija in medicina, pa tudi gradbeništvo, strojništvo, živilstvo itd (3). Pri operativnih disciplinah je delo institucionalizirano v dve samostojni vertikali, medsebojno povezani in soodvisni: univerzitetna vertikala in strokovna vertikala. Novo znanje, ustvarjeno v teh disciplinah preko

10 11

7. Jesenovčevi dnevi Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine 7. Jesenovčevi dnevi Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine

znanosti na univerzi, se uporablja v vsakdanjem življenju. Medicinske fakultete, v slovenskem visokošolskem prostoru pa tudi Katedra za klinično biokemijo Fakultete za farmacijo, sodelujejo z zdravstveno operativo, farmacevtske fakultete s farmacevtsko industrijo, fakultete za gradbeništvo z gradbeno operativo, itd. Fakultete te vrste imajo zunaj univerze od nje neodvisno „infrastrukturo“, kamor se prenaša ter preskuša novo znanje. Pri teh disciplinah je razmeroma lahko razločevati med znanostjo in stroko. Če se na univerzi z znanstvenimi pristopi ustvarja novo znanje, poteka v stroki prenos rezultatov znanosti in novega znanja v prakso.

V primeru medicinske biokemije in laboratorijske biomedicine sta obe vertikali zelo dobro strukturirani. Na Katedri za klinično biokemijo in Fakulteti za farmacijo poteka znanstveno, pedagoško in strokovno delo na treh bolonjskih stopnjah. V prvi, dodiplomski stopnji je pouk usmerjen v pridobivanje temeljnih znanj in kompetenc discipline, v drugi je večji poudarek tudi na pridobivanju osnovnih raziskovalnih kompetenc, v tretji stopnji pa je pouk individualiziran ter usmerjen v vzgojo znanstvenikov izbrane discipline. Strokovna vertikala so zdravstveni laboratoriji organizirani na primarnem, sekundarnem in terciarnem nivoju zdravstvene dejavnosti. Strokovna vertikala skrbi za razvoj stroke. V laboratorijih univerzitetnih bolnic se goji vrhunska stroka. Iz nje izvirajo vedno nova vprašanja in če je vrhunski strokovnjak tudi znanstvenik, išče in najde odgovore, jih preskuša ter oceni kakovost svojega dela tudi z objavo v znanstvenem časopisju. Če se v univerzitetni vertikali goji v glavnem temeljna znanost, se v njeni komplementarni strokovni vertikali goji v glavnem uporabna znanost.

Med obema vertikalama so velike razlike, celo tako velike, da so za to potrebni dve različni ministrstvi (Ministrstvo za izobraževanje, znanost in šport ter Ministrstvo za zdravje). Toda za obstoj discipline in njen razvoj so nujna povezovanja. Visokošolski učitelj, kot vrhunski znanstvenik, mora v sebi gojiti tudi strokovnjaka in vrhunski strokovnjak mora v sebi gojiti tudi znanstvenika. Visoko šolstvo, ki ne dela za stroko, je samó sáma sebi namen in stroka brez znanosti zelo hitro postane samó še obrt. Tako kot sta si komplementarni barvi v največji možni meri različni, pa se postavljeni enakovredno ena poleg druge druga drugo krepita in skupaj ustvarjata izjemno močne slikovne učinke. Zato moramo, v dobro sedanjosti in prihodnosti naše discipline in seveda pacienta oz. bolnika krepiti medsebojno sodelovanje obeh vertikal. Sodelovanje med Katedro za klinično biokemijo in nekaterimi terciarnimi zdravstvenimi laboratoriji je že institucionalizirano, vendar ga je nujno še naprej krepiti in sodelovanje razširiti še na ostale strukturne nivoje.

In kaj daje znanost stroki danes? Bliskovit napredek translacijske medicine (pri tem mislim na razvoj omik) danes "kar bruha" potencialne nove biološke označevalce. Pri mnogih novih bioloških označevalcih pravzaprav sploh še ne poznamo njihove prave vlogo v etiologiji in patofiziologiji bolezni. Njihovo potencialno uporabnost v vsakdanji klinični praksi je potrebno še preveriti, kar za stroko pomeni zelo veliko dela. Ker živimo v času samooklicane z dokazi podprte medicine, je sposobnost kritičnega razmišljanja ter proučevanja in vrednotenja znanstvene literature nujna kompetenca vsakega zdravstvenega delavca. Znanstveno delo omogoča pridobivanje kompetenc povezanih z kritičnim razmišljanjem, pregledovanjem in interpretacijo literature, načrtovanjem študij, tolmačenjem in objavljanjem podatkov ter novih dognanj, pomembno krepi zavedanje o nujnosti multidisciplinarnih skupin znanstvenikov in strokovnjakov iz prakse za doseganje novega znanja in komunikacije med njimi, pomembno pa krepi tudi zavedanje po nujnosti vseživljenjskega učenja in usposabljanja (4).Ob tem neizpodbitnem pomenu znanosti za stroko se seveda poraja vprašanje, kako v neki disciplini ovrednotiti obseg znanosti in njeno kakovost. Znanost je v načelu dostopna vsem ljudem, je mednarodna, nima meja. Njena kvantiteta in kvaliteta se zato lahko vrednosti skozi objave in priznanje v mednarodnem prostoru. Omenjen pristop ni idealen in zato pogosto kritiziran, vendar še vedno najboljši možni.

Za današnje srečanje in sporočilo sem analiziral obseg in kvaliteto objav slovenskih specialistov medicinske biokemije v obdobju zadnjih dvajsetih let. V 41,8 % vseh objav slovenskih specialistov medicinske biokemije naši specialisti nastopajo v vlogi prvega ali vodilnega avtorja (Slika 1). To je dober podatek, saj pomeni, da imajo specialisti medicinske biokemije v omenjenih raziskovanjih pogosto odločilno vlogo. Bolj zaskrbljujoče pa je, da če odštejemo tri specialiste medicinske biokemije, se število objav zmanjša za dobro polovico (na 47,6 %), če odštejemo 4 specialiste pa skoraj za 60 % (na 41,3 %). To pomeni, da je raziskovanje osredotočeno na zelo majhno število specialistov medicinske biokemije in da moramo v bodoče močno popularizirati raziskovanje tudi med ostalimi specialisti medicinske biokemije, če želimo zagotoviti čim boljši razvoj stroke. Dobro pa je, da pri tem ostaja delež objav s prvim ali vodilnim avtorstvom vsaj približno enak: v vseh primerih okoli ali le malo pod 40 %.

12 13


Slika 1. Analiza obsega mednarodnih objav specialistov medicinske biokemije. Raziskovanje je žal osredotočeno na zelo majhno število specialistov medicinske biokemije.

Kaj pa odmevnost naših objav v mednarodnem prostoru? Z našimi objavami dosegamo v povprečju 15,26 čistih citatov na eno mednarodno objavo in 7,38 normiranih citatov. Če odštejemo štiri najbolje citirane specialiste medicinske biokemije ostaja število doseženih čistih in normiranih citatov na eno mednarodno objavo približno enako (15,76 in 7,9), kar je zelo razveseljujoč podatek. To kaže, da se naši članki berejo in rezultati naših raziskav uporabljajo oz. navajajo, nakazujejo torej vpliv naših raziskav v svetovni znanstveni sredini.

Slika 2. Analiza odmevnosti objav specialistov medicinske biokemije.

Rad bi zaključil s sporočilom, da je za prihodnji obstoj in nadaljnji razvoj slovenske medicinske biokemije nujna popularizacija in širitev znanosti na širši krog specialistov medicinske biokemije. K realizaciji tega cilja želijo prispevati tudi Jesenovčevi dnevi, katerih namen je izboljšati slišnost in prepoznavnost raziskovanja na področji medicinske biokemije. Prvi del letošnjih Jesenovčevih dnevov je posvečen farmakogenetiki v medicinski biokemiji. Želimo okrepiti zavedanje, da je farmakogenetika v svetu in tudi pri nas povsem običajna dejavnost medicinske biokemije. Farmakogenetika že dolgo omogoča personalizirano medicino na področju hematologije in onkologije ter postaja nujna spremljevalka TDM-a. Drugi del Jesenovčevih dnevov je posvečen novejšim dognanjem pri odkrivanju in zdravljenju okvare ledvic. S slabšim delovanjem ledvic se danes sooča okrog deset odstotkov odrasle populacije, zato to področje predstavlja neizčrpen znanstveni izziv.

Literatura

1. Mileder LP. Medical students and research: Is there a current discrepancy between education and demands? GMS Z Med Ausbild 2014; 31(2):Doc15.2. Currat LJ, de Francisco A, Al-Tuwaijri S, Ghaffar A, Jupp S. The 10/90 Report on health

research 2003-2004. Geneve: Global forum for Health research, 2004. Spletna stran: http://www.isn.ethz.ch/Digital-Library/Publications/Detail/?id=17141; dostopno 25.7. 2015.

3. Kordaš M. Kaj je univerza in kaj medicina? ISIS 1998; 7(7): 22-6).4. Griffin MF, Hindocha S. Publication practices of medical students at British medical

schools: experience, attitudes and barriers to publish. Med Teach 2011; 33(1):e1-8.

14 15

Farmakogenetika v laboratorijski medicini

Pharmacogenomics, a new partner of TDM in clinical practiceMarja-Liisa Dahl

Farmakogenomika v personalizirani laboratorijski mediciniJanja Marc

Pomen farmakogenetke in TDM pri zdravljenju z zaviralci TNF-alfa pri kronični vnetni

David DrobneGregor Novak

Alojz Šmid

Novi pristopi pri genotipizaciji polimorfizmov v genu za CYP2D6Irena Prodan Žitnik

Genetske preiskave pri spremljanju uspeha zdravljenja bolnikov s kronično levkemijo

Tadej Pajič

Proteolizni encim katepsin K in njegov vpliv na rakave in matične celice možganskega tumorja gliobalstoma

Urška Verbovšek

16 17


Pharmacogenomics, a new partner of TDM in clinical practice

Marja-Liisa DahlDept of Laboratory Medicine, Division of Clinical Pharmacology, Karolinska Institutet, Karolinska University Hospital, Stockholm, Sweden

Therapeutic drug monitoring (TDM) is one of the key clinical activities within the discipline of clinical pharmacology. Already decades ago, it became clear that for many pharmaceutical drugs, the administered dose itself was not predictive of the individual drug exposure and corresponding clinical effects and that drug dosage needed to be individualized in order to achieve best therapeutic effect with a minimum of adverse effects. This stimulated the development of analytical methods to actually measure systemic drug concentrations during treatment as an aid to individualization of drug dosage. This applied especially for drugs with a large inter-individual variation in pharmacokinetics (PK), narrow therapeutic window, or critical thresholds for pharmacological action. Important indications for TDM include, apart from the abovementioned inter-individual PK variability, identification of intra-individual differences in PK due to for example drug interactions, variable clearance over time in critically ill patients (e.g. in intensive care units), variable compliance to prescribed dosage or conditions where treatment failure and/or concentration-related adverse effects are unacceptable. Tricyclic antidepressants, aminoglycosides, digoxin, theophylline, and antiepileptic drugs were early examples of the application of TDM. Today, TDM is routine also for immunosuppressants, lithium, many anti-infective drugs and antipsychotics.

Today, in an era of Personalised Medicine, with the increasing understanding of the molecular mechanisms behind inter- and intraindividual variability in drug exposure and drug effects, great expectations have been posed on pharmacogenetics/pharmacogenomics as a tool for individualized pharmacotherapy. The early developments in this field dealt with drug metabolising enzymes, especially the cytochromes P450 (CYP). In particular,

CYP2D6, CYP2C19 and CYP2C9 were early shown to be under genetic regulation, allowing individuals to be classified, based on genotyping of functional allele variants (causing lack of, decreased or increased enzyme activity), as poor metabolisers (PM), intermediate and “normal” extensive metabolisers (IM, EM), and in some cases as ultrarapid metabolisers (UM). These three enzymes play a major role in the metabolism of a large number of clinically important drugs of various therapeutic classes. Examples are CYP2D6 and many antidepressants and antipsychotics as well as tamoxifen, CYP2C19 and certain antidepressants and clopidogrel, and CYP2C9 and coumarin anticoagulants and antidiabetic drugs. Consequently, there was early enthusiasm on the possibility of prospectively predicting an individual´s optimal dose requirement by genotyping, with the prospect of avoiding time consuming dose adjustments, adverse effects and therapeutic failures. There is by now a large body of evidence for the impact of specific CYP genotypes on the PK of relevant drug substrates and also in some cases on therapeutic outcomes. For certain drugs, guidelines have been developed for genotype-based dosing (e.g. www.pharmgkb.org) and data on biomarkers are increasingly included in drug labeling (www.fda.gov) (1). PK-related biomarkers in drug labeling include apart from CYPs e.g. TPMT, phase II enzymes and drug transporters. Other genomic biomarkers are related to drug safety (e.g. HLA-B*5701 for Abacavir-induced skin reactions) or efficacy (e.g. somatic tumor biomarkers).

It is important to remember that the metabolism of most drugs is not catalyzed by one enzyme only but by several CYPs or other enzymes such as UDT-glucuronosyltransferaras (UGTs). Relevant examples are CYP1A2 and CYP3A4/5 that are involved in the metabolism of many drugs in parallel with the polymorphic CYPs and show not only large inter-individual but also intra-individual differences in activity. This is due to induction and inhibition by many drugs and other substances present in the environment, such as polycyclic hydrocarbons in tobacco smoke inducing CYP1A2 and many fruit juices inhibiting CYP3A. Polypharmacy is rather a rule than an exception in many patients and drug-drug interactions are thus a major cause of PK variability. The role of active drug transporters in the PK of drugs is increasingly acknowledged. Gender, age, ethnicity and other diseases may also influence enzyme activity and drug PK. We are only starting to understand the possible impact of epigenetics. The clinical relevance of a specific genetic polymorphism thus depends on the quantitative importance of that specific protein for the total clearance of the drug, as well as whether

18 19


the parent compound, its metabolite(s) or both are pharmacologically active. Moreover, even with the same drug exposure, individuals respond variably. The pharmacodynamics of most drugs is complex and, similar to PK, influenced by genetic, constitutional and environmental factors. Still, the last few decades´ achievements in understanding the role of specific enzymes in drug metabolism, and their molecular genetic and environmental regulation have greatly improved our possibilities to individualise treatment strategies.

TDM and pharmacogenetic testing have their pros and cons. The concept of TDM includes not only the analysis as such using a quality-assured methodology, but also preanalytical issues such as adequate sampling time in relation to duration of drug treatment (usually steady state) and drug intake (peak or trough levels), pre-analytical sample handling, as well as post-analytical pharmacological interpretation of concentration data taking these previously mentioned issues and clinical patient data into account. Genotyping can, on the other hand, be performed in a sample taken at any time, even prior to drug treatment. TDM is, however, in most cases a more precise tool for determining the actual systemic drug exposure in an individual and for predicting drug levels at target, than what is currently possible from genotyping of drug metabolizing enzymes or transporters which classifies individuals into only a few groups. The clinical relevance of genotyping depends on how well the test covers the functional variants of importance. Ethnic differences in allele distributions need to be taken into account. It is to be stressed that when it comes to e.g. CYP genotyping, there is also a large variation in enzyme activity even within a given genotype, and an overlap between genotype groups, limiting the predictive value of genotyping for drug PK in an individual patient. With TDM, changes in exposure over time can be identified, due to e.g. varying compliance, drug interactions, and influence of other environmental factors, age, or concomitant disease. Prediction of individual drug dosage based on pre-emptive genotyping usually does not take other concomitant drugs or other clinically relevant parameters into account. An exception is warfarin for which algorithms including non-genetic information apart from CYP2C9 and VKORC1 genotypes have been developed (2,3).

Dept of Clinical Pharmacology at Karolinska University Hospital has performed TDM as a clinical routine for about 40 years and introduced genotyping services in the early 1990’s (4). In 2014, around 70 000 TDM analyses were

performed, covering more than 100 different pharmaceutical entities. The main groups are immunosuppressants (41%), antiepileptics (24%), antibiotics (13%), followed by antipsychotic drugs (7%), antivirals (2-3%), antidepressants (2%) and others including antifungals, opioids, digoxin etc. Analysis of immunosuppressive drugs in blood has become an important clinical routine for essentially all patients in the post-transplantation period. In contrast, TDM of many anti-infective agents or psychotropic drugs is mainly performed in selected cases of therapeutic failure, pronounced adverse effects, or extreme variability in drug disposition. In the same year, the laboratory carried out genotyping of about 2000 patient samples, about half of them for TPMT, followed by HLA-B*5701 and CYP-genotyping. It is to be noticed that other HLA genotyping as well as tumor genotyping are performed by other laboratories than clinical pharmacology. TPMT genotyping is in most cases performed in parallel with TPMT activity measurement. The high frequency of TPMT and HLA genotyping can be explained by them being included in local guidelines while CYP genotyping is mostly performed in individual patients with either lack of effect, pronounced adverse effects or as a follow-up of either extremely high or low concentrations in relation to dose, as identified by TDM. Most CYP-genotyping samples come from psychiatry. Examples of our experience with genotyping as a complement to TDM will be discussed in more detail in the presentation.

Although drug concentrations measured in a TDM laboratory are primarily used to guide dosing during ongoing therapy, the information can also be of great value for future patients. Drug concentration data and associated clinical information accumulates into a database with potential for both clinical pharmacological research and for improved communication of TDM results to clinicians. Accumulated routine TDM data has successfully been utilized to describe variability in concentration-to-dose ratios in a naturalistic clinical setting, and to assess the impact of factors such as age, gender, concomitant drugs and smoking (5,6). In addition, outliers with exceptionally high or low drug exposure in relation to dosage can be identified for further pharmacogenetic studies. Examples are early case reports describing patients with extremely high and low concentrations of tricyclic antidepressants due to slow and rapid CYP2D6 activity, respectively (7-8). In the case of rapid metabolism, the patient could later be shown to have duplication of a functional CYP2D6 gene, classifying her as an ultrarapid metaboliser of CYP2D6 (9). Biobanking of DNA in parallel with routine TDM of large patient groups also provides a valuable research material to be utilized for

20 21


later pharmacogenetic studies with new scientific questions (4,10). Thus, pharmacogenetic testing and TDM are in many cases complementary rather than exclusive (11-13). Genotyping may in certain cases prove to be of particular relevance for drug and starting dose selection, but even wider for understanding the reasons behind exceptionally high or low concentration-to-dose ratios, side-effects or lack of efficacy despite normally adequate doses in individual patients.

References

1. Ehmann F, Caneva L, Prasad K, et al. Pharmacogenomic information in drug labels: European Medicines Agency perspective. The Pharmacogenomics J 2015;15:201-210.

2. Wadelius M, Chen LY, Lindh JD, et al. The largest prospective warfarin-treated cohort supports genetic forecasting. Blood 2009;113:784-92.

3. Lazo-Langner A, Kovacs MJ. Predicting warfarin dose. Curr Opin Pulm Med 2010;16:426-431.4. Eliasson E, Lindh JD, Malmström RE, Beck O, Dahl M-L. Therapeutic drug monitoring

for tomorrow. Eur J Clin Pharmacol 2013;69:25-32.5. Skogh E, Reis M, Dahl M-L, Lundmark J, Bengtsson F. Therapeutic drug monitoring

data on olanzapine and its N-demethyl metabolite in the naturalistic clinical setting. Ther Drug Monit 2002;24:518-526.

6. Lind A-B, Reis M, Bengtsson F, et al. Steady state concentrations of mirtazapine, N-desmethylmirtazapine, 8-hydroxymirtazapine and their enantiomers in relation to cytochrome P450 2D6 genotype, age and smoking behavior. Clin Pharmacokinetics 2009;48:63-70.

7. Alván G, Bertilsson L, Dahl M-L, Ingelman-Sundberg M, Sjöqvist F. Moving toward genetic profiling in patient care: the scope and rationale of pharmacogenetic/ecogenetic investigation. Drug Metab Dispos 2001;29:580-585.

8. Bertilsson L, Åberg-Wistedt A, Gustafsson LL, Nordin C. Extremely rapid hydroxylation of debrisoquine: a case report with implications for treatment with nortriptyline and other tricyclic antidepressants. Ther Drug Monit 1985;7:478-480.

9. Bertilsson L, Dahl M-L, Sjöqvist F, et al. Molecular basis for rational megaprescribing in ultrarapid hydroxylators of debrisoquine. The Lancet 1993;341:363.

10. Söderberg MM, Haslemo T, Molden E, Dahl M-L. Influence of FMO1 and 3 polymorphisms on serum olanzapine and its N-oxide metabolite in psychiatric patients. Pharmacogenomics J 2013;13:544-550.

11. Dahl M-L, Sjöqvist F. Pharmacogenetic methods as a complement to therapeutic monitoring of antidepressants and neuroleptics. Ther Drug Monit 2000;22:114-116.

12. Dahl M-L. Cytochrome P450 phenotyping/genotyping in patients receiving antipsychotics: useful aid to prescribing? Clin Pharmacokinet 2002;41:453-470.

13. Sjöqvist F, Eliasson E. The convergence of conventional therapeutic drug monitoring and pharmacogenetic testing in personalized medicine: focus on antidepressants. Clin Pharmacol Ther 2007;81:899-902.

22 23


Farmakogenomika in bolniku prilagojena laboratorijska medicina

/ Pharmacogenomics and personalised laboratory medicine /

Janja Marc *

Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, Ljubljana

* On behaf of EFLM/ESPT working group for Personalised Laboratory medicine: Pazzagli M (chair), Chresta C, Brandslund I, Vermish P, van Shaik R, Schwab M and Marc J

Povzetek

Končne definicije personalizirane medicine (bolniku prilagojene medicine) še nimamo. Ena od njih pravi, da je bolniku prilagojena medicina medicinski model, ki sloni na molekulskem profiliranju posameznika in omogoča izbor bolniku prilagojene (prave) terapije ob pravem času oziroma ugotavlja nagnjenost k bolezni ter uvaja preventivne, posamezniku prilagojene ukrepe ciljano in pravočasno. V pogenomskem obdobju je razvoj novih instrumentalnih tehnik in biostatističnih programov omogočil razvoj naprednih tehnologij »omic«. Te tehnologije omogočajo analizo celotne skupine kemijsko podobnih molekul kot je npr. genom, transkriptom, proteom, metabolom, epigenom, mikrobiom, itd. v nekem biološkem sistemu (tkivo, celica). Posebnost bolniku prilagojene (personalizirane) laboratorijske medicine je v tem, da se ne upira na spremembe v koncentraciji ene same molekule (diagnostičnega kazalca) temveč na spremembe profila molekul. Več kot je molekul, ki sestavljajo takšen profil bolj natančen je opis in več posebnosti stanja pri posameznika odraža – bolj je torej »oseben«. Od takšnega pristopa (medicinskega modela) si obetamo hitrejšo in učinkovitejšo diagnostiko ter boljše in varnejše zdravljenje s tem pa tudi hitrejše okrevanje in povrnitev zdravja. Bolniku prilagojena medicina v pravem pomenu predstavlja nov pristop k diagnostiki in terapiji, ki temelji na rezultatih naprednejših tehnologij »omik«. Stroka laboratorijske medicine se zaveda svoje vloge v bolniku prilagojeni medicini, vendar bo potrebno uvesti določene ukrepe in morda spremeniti organiziranost stroke ter predvsem povečati sodelovanje med posameznimi disciplinami znotraj laboratorijske medicine.

Ključne besede: napredne tehnologije omik, genom, proteom, transkriptom, metabolom, diagnostični kazalec, biooznačevalec

Abstract

Final Definitions of personalized medicine is still lacking. One of them says that personalized medicine refers to a medical model use the molecular profiling for tailoring the right therapeutic strategy to the righ patients at right time and/or to determine the predispossition to disease for deliver timely and targeted prevention. In postgenome period, the development of new instrumental techniques and biostatistics enable the development of “omic” advanced technologies. These technologies allow to analyze the whole group of chemically similar molecules like. genome, transcriptome, proteome, methabolome, epigenom, microbiom. etc. in a biological system (tissue, cell). The specialty of personalized laboratory medicine is that it is not based on only one (or few) measured concentration (diagnostic marker), but on the profile of molecules. The more the molecules is included in profiling more accurate is description of patients characteristics and therefore description is more "personal". Such an approach (the medical model) shall offer faster in more effective diagnosis with more effective and safer treatment and hence faster recovery of health. Personalized medicine represents new medical approach to the diagnosis and therapy based on the results of “omic” advanced technologies. Profession of laboratory medicine is aware of its role in personalized medicine, but it will be necessary to introduce specific measures and perhaps change the organization of the profession, in particular to enhance cooperation between the various disciplines within the laboratory medicine.

Key words: omic advance technology, genome, proteome, transcriptome, metabolome, diagnostic marker, biomarker

1. Uvod

Tako farmakogenomiko kot bolniku prilagojeno (personalizirano) laboratorijsko medicino bi figurativno lahko opisali »otroka moderne dobe«. Danes vstopata na področje diagnostike in terapije skozi velika vrata in sta rezultat več desetletnega

24 25


razvoja visoko zmogljivih »omskih" tehnologij.Pričakuje se, da bosta pripomogli k bolj točni diagnostiki ter učinkovitejši in varnejši ciljani terapiji in s tem bi prispevali k hitrejšemu okrevanju po bolezni, višji kakovosti življenja pacientov in hkrati k nižjim stroškom v zdravstveni blagajni. Zavedati pa se je potrebno , da bosta morala ta otroka skozi vsa razvojna obdobja predno bosta našla svoj prostor v stroki, a ta pot bo lažja in hitrejša, če bomo mi, ki delujemo v stroki razumeli pomen in sprevideli prednosti teh novih pristopov v zdravstvu.

2. Pogenomsko obdobje in napredne tehnologije omik

Po letu 2002, ko je bilo objavljeno zaporedje nukleotidov v humani DNA, torej v pogenomskem obdobju, so se začele razvijati analizne metode, katerih namen ni bil več analizirati nek posamezni analit (t.i. biokemijski kazalec), temveč pridobiti celotno sliko – profil vseh kemijsko ali po funkciji podobnih molekul v nekem biološkem sistemu. Nekaj podobnega sicer klinični kemiki že poznamo, npr. elektroforeza serumskih proteinov, vendar so bili znanstveniki pri razvoju teh tehnologij mnogo bolj ambiciozni. Želeli so razviti orodja, ki bi omogočila pridobiti profil tisočih ali nekaj deset tisočih molekul, npr. kot je profil proteinov v vzorcu urina za katerega danes vemo, da vključuje preko 2000 različnih proteinov in peptidov. Sočasen razvoj novih instrumentalnih tehnik in biostatističnih programov je omogočil razvoj naprednih tehnologij »omic«. Izraz »omike« je skrajšan izraz, ki zaobjema vsa področja celične biologije, s končnico –omika, in sicer: genomiko, transkriptomiko, proteomiko, lipidomiko, metabolomiko, epigenomiko, mikrobiomiko, idr. (1,2). Posamezno področje omike pa proučuje določeno skupino molekul. Tako se npr. na področju genomike analizira celoten genom in ne samo posamezne mutacije s tehnologijo sekvenciranja nove generacije (new generation sequencing, NGS). Podobno velja za analizo transkriptoma, kjer se analizira celoten set mRNA pa tudi tRNA in rRNA v neki celici običajno z NGS ali biočip tehnologijama . Analiza proteoma celice ali tkiva pomeni pregledati celotno proteinsko sliko npr. v nekem biološkem vzorcu. Za analizo proteoma največ uporablja masna spektroskopija podobno kot tudi za analizo metaboloma, torej profila metabolitov v posameznih bioloških sistemih ali tkivih. Ta »omski« pristop pa je zanimiv tudi za raziskovalce. Pomaga pri odkrivanju in identifikaciji posamezne ali skupine molekul, ki se v patološkem vzorcu izražajo drugače. Tudi ta pristop je kliničnim kemikom blizu, a ključna je razlika

v številu na ta način odkritih molekul, biooznačevalcev. Ko z proteomsko analizo pregledujemo profil nekaj tisoč proteinov je seveda zelo verjetno, da bomo odkrili nekaj deset ali sto proteinov, ki bi jih lahko opredelili kot biološke označevalce. Lahko bi rekli, da omike predstavljajo prvi korak nekakšno presejalno analizo, ki služi zgolj za identifikacijo potencialnih biooznačevalcev, ki jih bomo morali v nadaljevanju s potrditveno metodo bolj natančno kvalitativno ali kvantitativno oceniti. Po klinični evalvaciji in izračunu diagnostične občutljivosti in specifičnosti, pa bi lahko nov biooznačevalec uvedli v laboratorijsko diagnostiko kot diagnostični kazalec (slika 1).

Slika 1. Napredne tehnologije omik pri odkrivanju novih diagnostikov.

Bistvena prednost omskih tehnologij je v tem, da lahko »vidimo tudi tisto česar ne gledamo«. Pri klasičnih analizah merimo samo tiste molekule (parametre), za katere imamo reagente in za katere smo se vnaprej odločili, da jih želimo izmeriti (»gledati«). Dobro se zavedamo, da je npr. ob nespremenjeni izmerjeni količini albuminov v urinu, količina drugih proteinov lahko spremenjena, vendar tega ne moremo potrditi, saj jih nismo »pogledali« - torej izmerili, analizirali. Pri proteomski analizi urina pa pridobimo profil preko 2000 različnih proteinov sočasno , torej so vključeni tudi tisti, ki jih sicer verjetno ne bi analizirali. Zato predstavlja ta način najbolj inovativen pristop k odkrivanju in uporabi biooznačevalcev. V znanosti stroki se je zanj uveljavil izraz »pristop brez hipoteze« (»hypothesis less approach«). Glede na to kakšno skupino molekul analiziramo, ločimo različne omske tehnologije npr. genomske tehnologije, transkriptomske tehnologije, proteomske tehnologije in metabolomske tehnologije.

26 27


3. Napredne tehnologije omik in bolniku prilagojena laboratorijska medicina

Posebnost bolniku prilagojene (personalizirane) laboratorijske medicine je torej v tem, da se ne upira na spremembe v koncentraciji ene same molekule (diagnostičnega kazalca) temveč na spremebe profila molekul. Več kot je molekul, ki sestavljajo takšen profil bolj natančen bo opis in več posebnosti stanja pri posameznika bo odražal – bolj bo torej »oseben«. Lahko bi rekli, da s temi naprednimi tehnologijami s tem ko pregledamo celoten nabor genov, proteinov, mRNA in metabolitov v izbranem vzorcu pridobivamo pasameznikov genomski, proteinski, metabolomski ODTIS. Podobno kot prstni odtis, je tudi npr. genomski odtis lasten posamezniku, torej unikaten. Del genomskih odtisov služi danes za identifikacijo posameznikov v sodni medicini.. Če že ne s posameznimi omskimi analizami, pa s kombinacijo le-teh zagotovo zelo »poosebimo« nabor podatkov, ki so osnova nekakšnemu »molekulskemu« prepoznavanju posameznika (3) (Slika 2). Čeprav prave definicije personalizirane medicine še nimamo, je evropska komisija (2013) predlagala naslednjo definicijo: »Personalized medicine refers to a medical model use the molecular profiling for tailoring the right therapeutiv strategy to the righ patients at right time and/or to determine the predispossition to disease for deliver timely and targeted prevention.« (4)

Slika 2. Profili različnih bioloških molekul so potrebni za molekulsko prepoznavanje posameznika (3).

Ne glede na definicijo, cilj visoko zmogljivih naprednih tehnologije omik je oblikovati profila skupine molekul, kot je npr. proteinski profil patološkega urina ali metabolni profil izbranega punktata. Po primerjavi profila bolnikovega vzorca s profili kontrolnega (zdravega) vzorca lahko hitro prepoznamo odklone v preiskovanem vzorcu. Na osnovi profilov oz. odtisov različnih molekul, lahko prepoznamo molekulske/biokemične posebnosti posameznika ter jih pozneje uporabimo v njemu prilagojeni (potrditveni) diagnostiki in (ciljani) terapiji. Nedvomno si od takšnega pristopa obetamo hitrejšo in učinkovitejšo diagnostiko ter boljše in varnejše zdravljenje. s tem pa tudi hitrejše okrevanje in povrnitev zdravja. Zaključili bi lahko, da bolniku prilagojena medicina v pravem pomenu predstavlja torej nov pristop k diagnostiki in terapiji, ki temelji na rezultatih naprednejših tehnologij.

Vendar se je že zgodaj pokazalo, da upravljanje s tako veliko količino podatkov, kot so jih dajale genomske, proteomske, transkriptomske itd. analize ni enostavno. Slednje je izpostavilo nov dodaten izziv povezan z naprednimi tehnologijami omik. Razviti je bilo potrebno tudi visoko zmogljiva bioinformacijska orodja in programe za odbiranje, sejanje, razvrščanje, in povezovanje tisočih podatkov pred končno interpretacijo in končna vrednost naprednih tehnologij omik za medicino bo tako v veliki meri odvisna od umetne inteligence, ki doživlja intenziven razvoj.

4. Pacientu prilagojena laboratorijska medicina in farmakogenomika

Eno prvih področij na katerem se je bolniku prilagojena medicina začela uporabljati v klinični praksi je farmakogenomika, področje, ki proučuje tiste genetske spremembe, ki oblikujejo posameznika in njegov odziv na neko zdravljenje. Vzrok za to so bile težave pri zdravljenju z nekaterimi zdravili. Pokazalo se je, da teorija »One fits all« pri določenih terapijah ne vzdrži. Po aplikaciji enakega odmerka iste učinkovine različnim posameznikom je odziv na nekatera zdravila lahko zelo različen. Odziv je lahko premočan in povezan neželenimi učinki (NŽU) ali pa je odziv preslab in so farmakološki učinki zdravila prešibki. Obojemu lahko sledijo dodatni klinični zapleti, kar slabša stanje bolnika in zvišuje stroške zdravljenja. Ocenjujejo, da v ZDA vsako leto umre več kot 100.000 bolnikov zaradi NŽU, in pri skupno 2,2 miljona bolnikih se letno pojavljajo resni NŽU (5). Različen odziv na zdravilno

28 29


učinkovino je posledica številnih dejavnikov, pri čemer eni izhajajo iz stanja organizma, drugi pa iz lastnosti zdravila. Številne od teh poznamo in vemo, da npr. telesna teža, kajenje, jetrna funkcija, delovanje ledvic, fizična aktivnost ali prehrana tukaj nekaj manjka, po drugi strani pa npr. fizikalno-kemične lastnosti učinkovine in interakcije z drugimi učinkovinami določajo učinke apliciranega zdravila. Genetske dejavnike, ki spreminjajo odziv posameznika na zdravilen učinkovine, bi lahko uvrstili v prvo skupino. Teh dveh stavkov ne razumem najbolje.Geni naj bili odgovorni za 30-95% variabilnosti v odzivu na ZU . Večinoma gre za gene tistih proteinov, ki so vključeni v sistem ADME. Mutacije (nivo DNA) ali spremembe v izražanju teh genov (nivo RNA) lahko namreč spremenijo učinkovitost npr. presnovnih encimov, transportnih proteinov ali receptorjev s katerimi ineragira zdravilna učinkovina po aplikaciji. S tem lahko vplivajo mutacije tako na farmakokinetične lastnosti (npr. hitrost presnove in izločanja) kot tudi farmakodinamičnelastnosti zdravilne učinkovine (npr. vezava ućinkovine na tarčni protein). Na primer, zelo pomembna je uvedba farmakogenomike pred zdravljenjem z različnimi novimi tarčnimi zdravilnimi učinkovinami. Tukaj se na osnovi farmakogenetičnega testiranja, ki vključuje mutacijsko analizo tarčnega receptorja npr. HER2 in merjenje njegovega izražanja odločajo, ali je biološko zdravilo (trastuzumab) sploh smiselno aplicirati.V nasprotju z drugimi dejavniki, kot sta npr. ledvična ali jetrna funkcija, se značilnosti DNA tekom življenja ne spreminjajo in jih lahko odkrijemo že v mladosti. S pomočjo farmakogenomskega testiranja pred uvedbo nove terapije, lahko torej napovemo odziv posameznika (in NŽU) na aplicirano zdravilo. S tem, ko to genetsko informacijo vključimo v nadaljnje ukrepanje pa že vstopimo v individualizirano terapijo oz. »posamezniku prilagojeno zdravljenje«, ki je del personalizirane oz. »bolniku prilagojene« medicine«(6).

5. Zaključek

Bolniku prilagojena laboratorijska medicina predstavlja nov pristop k obravnavi bolnikov, ki sloni na molekulskem prepoznavanju posameznikovega stanja. Masovni podatki, pridobleni z naprednimi tehnologijami omik, bodo v polni meri izrabljeni šele z razvojem visoko zmogljivih inteligenčnih sistemov. Ob veliki zmogljivosti teh tehnologij se je povečala tudi možnost

»zlorabe« teh podatkov. Masa podatkov, ki je na voljo ob teh analizah zelo natančno karakterizira posameznika, zato je potrebno poskrbeti za varnost teh podatkov in dosledno slediti etičnim načelom, ki veljajo v laboratorijski medicini. Rezultati ankete, ki jo je izvedla delovna skupina za personalizirano laboratorisjo medicno pri EFLM (Eur. Federation of Lab Med in ESPT (Eur. Soc. for Pharmacogenomics and Personal Therapy) je pokazala, da se stroka laboratorijske medicine zaveda svoje vloge v personalizirani medicini kot novem zdravstvenem modelu. Opozorila pa je na ukrepe, ki jih bo potrebno uvesti in predvsem spremeniti organiziranost stroke. Potrebno bi bilo uvesti naprednejše tehnologije in omogočiti izpopolnjevanje strokovnjakov LM za pridobivanje kompetenc iz interpretacije in svetovanja ter predvsem povečati sodelovanje med posameznimi disciplinami znotraj laboratorijkse medicine (7).

Literatura

1. Noorbakhsh F, Atefeh A, Power C. Application of “Omics” Technologies for Diagnosis and Pathogenesis of Neurological Infections. Curr Neurol Neurosci Rep 2015; 9:580.

2. Checa A, Bedia C, Jaumont J. Lipodomic data analysis: Tutorials, practical guidelines and applications. Anal Chim Acta 2015; 885:1-16.

3. Topol E. Individualized Medicine from Prewomb to Tomb; Cell 2014; 157: 241-253. 4. Use »-omic« advanced technologies in the development of personalised medicine«

Commission staf working document, European Commission, Brussel 2013. 5. Chyka PV.How many deaths occur annually from adverse drug reactions in the united

states? Am J Med 2000;109:122–130.6. MARC, Janja. Farmakogenomika - nova možnost za varnejše in učinkovitejše zdravljenje.

Farmacevtski vestnik 2011; l62: 51-56.7. Malentacchi F, Mancini I, Brandslund I, et al. Is laboratory medicine ready for the era

of personalised medicine? Clin Chem Lab Med 2015; 53(2): i-iv.

30 31


Pomen farmakogenetike in določanja koncentracij bioloških zdravil pri zdravljenju z zaviralci TNF- α pri kronični vnetni črevesni bolezni

/ TNF- α inhibitors in inflammatory bowel disease: the role of pharmacogenetics and therapeutic drug monitoring /

Gregor Novak1, Lojze Šmid1, David Drobne1

1 Univerzitetni klinični center Ljubljana, Klinični oddelek za gastroenterologijo in hepatologijo, Japljeva 2, 1000 Ljubljana, Slovenija

Povzetek

Kronična vnetna črevesna bolezen (KVČB) je sistemska bolezen z nekontroliranim vnetjem v prebavni cevi, ki močno zniža kvaliteto življenja bolnikov, včasih pa bolnika tudi življensko ogroža. Zaviralci TNF-α so učinkovita zdravila za zdravljenje te bolezni, vendar 10-40 % bolnikov ne odgovori na zdravljenje (primarna rezistenca). Še večji problem je izguba učinka po začetnem odzivu, kar se zgodi pri vsakem drugem bolniku oz. pri 10 % bolnikov letno (sekundarna odpoved). Za primarno rezistenco naj bi bile odgovorne predvsem genetske razlike med bolniki (genetski polimorfizmi, različna ekspresija genov v črevesni sluznici pred uvedbo terapije), za sekundarno odpoved pa so pomembnejši farmakokinetski mehanizmi in imunogenost zaviralcev TNF-α; posledično se je izkazalo, da je možno z določanjem koncentracij zdravila (TDM) pri večini bolnikov preprečiti sekunadno odpoved. V članku tako predstavljamo novosti iz področja farmakogenetike in farmakokinetike zaviralcev TNF-α.

Ključne besede: določanje koncentracije zdravil, farmakogenetika, zaviralci TNF-α, kronična vnetna črevesna bolezen

Abstract

Inflammatory bowel disease is a systemic disease of uncontrolled inflammation in the gastrointestinal tract, which greatly reduces quality of life and can be life-threatening. TNF-α inhibitors are highly effective drugs, however 10-40 % of patients still do not respond (primary non-response). An even bigger issue is loss of response after initial response, which occurs in every second patient or in 10 % of patients per year (secondary failure). Primary non-response can be explained with genetic differences between individual patients (genetic polymorphisms, different pre-treatment expression of inflammatory genes in intestinal mucosa). For secondary failure more important mechanisms are believed to be pharmacokinetics and immunogenicity of TNF-α inhibitors; consequently, with therapeutic drug monitoring it is possible to prevent secondary failure. The article presents recent findings in the field of pharmacogenetics and pharmacokinetics/immunogenicity of TNF-α inhibitors.

Keywords: therapeutic drug monitoring, pharmacogenetics, TNF-α inhibitors, inflammatory bowel disease

1. Uvod

Pri kronični vnetni črevesni bolezni (KVČB) gre za nekontrolirano vnetje v prebavni cevi, ki poteka z zagoni in izboljšanji. Ločimo dva podtipa, in sicer ulcerozni kolitis (UK) in Crohnovo bolezen (CB). Bolezen se kaže s krvavavimi driskami, bolečinami v trebuhu, vročino, povišanjem vnetnih kazalcev, utrujenostjo, slabokrvnostjo. Ne gre zgolj za bolezen prebavne cevi, ampak za sistemsko bolezen, ki lahko poleg črevesa prizadene še številne druge organske sisteme (koža, pljuča, oči, jetra, sklepi...) in močno zniža kakovost življenja bolnikov. Zaradi nekontroliranega vnetja lahko bolniki tudi umrejo zaradi sepse, kirurških ali trombemboličnih zapletov. Cilj zdravljenja KVČB je torej popolna kontrola vnetne aktivnosti bolezni v vseh prizadetih organih, v črevesju je cilj popolna zacelitev sluznice. S konvencionalno terapijo (aminosalicilati, antibiotiki, imunomodulatorji, enteralna prehrana, kortikosteroidi) smo pri zdravljenju uspešni zgolj pri blagih do zmernih oblikah KVČB. Z uvedbo bioloških zdravil iz skupine zaviralcev TNF-α v zdravljenje KVČB v začetku novega tisočletja se je na

32 33


tem področju zgodila prava revolucija, saj je s temi zdravili mogoče zdraviti tudi težje oblike bolezni. Tumor nekrotizirajoči faktor-α (TNF-α) je citokin s pomembno vlogo v patogenezi KVČB. Zaviralci TNF-α so monoklonska protitelesa, ki vežejo topni in membransko vezani TNF-α in s tem povzročijo nevtralizacijo prostega TNF-α (t.j. vezavo topnega TNF-α) in indukcijo apoptoze mononuklearnih vnetnih celic (z vezavo na membranski TNF-α receptor izražen na teh celicah) – to vodi v kontrolo vnetja in s tem v remisijo bolezni.Na slovenskem trgu imamo 3 različne zaviralce TNF-α, ki so registrirani za bolnike s KVČB in sicer infliksimab, adalimumab in golimumab. Med sabo se razlikujejo po načinu apliciranja in doziranju. Infliksimab se aplicira intravenozno v zdravstveni ustanovi, medtem ko se ostala dva aplicirata subkutano s strani bolnika v domačem okolju. Navadno pričnemo z indukcijskim zdravljenjem (pri infliksimabu 5 mg/kg TT ob tednu 0-2-6), ki mu sledi vzdrževalno zdravljenje (5 mg/kg TT/ 8 tednov). Glavni problem zaviralcev TNF-α je primarna rezistenca in sekundarna odpoved.

• O primarni rezistenci govorimo, kadar bolnik sploh ne odgovori na uvedbo zaviralca TNF-α – takih bolnikov je od 10-40 %.

• Sekundrna odpoved pomeni, da bolnik najprej odgovori na zaviralec TNF-α, nato pa postoma izgubi odgovor na zdravilo. To se zgodi pri vsakem drugem bolniku oz. pri približno 10 %/ leto in v končni fazi povzroči odpoved izbranega zaviralca TNF-α pri vsakem četrtem bolniku.

Mehanizma primarne rezistence in sekundarne odpovedi sta različna. Pri prvem domnevajo, da gre za farmakodinamski fenomen, in sicer za »ne-TNF-α mehanizem«, kjer TNF-α ne igra odločilne vloge v vnetnem procesu. Slednje pomeni, da so tudi ostala zdravila iz skupine zaviralcev TNF-α neučinkovita in posledično slabo prognozo s pogosto potrebo po operativni terapiji. Pri sekundarni odpovedi zdravila pa gre bolj za faramakokinetski fenomen, predvsem zaradi imunogenosti zaviralcev TNF-α, saj pride med zdravljenjem do tvorbe protiteles usmerjenih proti zdravilu in posledično do hitrejšega klirensa zdravil. Raziskave zadnjih let kažejo, da bi s pomočjo farmakogenetike in določanja koncentracij zaviralcev TNF-α (TDM) lahko bistveno izboljšali učinkovitost in dolgoročno uspešnost zdravljenja z zaviralci TNF-α. Spodaj prikazujemo rezultate nekaterih raziskav in možnosti bolniku prilagojenega zdravljenja.

2. Pomen farmakogenetike pri zdravljenju z zaviralci TNF-α

2.1 Ugotavljanje/predvidevanje primarne rezistence

Mehanizem primarne rezistence ni znan; mnogi verjamejo, da bo genetika pojasnila vzrok. Študije polimorfozmov v genih, značilnih za KVČB, so identificirale nekatere alelne variante, ki so povezane z večjo ali manjšo možnostjo, da bo bolnik odgovoril na zaviralec TNF-α. Žal doslej še ni bil identificiran noben pomembnejši polimorfizem, na osnovi katerega bi lahko jasno predvideli, kateri bolniki bodo odgovorili na zdravljenje z zaviralci TNF-α. Odziv na zdravljenje z infliksimabom pri Crohnovi bolezni je bil sicer povezovan s polimorfizmi v številnih genih (genih za ligand Fas, kaspazo 9, FCGR3A itd.) (1). Slovenska raziskovalna skupina je pokazala, da je dober odziv na zdravljenje z adalimumabom pri CB povezan s polimorfizmom v genu za ATG16L1, ki je vpleten v avtofagijo. Pri 85 % bolnikov z genotipom CT ali TT so opažali odziv na zdravljenje in le pri 37,5 % bolnikov z genotipom CC (2). Ekspresijske študije so pokazale, da so določeni geni v biopsijah sluznice črevesa pri bolnikih, ki odgovorijo na zaviralce TNF-α, močneje izraženi kot pri tistih, ki ne odgovorijo na terapijo. Tako je na primer Arijs s sodelavci ugotovila, da lahko na podlagi različne ekspresije že petih genov (TNFAIP6, S100A8, IL-11, G0S2 in S100A9) v sluznici kolona pred uvedbo infliksimaba pri bolnikih s Crohnovim kolitisom napovemo, kateri bolniki bodo odgovorili na zdravljenje in kateri ne, z 100% točnostjo (3). Podobne so bile ugotovitve pri UK, kjer lahko napovemo, kateri bolniki bodo odgovorili na zaviralce TNF-α na podlagi ekspresije genov (TNFRSF11B, STC1, PTGS2, IL-13R alfa2, IL-11; vsi vpleteni v pridobljeni imunski odziv), z 95% občutljivostjo in 85% specifičnostjo (4).

2.2 Predvidevanje/preprečevanje sekundarne odpovedi zaviralcev TNF-α

Pred kratkim so pokazali (zaenkrat objavljeno le v obliki abstrakta), da je prisotnost alela HLA-DRB1*03 neodvisni napovedni dejavnik razvoja protiteles. Pri bolnikih s protitelesi je bil prisoten v 13 %, pri bolnikih brez protiteles pa v 4 % (OR 3,6). Prisotno arginina na poziciji 74 in odsotnost

34 35


glutamata na poziciji 71 v β1- verigi proteina HLA-DR je povezana z razvojem protiteles proti infliksimabu; to sekvenčno zaporedje je prisotno pri 95 % bolnikov z alelom HLA-DRB1*03, kar je dodaten dokaz za vlogo alela v razvoju protiteles. Prisotnost alela HLA-DRB1*03 pri bolniku, ki potrebuje zdravljenje z infliksimabom, tako vpliva na obravnavo bolnika: potrebni so preventivni ukrepi za zmanjšanje imunogenosti (indukcijska doza infliksimaba, kombinirana terapija z imunomodulatorjem, pogosto merjenje koncentracij zdravila) (5).

3. Določanje koncentracije zdravila in protiteles proti zdravilu v serumu (TDM)

Med faktorji, ki privedejo do izgube učinka zaviralcev TNF-α, se v literaturi omenjajo nizke serumske koncentracije zdravila in prisotnost protiteles proti zaviralcem TNF-α, ki so posledica imunogenosti. Protitelesa se vežejo na zdravilo (t.j. protitelo proti TNF-α) in zmanjšajo njegovo učinkovitost. Z vezavo na Fab podenoto zdravila protitelo onemogoči vezavo liganda (t.j.TNF-α), z vezavo na ostale dele zdravila pa vpliva na farmakokinetiko, saj pospeši imunsko pogojeno odstranjevanje zdravila preko retikulo-endotelijskega sistema. Meritev se izvede tik pred naslednjo aplikacijo zdravila, ko je koncentracija zdravila v serumu najnižja (TL; angl. trough level) (6). Večina študij je bila opravljena z infliksimabom, zato se bomo v prispevku osredotočili nanj. Prikazali bomo, kje v zdravljenju z infliksimabom je TDM pomembna in vpliva na odločitev o zdravljenju.

3.1 TDM med indukcijskim zdravljenjem

Nizke koncentracije zaviralca TNF-α in protiteles proti zdravilu v času indukcije kažejo na poddoziranje zdravila. Z optimizacijo odmerka (dvig doze, skrajšanje intervala med aplikacijami) zagotovimo zadostno koncentracijo zdravila v krvi in induciramo remisijo bolezni. Primer je akutni hudo-potekajoč ulcerozni kolitis, kjer gre za hudo sistemsko vnetje z visokimi koncentracijami TNF-α, ki porabljajo velike količine zdravila. Poleg tega gre za pospešen metabolizem infliksimaba ter izgubo zdravila preko vnete črevesne stene v lumen črevesa, zato pričakujemo nizke koncentracije zdravila v krvi.

Dokazali so, da s pospešeno indukcijo (3 aplikacije infliksimaba povprečno v 24 dneh) v primerjavi s standardnim režimom (3 aplikacije infliksimaba ob tednu 0-2-6) zmanjšamo potrebo po zgodnji totalni kolektomiji (odstranitvi celotnega debelega črevesja) iz 40 % na 6,7 % (7).Nizke koncentracije zdravila so lahko tudi med indukcijo posledica imunogenosti. Nedavno je bilo ugotovljeno, da se protitelesa proti infliksimabu pojavijo zelo zgodaj, lahko že po prvi infuziji infliksimaba (8). Če so torej koncentracije zaviralca TNF-α nizke ob hkratnih visokih vrednostih protiteles, gre za zgodnjo sekundarno odpoved. Z zamenjavo zdravila za drug zaviralec TNF-α lahko induciramo remisijo bolezni. TDM med indukcijo lahko torej prepreči napačen zaključek, da gre za primarno rezistenco zaviralcev TNF-α. Pomaga pri odločitvi za optimizacijo zdravljenja z infliksimabom pri poddoziranju ali zamenjavo za drug zaviralec TNF-α pri zgodnji sekundarni odpovedi. S tem prepreči nepotrebne operacije in zamenjave za omejen spekter zdravil drugih skupin, ki so navadno manj učinkovita (9).

3.2 TDM po indukciji

Bolniki s CB z dolgotrajnim odzivom na zaviralce TNF-α so imeli po indukciji (14. teden) višje vrednosti TL od bolnikov, pri katerih je prišlo do izgube odziva na zdravljenje. Vrednosti TL nad 3,5 µg/mL (in upad CRP) po indukciji napovedujejo dolgotrajen odziv na vzdrževalno zdravljenje pri bolnikih s povišanim CRP pred uvedbo infliksimaba. Pri bolnikih z TL pod 3,5 µg/mL pa bi bilo smiselno dvigniti TL z optimizacijo odmerka (ali pa pogosto spremljati TL) in s tem preprečiti padec koncentracije infliksimaba pod mejo zaznave in s tem razvoj protiteles, ki se pojavijo ob epizodičnih aplikacijah (10).Podobna so spoznanja pri ulceroznem kolitisu, kjer koncentracije TL 14. teden po začetku indukcije nad 2,5 µg/mL napovedujejo manj akutnih zagonov bolezni in manjšo stopnjo kolektomij kot koncentracije pod to vrednostjo (11). Zgodnja določitev TL po indukciji lahko napove dolgoročni klinični odgovor za zdravljenje z zaviralci TNF-α.

3.3 TDM v remisiji bolezni

Znana je povezava med TL in klinično remisijo pri KVČB; višje vrednoti TL pomenijo boljši nadzor nad boleznijo. Tako je povprečna vrednost TL pri

36 37


bolnikih s KVČB v klinični remisiji 2,6 µg/mL, pri bolnikih v klinični remisiji z nizkim CRP-jem (klinična in biokemična remisija) 3,5 µg/mL, pri bolnikih v klinični remisiji s kalprotektinom pod 250 (marker vnetne aktivnosti v črevesni steni, ki korelira z endoskopsko remisijo) pa 4,9 µg/mL (12). Študija TAXIT je dokazala, da je v klinični remisiji imelo kar 9 % bolnikov vrednosti TL pod mejo zaznave in od teh 77 % prisotna protitelesa proti infliksimabu (13). Ti bolniki lahko imajo aktivno bolezen, ki je klinično tiha, ali pa bo kmalu prišlo do zagona bolezni. Vaughn s sodelavci je primerjal proaktiven TDM s titracijo zdravila do ciljnih TL s standardnim režimom apliciranja infliksimaba. Ciljno vrednost zdravila so postavili med 5 in 10 µg/mL: pri bolnikih z nižjimi TL so povišali dozo zdravila in skrajšali interval, obratno so storili pri previsokih TL. Pri vrednostih TL nad 5 µg/mL je verjetnost, da so ostali na vzdrževalni terapiji z infliksimabom, več kot 90 % (HR 0,1 (95% CI:0,02-0,4)). Noben od bolnikov z vrednostmi v zaželjenem intervalu ni prenehal z zdravilom zaradi poslabšanja osnovne bolezni ali infuzijske reakcije, kar pa se je zgodilo v skupini bolnikov s standardnim režimom, kjer je najverjetneje prišlo do razvoja protiteles (14). Visoke vrednosti TL imajo malo verjetno korist, zato je umestno (čeprav ne dokazano) bolnikom z visokimi TL znižati odmerke zaviralca TNF-α, saj gre za zelo draga zdravila. Tako so v študiji TAXIT pri vrednostih TL nad 7 znižali odmerek zdravila ali podaljšali interval doziranja do vrednosti TL med 3 in 7. Pri tem niso opažali izgube učinka zdravila ali poslabšanja bolezni do skupnega opazovanega časa 1 leto, so se pa znižali stroški zdravljenja zaradi nižjih doz zdravil (13). Zaenkrat sicer zgornja koncentracija infliksimaba, ki je še koristna za bolnika, ni znana, vendar se verjetno giblje med 7 in 10 (12-14).Glavni pomen TDM med remisijo je identifikacija bolnikov z nizkimi ali nezaznavnimi vrednostmi TL in optimizacija zdravljenja, ki lahko prepreči zagon bolezni in razvoj protiteles s sekundarno odpovedjo.

3.4 TDM ob zagonu bolezni

Izraelska raziskava je analizirala uspešnost različnih intervencije pri izgubi odziva na zdravljenje z zaviralci TNF-α glede na nivoje TL ter protiteles. Ugotovili so, da pri vrednostih TL za infliksimab nad 3,8 µg/mL optimiziranje odmerka istega ali zamenjava za drug zaviralec TNF-α ni uspešna v 90 %. Nivoji nad to vrednostjo predstavljajo zadostne količine zdravila, zato so se za uspešnejše izkazale zamenjave za zdravila izven skupine zaviralcev TNF-α.

Pri koncentraciji protiteles proti infliksimabu nad 9 µg/mL-eq optimiziranje odmerka ni bilo uspešno v 90 %, v tem primeru se je za boljšo izbiro pokazala zamenjava za drug zaviralec TNF-α. Pri bolnikih z nizkimi ali nezaznavnimi vrednostmi tako TL kot protiteles pa je bilo najuspešnejše optimiziranje odmerka infliksimaba. Meritve TL pred in po optimiziranju odmerka so pokazale pomen protiteles. Ob prisotnih visokih titrih protiteles pred optimizacijo (>9 µg/mL-eq) se nivo TL po optimizaciji terapije ni spremenil (nevtralizacija zdravila s prisotnimi protitelesi), pri nezaznavnih ali nizkih titrih protiteles (<9 µg/mL-eq) pa je prišlo do pomembnega porasta TL po povišanju odmerka (15). TDM je torej pomemben pri izgubi odziva ob vzdrževalni terapiji z zaviralci TNF-α za odločitev glede ustrezne intervencije, kar pogosto predstavlja klinično dilemo. TDM pomaga pri odločitvi v več kot dveh tretjinah bolnikov, poleg tega je takšen način obravnave bolnikov tudi stroškovno ugodnješi. Slednje je dokazala danska študija, ki je primerjala optimizacijo odmerka infliksimaba pri izgubi odziva na podlagi TDM in glede na običajno klinično prakso. Pri zdravljenju po algoritmu s TDM so bili stroški zdravljenja bistveno nižji (34 %) ob podobni uspešnosti zdravljenja in kvaliteti življenja bolnikov (16).

3.5 TDM ob prehodu iz kombinirane terapije na monoterapijo

Kombirana terapija infliksimaba in imunomodulatorja (azatioprin, 6-merkaptopurin, metotreksat) je pri bolnikih, ki predhodno niso jemali teh zdravil, uspešnejša kot monoterapija (17), zato se terapija z infliksimabom načeloma vedno začne kot kombinirana terapija. Pomen kombinirane terapije je predvsem v prvih mesecih zdravljenja, saj imajo ti bolniki višje vrednosti TL kot bolniki na monoterapiji z infliksimabom (1,44-krat) in redkeje razvijejo protitelesa. Zaradi stranskih učinkov kombinirane terapije (malignomi, okužbe) pa je potrebno čimprej po doseženi remisiji bolezni ukiniti eno od imunosupresivnih zdravil, bodisi imunomodulator bodisi infliksimab. V primeru, da se zdravnik odloči za ukinitev infliksimaba in prehod na monoterapijo z azatioprinom, imajo TL nad 2 µg/mL negativno napovedno vrednost za remisijo bolezni po prehodu na monoterapijo z azatioprinom (HR 0,4 (95% CI: 0,19-0,91)) (18). Če imaš torej pred ukinitvijo visok nivo TL, to pomeni, da je zdravilo prisotno v krvi in verjetno sodeluje v doseganju remisije bolezni. Po ukinitvi infliksimaba, zato tvegaš zagon.

38 39


V primeru, da se zdravnik odloči za ukinitev azatioprina in prehod na monoterapijo z infliksimabom, imajo visoki nivoji TL ob prehodu iz kombinirane na monoterapijo pozitivno napovedno vrednost za dolgotrajno remisijo; bolniki TL nad 5 µg/mL nimajo ponovnega zagona bolezni, tisti z nezaznavnimi TL pa imajo že v nekaj mesecih spet zagon bolezni (19).

3.6 TDM pri ponovni uvedbi infliksimaba po prekinitvi

Ponovna uvedba infliksimaba po več kot 6 mesečni prekinitvi terapije (angl. drug holiday) je povezana z povečano možnostjo infuzijskih reakcij in z neučinkovitostjo, saj so bolniki, ki so bili že predhodno izpostavljeni zdravilu, lahko razvili protitelesa proti zdravilu. Posledično je do pred kratkim veljalo, da se bolnikom, ki so bili v preteklosti že izpostavljeni infliksimabu, ponovno ne uvaja zdravila. Nedavna raziskava pa je pokazala, da je ponovna uvedba zdravila varna (infuzijske reakcije v 20 % bolnikov) in učinkovita (odziv na zdravljenje pri 84,5 % bolnikov pri 14 tednih in 70 % po enem letu). Pomembno je le, da se zdravila ne uvede bolnikom, ki so imeli v preteklosti infuzijske reakcije ali dokazano sekundarno odpoved zaradi tvorbe protiteles proti infliksimabu. Podobni so bili izsledki, do katerih je prišel Louis s sodelavci, kjer je bila ponovna uvedba infliksimaba varna in uspeša (remisija) pri 88 % bolnikov (18). S pomočjo TDM se da napovedati, kateri bolniki lahko varno in učinkovito ponovno začnejo terapijo že po prvi oz. drugi ponovni infuziji infliksimaba. Bolniki, ki so imeli v serumu po ponovni infuziji protitelesa in nizke nivoje TL, niso imeli koristi od zdravljenja in so imeli pogoste infuzijske reakcije. Na drugi strani vrednosti TL nad 2 µg/mL oz. odsotnost protiteles po ponovni izpostavitvi infliksimabu napovedujejo dolgoročno uspešnost zdravljenja. Odsotnost protiteles se je izkazala za edini napovedni dejavnik za varno ponovno uvedbo infliksimaba (20).

3.7 TDM pri subkutanih zaviralcih TNF-α

Določanje TL in protiteles pri subkutanih zaviralcih TNF-α (adalimumab, golimumab) lahko pomaga odkriti nekompliantne bolnike (zdravilo si aplicirajo sami v domačem okolju), saj imajo ti bolniki ves čas nezaznavne nivoje.

4. Sklep

Koncept personalizirane medicine prodira v obravnavo bolnikov s KVČB, saj lahko pomaga pri problemu primarne rezistence in sekundarne odpovedi zaviralcev TNF-α. Pri problemu primarne rezsitence ima vlogo predvsem farmakogenetika, pri problemu sekundarne odpovedu pa TDM.

Pri izbiri zaviralca TNF-α so nam lahko v pomoč molekularne tehnike:

• ekspresija genov v biopsijah črevesne sluznice z visoko natančnostjo identificira bolnike s primarno rezistenco;

• genetski polimorfizmi (ligand Fas, ATG16L1, itd.) dobro korelirajo s primarno rezistenco, vendar so zaenkrat neuporabni v klinični praksi zaradi nizke absolutne napovedne vrednosti; in

• bolniki z HLA-DRB1*03 so bolj podvrženi tvorbi protiteles proti infliksimabu.

Ko je terapija s zaviralcem TNF-α enkrat uvedena, nam TDM omogoča bolj optimalno obravnavo:

• TDM ob indukciji: prepreči napačno odločitev, da gre za primarno rezistenco in s tem omogoči optimizacijo odmerka (poddoziranje) ali zamenjavo za drug zaviralec TNF-α (zgodnja sekundarna odpoved zaradi imunogenosti);

• TDM po indukciji: napove dolgoročni učinek zdravljenja;

• TDM v remisiji: omogoča optimizacijo odmerka zdravila, s čimer preprečimo zagon bolezni ali razvoj protiteles;

• TDM ob zagonu bolezni: loči farmakokinetični od farmakodinamičnega razloga poslabšanja bolezni in vodi v ustrezno terapevtsko odločitev;

• TDM pred prehodom iz kombinirane terapije na monoterapijo: omogoča predvideti dolgoročni učinek zdravljenja in varno ukinitev kombinirane terapije;

• TDM tik po ponovni uvedbi zdravila po daljši prekinitvi: omogoča predvideti varnost in dolgoročni učinek zdravljenja; in

• TDM pri subkutanih zaviralcih TNF-α: omogoča nadzor kompliantnosti.

40 41


V Sloveniji smo pričeli s personalizirano medicino na področju KVČB med prvimi v Evropi, srečujemo pa se z logističnimi (zamudno in drago pošiljanje biološkega materiala v tujino) in finančnimi težavami, saj se zaenkrat nivoji bioloških zdravil določajo le v tujini.

Literatura

1. Pierik M, Rutgeerts P, Vlietinck R, et al. Pharmacogenetics in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol 2006;12:3657–3667.

2. Koder S, Repnik K, Ferkolj I, et al. Genetic polymorphism in ATG16L1 gene influences the response to adalimumab in Crohn’s disease patients. Pharmacogenomics 2015;16:191-204.

3. Arijs I, Quintens R, Van Lommel L, et al. The predictive value of epithelial gene expression profiles for response to infliximab in Crohn’s disease. Inflamm Bowel Dis 2010;16:2090-2098.

4. Arijs I, Li K, Toedter G, et al. Mucosal gene signatures to predict response to infliximab in patients with ulcerative colitis. Gut 2009;58:1612-1619.

5. Billiet T, Vande Casteele N, Van Stappen T, et al. Immunogenicity to infliximab is associated with HLA-DRB1. Abstract. Gut 2015;64:1344–1345.

6. Chaparro M, Guerra I, Muñoz-Linares P, et al. Systematic review: antibodies and anti-TNF-α levels in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther 2012;35:971-986.

7. Gibson DJ, Heetun ZS, Redmond CE, et al. An Accelerated Infliximab Induction Regimen Reduces the Need for Early Colectomy in Patients with Acute Severe Ulcerative Colitis. Clin Gastroenterol Hepatol 2015;13:330-335.

8. Ungar B, Chowers Y, Yavzori M, et al. The temporal evolution of antidrug antibodies in patients with inflammatory bowel disease treated with infliximab. Gut 2014;63:1258-64.

9. Papamichael K, Gils A, Rutgeerts P, et al. Role for therapeutic drug monitoring during induction therapy with TNF antagonists in IBD: evolution in the definition and management of primary nonresponse. Inflamm Bowel Dis 2015;21:182-197.

10. Cornillie F, Hanauer SB, Diamond RH, et al. Postinduction serum infliximab trough level and decrease of C-reactive protein level are associated with durable sustained response to infliximab: a retrospective analysis of the ACCENT I trial. Gut 2014;63:1721-1727.

11. Arias MT, Vande Casteele N, Vermeire S, et al. A panel to predict long-term outcome of infliximab therapy for patients with ulcerative colitis. Clin Gastroenterol Hepatol 2015;13:531-538.

12. Roblin X, Rinaudo M, Jarlot C, et al. OPOO5 Infliximab trough level thresholds vary depending on the efficacy criterion chosen for IBD patients. Oral presentation, ECCO congress, Barcelona 2015.

13. Niels Vande Casteele, Marc Ferrante, Gert Van Assche, et al. Trough Concentrations of Infliximab Guide Dosing for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Gastroenterology 2015;148:1320–1329.

14. Vaughn BP, Martinez-Vazquez M, Patwardhan VR, et al. Proactive therapeutic concentration monitoring of infliximab may improve outcomes for patients withinflammatory bowel disease: results from a pilot observational study. Inflamm Bowel Dis 2014;20:1996-2003.

15. Yanai H, Lichtenstein L, Assa A, et al. Levels of drug and antidrug antibodies are associated with outcome of interventions after loss of response to infliximab or adalimumab. Clin Gastroenterol Hepatol 2015;13:522-530.

16. Steenholdt C, Brynskov J, Thomsen O, et al. Individualised therapy is more cost-effective than dose intensification in patients with Crohn’s disease who lose response to anti-TNF treatment: a randomised, controlled trial. Gut 2014;63:919-927.

17. Colombel JF, Sandborn WJ, Reinisch W, et al. Infliximab, azathioprine, or combination therapy for Crohn’s disease. N Engl J Med 2010;362:1383–1395.

18. Louis E, Mary JY, Vernier-Massouille G, et al. Maintenance of remission among patients with Crohn's disease on antimetabolite therapy after infliximab therapy is stopped. Gastroenterology 2012;142:63-70.

19. Drobne D, Bossuyt P, Breynaert C, et al. Withdrawal of Immunomodulators After Co-treatment Does Not Reduce Trough Level of Infliximab in Patients With Crohn’s Disease. Clin Gastroenterol Hepatol 2015;13:514-521.

20. Baert F, Drobne D, Gils A, et al. Early Trough Levels and Antibodies to Infliximab Predict Safety and Success of Reinitiation of Infliximab Therapy. Clin Gastroenterol Hepatol 2014;12:1474-1481.

42 43


Novi pristopi pri genotipizaciji polimorfizmov v genu za CYP2D6

/ Novel approaches to CYP2D6 genotyping /

Irena Prodan Žitnik1, Vid Mlakar1, Janja Marc1

1 Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, Katedra za klinično biokemijo, Aškerčeva 7, 1000 Ljubljana

Povzetek

Ocenjujejo, da citokrom P450 2D6 (CYP2D6) sodeluje pri metabolizmu 20-25 % zdravilnih učinkovin, ki se uporabljajo v klinični praksi, kot so npr. nekateri antidepresivi, antipsihotiki, antiaritmiki, antagonisti beta adrenergičnih receptorjev, opioidni analgetiki in protitumorske učinkovine. Zaradi številnih polimorfizmov v genu za CYP2D6, se aktivnost encima in s tem presnova teh zdravil med posamezniki zelo razlikuje. Aktivnost encima lahko sega od nezaznavne pri slabih presnovnikih do visoke pri ultrahitrih presnovnikih. S pomočjo genotipizacije polimorfizmov lahko predvidimo aktivnost encima in presnovo zdravil pred začetkom zdravljenja in, da bi se izognili neželenim učinkom oziroma zmanjšani učinkovitosti zdravila, odmerke ustrezno prilagodimo, kar predstavlja korak k individualizaciji zdravljenja. Običajne metode so pri genotipizaciji velikega števila polimorfizmov zamudne in drage, zato smo želeli vpeljati metodo, ki bi omogočila hkratno analizo več polimorfizmov. Z metodo podaljševanja začetnih oligonukleotidov smo uspešno genotipizirali 11 klinično najpomembnejših polimorfizmov v eni reakciji in s tem bistveno skrajšali čas analize ter zmanjšali stroške.

Ključne besede: polimorfizmi CYP2D6, individualizirano zdravljenje, podaljševanje začetnih oligonukleotidov

Abstract

It is estimated, that cytochrome P450 2D6 (CYP2D6) enzyme plays an important role in the metabolism of 20-25 % of all clinically used drugs, for example certain antidepressants, antipsychotics, antiarrhythmics, beta-blockers, opioid analgesics and anticancer agents. Due to the highly polymorphic status of the CYP2D6 gene, the enzyme is very variable in activity, ranging from zero in poor metabolizers to high in ultra rapid metabolizers. Preemptive genotyping for the CYP2D6 allele variants enables identification of patients with impaired or increased metabolic phenotypes and can help with individualization of therapy. Conventional methods for analysis of that many allele variants are time consuming and expensive and fast and reliable multiplex method is needed for simultaneous analysis of multiple polymorphisms. With the use of Multiplex Single Base Primer Extension Method we successfully genotyped 11 clinically most important CYP2D6 polymorphisms and substantially reduced the time and cost of the analysis.

Keywords: CYP2D6 polymorphisms, individualized therapy, multiplex single base primer extension method

1. Uvod

Citokrom P450 2D6 (CYP2D6) sodeluje pri metabolizmu 20-25 % klinično pomembnih zdravilnih učinkovin (1). Tipični CYP2D6 substrati so lipofilni in vključujejo učinkovine iz številnih terapevtskih skupin, kot so na primer nekateri antidepresivi (amitriptilin, citalopram, imipramin, nortriptilin,…), antipsihotiki (klorpromazin, klozapin, haloperidol, risperidon, …), antiaritmiki (propafenon, …), antagonisti beta adrenergičnih receptorjev (metoprolol, timolol,…), opioidni analgetiki (kodein, morfin, tramadol), protitumorske učinkovine (tamoksifen, debrizokin, gefitinib,…) in drugi (2).Gen za CYP2D6 je zelo polimorfen (do danes je znanih več kot 100 alelnih različic (3)) in zaradi številnih polimorfizmov obstajajo velike interindividualne razlike v aktivnosti encima. Preiskovance lahko na podlagi CYP2D6 genotipa razdelimo v 4 skupine: normalne, počasne, vmesne in ultrahitre presnovnike. Pri počasnih presnovnikih je encimska aktivnost CYP2D6 nezaznavna, presnova zdravilnih učinkovin, ki se presnavljajo s CYP2D6, pa upočasnjena. Plazemske koncentracije teh zdravilnih učinkovin so pri običajnem odmerjanju pri počasnih

44 45


presnovnikih zvišane, delovanje učinkovin je podaljšano, tveganje za pojav neželenih učinkov pa povečano. Zato počasni, v primerjavi z normalnimi presnovniki, pogosto potrebujejo nižje odmerke zdravil. Možna je tudi zmanjšana učinkovitost predzdravil, katerih pretvorbo v aktivni metabolit katalizira CYP2D6. V nasprotju s počasnimi presnovniki, je pri ultrahitrih presnovnikih, ki imajo zaradi duplikacije ali multiplikacije gena za CYP2D6 več kot dva funkcionalna alela, učinkovitost zdravil v običajnih odmerkih lahko zmanjšana in potrebujejo za ustrezno delovanje višje odmerke, pri uporabi predzdravil pa se pri njih pogosteje pojavijo neželeni stranski učinki (4, 5). Genotipizacija bolnikov pred začetkom zdravljenja omogoča identifikacijo bolnikov z različnimi CYP2D6 fenotipi in pomaga pri individualizaciji zdravljenja.

2. Analiza polimorfizmov CYP2D6

Za genotipizacijo polimorfizmov CYP2D6 se običajno uporablja metoda alelne diskriminacije s hidrolizirajočimi sondami, ki je pri analizi večjega števila polimorfizmov zamudna in draga, saj je potrebno izvesti več ločenih in zaporednih analiz (genotipizacij). Zato smo želeli vpeljati metodo, ki bi omogočila hkratno določitev 11-ih klinično najpomembnejših polimorfizmov CYP2D6 v čim krajšem času. Za analizo smo izbrali metodo podaljševanja začetnih oligonukleotidov (angl. Multiplex Single Base Primer Extension Method), ki temelji na podaljševanju neoznačenih začetnih oligonukleoidov, ki se komplementarno vežejo na dele gena tik pred posameznimi polimorfizmi, za en nukleotid (Slika 1).

Slika 1. Princip metode podaljševanja začetnih oligonukleotidov (povzeto po (6)). Figure 1. Principle of the Single Base Primer Extension Method (adapted from (6)).

Podaljšanje za točno en nukleotid dosežemo z uporabo dideoksinukleozid trifosfatov (ddNTP), s katerimi DNA polimeraza podaljša začetne oligonukleotide na polimorfnih mestih. Metoda je primerna za analizo polimorfizmov posameznih nukleotidov ter nekaterih krajših insercij ali delecij. Podobna metoda je že opisana (7), vendar smo jo za uporabo v našem laboratoriju morali ustrezno optimizirati.Z metodo podaljševanja začetnih oligonukleotidov smo določili genotipe 11-ih klinično najpomembnejših polimorfizmov v genu za CYP2D6 in sicer: 100C>T, 2850C>T, 1023C>T, 1661G>C, 1707delT, 1846G>A, 2549delA, 2613-15delAAG, 2988G>A, 3183G>A in 4180G>C. Najprej smo z metodo verižne reakcije s polimerazo pomnožili celoten gen CYP2D6 in produkt dolžine 5,1 kb uporabili v reakciji podaljševanja začetnih oligonukleotidov. Za analizo polimorfizmov smo oblikovali 11 specifičnih začetnih oligonukleotidov, ki se prilegajo delu gena CYP2D6 tik pred posameznimi polimorfizmi in se med seboj v dolžini razlikujejo za 4-5 nukleotidov (Tabela 1). Razlika v dolžini omogoča kasnejšo ločbo podaljšanih začetnih oligonukleotidov s kapilarno elektroforezo.

Tabela 1: Sekvence in dolžine uporabljenih začetnih oligonukleotidovTable 1: Sequence and length of interrogation primers

Polimorfizem Sekvenca začetnega oligonukleotida Dolžina

100 C>T ACGCTGGGCTGCACGCTAC 19

2850 C>T TTAGCTTCAATGATGAGAACCTG 23

1023 C>T (T)7ACCGCCCGCCTGTGCCCATCA 28

1661 G>C (T)12CGAGCAGAGGCGCTTCTCCGT 33

1707 delT (T)18GCAAGAAGTCGCTGGAGCAG 38

1846 G>A (T)25CCGCATCTCCCACCCCCA 43

2549 delA (T)27GATGAGCTGCTAACTGAGCAC 48

2613-15 delAGA (T)32GCCTTCCTGGCAGAGATGGAG 53

4180 G>C (T)37GTGTCTTTGCTTTCCTGGTGA 58

2988 G>A (T)44AGTGCAGGGGCCGAGGGAG 63

3183 G>A (T)46TGTCCAACAGGAGATCGACGAC 68

Legenda: ddGTP – dideoksi gvanozin trifosfat; ddATP – dideoksi adenozin trifosfat; ddTTP – dideoksi timidin trifosfat; ddCTP – dideoksi citidin trifosfat.

Legend: ddGTP – dideoxy guanosine triphosphate; ddATP – dideoxy adenosine triphosphate; ddTTP – dideoxy thymidine triphosphate; ddCTP – dideoxy cytidine triphosphate.

ddTGPddATPddTTPddCTP

polimorfno mesto

kapilarna elektroforeza, detekcija

ACGCTGGGCTGCACGCTACNNNNTGCGACCCGACGTGCGATGGNNNNNNN

ACGCTGGGCTGCACGCTACCNNNNTGCGACCCGACGTGCGATGGNNNNNNN

barva = genotip

46 47


Po reakciji podaljševanja začetnih oligonukleotidov s fluorescentno označenimi ddNTP, smo produkte ločili s kapilarno elektroforezo, ki ji je sledila detekcija fluorescence. Rezultati so prikazani na Sliki 2.

Slika 2. Rezultati genotipizacije 11-ih CYP2D6 polimorfizmov z metodo podaljševanja začetnih oligonukleotidov. Prvi in zadnji vrh (13 in 88 nt) predstavljata velikostna standarda, vmes so podaljšani začetni oligonukleotidi. Barva vrhov označuje za kateri polimorfizem gre.Figure 2. Results of primer extension method for CYP2D6 genotyping. First and last peak represent the size standard and in between are the extended interrogation primers. Color of the peaks denotes the type of polymorphism.

Rezultate smo potrdili s sekvenčno analizo. Primera rezultatov sekvenčne analize za polimorfizma 2988 G>A in 3183 G>A sta prikazana na Sliki 3.

Slika 3. Rezultati sekvenčne analize za polimorfizma 3183 G>A (A) in 2988 G>A (B). Modro sta označena začetna oligonukleotida, ki jima sledi polimorfno mesto. A: GG homozigot za polimorfizem 3183 G>A; B: GA heterozigot za polimorfizem 2988 G>A.Figure 3. Sequencing results for 3183 G>A (A) in 2988 G>A (B) polymorphisms. Interrogation primers are represented in blue and next to them on the right is the polymorphic site. A: GG homozygous individual for 3183 G>A polymorphism. B: GA heterozygous individual for 2988 G>A polymorphism

3. Sklep

Metoda podaljševanja začetnih oligonukleotidov je učinkovita, hitra in cenovno ugodna metoda za hkratno genotipizacijo več polimorfizmov posameznih nukleotidov ter krajših insercij ali delecij, s katero smo uspešno genotipizirali 11 polimorfizmov v genu za CYP2D6 v eni reakciji. Z vključitvijo specifičnih začetnih oligonukleotidov za dodatne polimorfizme v reakcijsko zmes je možno nabor preiskovanih polimorfizmov tudi razširiti, z nadaljnjo optimizacijo pa načrtujemo z opisano metodo analizirati tudi prisotnost delecij ali duplikacij gena za CYP2D6.

48 49


Literatura

1. Ingelman-Sundberg M. Genetic polymorphisms of cytochrome P450 2D6 (CYP2D6): clinical consequences, evolutionary aspects and functional diversity. The pharmacogenomics journal 2005; 5: 6-13.

2. PharmGKB. https://www.pharmgkb.org/gene/PA128#tabview=tab3&subtab=33, dostopno: 26.7. 2015.

3. Ulrich MZ. Genetic variability of CYP2D6: basic and clinical aspects. In CYP2D6: Genetics, Pharmacology and Clinical Relevance. Future Medicine Ltd, 2014: 28-41.

4. Teh LK,Bertilsson L. Pharmacogenomics of CYP2D6: molecular genetics, interethnic differences and clinical importance. Drug metabolism and pharmacokinetics. 2012; 27: 55-67.

5. Marc J. Farmakogenomika – nova možnost za varnejše in učinkovitejše zdravljenje. Farmacevtski vestnik 2011; 62: 51-56.

6. Life technologies. SNaPshot® Multiplex System for SNP genotyping. Product bulletin. https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/cms_101014.pdf, dostopno: 26.7. 2015.

7. Sistonen J, Fuselli S, Levo A, Sajantila A. CYP2D6 genotyping by a multiplex primer extension reaction. Clinical chemistry 2005; 51: 1291-1295.

50 51


Genetske preiskave pri spremljanju uspeha zdravljenja bolnikov s kronično mieloično levkemijo

/ Molecular genetic tests and monitoring of the therapy in chronic myeloid leukemia patients /

Tadej Pajič1, Irena Preložnik Zupan1, Mateja Grat2, Peter Černelč1

1 Univerzitetni klinični center Ljubljana, Interna klinika, Klinični oddelek za hematologijo, Zaloška cesta 7, Ljubljana

2Splošna bolnišnica Celje, Oblakova ulica 5, Celje

Povzetek

Kronično mieloično levkemijo (KML) označuje zliti gen BCR-ABL1. Z razvojem tarčnih zdravil, zaviralcev tirozin-kinaze (TKI) BCR-ABL1, se je strategija zdravljenja KML povsem spremenila, kakovost življenja izboljšala, preživetje bolnikov pa podaljšalo. Večina bolnikov doseže stabilne in trajne globoke molekularne odzive. Manjši del bolnikov s KML je neodzivnih na zdravljenje s TKI ali pa bolezen napreduje kljub zdravljenju. Pojav točkovnih mutacij v ABL1 kinazni domeni beljakovine BCR-ABL1 je eden pogostih dejavnikov, ki vpliva na neodzivnost za zdravljenje s TKI. Zato so molekularno genetske metode postale zelo pomembne pri oceni uspeha zdravljenja bolnikov s KML. Opisujemo naše izkušnje z molekularno genetskimi metodami za ugotavljanje bolezni in spremljanje uspešnosti zdravljenja bolnikov s KML.

Ključne besede: Kronična mieloična levkemija, BCR-ABL1, zaviralec tirozin-kinaze, molekularno genetske preiskave

Abstract

Chronic myeloid leukemia (CML) is caused by the formation of BCR-ABL1 fusion gene, which is also a molecular marker for the disease. Development of targeted drugs, BCR-ABL1 tyrosine kinase inhibitors, has changed the strategy for treatment of CML and improved the quality of life and survival rates of the patients. Majority of patients develop stable and durable deep molecular response. However, some of them are resistant to TKI. Point mutations in the ABL1 kinase domain of BCR-ABL1 protein are a frequent mechanism of resistance to TKI therapy. Therefore, molecular genetics tests have become very important in monitoring of treatment of CML patients with TKI. Here, we describe our experiences of the molecular genetics methods used for diagnosis and monitoring the therapy of CML patients.

Key words: Chronic myeloid leukemia, BCR-ABL1, inhibitor of tyrosine kinase, molecular genetic tests

1. Uvod

Kronična mieloična levkemija (KML), je maligna bolezen krvotvorne matične celice, ki jo uvrščamo med mieloproliferativne novotvorbe (1, 2). Zanjo je značilen zliti gen BCR-ABL1, ki nastane kot posledica dvojne zamenjave (recipročna translokacija) kromosomskih delov med kromosomoma 9 (9q34.1), na katerem se nahaja gen ABL1, in 22 (22q11.2), na katerem se nahaja gen BCR. Nastaneta dolg kromosom 9 (9+) in skrajšan kromosom 22, imenovan kromosom Philadelphia (Ph; (t(9;22)(9q34.1; 22q11.2)) (3, 4). Na kromosomu Ph nastali zliti gen BCR-ABL1 kodira zapis za tirozin-kinazo BCR-ABL1. Protein BCR-ABL1 vpliva na stalno aktivacijo signalnih poti v celici, poveča se proliferacija in prepreči apoptoza (celična smrt) celic (5). Zliti gen BCR-ABL1 ugotovimo tudi pri 20 - 40 % odraslih bolnikov z akutno limfoblastno levkemijo celic B (B-ALL) in v 2 - 5 % B-ALL pri otrocih. Zelo redko ga odkrijemo pri bolnikih z akutno mieloično levkemijo (< 1%) (1, 6).

Beljakovina BCR-ABL1 je tarča za ciljano zdravljenje z zaviralci tirozin-kinaze (TKI). Prva učinkovina iz skupine TKI, ki so jo uporabili za zdravljenje, je bila imatinib mesilat (imatinib). Ta je povsem spremenil kakovost življenja

52 53


in preživetje bolnikov s KML v primerjavi s prejšnjimi zdravljenji. Molekula imatiniba se veže v aktivno mesto encima, ga blokira in omogoči proces apoptoze celic (1). Danes za zdravljenje KML uporabljamo tudi drugo generacijo TKI, nilotinib in dasatinib, ki sta še močnejša zaviralca BCR-ABL1 tirozin-kinaze. Omogočata hitrejše in globlje odzive na zdravljenje. Način zdravljenja je odvisen tudi od obdobja bolezni KML: kronično, pospešeno ali blastna preobrazba. Pospešeno obdobje in blastno preobrazbo lahko skupaj opredelimo tudi kot napredovalo obdobje. Natančnejši načini zdravljenja so opisani drugje (4, 7). Genetska nestabilnost spremenjenega klona celic lahko vodi do neodzivnosti (rezistenco) na zdravljenje in do napredovanja bolezni, nastanka sekundarne akutne levkemije (8). V primeru neodzivnosti na zdravljenje ali ko bolezen napreduje kljub zdravljenju s TKI, se odločimo za druga zdravila ali presaditev krvotvornih matičnih celic (PKMC)(7).Uspešnost zdravljenja spremljamo s celotno krvno sliko, standardizirano kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (kvantitativni PCR) in/ali s citogenetsko preiskavo ter preiskavo FISH. V primeru rezistence na zdravljenje s TKI, poslabšanja (nepojasnena anemija, levkopenija in trombocitopenija) oz. napredovanja bolezni opravimo še dodatne preiskave, kot so citogenetska preiskava vzorca kostnega mozga za oceno drugih kromosomskih sprememb v celicah s kromosomom Ph (Ph+) ali brez kromosoma Ph (Ph-) , ugotavljamo pridobljene mutacije v genu BCR-ABL1, ki lahko vplivajo na učinek zdravljenja s TKI, in citološki ter histološki pregled kostnega mozga (7). V nadaljevanju opisujemo molekularno genetske preiskave, ki so pomembne za postavitev diagnoze KML ter spremljanja učinka zdravljenja s TKI.

2. Ugotavljanje specifičnih BCR-ABL1 mRNA prepisov z obratnim prepisovanjem in verižno reakcijo s polimerazo

Regije, v katerem se izvrši prelom v genu, so lahko široke tudi nekaj 10 kilobaznih parov (kbp), tako da za zaznavo strukturnih kromosomskih nepravilnosti kot npr. translokacij, ni mogoče uporabiti PCR na osnovi genomske DNA. Zato pri večini levkemij uporabimo himerično, specifično informacijsko RNA (messenger RNA, mRNA), ki jo izoliramo iz levkocitov kostnega mozga ali periferne krvi. To prepišemo v komplementarno DNA (cDNA) z uporabo

naključnih ali specifičnih oligonukleotidov in encimov reverznih transkriptaz. Komplementarna DNA je osnova za verižno reakcijo s polimerazo (Reverse Transcriptase and Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) (6).

Pri nastanku Ph kromosoma lahko nastane eden izmed več vrst fuzijskih genov BCR-ABL1 in tako tudi več vrst prepisov BCR-ABL1. To je odvisno od tega, kje se je zgodil prelom znotraj gena BCR (ima 23 eksonov) in gena ABL1 (ima 11 eksonov). Medtem, ko so prelomi na kromosomu 9 večinoma v 5' koncu gena ABL1 v intronu 1, se prelomi na kromosomu 22 v genu BCR lahko zgodijo na štirih mestih in sicer:

• v tki. večjem prelomnem področju (major breakpoint cluster region - M-bcr), ki obsega eksone 12 do 16 (prvotno so bili ti eksoni označeni od b1-b5),

• manjšem prelomnem področju (minor breakpoint cluster region - m-bcr), kjer se prelom zgodi znotraj širokega področja v intronu 1,

• mikro prelomnem področju (mikro breakpoint cluster region - μ-brc), ki obsega eksone 19 do 21 in

• nano prelomnem področju (nano breakpoint cluster region - ν-brc), ki obsega eksona 6 in 7.

Pri KML se najpogosteje pojavita prepisa vrste e13a2 ali e14a2, ki nastaneta iz fuzijskega gena BCR-ABL1, kjer se prelom v genu BCR zgodi v področju M-bcr in v intronu 1 gena ABL1. Prepisa vrste e13a2 ali e14a2, zelo redko oba, ugotovimo pri kar 98 % bolnikov s KML. Prepisa kodirata protein BCR-ABL1 molekularne mase 210000 (p210). Zelo redko lahko pri KML ugotovimo prepis vrste e1a2, ki se prepiše iz fuzijskega gena BCR-ABL1, ki je nastal zaradi prelomov v manjšem prelomnem področju (minor breakpoint cluster region ali m-bcr) gena BCR in intronu 1 gena ABL. Prepis kodira protein BCR-ABL1 molekularne mase 190000 (p190). Druge vrste prepisov zelo redko ugotovimo pri KML.

Prepisa vrste e13a2 ali e14a2 ugotovimo tudi pri 25 % bolnikov z BCR-ABL1 pozitivno B-ALL. V 70 % bolnikov z BCR-ABL1 pozitivno B-ALL pa ugotovimo prepis vrste e1a2. Drugi prepisi pri B-ALL so prav tako redki.

Kot presejalna preiskava za ugotavljanje BCR-ABL1 mRNA prepisov je zelo uporabna metoda hkraten PCR (multiplex PCR). Ta omogoča, da lahko v

54 55


eni reakciji s pomočjo več parov oligonukleotidov ugotavljajmo več iskanih BCR-ABL1 cDNA segmentov značilnih za različne fuzijske prepise BCR-ABL1. V našem laboratoriju smo za ugotavljanje BCR-ABL1 prepisov uvedli metodo hkratnega PCR po referenci (9). Postopek smo modificirali tako, da smo za reakcijo PCR izbrali takšno Taq DNA- polimerazo, ki omogoča hitro in specifično pomnoževanje ciljnega odseka cDNA in tako hitro pridobitev rezultata. Sam PCR je končan v eni uri. V primeru pozitivnega rezultata v multipleks PCR-ju opravimo še potrditveni PCR, s katerim natančneje opredelimo vrsto prepisa BCR-ABL1 (9).

V obdobju od 30.06.2011 do 30.06.2015 smo pri 85 bolnikih s sumom na KML ugotovili značilen BCR-ABL1 mRNA prepis v našem laboratoriju. Mediana starosti bolnikov je bila 61 let, razpon od 11 do 90 let. Od tega je bilo 44 moških in 41 žensk. Izmed njih sta bila dva bolnika stara 11 in 15 let. Pri 83/85 (98 %) bolnikom smo ugotovili bodisi e13a2 ali e14a2 BCR-ABL1 prepis. Prepis e13a2 smo ugotovili pri 35/85 (41 %), prepis e14a2 pa pri 48/85 (57 %) bolnikov. Pri 2/85 (2 %) smo ugotovili prepis e1a2. Naši rezultati so skladni s podatki iz literature.

Preiskava ugotavljanja specifičnega BCR-ABL1 prepisa je del algoritma opredelitve mieloproliferativnih novotvorb (MPN) po klasifikaciji Svetovne zdravstvene organizacije (SZO) in je ena izmed najpogostejših preiskav v našem laboratoriju. Določitev vrste prepisa je nujno potrebna tudi zato, ker imamo v našem laboratoriju (tudi večina drugih laboratorijev) za tri najbolj pogoste BCR-ABL1 prepise, e13a2, e14a2 in e1a2, razvite kvantitativne PCR. Ta preiskava je najpomembnejša preiskava za spremljanje učinkovitosti zdravljena bolnikov s KML.

3. Določitev ravni izražanja gena BCR-ABL1 z obratnim prepisovanjem in kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (RT-qPCR)

Najobčutljivejša in najpomembnejša preiskava za spremljanje uspešnosti zdravljenja KML s TKI je standardizirana metoda - kvantitativni PCR (qPCR), s katerim določimo raven izražanja gena BCR-ABL1 v levkocitih periferne krvi. Iz teh izoliramo RNA, ki jo v reakciji obratnega prepisovanja (RT) prepišemo v cDNA, ki je osnova za qPCR (RT-qPCR).

Že pred časom so ugotovili, da je raven izražanja gena BCR-ABL1 v levkocitih periferne krvi in kostnega mozga skladna. Skladna je tudi s številom levkemičnih celic v telesu. Metoda je zelo občutljiva, ker z njo lahko ugotovimo eno levkemično celico med 100.000 ali več normalnih celic (10). Zato lahko to metodo uporabimo za določitev minimalne preostale bolezni in tako določitve molekularnega odziva. Molekularni odziv (MolO) opredelimo kot zmanjšanje ravni izražanja gena BCR-ABL1, to je zmanjšanje ravni BCR-ABL1 mRNA prepisa (prepis) določenega z RT-qPCR. MolO je del ocene uspešnosti zdravljenja in ga merimo po treh, šestih in dvanajstih mesecih od začetka zdravljenja s TKI , nato vsake tri mesece prva tri leta, nato na 3 do 6 mesecev (4, 7). Raven izražanja gena BCR-ABL1 predstavlja razmerje med številom kopij prepisa BCR-ABL1 in številom kopij prepisa referenčnega gena, običajno gena ABL1 (tudi BCR, β-glukoronidaza (GUSB)), določenih z RT-qPCR. Razmerje lahko izrazimo kot delež, odstotek (%) na mednarodnem desetiškem logaritemskem merilu (mednarodno merilo, International Scale, IS), kjer 10 %, 1 %, 0,1 %, 0,01 %, 0,0032 % in 0,001 % ustreza zmanjšanju za 1, 2, 3, 4, 4.5 in 5 logaritmov pod začetno standardno vrednostjo 100 %, ki so jo določili v raziskavi IRIS (11, 12). Mednarodno merilo so predlagali izbrani strokovnjaki Nacionalnega inštituta za zdravje leta 2006 (12). Osnova za mednarodno desetiško logaritemsko merilo (12) sta vrednosti 100 % in 0,1 %. Obe vrednosti so določili v raziskavi IRIS, kjer je bila vrednost 100 % določena kot mediana razmerij števila kopij BCR-ABL1 in številom kopij referenčnega gena BCR 30 nezdravljenih bolnikov v kroničnem obdobju bolezni. Vrednost 0,1 %, ki so jo imenovali kot glavni MolO (MolO; Major Molecular Response, MMR), je za tri desetiške logaritme zmanjšanje ravni BCR-ABL1 mRNA prepisa od začetne standardne vrednosti 100 %. V tej raziskavi so ugotovili, da je velika večina bolnikov s KML, zdravljenih z imatinibom, dosegla popolni citogenetski odgovor in da imajo bolniki, ki dosežejo glavni MolO po 18 mesecih zdravljenja z imatinibom, zelo veliko verjetnost, da bolezen v 5 letih ne bo napredovala (13, 14). Glavni MolO je zaradi te in drugih raziskav(7), ki so potrdile njegov pomen, postal po priporočilih evropske mreže za levkemijo želen odziv in glavni cilj zdravljenja KML bolnikov s TKI (7).

Postavitev mednarodnega merila je omogočila harmonizacijo metod RT-qPCR za določitev ravni izražanje gena BCR-ABL1 pri bolnikih z KML, ki imajo najpogostejša prepisa e13a2 in/ali e14a2. Rezultati RT-qPCR so se pred harmonizacijo metod med laboratoriji znatno razlikovali. Zato je bil v okviru

56 57


evropske mreže za levkemijo ustanovljen program EUTOS (The EUropean Treatment Outcome Study), kjer smo s pomočjo izmenjave vzorcev in primerjave rezultatov RT-qPCR našega laboratorija z rezultati referenčnega laboratorija, ki je sodeloval v raziskavi IRIS, pridobili konverzijski faktor. Z njim pomnožimo naš rezultat BCR-ABL1 RT-qPCR in ga predstavimo na mednarodnem merilu. Na osnovi tega sodelovanja smo postali referenčni center za izvedbo te metode v Sloveniji (15). Nadaljnja standardizacija metode je še v teku (16).

Veliko raziskav je potrdilo prognostični pomen zgodnje ocene uspešnosti zdravljenja bolnikov s KML po treh mesecih od začetka zdravljenja s TKI. Tako imajo želen MolO tisti bolniki, ki po treh mesecih dosežejo raven izražanja gena BCR-ABL1, ki je enaka ali manjša kot 10 % IS. Odziv na zdravljenje pri bolnikih, ki niso dosegli želenega odziva po treh mesecih, ni optimalen. Zato zahteva pogostejše kontrole in menjavo zdravila v primeru prehoda v skupino neuspešnega zdravljenja (7).

Tudi mi smo želeli preveriti kakšen je delež naših bolnikov z ustreznim odzivom na zdravljenje po treh mesecih in ali obstajajo razlike zaradi vrste uporabljenega TKI. V raziskavo smo vključili 171 bolnikov s KML v kronični fazi bolezni, ki so se zdravili v Sloveniji v obdobju od 01.08.2004 do 31.08.2014. Od tega je bilo 80 (47 %) žensk in 91 moških (53 %). Mediana starosti je bila 58 let, razpon od 11 do 88 let. Za štiri bolnike, tri ženske in enega moškega, nismo imeli podatka o molekularnem odzivu po treh mesecih od začetka zdravljenja, zato smo jih izključili iz analize. Trije izmed njih so se zdravili z imatinibom, eden z nilotinibom. Z imatinibom se je zdravilo 133, nilotinibom 33 in dasatinibom 1 izmed 167 bolnikov. Izmed 133 bolnikov, ki so se zdravili z imatinibom, je ustrezen MolO na zdravljenje po treh mesecih doseglo 98 (74 %) bolnikov. Izmed 33 bolnikov, ki so se zdravili z nilotinibom, je ustrezen MolO na zdravljenje po treh mesecih doseglo 30 (91 %) bolnikov. Bolnik, ki se je zdravil z dasatinibom je tudi dosegel ustrezen MolO po treh mesecih od začetka zdravljenja. Z Fisherjevim statističnim testom smo ugotovili, da obstaja statistično značilna razlika v doseganju ustreznega molekularnega odziva po treh mesecih od začetka zdravljenje v odvisnosti od vrste uporabljenega TKI. Podrobnih vzrokov za neustreznost molekularnega odziva pri bolnikih nismo raziskali. V analizo smo vključili bolnike, ki so se zdravili z imatinibom ali nilotinibom in ugotovili,da je med bolniki, ki so prejemali nilotinib,

bilo več takšnih, ki so dosegli ustrezen MolO po treh mesecih od začeta zdravljenja kot pri bolnikih, ki so prejemali imatinib (Fisherjev test; P=0,0379). Naše ugotovitve na proučevani populaciji bolnikov s KML so v skladu z ugotovitvami, ki so jih opravili v kliničnih raziskavah (7), to je, da je pri novejših zdravilih, kot sta nilotinib in dasatinib, delež bolnikov, ki doseže ustrezne odzive v krajšem času, večji (7).

Manjši del bolnikov s KML je neodzivnih na zdravljenje s TKI ali pa bolezen napreduje kljub zdravljenju s TKI. Porast produkta BCR-ABL1 sicer ne pomeni nujno neuspeha zdravljenja, ampak je razlog potrebno raziskati. Možni vzroki so prekinitev ali opustitev jemanja zdravila ali odpornost proti zdravljenju. Čeprav je vzrokov za pojav odpornosti proti zdravljenju s TKI več, sta klonska evolucija in pojav točkovnih mutacij v kinazni domeni ABL1 beljakovine BCR-ABL1 najpomembnejša dejavnika, ki sta medsebojno povezana (7, 17). Drugi vzroki so vpliv na farmakokinetiko zdravila in aktivacija alternativnih signalnih poti, ki vodijo do rasti celic neodvisno od BCR-ABL1 (17).

4. Ugotavljanje mutacij v genu BCR-ABL1 pri kronični mieloični levkemiji

Klinično pomembne mutacije določimo s (klasičnim) sekvenciranjem po Sangerju, določitvijo nukleotidnega zaporedja odseka cDNA ali DNA v BCR-ABL1, ki kodira kinazno domeno beljakovine BCR-ABL1 (7, 18). Priporočajo, da opravimo mutacijsko analizo BCR-ABL1 v primerih ko bolniki niso dosegli želenega odziva ali so le-tega izgubili (8). Določitev mutacije lahko vpliva na odločitev o nadaljnji izbiri zdravljenja. Med njimi so nekatere, ki močno vplivajo na odzivnost na zdravljenje s TKI. Takšna mutacija je zamenjava treonina za izolevcin na mestu 315 (T315I) aminokislinskega zaporedja beljakovine BCR-ABL1, ki povzroči pojav klona, ki je odporen proti imatinibu, nilotinibu in dasatinibu. Za nilotinib in dasatinib je manj odpornih mutacij kot za imatinib in se med seboj ne pokrivajo, razen mutacije T315I (7, 18, 19). V naši raziskavi, ki smo jo opravili pred nekaj leti (19), smo v skupini bolnikov s KML, ki so jih zdravili s TKI in ki niso dosegli glavnega MolO v najmanj 18 mesecih ali so le-tega izgubili napravili mutacijsko analizo BCR-ABL1. Pri enem izmed devetih bolnikov smo ugotovili mutacijo T315I (slika 1), pri drugem tiho mutacijo (SNP, rs2227985). Mutacije so najverjetneje redke

58 59


pri skupini bolnikov s KML pri katerih bolezen še ni napredovala, vendar je preiskavo ugotavljanja mutacij pri teh bolnikih vseeno smiselno opraviti in tudi ponavljati. To je tudi v skladu z priporočili (7, 18). Vpliv polimorfizmov na odpornost na zdravljenje s TKI še danes ni povsem pojasnjen.

Slika 1. Elektroferograma nukleotidnega zaporedja, dobljenih iz aparata ABI 310 (Applied Biosystems) za odsek PCR segmenta BCR-ABL1 bolnika s kronično mieloično levkemijo, ki vsebuje mutacijo p.T315I (c.947 C>T ref zap NM_005157.5; p.Thr315Ile, p.T315I ref zap NP_005148.2).Figure 1. Electropherograms of nucleotides sequences, obtained from the ABI 310 sequencer (Applied Biosystems) for the BCR-ABL1 PCR fragment in chronic myeloid lekaemia patient having mutation p.Thr315Ile (c.947 C>T ref seq NM_005157.5; p.Thr315Ile, p.T315I, ref seq NP_005148.2).

5. Sklep

Genetske preiskave so zelo pomembne za ugotavljanje in spremljanje uspešnosti zdravljenja KML. Odziv na zdravljenje s TKI nastopi hitro in v večini primerov tudi traja. Stabilne molekularne odzive, ki jih razvijejo bolniki s KML med zdravljenjem s TKI, spremljamo z zelo občutljivo metodo, standardiziranim kvantitativnim PCR. Manjši del bolnikov s KML je neodzivnih na zdravljenje s TKI ali pa bolezen napreduje kljub zdravljenju s TKI. Pojav točkovnih mutacij v kinazni domeni beljakovine BCR-ABL1 je eden najpomembnejših dejavnikov za razvoj odpornosti na zdravljenje s TKI. S sekvenciranjem po Sangerju ugotovimo klinično pomembne mutacije, ki vplivajo na odločitev o izbiri nadaljnjega zdravljenja (20).

Literatura

1. Vardiman JW, Melo JV, Baccarani M and Thiele J. Chronic myelogenous leukemia BCR-ABL1 positive. In: Swerdlow SH, Campo E, Harris NL et al. WHO classification of tumors of hematopoietic and lymphoid tissues. IARC, 2008: 32-37.

2. Modic M. Mieloproliferativne novotvorbe. In: Košnik M, Mrevlje F, Štajer D, Černelč P, Koželj M. Interna medicina. Littera Picta, d.o.o., Slovensko medicinsko društvo, 2011: 1312-1315.

3. Rowley JD. A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature 1973; 243: 290-293.

4. Pajič T, Marc J, Preložnik-Zupan I. Kronična mieloična levkemija. Farm Vestnik 2013; 64: 343-353.

5. Quintas-Cardama A, Cortes J. Molecular biology of bcr-abl1-positive chronic myeloid leukemia. Blood 2009; 113: 1619-1630.

6. van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13: 1901-1928.

7. Baccarani M, Deininger MW, Rosti G et al. European LeukemiaNet recommendations for the management of chronic myeloid leukemia: 2013. Blood 2013; 122: 872-884.

8. Radich J. Chronic Myeloid Leukemia 2010: Where Are We Now and Where Can We Go? Hematology Am Soc Hematol Educ Program 2010; 2010:122-8. doi: 10.1182/asheducation-2010.1.122.

9. Burmeister T and Reinhardt R. A multiplex PCR for improved detection of typical and atypical BCR-ABL fusion transcripts. Leuk Res 2008; 32: 579-585.

10. Gabert J, Beillard E, van der Velden VH.et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia 2003; 17: 2318-2357.

11. Drucker BJ, Guilhot F, O’Brien SG et al. Five-year follow-up of imatinib therapy for newly diagnosed chronic myeloid leukemia in chronic-phase shows sustained responses and high overall survival. N Eng J Med 2006; 355: 2404-2417.

12. Hughes T, Deininger M, Hochhaus A et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors - recommendations for ‘harmonizing’ current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results. Blood 2006; 108: 28-37.

13. Iacobucci I, Saglio G, Rosti G et al. Achieving a major molecular response at the time of a complete cytogenetic response (CCgR) predicts a better duration of CCgR in imatinib-treated chronic myeloid leukemia patients. Clin Cancer Res 2006; 12: 3037-3042.

14. Press RD, Love Z, Tronnes AA et al. BCR-ABL mRNA levels at and after the time of a complete cytogenetic response (CCR) predict the duration of CCR in imatinib mesylate-treated patients with CML. Blood 2006; 107: 4250-4256.

15. Muller MC, Cross NC, Erben P et al. Harmonization of molecular monitoring of CML therapy in Europe. Leukemia 2009; 23: 1957-1963.

16. White H, Deprez L, Corbisier P et al. A certified plasmid reference material for the standardisation of BCR-ABL1 mRNA quantification by real-time quantitative PCR. Leukemia 2015; 29: 369-376.

60 61


17. Apperley JF Part I: Mechanisms of resistance to imatinib in chronic myeloid leukaemia. Lancet Oncol 2007; 8: 1018-1029.

18. Soverini S, Hochhaus A, Nicolini FE, Gruber F et al. BCR-ABL kinase domain mutation analysis in chronic myeloid leukemia patients treated with tyrosine kinase inhibitors: recommendations from an expert panel on behalf of European LeukemiaNet. Blood 2011; 118: 1208-1215.

19. Pajič T, Lamovšek N, Fink, M et al. Analiza mutacij v kinazni domeni proteina BCR-ABL1 pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo in z nezadostnim odgovorom na zdravljenje z zaviralcem tirozinske kinaze. Zdrav Vestn 2012; 81 supl 2: II-174-179.

20. Preložnik Zupan I, Pajič T, Glaser M et al. Uspešnost zdravljenja KML v Sloveniji v obdobju inhibitorjev tirozinske kinaze. Zdrav Vestn 2012; 81: 56-64.

62 63


Proteolizni encim katepsin K in njegov vpliv na rakave in matične celice možganskega tumorja glioblastoma

/ Proteolytic enzyme cathepsin K and his impact on cancer and stem cells of brain tumour glioblastoma /

Urška Verbovšek1, Daniela Cesselli2, Tamara T. Lah1,3

1 Oddelek za genetsko toksikologijo in biologijo raka, Nacionalni inštitut za biologijo, Večna pot 111, 1000 Ljubljana, Slovenija

2 Department of Medical and Biological Sciences, University of Udine, Udine, Italija3 Katedra za biokemijo, Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo, Univerza v Ljubljani,

Večna pot 113, 1000 Ljubljana, Slovenija

Povzetek

Proteolizni encimi oziroma proteaze so vključeni v raznolike procese v raku, od njegovega nastanka do invazije in metastaziranja. Proteaze v celičnih prebavnih organelih, lizosomih, so katepsini, ki pomembno prispevajo k natančno organizirani mreži proteaz tekom napredovanja raka. V prispevku je predstavljen katepsin K, cisteinska proteaza, prvotno opisana v osteoklastih kot pomemben dejavnik fiziološke presnove hrustanca in kosti, s katero so povezane tudi dedne bolezni pomanjkanja tega encima in kronična vnetja. Vse več je objav o možnem vplivu katepsina K na razvoj različnih vrst rakavih obolenj. Kot prvi smo opisali povišano izražanje katepsina K v najbolj agresivni obliki možganskega tumorja glioma, v glioblastomu multiforme. Naše nadaljnje raziskave kažejo, da je njegova vloga v tem tumorju povezana z regulacijo mobilizacije matičnim celicam podobnih gliomskih celic, medtem ko so v drugih tipih raka ugotavljali predvsem vpliv na rast, angiogenezo in metastaziranje tumorjev, še posebno v kosti. Z analizo preživetja bolnikov z gliomom nizke in visoke stopnje smo pokazali, da izražanje katepsina K v tumorju statistično značilno poslabša preživetje bolnikov. Katepsin K je nedvomno pomemben encim v patobiologiji glioma.

Ključne besede: glioblastoma multiforme, katepsin K, matični celici podobna rakava celica, niša matičnih celic, proteoliza, tumor.

Abstract

Proteolytic enzymes or proteases are involved in various processes in cancer from its initiation to invasion and metastatic spread. Proteases in cellular digestive organelles, lysosomes, are called cathepsins that significantly contribute to the precisely orchestrated protease network during cancer progression. Here, cathepsin K is presented, a cysteine protease originally characterised in osteoclasts as an important player in cartilage and bone metabolism also linked to genetic diseases, caused by cathepsin K deregulation, and to chronic inflammation. A vast body of literature is recently dedicated to possible involvement of cathepsin K in various types of cancers. We were the first to describe its overexpression in most malignant form of glioma, i.e. glioblastoma multiforme. Our further research, is pointing out on its involvement in regulation of glioma stem-like cells mobilisation, whereas in other types of cancer cathepsin K was reportedly involved in tumour growth, angiogenesis and metastasis, in particular to the bone. Survival analysis of patients with low and high grade glioma showed that cathepsin K expression by the tumour significantly lowers patient survival rate. Cathepsin K is certainly a new prominent enzyme in pathobiology of glioma.

Keywords: cathepsin K, glioblastoma multiforme, glioma stem-like cell, stem cell niche, proteolysis, tumour.

1. Uvod

Glioblastoma multiforme (GBM) je najbolj maligna oblika možganskega tumorja vrste glioma, za katerega je značilna srednja vrednost preživetja bolnikov samo 15 mesecev po diagnozi. Eden izmed glavnih razlogov za slabo preživetje je difuzna infiltracija visoko invazivnih posameznih rakavih celic v sosednje zdravo možgansko tkivo (parenhim), kar onemogoča popolno kirurško odstranitev tumorja. Z invazivno rastjo tumorjev, vključno z GBM, so povezani proteolizni encimi oziroma proteaze. Invazija gliomskih celic v parenhim se razlikuje od invazije v ostala tkiva, saj se možganski zunajcelični matriks (ZCM) razlikuje od večine ZCM drugih organov. Zaradi kompaktne organizacije celic v možganih je ta zgoščen na približno 20% tkivnega volumna. Prvenstveno je sestavljen iz glikozaminoglikanov (GAG) in

64 65


proteoglikanov, laminina, tenascina in nekaterih drugih firbilarnih proteinov, a je v njem večinoma zelo malo kolagena. Ta je prisoten predvsem v dveh območjih, in sicer okrog krvnih žil in na površini pie (glia limitans), kjer je prisotna bazalna lamina.Proteaze so, poleg razgradnje ZCM in omogočanja invazije tumorja, lahko vpletene tudi v ostale procese, povezane z napredovanjem tumorja (1), vplivajo na primer na celično proliferacijo, preživetje, angiogenezo, senescenco, apoptozo in avtofagijo, vpletene pa so tudi v medcelične interakcije v imunskem odzivu na novotvorbe. V vseh teh procesih bolj ali manj cepijo peptidne vezi ključnih onkoproteinov in regulirajo npr. aktivnosti kinaz (2), rastnih in kemotaktičnih faktorjev, kar imenujemo proteolizno signaliziranje (3). Aktivnost proteaz je strogo uravnavana na vseh nivojih izražanja, vključno s post-translacijskim, ki ga nadzorujejo endogeni aktivatorji prekurzorskih oblik proteaz, njihovi inhibitorji in možne interakcije z drugimi makromolekulami. Ravnovesje med proteazami in inhibitorji torej ključno vpliva na razgradnjo fizioloških substratov v raku, kar skupaj tvori molekulsko mrežo, imenovano degradom raka. Številne proteaze in njihovi inhibitorji so tako povezani z nastankom in napredovanjem raka, bodisi v smislu pospeševanja bodisi zaviranja omenjenih procesov. Zato so proteaze uporabne v kliniki tudi kot biološki označevalci – kot diagnostični in napovedni kazalci preživetja ali celo odziva na zdravljenje pri različnih vrstah raka, tudi pri GBM (4).

2. Določanje dereguliranih genov za proteaze in njihove inhibitorje v glioblastomu

Glede na podatkovno zbirko MEROPS (podatki z dne 10.7.2015) poznamo 990 proteaz in 1605 proteaznih inhibitorjev, v času naše analize (na dan 18.4.2011) pa je bilo v zbirko vnešenih 669 proteaz in 242 proteaznih inhibitorjev. Izmed teh smo želeli določiti tiste proteaze in inhibitorje, ki so deregulirani v GBM in se pri tem poslužili bioinformatskih pristopov oziroma orodij. Pri tem smo uporabili naše rezultate transkriptomskih analiz in jih dopolnili s prosto dostopnimi v podatkovnih zbirkah. Transkriptom GBM tkiv in celičnih linij smo primerjali s podatki ne-malignega možganskega tkiva in celičnih linij normalnih človeških astrocitov. Zatem smo izvedli molekularna in biološka preverjanja, to je validacije prepoznanih dereguliranih proteaz in njihovih

inhibitorjev v GBM, vendar samo povišano izraženih genov, saj so ti bolj uporabni v kliniki. Primerjava med tkivi in celicami je pokazala na izrazito povišanje določenih genov proteaz oz. proteinov s proteaznimi motivi v primerjavi z nemalignimi kontrolnimi vzorci. Ti geni so TFRC (transferinski receptor), ERAP2 (aminopeptidaza 2 endoplazemskega retikuluma), GPR56 (z G proteinom sklopljen receptor 56), GFPT2 (glutamin-fruktoza-6-fosfat transaminaza 2), CTSK (katepsin K), CSTB (stefin B), PI3 (peptidazni inhibitor 3, imenovan tudi elafin) in CD74 (integralni protein CD74; molekulski spremljevalec poglavitnega histokompatibilnostnega kompleksa II). V nadaljnjih raziskavah smo se predvsem osredotočili na lizosomalno cisteinsko proteazo katepsin K (CatK), ki jo kodira gen CTSK, katerega do zdaj še niso prepoznali za biološkega označevalca v tej vrsti raka.Naša raziskovalna skupina (5–7), in tudi drugi (strnjeno v (8)), je že v preteklosti obširno raziskovala cisteinske katepsine v napredovanju glioma. Za katepsine B (CatB), L (CatL) in S (CatS) je znano, da so povezani z napredovanjem glioma in so v GBM povišano izraženi na nivoju mRNA, proteinov in aktivnosti. CatB in CatS sta bila povezana z invazijo tumorja in preživetjem bolnikov (7,9), medtem ko je CatL najverjetneje vključen v aktivacijo transkripcijskih faktorjev v procesu apoptoze in celične proliferacije (10). Vendar pa navkljub raziskavam o pomembni vlogi CatK v delovanju možganov pri glodalcih (11), do sedaj še ni literaturnih podatkov o CatK v gliomih, razen naših študij (12,13).

3. Katepsin K

Gen, ki ga kodira (CTSK), je brez dvoma eden najzanimivejših genov za preučevanje v GBM. Do sedaj ni bil povezan s to boleznijo, saj je njegova poznana aktivnost predvsem usmerjena v proteinske makromolekulske substrate, kot so fibrilarni proteini, kolageni in proteoglikani, ki niso običajne sestavine ZCM možganov. CatK sodeluje pri razgradnji kolagena v procesu preoblikovanja kostnega in hrustančnega matriksa in je zato močno izražen v osteoklastih (Slika 1) oz. hondrocitih (14). V teh tkivih je nujno potreben za rast in razvoj, saj genetske okvare CatK povzročajo hude dedne bolezni, kot je piknodisostoza. To je posebna oblika osteopetroze, za katero je značilna povečana kostna gostota in posledično zelo krhke kosti. Nepravilna regulacija CatK, pogojena s hormonskimi in drugimi vzroki, pa povzroča osteoporozo,

66 67


pri kateri je resorpcija kostnega matriksa večja od njegovega nastanka. Poleg bolezni kosti ima CatK pomembno vlogo tudi v drugih patologijah, kot je revmatoidni artritis in njegovih sekundarnih zapletih, kjer je spet udeležen v razgradnji proteinov ZCM (14).V zadnjem času se pojavlja vedno več objav o vlogi CatK v invazivnih vrstah raka, še posebej je dobro preučena razgraja kostnega matriksa v metastazah karcinomov (15). Za zdravljenje osteoporoze in kostnih metastaz je bila zato razvita že cela vrsta inhibitorjev CatK (16), med katerimi se kot najbolj uspešen za zdravljenje izkazal odanacatib (Merck) (17,18). Odanacatib je selektivni nizkomolekulski organski inhibitor CatK. Akumulira se v resorpcijskih lakunah in preprečuje vezavo CatK na substrat.Vendar pa odkrivamo tudi druge nizkomolekulske proteinske in peptidne substrate CatK, ki imajo poseben pomen v prenašanju fizioloških signalov. Miši z onesposobljenim genom za CatK, za razliko od živali z onesposobljenimi geni za druge katepsine (CatB ali CatL), imajo znatno prizadet živčni sistema (11). Na primarnih kulturah možganskega tkiva, bogatih s celicami astroglije, iz miši z onesposobljenim genom za CatK, je bilo ugotovljeno, da ima CatK določeno, a še nepoznano, vlogo v zorenju oligodendrocitov (19). Poleg osteoklastov in celic glije, CatK izražajo tudi druge celice, kot so kožni (20) in pljučni fibroblasti (21), adipociti (22) in epitelne celice žleze ščitnice (23).

Slika 1. Izražanje CatK v različnih tkivih in celicah. Izražanje CatK smo določili z imunohistokemijskim barvanjem (A) parafinske rezine mišje čeljusti, ki vsebuje kost, (C)

človeških osteoklastov, pridobljenih z diferenciacijo makrofagov, izoliranih iz periferne krvi, (B) zamrznjene rezine človeškega GBM in (D) človeške GBM celične linije U87-MG. Za to smo uporabili protitelo Abcam anti-CatK (ab19027). Jedra so obarvana s hematoksilinom. Vsi omenjeni vzorci so pozitivni za CatK. V mišji čeljusti (A) sta se pozitivno obarvala kostni mozeg (KM) in osteoklasti (O) ob kosti (K), medtem ko je tkivo GBM močno pozitivno okrog krvnih žil. Osteoklasti (C) in celice U87-MG (D) kažejo močno in difuzno znotrajcelično barvanje za CatK.Figure 1. CatK expression in different tissues and cells. CatK expression was revealed by immunohistochemical staining in (A) a paraffin section of mouse jaw (containing bone), (C) human osteoclasts obtained by differentiation of macrophages isolated from peripheral blood, (B) cryostat section of human glioblastoma multiforme (GBM) and (D) human GBM U87-MG cells in culture. Abcam anti-CatK antibody ab19027 was used. Nuclei are counterstained with haematoxylin. All samples show positive staining for CatK. Mouse jaw (A) shows strong positivity in bone marrow (KM) and osteoclasts (O) adjacent to bone (K) while GBM tissue (B) shows strong staining around blood vessels. Osteoclasts (C) and U87-MG cells (D) show strong and diffuse intracellular labelling of CatK.

Povišanega izražanja CatK v tkivih in celicah GBM nismo odkrili le na nivoju prepisovanja gena, pač pa se prekomerno izraža tudi njegov protein, kot je razvidno v celicah in tkivu na Sliki 1 (12). V celičnih linijah GBM se CatK nahaja v granularnih strukturah ob jedru, v lizosomih, na tkivnem nivoju pa smo ga v GBM identificirali v okolici krvnih žil. Tako v celicah kot v tkivih je v večini prisotna le neaktivna pro-oblika encima z molekulsko maso 39 kDa. Aktivne oblike CatK v celicah nismo zaznali, prav tako ne njegovega izločanja iz celic, kakor smo to opazili pri drugih katepsinih, na primer pri CatB v istih vrstah celic.

4. Pomen katepsina K v uravnavanju tkivne lokalizacije glioblastomskih matičnih celic

Imunohistokemijske slike glioblastomskih tkiv so pokazale na čisto določeno lokalizacijo CatK v tumorju, in sicer obkroža krvne žile (natančneje arteriole), kjer smo lahko locirali tudi matičnim celicam podobne gliomske celice (MCGC). Te smo določili tako, da smo na zaporednih tkivnih rezinah zamrznjenega vzorca tkiva GBM imunsko označili CatK in CD133, ki je označevalce MCGC, zatem še CD31, ki je označevalec endotelijskih celic. Slednje so del celične niše, ki v tkivih (tudi v tumorjih) veže matične celice. Ko-lokalizacija obeh označevalcev s CatK je potrdila njegovo prisotnost v teh nišah in s tem

68 69


nakazala na njegovo možno vlogo v sidranju tumorskih matičnih celic. Podobno vlogo ima CatK tudi v niši krvotvornih matičnih celic.Tumorske matične celice predstavljajo populacijo celic z neomejenim samoobnovitvenim potencialom, ki so se sposobne diferencirati v razne vrste malignih celic in so manj občutljive na večino protirakavih učinkovin. Nosijo neke vrste zapis za specifičen razvoj tumorja, zato predstavljajo glavni vir za njegov razvoj in rast, zaradi svoje odpornosti na kemoterapijo pa so vir ponovljene bolezni.Sidranje tumorskih matičnih celic v niši poteka preko osi CXCL12-CXCR4, kot je prikazano na Sliki 2. CXCL12 (oz. SDF-1; angl. stromal cell derived factor 1) je kemokin, ki se veže na receptor CXCR4, izražen na tumorskih matičnih celicah. Ugotovili smo, da se SDF-1 in CXCR4 izražata v vseh nišah MCGC v GBM (13). Med CatK in SDF-1 smo opazili obratno sorazmerje – kjer je bilo izražanje CatK visoko, je bilo izražanje SDF-1 nizko in obratno. Predpostavljamo, da je SDF-1 odgovoren, da ohranja zalogo MCGC v GBM tkivni niši v okolici tumorske arteriole (13) in da ga CatK s proteolizno cepitvijo inaktivira, kar omogoči izplavljanje MCGC iz niše in njihovo nadaljnjo aktivacijo ter diferenciacijo v invazivne tumorske celice GBM.

Slika 2. Karakterizacija in shematski prikaz niše MCGC v GBM z ozirom na vlogo CatK v migraciji MCGC iz niše. (A) Imunohistokemijska lokalizacija CatK, SDF-1α in CXCR4 na

zaporednih rezinah GBM kaže del niše MCGC pri visoki povečavi, ki vključuje 1, lumen tumorske arteriole; 2, plast endotelijskih celic; 3, tunico medio stene arteriole, ki jo sestavljajo gladke mišične celice; 4, plast stromalnih celic in ZCM; 5, plast MCGC; in 6, gliomske celice. Vsi trije proteini so izraženi v nekaterih endotelijskih celicah, najmočneje pa v plasti MCGC in v nekaterih gliomskih celicah izven niše. (B) Shematski prikaz MCGC niše in aktivnosti CatK v procesu migracije MCGC iz niše. Številke 1-6 pripadajo enakim plastem tkiva kot pri (A). V odzivu na signale endotelijske in gliomske celice izločajo različne proteaze, vključno s CatK. CatK cepi SDF-1α v ZCM stene arteriole, kar oslabi pritrjanje MCGC ter spremeni signale v niši. MCGC izražajo receptor za SDF-1α, CXCR4. Cepitev SDF-1α omogoči migracijo MCGC iz niše.Figure 2. Characterisation and schematic representation of the glioma stem-like cell (GSLC) niche in GBM with respect to the role of CatK in migration of GSLCs out of the niche. (A) Immunohistochemical localisation of CatK, SDF-1α and CXCR4 in serial cryostat sections of GBM, showing part of a GSLC niche at high magnification with 1, lumen of tumour arteriole; 2, endothelial cell layer; 3, tunica media of arteriolar wall consisting of smooth muscle cells; 4, layer of stromal cells and extracellular matrix (ECM); 5, layer of GSLCs; and 6, glioma cells. All three proteins are expressed in some endothelial cells, most strongly in the layer of GSLCs and in some cancer cells outside the niche. (B) Schematic representation of the GSCL niche and CatK activity in migration of GSLCs away from the niche. Numbers 1-6 correspond to the same tissue layers as in (A). In response to signals, endothelial and cancer cells secrete various proteases, including CatK. CatK cleaves SDF-1α in the ECM of arteriolar walls which weakens GSLC anchorage and alters signals provided by the niche. GSLCs express receptor for SDF-1α, CXCR4. Cleavage of SDF-1α enables migration of GSLCs out of the niche.

5. Klinični pomen izražanja katepsina K v GBM

Povišano izražanje CatK smo klinično ovrednotili v gliomih nizke (LGG) in visoke stopnje (HGG). Na parafinskih rezinah 24 vzorcev HGG in 24 vzorcih LGG smo imunsko označili CatK. Kaplan-Meier analiza preživetja bolnikov z LGG oziroma HGG je pokazala statistično značilno daljše preživetje pri tistih, ki CatK v tumorju ne izražajo, kot pri tistih, ki ga (Slika 3). To nakazuje prognostično vrednost CatK v gliomu in še dodatno potrjuje njegov patofiziološki in klinični pomen.

70 71


Slika 3. Klinično ovrednotenje izražanja CatK v LGG in HGG. Analiza preživetja (analiza Kaplan-Meier) je pokazala statistično značilno daljše preživetje pacientov z gliomom (A – LGG, B – HGG), pri katerih CatK ni izražen, v primerjavi s pacienti, pri katerih je CatK izražen, predvsem v primeru LGG (A).Figure 3. Clinical evaluation of CatK expression in LGG and HGG. Survival analysis (Kaplan-Meier analysis) showed statistically significant longer survival of patients with glioma (A – LGG, B – HGG) who do not express CatK in comparison with those who express CatK, especially in LGG (A).

6. Zaključki

CatK ima pomembno vlogo v patobiologiji glioma in je najverjetneje povezan z modulacijo kemokinske aktivnosti in migracijo MCGC, kar je podobno dogajanju v niši krvotvornih matičnih celic v kostnem mozgu. Proteolizna aktivnost CatK inaktivira kemokinsko aktivnost SDF-1, kar omogoči mobilizacijo CXCR4+ MCGC iz niše. Te se nato diferencirajo v invazivne tumorske celice in tako vzdržujejo tumor. Ti procesi pomembno vplivajo na preživetje bolnikov z gliomom. Inhibitorji CatK, kot je odanacatib, tako predstavljajo potencialno dopolnilno zdravljenje tega agresivnega tumorja, saj bi z njimi lahko preprečili mobilizacijo in diferenciacijo MCGC ter jih tako zadržali v niši, kjer bi jih lažje ciljali z drugimi terapevtskimi sredstvi. Za uspešno zdravljenje glioma in njegove najbolj maligne oblike GBM bi bilo namreč potrebno odstraniti prav vse MCGC.

Literatura

1. Hanahan D, Weinberg R. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell 2011;144:646–674.2. López-Otín C, Hunter T. The regulatory crosstalk between kinases and proteases in

cancer. Nat Rev Cancer 2010;10:278–292.

3. Turk B, Turk D, Turk V. Protease signalling: the cutting edge. EMBO J 2012;31:1630–1643.4. Lah TT, Obermajer N, Duran Alonso MB, Kos J. Cysteine cathepsins and cystatins as

cancer biomarkers. In: Edwards D, Hoyer-Hansen G, Blasi F, Sloane BF. The Cancer Degradome. Springer Science Business Media, 2008:575–613.

5. Colin C, Voutsinos-Porche B, Nanni I et al. High expression of cathepsin B and plasminogen activator inhibitor type-1 are strong predictors of survival in glioblastomas. Acta Neuropathol 2009;118:745–754.

6. Gole B, Huszthy PC, Popović M et al. The regulation of cysteine cathepsins and cystatins in human gliomas. Int J Cancer 2012;131:1779–1789.

7. Strojnik T, Kavalar R, Trinkaus M, Lah TT. Cathepsin L in glioma progression: comparison with cathepsin B. Cancer Detect Prev 2005;29:448–55.

8. Mentlein R, Hattermann K, Held-Feindt J. Lost in disruption: role of proteases in glioma invasion and progression. Biochim Biophys Acta 2012;1825:178–185.

9. Flannery T, McQuaid S, McGoohan C et al. Cathepsin S expression: an independent prognostic factor in glioblastoma tumours - a pilot study. Int J Cancer 2006;119:854–860.

10. Kenig S, Frangež R, Pucer A, Lah TT. Inhibition of cathepsin L lowers the apoptotic threshold of glioblastoma cells by up-regulating p53 and transcription of caspases 3 and 7. Apoptosis 2011;16:671–682.

11. Dauth S, Sîrbulescu RF, Jordans S et al. Cathepsin K deficiency in mice induces structural and metabolic changes in the central nervous system that are associated with learning and memory deficits. BMC Neurosci 2011;12:74.

12. Verbovšek U, Motaln H, Rotter A et al. Expression analysis of all protease genes reveals cathepsin K to be overexpressed in glioblastoma. PLoS One 2014;9:e111819.

13. Hira VVV, Ploegmakers KJ, Verbovšek U et al. CD133+ and nestin+ glioma stem-like cells reside around CD31+ arterioles in niches that express SDF-1α, CXCR4, osteopontin and cathepsin K. J Histochem Cytochem 2015;63:481–493.

14. Novinec M, Lenarčič B. Cathepsin K: a unique collagenolytic cysteine peptidase. Biol Chem 2013;394:1163–1179.

15. Deng X, He G, Liu J et al. Recent advances in bone-targeted therapies of metastatic prostate cancer. Cancer Treat Rev 2014;40:730–738.

16. Brömme D, Lecaille F. Cathepsin K inhibitors for osteoporosis and potential off-target effects. Expert Opin Investig Drugs 2011;18:585–600.

17. Chapurlat RD. Odanacatib: a review of its potential in the management of osteoporosis in postmenopausal women. Ther Adv Musculoskelet Dis 2015;7:103–109.

18. Jensen AB, Wynne C, Ramirez G et al. The cathepsin K inhibitor odanacatib suppresses bone resorption in women with breast cancer and established bone metastases: results of a 4-week, double-blind, randomized, controlled trial. Clin Breast Cancer 2010;10:452–458.

19. Dauth S, Schmidt MM, Rehders M et al. Characterisation and metabolism of astroglia-rich primary cultures from cathepsin K-deficient mice. Biol Chem 2012;393:959–970.

20. Quintanilla-Dieck MJ, Codriansky K, Keady M et al. Expression and regulation of cathepsin K in skin fibroblasts. Exp Dermatol 2009;18:596–602.

21. Bühling F, Röcken C, Brasch F et al. Pivotal role of cathepsin K in lung fibrosis. Am J Pathol 2004;164:2203–2216.

22. Chiellini C, Costa M, Novelli SE et al. Identification of cathepsin K as a novel marker of adiposity in white adipose tissue. J Cell Physiol 2003;195:309–321.

23. Dauth S, Arampatzidou M, Rehders M et al. Thyroid cathepsin K: roles in physiology and thyroid disease. Clin Rev Bone Miner Metab 2011;9:94–106.

7372


Novejša dognanja pri odkrivanju in zdravljenju okvare ledvic

Okvara ledvic - vrednotenje in izziv za laboratorijsko medicinoMilan Skitek

Aleš Jerin

Spremljanje akutne ledvične okvare po operacijah na srcu z novejšimi biooznačevalci

Jurij Matija Kališnik

Kronična ledvična bolezen – kje smo in kako naprejJelka Lindič

Uporaba vitamina D pri zdravljenju pacientov z IgA nefropatijoJoško Osredkar, Tina Humar, Damjan Kovač

Mikroskopski pregled sedimenta sečaMateja Šter

74 75


Nizki, subterapevtski odmerki statina in sartana v kombinaciji – nov preventivni pristop za zaščito arterijske stene

/ Acute kidney injury – assessment and the role of laboratory medicine in monitoring injury and function of kidney /

Milan Skitek, Aleš Jerin Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 2, Ljubljana

Povzetek

Akutno okvaro ledvic (AOL) razvije okoli 20% bolnikov v bolnišničnih urgentnih in intenzivnih oddelkih. Stopnja okvare in disfunkcije ledvic je povezana z višjo umrljivostjo in je neodvisen vzrok za smrt bolnika. Najpogostejša oblika intrinzične-renalne AOL je ishemija, povezana z hemodinamskimi motnjami, poškodbami parenhima in imunološkimi mehanizmi, ki so vključeni v začetek procesa in poslabšanje AOL z intenzivnim proinflamatornim stanjem. Obravnavana bo nova klasifikacija stopenjske AOL v luči konvencionalnih in novejših biooznačevalcev ledvične (dis)funkcije in okvare. Izziv za laboratorijsko medicino predstavljajo novejši biooznačevalci, bolj občutljivi in specifični za bolj točno, zanesljivo in zgodnejšo napoved AOL.

Ključne besede: Akutna okvara ledvic (AOL), biooznačevalci

Abstract

SAcute kidney injury (AKI) is affecting about one in five patients in hospital emergency departments. It occurs frequently after cardiac surgery. The degree of kidney injury and disfunction is associated with higher mortality and is independent factor for death. The most common cause and etiology of intrinsic AKI is ischaemia. The haemodynamic disturbances, endothelial an epithelial

cell injury with immunological mechanisms are involved in AKI initiation and extension, that lead to an intense, proinflammatory state.The new classification of AKI staging will be discussed in the light of the new and conventional biomarkers of kidney function and injury. The challenge for laboratory medicine is to find more sensitive renal biomarkers for more precise and earlier prediction of AKI

Key words: Acute kidney injury, biomarkers

1. Uvod

Akutno okvaro ledvic (AOL) razvije okoli 20% bolnikov v bolnišničnih urgentnih in intenzivnih oddelkih, umrljivost pa znaša okoli 25-40%. Stopnja okvare in disfunkcije ledvic je povezana z višjo umrljivostjo in je neodvisen vzrok za smrt bolnika. Običajni vzroki smrti so poleg uremije krvavitve in sepsa (1). Z AOL je povezan tudi ekonomski vpliv na stroške zdravljenja, saj bolniki običajno potrebujejo dolgotrajne dialize in intenzivno terapijo in nego (2). Prav zato je zgodnje prepoznavanje rizičnih bolnikov s pomočjo zanesljivih kriterijev in klasifikacije diagnoze toliko pomembnejše.

1.1 Klasifikacija AOL

V preteklosti smo pogrešali harmonizacijo pri klasifikaciji in stopenjski diagnostiki AOL. Zadnja klasifikacija KDIGO (3) temelji na koncentraciji serumskega kreatinina (sKr) in količini izločanega seča. Klasifikacija loči tri stopnje AOL glede na težavnost stanja (Tabela 1).

76 77


Tabela 1. K-DIGO klasifikacija AOL

AOL je definirana pri izpolnjevanju enega od naslednjih kriterijev:• Zvišanje sKr za ≥ 26.5µmol/L znotraj 48 ur; ali• Zvišanje sKr za ≥ 1.5 krat od osnovne vrednosti, ki je znana ali se predvideva iz rezultatov prejšnjih 7 dni• Volumen urina < 0.5ml/kg/h v 6 urahSKr = koncentracija serumskega kreatinina

Stopnja AOL* sKr Izločeni seč

11.5 – 1.9 krat osnovni ali zvišanje ≥ 26.5µmol/L

< 0.5ml/kg/h v 6 - 12 urah

2 2.0 – 2.9 krat osnovni < 0.5ml/kg/h v ≥ 12 urah

3

3.0 krat osnovni alizvišanje ≥ 354 µmol/L alizačetek terapije nadomestitve ledvic (dialize) alipri bolnikih ≤ 18 let, znižanje oGF na <35ml/min/1.73 m2

< 0.3ml/kg/h v ≥ 24 urah aliAnuria ≥ 12 ur

*upošteva se strožji kriterij, npr. dvakratnik SKr osnovne koncentracije ob normalnem izločenem urinu = stopnja AOL 2.oGF – ocena glomerularne filtracije.sKr – serumska koncentracija kreatinina.

AOL delimo v tri glavne kategorije: prerenalno, intrinzično-renalno in postrenalno (obstruktivna). Intrinzična se lahko nadalje deli na podkategorije: glomerularno (npr. hitro napredovalni glomerulonefritis), žilno (npr. renalna skleroza) in tubulo-intersticijske bolezni. Vzroki za večino AOL je ishemija. Ishemična AOL je lahko tudi posledica prerenalne AOL kot odgovor na hipoperfuzijo in intenzivno retenzijo natrija in vode ter posledično visoko stopnjo poškodbe ledvičnih celic. Sem prištevamo tudi pooperativno AOL kot pogost in resen zaplet po srčni operaciji z zunajtelesnim krvnim obtokom (ZTO) ter glavnim vzrokom obolevnosti in smrtnosti po operaciji. V glavnem so vzroki ishemične AOL v znižanju intravaskularnega volumna (npr. krvavitve, dehidracije), znižanju efektivnega volumna cirkulacije (npr. peritonitis, kardiogeni šok), jetrno renalni sindrom, zdravila (npr. vpliv na renin-angiotenzin-aldosteron sistem), kontrastna sredstva, ledvično žilne bolezni (okluzije/stenoze arterij) in sepsa.

AOL poteka v več fazah: začetna (začetna okvara, hitro znižanje GF), razširitvena (širitev okvare, poslabšanje funkcije, ishemična reperfuzijska poškodba), vzdrževalna faza in faza povrnitve stanja pred začetno fazo oz. ozdravitve (recovery). Celoten proces od začetne faze do prvih znakov ozdravitve lahko znaša več tednov. Patofiziološki dejavniki v prvih 2 fazah zajemajo hemodinamske faktorje, poškodbe endotelija in epitelija ter imunološke faktorje. Vsi ti različni procesi so med seboj povezani in pospešujejo ledvično okvaro. Pomemben vzrok strukturne, biokemijske in funkcionalne spremembe proksimalnih tubulnih celic med ALO je depolimerizacija aktina. Apikalne membrane celic so zelo občutljive na ishemijo in se hitro strukturno spremenijo zaradi depolimerizacije aktina, ki je sestavina mikrovilov. V procesu sodeluje aktin-depolimerizacijski faktor, ki je odvisen od pH. Ishemija povzroči padec pH vrednosti, kar povzroči defosforilacijo proteina, posledično pa depolarizacijo aktina (4-6).

2. Biooznačevalci AOL Na razpolago imamo biooznačevalce poškodbe in funkcije ledvic. Vse klasifikacije temeljijo na meritvah koncentracije serumskega kreatinina kot funkcijskega biooznačevalca, ki je slabo občutljiv za zgodnejše odkrivanje AOL. Bolj občutljiv funkcijski biooznačevalec je cistatin C kot neglikozilirana beljakovina, sestavljena iz enojne polipeptidne verige, z majhno molekulsko maso (13-kDa). Spada v družino zaviralcev proteinaze. Nastaja s stalno hitrostjo v vseh jedrnih celicah, od koder se s stalno hitrostjo sprošča v krvni obtok. Cistatin C se zaradi majhne molekulske mase in pozitivnega naboja pri fiziološkem pH običajno skoraj v celoti prosto filtrira skozi glomerulno membrano. Nato pa se v proksimalnih tubulnih celicah skoraj v celoti reabsorbira in razgradi. Normalno se najmanj 99 % cistatina C razgradi v tubulnih celicah. Zaradi tega se njegovega očistka ne more izmeriti, njegova koncentracija v serumu pa je dober pokazatelj GFR (7-9).

Za odkrivanje in razlikovanje vzrokov zgodnejših faz AOL poznamo več urinskih osnovnih preiskav: urinski sediment, proteinurija, osmolalnost urina oz. relativna gostota urina in koncentracija natrija ter sečnine. Osnovna urinska analiza je tradicionalna neinvazivna metoda uporabna za odkrivanje, opredelitev in napoved poteka številnih ledvičnih bolezni. Biooznačevalci epitelijske poškodbe so predvsem epitelijske celice in tubularni cilindri v

78 79


urinu. Pri opredeljevanju intrinzične ledvične bolezni smo predvsem pozorni na hematurijo in proteinurijo. Mikroskopsko potrjena prisotnost krvnih celic in nekaterih formiranih elementov (ledvičnih tubulnih celic, cilindrov) je lahko pomemben znak bolezni (2). Študije so pokazale na visoko specifičnost in nizko občutljivost sedimenta seča za odkrivanje in razlikovanje AOL v primerjavi z lipokalinom povezanim z nevtrofilno gelatinazo (10-13).

Lipokalin povezan z nevtrofilno gelatinazo (angl. neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL) je majhen 25-kDa velik sekretorni glikoprotein nevtrofilnih granulocitov. V nizkih koncentracijah se sintetizira tudi v drugih tkivih, vključno z ledvičnimi proksimalnimi tubuli. V nevtrofilcih in v urinu obstaja v obliki monomera, v majhnem odstotku v obliki dimera in trimera in v kompleksu z gelatinazo B, vrsto kolagenaze humanih nevtrofilcev. Izkazalo se je, da je občutljiv, neinvaziven in visoko napovedljiv zgodnji biooznačevalec AOL, ki hitro poraste v krvi in urinu po ishemični, septični in nefrotoksični poškodbi ledvic. Rezultati objavljenih študij kažejo, da koncentracija NGAL v urinu naraste nekajkrat po ishemičnih poškodbah, ki sledijo operacijam srca in poškodbam ledvic povzročenimi z radiološkimi kontrastnimi sredstvi ter prehitevajo povečanje koncentracije serumskega kreatinina za 12 do 24 ur (14).

2.1 Encimi v urinu ledvičnega izvora

Encimi, ki se sprostijo v urin iz poškodovanih tubulnih celic, se nahajajo na različnih lokacijah v celici, kot je citoplazma, lizosomi ali celična membrana. Zato njihovo določanje zagotovi podrobnejšo informacijo o nastanku in obširnosti poškodb tubulnih celic. Primer takih encimov so: encimi resaste površine proksimalnega nefrona (alkalna fosfataza, γ-glutamil transpeptidaza in alanin aminopeptidaza), citoplazemski encimi (izoencim α glutation S-transferaze (GST-α) nastaja v epitelijskih celicah proksimalnih tubulov, izoencim π pa v distalnih tubulih) in lizosomski encim N-acetil glukozaminidaza (NAG). NAG je hidrolitičen encim, ki ga najdemo v mnogih tkivih v telesu. Ima visoko molekulsko maso (130-140 kDa), zaradi česar se v glomerulih ne filtrira. Visoko aktiven je v ledvičnih proksimalnih tubulnih celicah, kot posledico poškodb/okvar pa zaznamo povečano aktivnost v urinu (nekroza proksimalnih tubulnih celic).

2.2 Beljakovine z majhno molekulsko maso

Beljakovine z majhno molekulsko maso (<40 kDa) se prosto filtrirajo v primarni urin in se nato reabsorbirajo in razgradijo v proksimalnih tubulnih celicah. Povečane koncentracije teh beljakovin v urinu pomenijo resorbcijsko okvaro proksimalnih tubulov. V ta namen se najpogosteje določajo α1- in β2-mikroglobulin, retinol vezoči protein in cistatin C (5). Novejši biooznačevalec je jetrna oblika maščobne kisline vezočega proteina (angl. liver type-fatty acid binding protein, L-FABP), ki je 14-kDa velik citoplazemski protein, ki se sintetizira predvsem v jetrih in proksimalnih tubulih ledvic, kjer ima pomembno zaščitno vlogo. Veže proste maščobne kisline, ki spremljajo ledvične bolezni in proteinurijo, ki se nato razgradijo. Zadnje raziskave so potrdile, da je primeren označevalec napredovanja kronične ledvične bolezni in tubulne ishemije (15, 16).

2.3 Biooznačevalci sintetizirani v ledvicah

S pomočjo raziskav celičnih kultur človeških proksimalnih tubulnih celic so bili odkriti geni in genski produkti, ki so potencialni biooznačevalci ALO: protein bogat s cisteinom 61 (angl. cystein rich protein 61, CYR61), NGAL, molekula za odkrivanje ledvičnih okvar-1 (angl. kidney injury molecule-1, KIM-1) in Klotho (fosfatonin). CYR61 je protein iz družine zunajceličnih rastnih faktorjev z mnogimi funkcijami, predvsem zaščitnimi. Po ishemičnih poškodbah ledvic se začne izražati v proksimalnih tubulnih celicah in izločati z urinom. Urinske in serumske koncentracije CYR61 so tudi vključene v raziskave ishemičnih poškodb ledvic (17, 18).KIM-1 je transmembranski protein, ki se sintetizira v zelo majhni meri v zdravem ledvičnem tkivu, zelo pa je izražen v ledvičnih proksimalnih tubulnih celicah po ishemičnih in toksičnih poškodbah. Zunajcelični del proteina se sprosti v urin, kjer je tudi dobro stabilen. Raziskave kažejo, da je biooznačevalec zgodnjih ledvičnih okvar primeren za diferencialno diagnostiko med akutno tubulno nekrozo in ostalimi vrstami ledvičnih poškodb (19). Klotho (fosfatonin) se izvirno izloča kot neaktivna oblika transmembranskega proteina. Aktivacija poteka preko delovanja sekretaz in odstranitve ekstracelularne domene (ADAM 10 and ADAM 17). Dva tipa Klotho se

80 81


sprostita, membranski in topni Klotho z različnimi funkcijami. Membranski Klotho deluje kot receptor za fibroblast rastni faktor factor-23 (FGF-23), kostni hormone, ki kontrolira metabolizem fosfata. Sproščeni topni Klotho pa regulira ionske kanale (TRPV5 in ROMK), rastne faktorje (insulin/IGF-1) in oksidativni stres. Klotho je izražen v višjih koncentracijah v renalnih tubulih, možganih in v manjši meri v paratiroidni žlezi ter v srcu. Mehanizem delovanja Klotho pri AOL je še nepoznan in ni odvisen od znižanja ekspresije Klotho mRNA. Hitro znižanje koncentracije Klotha v urinu in plazmi kot odgovor na renalno tubularno poškodbo in vrnitev koncentracij na bazalno vrednost pred poškodbo kaže na vlogo Klotho pri popravi ledvične poškodbe. Študije na živalskih in humanih modelih nakazujejo, da je AOL stanje pomanjkanja Klotha in njegove vloge pri reverzibilni regeneraciji ledvic (20-22).

2.4 Citokini in kemokini

Pri ishemični poškodbi ledvic je pomemben imunski in vnetni odziv, kar je povezano tudi z začetno poškodbo endotelija. Zato je povečana tudi sinteza membranskih adhezivnih molekul (intercelularna adhezivna molekula – ICAM-1), provnetnih citokinov in kemokinov. Interlevkin 18 (IL-18) je mediator vnetja in ishemične poškodbe tkiv ter nastaja v mnogih organih v telesu. V ishemičnih proksimalnih tubulnih celicah poškodbe povzroča s kaspazo-1 posredovana aktivacija IL-18. Raziskave kažejo, da ima določanje IL-18 v urinu občutljivost in specifičnost >90% za odkrivanje ALO. Zvišana vazokonstrikcija je povezana tudi s tvorbo vazoaktivnih citokinov (npr. tumor nekrozni faktor alfa-TNFα) in endotelina, kot posledice interakcije endotelija in levkocitov (23)

3. Zaključek

AOL je zapleten in pogost sindrom, predvsem povezan z bolnišničnim zdravljenjem, čigar diagnostika je desetletja ostajala nespremenjena in nezadostna. Zaradi skupnih prizadevanj profesionalnih organizacij in številnih raziskovalnih skupin je bil zadnja leta narejen precejšen napredek na tem področju, predvsem v razumevanju poteka bolezni in odkritju mnogih novih in potencialnih biooznačevalcev AOL. Vendar le ti potrebujejo še nadaljno

evaluacijo v večjih skupinah pacientov in v daljšem časovnem obdobju. Trenutno še ni idealnega biooznačevalca AOL, uveljavlja pa se določanje več panelov biooznačevalcev v urinu in serumu za zgodnje odkrivanje AOL in prepoznavanje mest poškodbe ter za napoved poteka AOL in ogroženosti bolnika.

Literatura

1. NICE. Acute kidney injury: Prevention, detection and management of acute kidney injury up to the point of renal replacement therapy. In NICE clinical guideline 169: National Institute for Health and Care Excellence, 2013

2. Triverio PA, Martin PY, Romand J, et al. Long-term prognosis after acute kidney injury requiring renal replacement therapy. Nephrol Dial Transplant 2009; 24: 2186-89.

3. KDIGO. KDIGO Clinical practice guideline for acute kidney injury. Kidney Int 2012;2: 8.4. Mehta RL, Pascual MT, Soroko S, et al. Spectrum of acute renal failure in the intensive

care unit: The PICARD experience. Kidney Int 2014;66: 1613-21.5. Kanagasundaram NS. Pathophysiology of ischaemic acute kidney injury. Ann Clin

Biochem 2015;52: 193-205.6. Lattanzio MR, Kopyt NP. Acute Kidney Injury: New Concepts in Definition, Diagnosis,

Pathophysiology, and Treatment. J Am Osteopath Assoc 2009; 109:13-19. 7. Bagshaw SM, Gibney N. Conventional markers of kidney function. Crit Care Med 2008;

Vol. 36; No. 4.8. Randers E., Erlandsen E.J. Serum cystatin C as an endogenous marker of the renal

function – a Review. Clin Chem Lab Med 1999; 37(4): 389–395. 9. Šter M. Ocena ledvične funkcije s cistatinom C pri bolnikih, operiranih na koronarnih

arerijah: magistrska naloga. Fakulteta za farmacijo, Ljubljana 2009. 10. Perazzella MA, Parikh CR. How can urine microscopy influence the differential diagnosis

of AKI. Clin J Am Soc Nephrol 2009; 4: 691-93.11. Perazzella MA, Coca SG, Hall IE, et al. Urine microscopy is associated with severity

and worsening of acute kidney injury. Clin J Am Soc Nephrol 2010; 5: 402-8.12. Bagshaww SM, Haase M, Haase-Fielitz, et al. A prospective evaluation of urine

microscopy in septic and non-septic acute kidney injury. Nephrol Dial Transplant 2012; 27: 582-88.

13. Schinstock CA, Semret MH, Wagner SJ, et al. Urinalysis is more specific and urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin is more sensitive for early detection of acute kidney injury. Nephrol Dial Transplant 2013; 28: 1175-85.

14. Mishra J, Mori K, Ma Q, e tal. Amelioration of ischemic of ischemic acute renal injury by neutrophil gelatinase-associated lipocalin. J Am Soc Nephrol 2004; 15: 3073 – 82.

15. Malyszko J. Biomarkers of acute kidney injury in different clinical settings: a time to change the paradigm? Kidney Blood Press Res 2010; 33: 368-382.

16. Lisowska-Myjak B. Serum and Urinary Biomarkers of Acute Kidney Injury. Blood Purif 2010; 29: 357-365.

17. Muramatsu Y1, Tsujie M, Kohda Y, Pham B, Perantoni AO, Zhao H, Jo SK, Yuen PS, Craig L, Hu X and Star RA. Early detection of cysteine rich protein 61 (CYR61, CCN1) in urine following renal ischemic reperfusion injury. Kidney Int, 2002; 62:1601-10.

82 83


18. Lai CF, Lin SL, Chiang WC, et al. Blockade of Cysteine-rich Protein 61 Attenuates Renal Inflammation and Fibrosis after Ischemic Kidney Injury. Am J Physiol Renal Physiol, 2014; 307: F581-F592.

19. Ichimura T, Asseldonk EJ, Humphreys BD, et al. Kidney injury molecule-1 is a phosphatidylserine receptor that confers a phagocytic phenotype on epithelial cells. J Clin Invest 2008: 118: 1657-68.

20. Hu MC , Moe OW. Klotho as a potential biomarker and therapy for acute kidney injury. Nat Rev Nephrol, 2012. 8(7): p. 423-9.

21. Torregrosaa I, Montoliub C, Uriosb A, et al. Urinary Klotho measured by ELISA as an early biomarker of acute kidney injury in patients after cardiac surgery or coronary angiography. Nefrologia.2015;35:172-8.

22. Seo MY, Yang J, Lee JY, etal. Renal Klotho expression in patients with acute kidney injury is associated with the severity of the injury. Korean J Intern Med. 2015;30:489-95.

23. Bonventre JV, Yang L. Cellular pathophysiology of ischemic acute kidney injury. J Clin Invest 2011; 121: 4210-21.

84 85


Novel markers neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and cystatin C in determining acute kidney injury after heart operations using cardiopulmonary bypass

/ Spremljanje akutne ledvične okvare po operacijah na srcu z novejšimi biooznačevalci /

Jurij Matija Kališnik1,2, Eva Hrovat1, Alenka Hrastovec3, Janez Žibert4, Aleš Jerin5, Milan Skitek5

1Department of Cardiovascular Surgery, University Medical Center, Ljubljana, Slovenia;2Department of Cardiac Surgery –Paracelsus Medical University Nuremberg, Germany;3Department of Anesthesiology, University Medical Center, Ljubljana, Slovenia;4Faculty of Health Sciences, Ljubljana, Slovenia;5Institute of Clinical Chemistry and Biochemistry, University Medical Centre, Ljubljana, Slovenia

*The authors report no conflicts of interest. The Study was supported by funding from University Medical Centre affiliated Research Trust under Grant Agreement No. 20100605.The study was presented at 14th ISMICS annual scientific meeting in Boston (28-31 May 2014).

Abstract

Objective: Acute kidney injury (AKI) represents frequent complication after cardiac surgery using cardiopulmonary bypass (CPB). The assessment of AKI rests on creatinine levels, which are dependent on many parameters, causing relatively late and less reliable AKI recognition after surgery. We tested the utility of neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and cystatin C (CysC) for determination of AKI after cardiac surgery using CPB.

Methods: 41 patients met the inclusion criteria. Arterial blood samples collected after induction of general anesthesia were used as baseline, further sampling occurred at CPB termination, 2 hours after CPB, on the first and second day after surgery.

Results: According to AKIN classification 18 patients (44%) developed AKI (AKI1-2 groups) and 23 (56%) did not (non-AKI group). Groups were similar regarding demographics and operative characteristics. CysC levels differed already preoperatively (non-AKI vs. AKI2; p=0.045; AKI1 vs. AKI2; p=0.011), while postoperatively AKI2 group differed on first day and AKI1 on the second regarding non-AKI group (p=0.004; p=0.021, respectively). NGAL showed significant difference already 2h after CPB between groups AKI2 and non-AKI and later on first postoperative day between groups AKI1 and AKI2 (p=0.028; p=0.014, respectively).

Conclusions: Both novel markers NGAL and CysC proved efficient in differentiating between AKI and non-AKI group after heart surgery using CPB. While the postoperative peak of serum NGAL occurred as early as immediately after separating from CPB, CysC peaked later in postoperative course, similarly to creatinine only on the second postoperative day.

1. Introduction

Acute kidney injury (AKI) after cardiac surgery with cardiopulmonary bypass (CPB) represents a serious complication increasing morbidity and mortality rate. Cardiac patients with AKI requiring renal replacement therapy postoperatively suffer high mortality in the range from 30-80% (1-6). Not surprisingly, to alleviate the devastating consequences of this serious condition, reliable timely diagnosis is paramount. Serum creatinine and/or diuresis remain first line diagnostic tools for AKI determination despite well-known limitations. Firstly, creatinine serum concentration is dependent on body weight and is therefore stable only in stationary state. Secondly, it varies with respect to gender, age, muscle mass, is affected by different drug uptake (e.g., cimetidine, cephalosporin), hydration status and alimentation (7,8), so it may last as long as few days until it becomes representative again after surgery (4). Kidney damage with concomitant severe reduction in glomerular filtration rate (GFR) by 50% (9) will result in serum creatinine increase, while small to moderate decrease of GFR might not be detected at all. Not surprisingly, substantial kidney tubular injury results in rise of creatinine concentration no earlier than 24 to 36 hours after the noxious event (1-3). Diuresis, on the other hand, is

86 87


not always a reliable marker of kidney function in the acute postoperative period, as it is influenced by postoperative changes of endocrine regulation and might already be induced by diuretic agents (3,10). Due to the aforementioned reasons, classic markers of kidney function exhibit low sensitivity, rendering them less suitable for early monitoring and detection of AKI. Thus, the aim of our present study was to test the utility of novel biomarkers neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) and cystatin C (CysC) for early determination of AKI and assessing their performance in identifying patients at risk of severe AKI after cardiac surgery using CPB.

2. Methods

The study was designed as a prospective observational study, comparing creatinine, NGAL and CysC levels in patients who develop AKI or not after heart surgery using CPB. The National Medical Ethics Committee of the Republic of Slovenia approved the study protocol and an informed consent was obtained from all study participants prior to data collection. The study was carried out at the Department of Cardiovascular Surgery, University Clinical Centre Ljubljana, Slovenia from December 2012 to August 2013.

2.1 Study population

Patients, eligible for enrolment in our study, underwent one of the following elective cardiac procedures using CPB: coronary artery bypass grafting (CABG), isolated or combined aortic procedures, such as ascending aorta and/or valve repair and/or replacement, mitral and/or tricuspid valve repair/replacement in any combination. Exclusion criteria included: end stage kidney disease on chronic dialysis, the use of radiocontrast agent 24 hours prior to surgery, required emergent cardiac surgery, off-pump surgery, age less than 18 years, history of previous open heart surgery and kidney transplant recipients. Preoperative patient’s characteristic, significant intraoperative risk factors as well as peri- and postoperative complications were documented. Special attention has been paid to account for any additional comorbidity, such as

arterial hypertension, diabetes mellitus, and hypercholesterolemia. Left ventricular ejection fraction was determined for each patient preoperatively using transthoracic echocardiography. Operative risk was calculated using Euroscore II model. Estimated GFR (eGFR) was calculated using Modification of Diet in Renal Disease (MDRD) formula (eGFR = 186 x serum creatinine-1.154

x age-0.203 x (1.210 if black) x (0.742 if female)). (11)Patients were divided into two groups (AKI group and non-AKI group), depending on the postoperative increase in serum creatinine. AKI group was defined as having an increase in serum creatinine larger than or equal to 150% (1.5-fold) of baseline, or more than 26.4 µmol/L during the first 48 hours after surgery. Results were compared between these two groups. Following the Acute kidney Injury Network classification we further subdivided the AKI group into three subgroups (AKI1, AKI2, AKI3) according to the severity of postoperative peak creatinine rise (Table 1) (12).

Table 1. Acute Kidney Injury Network (AKIN) classification of AKI

Stage Serum creatinine criteria

AKI1Increase in serum creatinine of more than or equal to 26.4 μmol/L or increase to more than and equal to 150-200% from baseline

AKI2Increase in serum creatinine to more than or equal to 200-300% from baseline

AKI3Increase in serum creatinine to more than or equal to 300% from baseline

*AKI = acute kidney injury

2.2 Blood samples collection and assays

Samples of arterial blood collected after induction of general anaesthesia and before surgical incision were assigned as baseline reference. During and after the operation, blood samples were obtained simultaneously at four predetermined time-points: at the end of CPB, 2 hours after the end of CPB, on the first and on the second postoperative day (24 and 48 hours after surgery). Subsequent analyses were performed only in subjects with

88 89


available samples on all predetermined time-points. Blood samples were collected in tubes without additive for the measurement of creatinine and CysC. For the measurement of NGAL, tubes with ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) were used. After collection, samples were centrifuged to obtain serum or plasma and then stored at -20°C for final analyses.Determination of creatinine, CysC and NGAL was carried out by the Institute of Clinical Chemistry and Biochemistry, University Medical Centre Ljubljana, Slovenia. Creatinine in serum was measured using automated assay based on modified kinetic Jaffe reaction (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark, DE, USA); limit of detection was 9 µmol/L. For the measurement of CysC in serum ELISA kit (BioVendor GmbH, Heidelberg, Germany) with 0.2 µg/L detection limit was used. Plasma concentration of NGAL was measured with Advia analyser (Siemens Healthcare Diagnostics Inc., Newark, DE, USA) using turbidimetric immunoassay (BioPorto Diagnostics, Gentofte, Denmark); the limit of detection was 12 µg/L.

2.3 Statistical analysis

The differences of demographic and perioperative data between AKI and non-AKI group were evaluated by two-tailed Student's t-test in normally distributed data, while for non-normally distributed data a non-parametric Mann-Whitney U test was applied. The differences in proportions between AKI and non-AKI group were computed by Chi-square statistics. Mixed-design repeated measures ANOVA was used in testing differences of serum creatinine, CysC and plasma NGAL concentration measurements between non-AKI, AKI1 and AKI2 groups. None of the subjects enrolled met the criteria for AKI3. In repeated measures ANOVA a within-subjects factor was time of measurement and a between-subject factor corresponded to AKI groups. Further post-hoc pairwise tests using the Bonferroni correction were applied to study differences of serum concentrations between different AKI groups at each time point. All statistical analyses were performed with a software package SPSS (version 20.0) and a p-value of less than 0.05 was considered to be statistically significant.

3. Results

41 patients were enrolled into the final study sample. 18 patients (44%) developed AKI (AKI group) and 23 (56%) did not (non-AKI group). None of AKI patients required renal replacement therapy. Importantly, AKI and non-AKI groups were similar regarding preoperative creatinine level and proportions of eGFR below 60 ml/min/1.73 m2. Other anthropometric and demographic characteristics were comparable in AKI and non-AKI group as depicted in Table 2.

Table 2. Clinical characteristics of the patients

Non-AKI(n=23)

AKI(n=18)

P-value

Age (yrs) 71.7 ± 11.7 77.0 ± 7.1 0.156

Gender (M/F) 14/9 12/6 0.146

BMI (kg/m2) 28.0 ± 4.9 28,2 ± 4,8 0.881

Euroscore II 2.3 ± 1.7 3.3 ± 2.3 0.189

Diabetes mellitus (non/oral/insulin) 19/4/0 14/2/2 0.240

Arterial hypertension (Y/N) 22/1 18/0 0.370

Hypercholesterolemia (Y/N) 10/13 12/6 0.139

Left ventricular ejection fraction (%) 65.2 ± 12.3 63.2 ± 6.9 0.603

Preoperative creatinine 79 ± 13 89 ± 25 0.129

Preoperative eGFR 82.2 ± 18.8 76.5 ± 27.0 0.431

eGFR ≤ 60 ml/min/1.73 m2 (number of patients)

4 5 0.425

*Data are represented as mean ± SD. AKI = acute kidney injury; BMI = body mass index; eGFR = estimated glomerular filtration rate. Statistically significant difference between the groups is considered at p < 0.05.

Among intraoperative factors, regardless of the type of operation, CPB was associated with increased incidence of AKI with borderline significance

90 91


level, while AKI group received significantly more units of red blood cell transfusion as shown in Table 3.

Table 3. Perioperative characteristics of the patients

Non-AKI(n=23)

AKI(n=18)

P-value

Intraoperative data

CPB time (min) 91.5 ± 21.7 106.4 ± 33.2 0.090

Cross clamp time (min) 70.1 ± 21.4 81.4 ± 31.6 0.215

RBC transfusion 2.6 ± 3.1 3.9 ± 2.8 0.036

Fresh frozen plasma transfusion

2.22 ± 2.0 2.3 ± 3.2 0.593

Platelets transfusion 0.17 ± 0.49 0.28 ± 0.56 0.458

Postoperative data

Respiratory support (h) 16.6 ± 22.3 13.8 ± 10.1 0.782

Inotropes (h) 27.4 ± 49.2 40.1 ± 41.1 0.204

ICU stay (days) 7.4 ± 9.4 4.8 ± 1.9 0.179

Hospital stay (days) 14.5 ± 14.2 11.4 ± 5.9 0.916

Dialysis 0 0 -

Death (Y/N) 0/23 1/17 0.252

Data are represented as mean ± SD. AKI = acute kidney injury; CPB = cardiopulmonary bypass; ICU = intensive care unit; RBC = red blood cell. Statistically significant difference between the groups is considered at p < 0.05.

3.1 Creatinine

In AKI group serum creatinine concentration started to rise two hours after CPB termination and progressively reaching peak or plateau levels within 24 or 48 hours after CPB. In non-AKI group serum creatinine levels stabilized

early in the course and returned to baseline within 48 hours. Rise of serum creatinine was significantly higher in AKI2 group already two hours after CPB termination (p = 0.038) (Figure 1). Given the AKI determination is predominantly based on creatinine dynamics, a repeated measures ANOVA confirmed that the mean creatinine values differed statistically significantly at different time points regardless of AKI grade (p < 0.001) and also with respect to AKI group (p < 0.001) as presented in Figure 1. While creatinine did not differentiate AKI groups according to severity of renal impairment at CPB termination, it started to do so 2 hours after CPB termination exhibiting rough 10% additional rise in AKI2 group. 24 and 48 hour samples revealed fully expressed differences across groups as expected (Figure 1).

Figure 1. Estimated marginal means of serum creatinine. Blue dots correspond to statistically significant differences of the post-hoc pair-wise comparisons of serum creatinine concentrations in the repeated measures ANOVA, presented in Table 5. AKI = acute kidney injury; CPB = cardiopulmonary bypass.

92 93


3.2 Cystatin C

Preoperative serum CysC was highest in patients developing highest grade of AKI postoperatively (p = 0.045) compared to non-AKI group. Starting CysC levels differed also with respect to extent of AKI after surgery (p = 0.011). Postoperatively, CysC levels were significantly higher in AKI2 group on the first and on the second postoperative day (p = 0.004; p < 0.001, respectively), whereby excessive increase in CysC in AKI1 occurred later on the second postoperative day (p = 0.021). Noteworthy, we found CysC dynamics profile similar to that of creatinine within 48 hours following cardiac surgery (Figures 1 and 2).

Figure 2. Estimated marginal means of serum Cystatin C. Blue dots correspond to statistically significant differences of the post-hoc pair-wise comparisons of serum Cystatin C concentrations in the repeated measures ANOVA, presented in Table 7.AKI = acute kidney injury; CPB = cardiopulmonary bypass.

3.3 NGAL

While not distinguishing between groups preoperatively, NGAL in AKI2 group at 2 hours after CPB termination exceeded the NGAL value in non-AKI group by rough 50% (p = 0.028). As shown in Figure 3, it displayed highest discriminatory power on the first postoperative day sharply differentiating between AKI1 and AKI2 groups and AKI2 and non-AKI groups (p = 0.014; p < 0.001, respectively), while on the second postoperative day subsiding NGAL values still demarcated AKI2 from non-AKI group (p < 0.001).

Figure 3. Estimated marginal means of plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL). Blue dots correspond to statistically significant differences of the post-hoc pair-wise comparisons of plasma NGAL in the repeated measures ANOVA, presented in Table 9.AKI = acute kidney injury; CPB = cardiopulmonary bypass.

94 95


4. Discussion

Although without any manifested kidney dysfunction, we found that patients developing highest grade of AKI after operation, that is AKI2, had significantly elevated levels of CysC already before operation. Conversely, creatinine and NGAL levels in patients with highest AKI grade were elevated already two hours after CPB termination. NGAL peaked earliest directly after CPB termination and returned towards baseline on the first postoperative day in patients without or with only mild renal impairment (AKI1) while CysC and creatinine incrementally achieved peak values only on the first and second postoperative day respectively, having similar patterns in the first 24 hours after CPB, consistent with a hemodilution effect.

Creatinine, CysC, NGAL and AKI

It is known that chronic kidney disease increases the incidence of AKI following CPB (7,15,22). Including patients with pre-existing renal dysfunction and preoperative GFR 60 ml/min/1,73 m2 or below did not uniformly predict AKI in our study since only in half of them kidney function got worse in postoperative period. According to the literature, creatinine concentration immediately after CPB drops below preoperative levels despite intraoperative kidney injury (23,24). The latter is attributed to the influence of haemodilution. Svenmarker et al. concluded that haemodilution induced by CPB significantly overestimates the renal function as indicated by eGFR based on serum markers (25). In line with previous observations we found lowered serum creatinine and CysC consistent with haemodilution immediately after separation from CPB in all studied groups. Despite the observed limitation, serum creatinine rose significantly high already two hours post-CPB in patients developing AKI2. On the other hand, lower grade AKI (AKI1) was reflected in creatinine rise no earlier than first day after surgery, which is in line with other authors who reported disability to diagnose AKI by serum creatinine until at least the first postoperative day (2), since in their case serum creatinine did not increase by 50% in AKI until second postoperative day (3). Thus, creatinine might be helpful at predicting higher grades of AKI, while lower grades of AKI can be missed easily immediately after surgery, the latter consequently enhancing subsequent progress to more extensive kidney impairment, since appropriate

interventions are delayed because of late diagnosis.CysC recently emerged as a potential diagnostic marker of AKI. CysC is a nonglycosylated 13kDa basic protein that is a member of cystatin superfamily of cysteine protease inhibitors (3). It is produced constantly by all nucleated cells, unaffected by muscle mass (unlike creatinine), gender, age, race, and protein intake (26,27). CysC is excreted by glomerular filtration and then fully catabolized in the proximal renal tubule without being secreted or reabsorbed (16). Serum values correspond to GFR, meanwhile high urinary values point out tubular injury (3). Shlipak et al. concluded in their large, multi-center study that pre-surgical CysC is better than creatinine or creatinine-based eGFR at forecasting the risk of AKI after cardiac surgery (17), however they did not find any difference regarding AKI grade. In contrast, we found that patients developing AKI2 have increased CysC plasma levels before operation while AKI1 patients have CysC levels similar to non-AKI group. NGAL is a small 25kDa protein covalently bound to gelatinase and secreted from neutrophils and epithelial cells. It is expressed at low levels in various organs containing epithelial tissue, including the kidneys, trachea, lungs, stomach and large intestine (28). During AKI, NGAL expression is increased in kidneys as well as systemically, protein synthesis occur in other organs, particularly the liver and the lungs, leading to the rise in systemic NGAL. NGAL is released from neutrophils, macrophages and other immune cells, which add part to the systemic rise in concentration (29), however, predominantly elevated plasma NGAL concentration reflects a change in renal glomerular function (decreased filtration) and /or in structural tubular injury (30). With respect to preoperative values, plasma NGAL levels were not different in patients who developed AKI postoperatively. This is in accordance with results of Hasse-Fielitz et al. (9). Upgrading previous reports in adult cardiac patients (2,3,9) results of our study demonstrate that significant plasma NGAL increase 2h after CPB termination could identify patients that presented with severe kidney impairment with a peak rise of creatinine up to 200 μmol/L 48 hours after surgery. In contrast to Koyner et al. (3), the conclusions could be drawn from the results of plasma samples rather than urine. In sharp contrast with serum CysC and creatinine, NGAL peaked highest in all three groups immediately after separating from CPB demonstrating different temporal profile as the other two markers. Although we could discriminate among patients progressing to AKI1 and AKI2 group already two hours after CPB, it is obviously too preliminary and beyond the scope of the present study to infer any relationship between the peak NGAL values and any subsequent clinical acute and intermediate consequences on the progression of kidney disease.

96 97


References

1. Wagener G, Gubitosa G, Wang S, et. al. Urinary Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin and Acute Kidney Injury After Cardiac Surgery. Am J Kidney Dis. 2008; 52: 425-33.

2. Tuladhar SM, Püntmann VO, Soni M, et. al. Rapid Detection of Acute Kidney Injury by Plasma and Urinary Neutrophil Gelatinase–associated Lipocalin After Cardiopulmonary Bypass. J Cardiovasc Pharmacol. 2009; 53: 261-6.

3. Koyner JL, Bennett MR, Worcester EM, et al. Urinary cystatin C as an early biomarker of acute kidney injury following adult cardiothoracic surgery. Kidney Int. 2008; 74: 1059-69.

4. Dent CL, Ma Q, Dastrala S, et al. Plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin predicts acute kidney injury, morbidity and mortality after pediatric cardiac surgery: a prospective uncontrolled cohort study. Crit Care. 2007; 11: R12.

5. Conlon PJ, Stafford-Smith M, White WD, et al. Acute renal failure following cardiac surgery. Nephrol Dial Transplant. 1999; 14: 1158-62.

6. Mangano CM, Diamonstone LS, Ramsay JG, et al. Renal dysfunction after myocardial revascularization: risk factors, adverse outcomes and hospital utilization. Ann Intern Med. 1998; 128: 194-203.

7. Hudson C, Hudson J, Swaminathan M, Shaw A, et al. Emerging Concepts in Acute Kidney Injury Following Cardiac Surgery. Semin Cardiothorac Vasc Anesth. 2008; 12: 320-30.

8. Devarajan P. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL): A new marker of kidney disease. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2008; 241: 89-94.

9. Haase-Fielitz A, Bellomo R, Devarajan P, et al. Novel and conventional serum biomarkers predicting acute kidney injury in adult cardiac surgery- A prospective cohort study. Crit Care Med. 2009; 37: 553-60.

10. Sykes E, Cosgrove JF. Acute renal failure and the critically ill surgical patient. Ann R Coll Surg Engl. 2007; 89: 22-9.

11. National kidney foundation. K/DOQI clinical practice guidelines for chronic kidney disease: evaluation, classification, and stratification. Am J Kidney Dis. 2002; 39 (2 Suppl 1): S1-266.

12. Mehta RL, Kellum JA, Shah SV, Molitoris BA, Ronco C, Warnock DG, Levin A, Acute Kidney Injury Network: Report of an initiative to improve outcomes in acute kidney injury. Crit Care 2007; 11: R31.

13. Shaw A. Update on acute kidney injury after cardiac surgery. J Thorac Cardiovasc Surg. 2012 Mar; 143: 676-81.

14. Thakar CV, Arrigain S, Worley S, et al. A Clinical Score to Predict Acute Renal Failure after Cardiac Surgery. J Am Soc Nephrol. 2005; 16: 162-8.

15. Landoni G, Bove T, Crivellari M, et al. Acute renal failure after isolated CABG surgery: six years of experience. Minerva Anestesiol. 2007; 73: 559-65.

16. Wald R, Liangos O, Perianayagam MC, et al. Plasma cystatin C and acute kidney injury after cardiopulmonary bypass. Clin J Am Soc Nephrol. 2010; 5:1373-9.

17. Shlipak MG, Coca SG, Wang Z, et al. Presurgical serum cystatin C and risk of acute kidney injury after cardiac surgery. Am J Kidney Dis. 2011; 58: 366-73.

18. Salis S, Mazzanti VV, Merli G, et al. Cardiopulmonary bypass duration is an independent predictor of morbidity and mortality after cardiac surgery. J Cardiothorac Vasc Anesth.

2008; 22: 814-22.19. Kumar AB, Suneja M. Cardiopulmonary Bypass–associated Acute Kidney Injury.

Anesthesiol. 2011; 114: 964-70.20. Parikh CR, Devarajan P, Zappitelli M, et al. Postoperative biomarkers predict acute

kidney injury and poor outcomes after pediatric cardiac surgery. J Am Soc Nephrol. 2011; 22: 1737-47.

21. Alsabbagh MM, Asmar A, Ejaz NI, et al. Update on clinical trials for the prevention of acute kidney injury in patients undergoing cardiac surgery. Am J Surg. 2013; 206: 86-95.

22. Doi K, Urata M, Katagiri D, et al. Plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin in acute kidney injury superimposed on chronic kidney disease after cardiac surgery: a multicenter prospective study. Crit Care. 2013; 17: R270.

23. Wagener G, Jan M, Kim M, et al. Association between Increases in Urinary Neutrophil Gelatinase–associated Lipocalin and Acute Renal Dysfunction after Adult Cardiac Surgery. Anesthesiol. 2006; 105: 485-91.

24. Devarajan P. Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL): A new marker of kidney disease. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2008; 241: 89-94.

25. Svenmarker S, Häggmark S, Holmgren A, et al. Serum markers are not reliable measures of renal function in conjunction with cardiopulmonary bypass. Interact Cardiovasc Thorac Surg. 2011; 12: 713-7.

26. Perianayagam MC, Seabra VF, Tighiouart H, et al. Serum Cystatin C for Prediction of Dialysis Requirement or Death in Acute Kidney Injury: A Comparative Study. Am J Kidney Dis. 2009; 54: 1025-33.

27. Keller CR, Odden MC, Fried LF et al. Kidney function and markers of inflammation in elderly persons without chronic kidney disease: the health, aging, and body composition study. Kidney Int. 2007; 71: 239-44.

28. Xu S, Venge P. Lipocalins as biomarkers of disease. Biochim Biophys Acta. 2000; 1482: 298-307.

29. Schmidt-Ott KM, Mori K, Li JY, et al. Dual action of neutrophil gelatinase-associated lipocalin. J Am Soc Nephrol. 2007; 18: 407-13.

30. Pickering JW, Endre ZH. The clinical utility of plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin in acute kidney injury. Blood Purif. 2013; 35: 295-302.

98 99


Kronična ledvična bolezen

/ Chronic kidney disease /

Jelka LindičKlinični oddelek za nefrologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, Zaloška 7, 1000 Ljubljana

Povzetek

Kronična ledvična bolezen predstavlja velik problem javnega zdravja. Najpogosteje je posledica sladkorne bolezni, arterijske hipertenzije in srčno-žilnih bolezni. S preventivnim načinom življenja, zgodnjim odkrivanjem pri skupinah z dejavniki tveganja in pravočasno uvedbo zdravljenja lahko upočasnimo slabšanje ledvičnega delovanja in s tem povezane zaplete, zmanjšamo smrtnost in nastanek končne odpovedi ledvic. Ker bolezen dolgo časa poteka tiho, so preiskave za oceno glomerulne filtracije, oceno proteinurije, najdbo eritrociturije in drugih značilnih sprememb v sedimentu ključnega pomena. Z usklajenim sodelovanjem med laboratorijsko in klinično medicino je možno ustvariti ustrezne pogoje za multidisciplinarno obravnavo bolnika na vseh nivojih zdravstvene obravnave in zaustaviti epidemijo kronične ledvične bolezni.

Ključne besede: kronična ledvična bolezen, presejalne preiskave.

Abstract

Chronic kidney disease is a major public health problem. Mostly it is associated with diabetes, arterial hypertension and aterosclerotic hearth and vessel disease. With preventive lifestyle, early detection in the groups with risk factors and timely initiation of treatment we can slow the deterioration of renal function, prevent complications, reduce mortality and occurrence of end-stage renal disease. The disease has nonspecific early signs, therefore assessment of estimated glomerular filtration rate, proteinuria, erythrocyturia and other significant changes in urine sediment are of crucial importance. With synergistic approach between laboratory and clinical medicine we can create the right conditions

for the proper multidisciplinary evaluation and treatment of kidney patients to reverse the epidemic of chronic kidney disease.

Keywords: chronic kidney disease, screening.

1. Uvod

Kronična ledvična bolezen je bila prepoznana kot pogosta kronična bolezen s slabim izhodom šele leta 2002, ko so bila s pomočjo delovne skupine National Kidney Foundation Kidney Disease Outcomes Quality Initiative (NKF KDOQI) opredeljena jasna merila za njeno prepoznavanje in obravnavo (1). Ta merila so bila dopolnjena in usklajena leta 2012 v okviru delovne skupine Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) in so izhodišča za obravnavo teh bolnikov (2). Svetovna zdravstvena organizacija od leta 2006 uvršča kronično ledvično bolezen med prioritete pri obravnavi nenalezljivih kroničnih bolezni, ker zaradi velike pogostosti predstavlja v svetu in pri nas velik javnozdravstveni problem. Ocenjujemo, da ima v Sloveniji kronično ledvično bolezen več kot 200.000 ljudi, pojavnost narašča sorazmerno s starostjo. Ima jo kar vsaka deseta odrasla oseba, kar presega pojavnost sladkorne bolezni. Vzrok za takšno pogostnost je dejstvo, da je pri večini bolnikov posledica drugih najpogostejših kroničnih bolezni, kot so sladkorna bolezen, arterijska hipertenzija in aterosklerotična srčno-žilna bolezen. Ima jo kar vsaka tretja oseba s sladkorno boleznijo in vsaka peta z arterijsko hipertenzijo, zato sta ti dve bolezni vzrok za kronično ledvično bolezen kar pri 60% bolnikov. V poteku bolezni se pojavljajo zapleti kronične ledvične bolezni, kot so ledvična anemija, presnovna acidoza in kostna bolezen, ki dodatno vplivajo na zdravstveno stanje obolelih. Sčasoma lahko nastane končna odpoved ledvic, ki poslabša kvaliteto bivanja in je združena z velikimi stroški zdravljenja (1-3). Poseben problem pri teh bolnikih, ki ga pri vsakdanjem delu še premalo prepoznavamo, je večje tveganje za obolevnost in smrtnost zaradi srčno-žilnih bolezni kot pri populaciji bolnikov brez kronične ledvične bolezni. Tveganje za smrt je povečano pri stopnji kronične ledvične bolezni 3 in več ali pri prisotni proteinuriji oziroma albuminuriji in se povečuje sorazmerno s slabšanjem ledvičnega delovanja ter večanjem proteinurije ali albuminurije in je kar 10-100x večje kot pri splošni populaciji. Večina starejših bolnikov

100 101


zato umre prej kot pa nastane končna odpoved ledvic (1-2).Pri obravnavi kronične ledvične bolezni so ključnega pomena:• preventivni ukrepi za preprečevanje njenega nastanka z zdravim

življenjskim slogom,• zgodnje odkrivanje,• čim prejšnja uvedba neimunološkega in imunološkega zdravljenja,• primarna in sekundarna preventiva srčno-žilnih bolezni. Na ta način lahko zmanjšamo pojavnosti bolezni, zaustavimo ali upočasnimo njeno napredovanje, preprečimo nastanek srčno-žilnih zapletov in končne ledvične odpovedi, zmanjšamo smrtnost in omogočimo pravočasno pripravo na nadomestno zdravljenje končne odpovedi ledvic. Zaradi kompleksnosti obravnave in prehajanja bolnika med primarnim, sekundarnim in terciranim nivojem je potrebna multidisciplinarna obravnava bolnika, ki zahteva usklajeno sodelovanje med laboratorijsko in klinično medicino.

2. Dejavniki tveganja za kronično ledvično bolezen

Kronična ledvična bolezen poteka tiho brez zanjo značilnih kliničnih znakov in simptomov. Težave se pojavijo šele pri napredovali stopnji bolezni oziroma uremiji, ko končne odpovedi ledvic ne moremo več preprečiti. Bolniki se slabo počutijo, slabo jim je, bruhajo, imajo drisko, bolečine v prsih, zvišan krvni tlak, otekajo, težko dihajo, odvajajo manj seča, ki se lahko peni in je zelo prosojen ali pa temen. Za zgodnje odkrivanje kronične ledvične bolezni je zato ključno prepoznati dejavnike tveganja za nastanek kronične ledvične bolezni, ki so:• sladkorna bolezen, • arterijska hipertenzija, • aterosklerotična srčno-žilna bolezen (ishemična bolezen srca, srčno

popuščanje, periferna arterijska okluzivna bolezen in cerebrovaskularna bolezen),

• znana kronična ledvična bolezen pri sorodniku prvega kolena ne glede na vzrok,

• debelost (indeks telesne mase > 30 kg/m2), • kajenje, • slabši socialno-ekonomski status, • strukturne motnje v sečilih z oviro odtoka seča (hiperplazija prostate,

sečni kamni, nevrogeni mehur in podobno),

• sistemska bolezen, ki lahko prizadene ledvice (SLE, sistemski vaskulitis, plazmocitom, revmatioidni artritis in podobno),

• starost nad 50 let. S sistematičnim iskanjem prisotnosti kronične ledvične bolezni pri naštetih skupinah ljudi bolezen odkrijemo v zgodnjem obdobju, kar vodi v hitro diagnostično obravnavo in zdravljenje, s katerim zmanjšamo obolevnost in umrljivost in ne povečamo, ampak celo zmanjšamo stroške obravnave in zdravljenja (1-3).

3. Kriteriji za prisotnost kronične ledvične bolezni

Kako dobro ali slabo delujejo ledvice nam pove določitev glomerulne filtracije, na vrsto ledvične bolezni pa sklepamo s pomočjo pregleda seča s testnim lističem, sulfasalicilno kislino in mikroskopskim pregledom sedimenta seča. Kriteriji za postavitev diagnoze kronična ledvična bolezen so jasno opredeljeni, nazadnje so bili v mednarodnem smislu dopolnjeni leta 2012 v kliničnih in praktičnih smernicah za obravnavo kronične ledvične bolezni KDIGO (2). O kronični ledvični bolezni govorimo, ko je v obdobju 3 mesecev dokumentirano prisotna: 1. izmerjena ali ocenjena glomerulna filtracija (oGF) zmanjšana pod 60

mL/min/1,73 m2 ali 2. bolezen ledvic, ki se kaže z nenormalnimi najdbami v seču: • proteinurija (albuminurija), • nenormalnost v sedimentu seča (eritrociturija, ki je praviloma

glomerulna, eritrocitni cilinder, levkocitni cilinder, maščobni cilinder, tubulni epitelni cilinder, ovalna maščobna telesca, maščobne kapljice),

• nenormalnost v delovanju tubulov (ledvična tubulna acidoza, nefrogeni diabetes insipidus, ledvično izgubljanje kalija ali magnezija, Fanconijev sindrom, cistinurija),

3. morfološka sprememba pri slikovnih preiskavah (npr. ultrazvočna preiskava pri avtosomno dominantni policistični bolezni ledvic),

4. z biopsijo dokazana ledvična bolezen.

Glede na ugotovljeno oGF in proteinurijo razvrstimo kronično ledvično bolezen v več stopenj in razredov, hkrati s tem pa ugotovimo, kakšno je srčno-žilno tveganje in tveganje za nastanek končne odpovedi ledvic (preglednica 1).

102 103


Preglednica 1. Relativno tveganje za napredovanje, srčno-žilne zaplete in smrt glede na stopnjo oGF in proteinurijo ali albuminurijo. Tveganje se povečuje s slabšanjem ledvičnega delovanja in večanjem proteinurije, kot prikazuje stopnjevanje sivine v poljih. Legenda: KLB – kronična ledvična bolezen, U – v vzorcu seča, alb. – albumin, belj. – beljakovine, kreat. – kreatinin. Modificirano po (2).

Stopnja albuminurije, proteinurije in ocena glomerulne filtracije

normalno albuminurija

U-alb./kreat. > 3 g/mol

proteinurija

U-belj./kreat. > 20 g/mol

nefrotska proteinurija

U-belj./kreat. > 300 g/mol

oGF(mL/min/1,73 m2)

stopnja KLB

A1 A2 A3 A4

> 90 KLB 1

60 - 89 KLB 2

45 - 59 KLB 3 A

30 - 44 KLB 3 B

15 - 29 KLB 4

< 15 KLB 5

Med laboratorijske presejalne preiskave za ugotavljanje prisotnosti kronične ledvične bolezni sodijo:• oGF, ki pove, kako dobro delujejo ledvice,• ocena prisotnosti proteinurije in njene velikosti, na osnovi katere

sklepamo o vrsti ledvične bolezni, hitrosti napredovanja bolezni in tveganju za sočasno srčno-žilno bolezen in s tem povezane zaplete,

• pregled seča s testnim lističem, s katerim ocenimo kemično sestavo seča in ugotovimo eritrociturijo ali levkociturijo,

• pregled sedimenta seča, s katerim opredelimo vrsto eritrociturije in iščemo prisotnost drugih celic, cilindrov in pomembnih bolezenskih najdb v sedimentu seča, na osnovi katerih lahko sklepamo, kaj je vzrok za ledvično bolezen.

4. Ocena glomerulne filtracije

Diagnostične presejalne preiskave za oceno glomerulne filtracije (oGF) in prisotnost proteinurije ali albuminurije so bile pri nas opredeljene leta 2009 v okviru delovne skupine strokovnjakov različnih strok, ki se srečujejo z obravnavo bolnikov s kronično ledvično boleznijo (ISIS) (4, 5). Posebna pozornost je bila namenjena oGF in oceni proteinurije.V letu 2014 je na osnovi priporočil 2012 Kidney Disease, Improving Global Outcomes (KDIGO) Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease razširjeni strokovni kolegij za laboratorijsko diagnostiko sprejel sklep o implementaciji nove enačbe za izračun hitrosti glomerulne filtracije po enačbi raziskave Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration iz leta 2009 (CKD-EPI) (2, 6). Spremembo priporočila so pogojevala nova priporočila, osnovana na dejstvu, da je ocena glomerulne filtracije z oGF CKD-EPI realnejša v primerjavi z oGF MDRD in realna prevalenca kronične ledvične bolezni na osnovi uporabe oGF CKD-EPI manjša. V praksi si kliniki želimo, da bi bile uporabljene metode takšne, da bi bil rezultat izmerjene koncentracije kreatinina in izračunane oGF čim zanesljivejši, variabilnost znotraj laboratorija in med laboratoriji pa čim manjša.

Ključna priporočila so:• vsem laboratorijem je bila za določanje kreatinina v serumu ali plazmi

priporočena uporaba metode, ki je sledljiva do referenčne izotopske dilucijske masne spektroskopske metode (IDMS),

• sočasno s poročanjem o koncentraciji kreatinina v serumu ali plazmi se avtomatsko poroča tudi o oGF CKD-EPI,

• rezultati se izražajo kot kvantitativne vrednosti do 90 mL/min/1,73m2 in kot >90 mL/min/1,73m2, starostne omejitve nad 75 let ni več, ne uporablja se do starosti 18 let.

• v primeru kronične ledvične bolezni stopnje 3, pri kateri ni drugih jasnih označevalcev ledvične bolezni, lahko oGF izračunamo s pomočjo enačbe oGFcys CKD-EPI na osnovi določitve koncentracije cistatina C v serumu.

104 105


5. Ocena proteinurije

Vsaka preiskava seča je odvisna od načina odvzema seča. Pravilen odvzem seča mora biti standardiziran in izpolnjeni morajo biti določeni pogoji. Na izvid vplivajo prehrana, stradanje, napor, počitek, čas zadrževanja seča v sečnem mehurju, okužba in ejakulacija semena pri moških, zato preiskovance na to opozorimo. Opozorimo jih tudi, da dva dni pred načrtovanim standardiziranim odvzemom seča niso telesno aktivni (hoja v hrib, tek, tenis ipd.) in da ne uživajo mesa. Moški naj bodo en dan pred preiskavo spolno vzdržni, ženske pa naj ne opravljajo preiskav seča v času menstruacije (5).

Za vse preiskave seča je diagnostična preiskava srednjega curka drugega jutranjega seča, o načinu odvzema seča mora biti preiskovanec ustno in pisno dobro poučen. Preiskovanec od 22. ure prejšnjega dne ne pije, ko vstane, urinira v straniščno školjko, spije do največ 2 dL vode, sedi ali hodi, nato pa po dveh urah po predhodnem očiščenju spolovila zajame srednji curek seča brez prekinitve mikcije. Napačen odvzem zaradi pomanjkljivih navodil še vedno kar pogosto onemogoča interpretacijo izsledkov analize seča.

5.1 Testni listič in sulfosalicilna kislina

Za ugotavljanje proteinurije je najprej potrebna analiza vzorca seča s testnim lističem za analizo seča in hkrati s sulfosalicilno kislino. Na ta način ne spregledamo prelivne proteinurije, saj je testni listič najbolj občutljiv za albumine, za druge beljakovine pa bistveno manj. S preiskavo s testnim lističem ugotovimo, ali je prisotna proteinurija, ne pa, kako velika je.

5.2 Razmerje U-beljakovine/kreatinin

Če je pri preiskavi seča s testnim lističem prisotna proteinurija stopnje 1 ali več, njeno velikost ovrednotimo s kvantitativno določitvijo beljakovin in kreatinina v drugem jutranjem vzorcu seča. Laboratorij izsledke podaja kot količnik U-beljakovine/kreatinin v g/mol, dodatno z vrednostjo količnika lahko poda še oceno dnevne proteinurije (oDP). Vrednost količnika nad 20 g/mol ali oDP nad 0,150 g/dan/1,73 m2 je patološka. Z izražanjem rezultata na enoto kreatinina zmanjšamo napako zaradi večje ali manjše koncentriranosti

seča. Če je seč preveč razredčen in zato koncentracija kreatinina v vzorcu seča pod 2 mmol/L, laboratorij ne poda izsledkov meritve, ampak na izvid napiše pojasnilo, da je vzorec seča neustrezen in meritve nezanesljive.Zakaj je pri pozitivnem rezultatu testnega lističa bolj smiselno določati proteinurijo, čeprav veliko smernic priporoča kot prvo preiskavo določitev albuminurije? Prvi vzrok je, da v primeru določanja albuminurije pri kar 16 % bolnikih spregledamo proteinurijo, ki ni glomerulnega izvora, kar lahko zaradi zakasnitve diagnostike in zdravljenja poslabša izhod bolezni (7). To velja tudi za bolnike z diabetično ledvično boleznijo zaradi sladkorne bolezni tipa 2, kjer kar tretjina kljub zmanjšani GF v seču nima albuminurije, ampak tubulno proteinurijo (8). Drugi vzrok je, da določanje albuminurije in tubulne proteinurije kot presejalne preiskave nima nobene prednosti pred določanjem proteinurije, ki zazna večino beljakovin v seču, med drugim tudi lahke verige in imunoglobuline, ki bi jih z usmerjenim iskanjem albuminurije in tubulne proteinurije zlahka spregledali (5). Tretji vzrok je, da se z večanjem albuminurije pojavi in veča tubulna proteinurija, ki je posledica resorbcijske okvare tubulov, zato je celokupna proteinurija večja. Četrti vzrok je, da proteinurija enako dobro kot albuminurija napoveduje tveganje za slabšanje ledvičnega delovanja in nastanek končne odpovedi ledvic, srčno-žilne zaplete in s tem povezano večjo smrtnost (9). Peti vzrok je ekonomske narave, saj je določanje albuminurije do 10-krat dražje od določanja proteinurije in če bi temu pridružili še določanje tubulne proteinurije, bi se dodatno zmanjšala diagnostična zanesljivost pri odkrivanju proteinurije terstroški povečali.

5.3 Razmerje U-albumin/kreatinin

Če pri preiskavi seča s testnim lističem ni proteinurije (izsledek je 0), je priporočena preiskava za odkritje bolezenske albuminurije kvantitativna določitev albumina in kreatinina v vzorcu seča, ko je to klinično indicirano. To velja tako za nediabetično kot diabetično ledvično bolezen. Laboratorij izsledke podaja kot razmerje U-albumin/kreatinin v g/mol. Za bolezensko vrednost štejemo vrednost več kot 3 g/mol ne glede na spol (5).

106 107


6. Mikroskopski pregled sedimenta seča

Mikroskopsko preiskavo sedimenta seča so redno začeli opravljati zdravniki v prvi polovici 17. stoletja in je bila že takrat nepogrešljiv del obravnave. Tudi danes je izjemno pomembna za opredelitev vzroka oziroma vrste ledvične bolezni. S pojavom testnih lističev in večanjem potreb se je izvedba preiskave večinoma preselila v laboratorije in postaja zaradi velike količine vzorcev poslanih na analizo vedno bolj avtomatizirana. Avtomatizirana analiza seča je v smislu presejalnih preiskav nepogrešljiva za ugotavljanje kemičnih lastnosti seča in izključevanje bolezenskih najdb, kot so eritrociturija in levkociturija. Poteka lahko dvostopenjsko na način, da se na osnovi normalnih izvidov analize testnega lističa izbere vzorce, ki zahtevajo ročni pregled sedimenta seča. Ta način je zamuden in v primerjavi s povsem avtomatiziranimi sistemi, ki opravijo analizo v eni minuti, v povprečju traja 6 minut, v primeru kvantifikacije proliferativnega sedimenta pa bistveno dlje (10). V zadnjih letih se je tehnologija na tem področju na srečo zelo razvila, na tržišču so avtomatizirani analizatorji, ki omogočajo hitro analizo s testnimi lističi, prepoznavo delcev v sedimentu in njihov prikaz (11). Na ta način je možno v kratkem času opraviti analizo velikega števila vzorcev, povečati zanesljivost analize in zmanjšati breme zaradi ročnih analiz sedimenta seča.

Analiza sedimenta seča s fazno-kontrastnim mikroskopom je ključna pri ločevanju med glomerulno in neglomerulno eritrociturijo: pri glomerulni eritrocituriji najdemo v sedimentu vsaj 40% dismorfnih eritrocitov ali vsaj 5% akantocitov (slika 1), pri neglomerulni pa izomorfno eritrociturijo (12). Izraz izluženi eritrociti se je opustil, saj pomeni samo spremembo oblike eritrocitov zaradi osmotskih lastnosti seča in niso dismorfni. Pomembne najdbe v sedimentu so tudi eritrocitni, levkocitni in celični cilindri, prisotnost ledvičnih tubulnih in uroepitelnih celic, Decoyevih celic, maščobnih kapljic in diagnostičnih kristalov (13, 14).

Slika 1. Dismorfni eritrociti in akantociti . Figure 1. Dysmorphic erythrocytes and acantocytes

Kljub napredku tehnologije in razvoju laboratorijske dejavnosti avtomatizirana obravnava vzorcev še vedno ne more nadomestiti mikroskopskega pregleda seča (15, 16), saj ekspertni sistemi niso idealni. Rezultati pregleda sedimenta seča so za zdravnika izjemno pomembni, saj na osnovi tega sklepa o vrsti ledvične bolezni. Prepoznava patologije s pomočjo avtomatskega odčitavanja zaenkrat še ni popolnoma zanesljiva, pri obravnavi velikega števila vzorcev je tudi iluzorno pričakovati, da bi bilo možno v tako omejenem času z omejenim številom osebja pregledati vse sedimente seča. Vsaka bolezenska najdba, opisana v sedimentu, je zato še posebej dragocena. Verjetno so navedeni vzroki pogojevali ugotovitve raziskav, da v primerjavi z laboratorijskim osebjem izurjen nefrolog pri bolniku, pri katerem za razliko od laboratorijskega osebja potek bolezni dobro pozna, v večjem odstotku prepozna ledvične tubulne celice, dismorfne eritrocite in akantocite, eritrocitne ali levkocitne cilindre, celične cilindre in druge delce v sedimentu seča, kar omogoča hitrejše in racionalnejše odločanje za invazivno diagnostiko in diferentno zdravljenje (15, 16). Še posebej je to pomembno pri obravnavi bolnika z akutno ledvično okvaro ali multiorgansko odpovedjo, kjer se zelo mudi in je izjemno malo časa za postavitev diagnoze, saj so lahko s testnim lističem zaznane spremembe seča sprva še minimalne in nepovedne, že en eritrocitni cilinder v sedimentu seča pa diagnostičen za glomerulno ledvično bolezen. Ena od utemeljiteljic analize sedimenta seča dr. Kincaid-Smith je zato že leta 1982

108 109


menila, da so najboljši zdravniki tisti, ki po kliničnem pregledu bolnika sami opravijo analizo seča in lahko takoj postavijo diagnozo glomerulonefritisa (17). Podobnega mnenja je italijanski nefrolog dr. Fogazzi, ki velja za enega izmed od utemeljitelev sodobne analize sedimenta seča in zagotavljanja njene kakovosti (16, 18, 19). To je seveda možno doseži le v sodelovanju in tesnem povezovanju laboratorijske in klinične medicine.

7. Bodoče usmeritve

Sodelovanje laboratorijske in klinične medicine je na področju nefrologije tradicionalno dobro in je pri prepoznavi ledvične bolezni nepogrešljivo. Naša skupna dejavnost predstavlja piramido, ki s široko bazo omogoča hitro prepoznavo večine bolezenskih najdb v primarnem zdravstvu in pravočasno napotitev bolnika k nefrologu, nefrologu omogoča uvid v osnovno patologijo ledvične bolezni in s pomočjo pregleda sedimenta seča pri izbranih bolnikih še dodatno skrajša čas do pravilne diagnoze in ustreznega zdravljenja. Naš skupen cilj je, da bi v prihodnosti v tesnem sodelovanju med laboratorijsko in klinično medicino v vsej državi in regijah uskladili diagnostične laboratorijske metode v javnem in privatnem zdravstvu, omogočili racionalno stopenjsko diagnostiko in nadgradili sistem tako, da bi omogočili najboljši izhod zdravljenja ledvičnih bolnikov.

Literatura

1. KDOQI Clinical Practice Guidelines for Chronic Kidney Disease: Evaluation, Classification, and Stratification. Dostopno na: http://www2.kidney.org/professionals/KDOQI/guidelines_ckd/toc.htm.

2. KDIGO 2012 Clinical Practice Guideline for the Evaluation and Management of Chronic Kidney Disease. Kidney Int Suppl2013; 3: 1-150.

3. Levin A, Stevens PE. SummaryofKDIGO2012 CKD Guideline: behind the scenes, need for guidance and a framework for moving forward. Kidney Int 2014; 85:49-61.

4. Hojs R, Gorenjak M, Krsnik M et al. Presejalne metode za kronično ledvično bolezen: ocena glomerulne filtracije. ISIS 2009; 18: 44–6.

5. Lindič J, Gorenjak M, Hojs R et al. Presejalne metode za kronično ledvično bolezen: ocena proteinurije in albuminurije. ISIS 2009; 18: 42–6.

6. Slovensko združenje za klinično kemijo in laboratorijsko medicino. Ocena glomerulne filtracije. Dostopno na: http://www.szkk.si/default-30100.html.

7. Methven S1, Traynor JP, Hair MD, St J O'Reilly D, Deighan CJ, MacGregor MS. Stratifying risk in chronic kidney disease: an observational study of UK guidelines for measuring total proteinuria and albuminuria. QJM 2011; 104: 663-70.

8. Kim SS, Song SH, Kim IJ, Kim WJ, Jeon YK, Kim BH, Kwak IS, Lee EK, Kim YK. Nonalbuminuric proteinuria as a biomarker for tubular damage in early development of nephropathy with type 2 diabetic patients. Diabetes Metab Res Rev 2014; 30:736-41.

9. Methven S, MacGregor MS, Traynor JP, Hair M, O'Reilly DS, Deighan CJ. Comparison of urinary albumin and urinary total protein as predictors of patient outcomes in CKD. Am J Kidney Dis 2011; 57:21-8.

10. Chien TI, Kao JT, Liu HL, Lin PC, Hong JS, Hsieh HP, Chien MJ. Urine sediment examination: a comparison of automated urinalysis systems and manual microscopy. Clin Chim Acta. 2007; 384: 28-34.

11. Shayanfar N, Tobler U, vonEckardstein A, Bestmann L. Automated urinalysis: first experiences and a comparison between the Iris iQ200 urine microscopy system, the Sysmex UF-100 flowcytometer and manual microscopic particle counting. Clin Chem Lab Med. 2007; 45: 1251-6.

12. Fogazzi GB, Edefonti A, Garigali G, Giani M, Zolin A, Raimondi S, Mihatsch MJ, Messa P. Urine erythrocyte morphology in patients with microscopic haematuria caused by a glomerulopathy. Pediatr Nephrol 2008;23: 1093-100.

13. Fogazzi GB, Verdesca S, Garigali G. Urinalysis: core curriculum 2008. Am J Kidney Dis 2008; 51:1052-67.

14. Fogazzi GB. The value of the examination of urinary sediment in kidney transplant recepients. Dostopno na: https://www.youtube.com/watch?v=YfIbO1uPPsU.

15. Tsai JJ, Yeun JY, Kumar VA, Don BR. Comparision and interpretation of urnalysis performmed by a nephrologist versus hospital-based clinical laboratory. Am J kidney Dis 2005; 46: 820-9.

16. Verdesca S, Brambilla C, Garigali G, Croci MD, Messa P, Fogazzi GB. How a skillful (correction of skilful) and motivated urinary sediment examination can save the kidneys. Nephrol Dial Transplant. 2007; 22:1778-81.

17. Kincaid-Smith P. Haematuria and exercise-related haematuria. Br Med J (Clin Res Ed) 1982; 4: 1595-7.

18. Fogazzi GB, Grignani S. Urine microscopy analysis – an art abandoned by nephrologist. Nephrol Dial Transplant 1998; 13: 2485-7.

19. Fogazzi GB, Secchiero S, Garigali G, Plebani M. Evaluation of clinical cases in External Quality Assessment Scheme (EQAS) for the urinary sediment. Clin Chem Lab Med 2014; 52: 845-52.

110 111


Uporaba vitamina D pri zdravljenju pacientov z IgA nefropatijo

/ Use of vitamin D in the treatment of IgA nephropathy /

Joško Osredkar1, Tina Humar1, Damjan Kovač2

1Univerzitetni klinični center Ljubljana, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Zaloška cesta 2, Ljubljana2Univerzitetni klinični center Ljubljana, Interna klinika, Klinični oddelek za nefrologijo, Zaloška cesta 2, Ljubljana

Povzetek

IgA nefropatija je najpogostejša oblika primarnega glomerulonefritisa. Nastane zaradi kopičenja nepravilno glikoziliranega IgA1 v krvi in odlaganja imunskih kompleksov v glomerulih. Izraža se kot hematurija, proteinurija, nefrotski sindrom ali akutna ledvična okvara in običajno vodi v kronično ledvično bolezen. Zdravimo jo z zaviralci renin-angiotenzin-aldosteronskega sistema in kortikosteroidi.Vitamin D ima pomembno vlogo pri zmanjševanju številnih kroničnih bolezni. Aktivna oblika vitamina D (kalcitriol) značilno zmanjša proteinurijo pri IgA nefropatiji, osnovna oblika vitamina D (holekalciferol) pa učinkovito zmanjša albuminurijo pri diabetični nefropatiji in kronični ledvični bolezni. Pri bolnikih z IgA nefropatijo še ni znana učinkovitost zdravljenja s holekalciferolom na zniževanje proteinurije, kar smo v študiji želeli opredeliti.Vrednotili smo zmanjšanje ocenjene dnevne proteinurije po uvedbi holekalciferola in njeno spremembo glede na jemanje ali ne jemanje posameznega zdravila.Uspeli smo dokazati, da uvedba holekalciferola pri bolnikih z IgA nefropatijo poveča delež bolnikov, pri katerih se dnevna proteinurija zmanjša.

Ključne besede: IgA nefropatija, vitamin D, proteinurija, zdravljenje

Abstract

IgA nephropathy is the most common form of primary glomerulonephritis. The reason is the accumulation of incorrectly glycosylated IgA1 in the blood and deposition of immune complexes in the glomeruli. It is expressed as hematuria, proteinuria, nephrotic syndrome or acute renal failure, and usually leads to chronic kidney disease. It can be treated with inhibitors of the renin-angiotensin-aldosterone system and corticosteroids.Vitamin D plays an important role in reducing the number of chronic diseases. The active form of vitamin D (calcitriol) significantly reduces proteinuria in IgA nephropathy; the basic form of vitamin D (cholecalciferol) effectively reduces albuminuria in diabetic nephropathy and chronic kidney disease. In patients with IgA nephropathy is not yet known efficacy of cholekalciferol in lowering proteinuria, what we wanted to identify in the present work.We evaluated the reduction of the estimated daily proteinuria after the introduction of cholecalciferol and its amendment with respect to taking or not taking a particular drug.We have managed to prove that the introduction of cholecalciferol in patients with IgA nephropathy increases the proportion of patients in whom the daily proteinuria decreases.

Key words: IgA nephropathy, vitamin D, proteinuria, treatment

1. Uvod

1.1 IgA NEFROPATIJA

Imunoglobulin A (IgA) nefropatija je najpogostejša oblika primarnega glomerulonefritisa, vnetja ledvičnih telesc (1). Prizadene oba spola in se najpogosteje pojavi v drugem in tretjem desetletju življenja (2). Privede do končne odpovedi ledvic pri 15–20% bolnikov v 10 letih in pri 30–35% bolnikov v 20 letih od nastopa bolezni (3).

112 113


1.1.1 Etiopatogeneza IgA nefropatije

Ljudje tvorimo dva podrazreda IgA – IgA1 in IgA2. Plazmatke, povezane z respiratornim in gastrointestinalnim traktom, tvorijo tako IgA1 kot IgA2, plazmatke v kostnem mozgu, bezgavkah in vranici pa v glavnem tvorijo IgA1. Za IgA nefropatijo je značilna okvarjena O-galaktozilacija IgA1 (2), ki nastane zaradi zmanjšane aktivnosti encima β-1,3-galaktoziltransferaze in/ali prezgodnje in prekomerne sializacije N-acetilgalaktozamina, kar preprečuje dodajanje galaktoze (4,5,6).Obstaja alternativna hipoteza o vplivu infekcije na pojav IgA nefropatije. Bakterijski lipopolisaharidi na perifernih monocitih povzročajo prekomerno sintezo Tollu podobnega receptorja 4 (TLR4) (5), transmembranskega receptorja, ki prepozna sestavni del zunanje membrane Gram-negativnih bakterij (7,8). Pri razvoju in napredovanju ledvične poškodbe sodelujejo številni citokini in rastni dejavniki (2) in levkotrieni (9).

1.1.2 Klinično izražanje IgA nefropatije

Makroskopska hematurijaPojavi se pri 40–50% bolnikov z IgA nefropatijo. Hematurijo ponavadi opazijo bolniki v 24 urah od pojava simptomov infekcije zgornjih dihal. Urin je prej rjav kot rdeč in običajno ni strdkov.

Asimptomatska hematurija in proteinurijaBolniki z IgA nefropatijo so večinoma asimptomatski in jih lahko odkrijemo s presejalnim testiranjem urina. Pri tem ugotovimo mikroskopsko hematurijo z ali brez proteinurije.

Proteinurija in nefrotski sindromProteinurija se redko pojavi brez mikroskopske hematurije. Nefrotski sindrom se izrazi pri 5% bolnikov z IgA nefropatijo.

Akutna ledvična okvaraPri bolnikih z IgA nefropatijo je zelo redka (<5%) (10), čeprav se lahko pojavi pri do 27% bolnikov, starejših od 65 let (11).

Kronična ledvična bolezenIgA nefropatija pri velikem deležu bolnikov napreduje v kronično ledvično bolezen. Pri približno eni tretjini bolnikov je sicer možna tudi spontana

remisija bolezni. Poleg tega je pri 5% bolnikov z IgA nefropatijo prisotna tudi pospešena hipertenzija (10,11).

1.1.3 Zdravljenje IgA nefropatije

Proteinurija je najpomembnejši napovedovalec napredovanja ledvične okvare in dober prognostični označevalec. Pri bolnikih s proteinurijo nad 1 g/dan bolezen pogosteje napreduje do končne odpovedi ledvic, zato je cilj zdravljenja zmanjšati proteinurijo pod 1 g/dan. Zdravljenje bolezni je običajno najprej neimunološko in če to ni dovolj učinkovito, sledi imunološko zdravljenje. Druge oblike zdravljenja so mikofenolat (MMF), ribje olje, tonzilektomija (odstranitev mandljev), antitrombotiki, ciklosporin in rituksimab (12).

1.2 Proteinurija

1.2.1 Opredelitev albuminurije in proteinurije

Glomeruli s filtriranjem krvi proizvajajo primarni urin. Pri tem zadržijo večje proteine, vključno z večino serumskega albumina. Proteini z molekulsko maso pod 60 kDa prosto prehajajo skozi glomerulno bazalno membrano in so aktivno reabsorbirani iz tubulnega lumna. Vrsta proteinov, izločenih v urin, je odvisna od vzroka ledvične bolezni. Izločanje albumina je bolj pogosto pri glomerulni, diabetični ali hipertenzivni ledvični bolezni, nizko molekularni proteini pa so pogosto tubulointersticijskega izvora (13).Albuminurijo določimo s preiskavo razmerja albumin/kreatinin v drugem jutranjem vzorcu urina (14). Izločanje kreatinina je konstantno in ni odvisno od volumna urina, zato albumin/kreatinin razmerje ocenjuje dnevno izločanje albumina (13). Če je albuminurija večja kot 150 mg dnevno, je že v območju proteinurije. Bolezensko proteinurijo določimo z analizo celokupnih proteinov v drugem jutranjem vzorcu urina. S pomočjo določitve kreatinina podamo rezultat kot razmerje proteini/kreatinin [g/mol]. To razmerje lahko pomnožimo s povprečnim dnevnim izločanjem kreatinina, ki je približno 8,8 mmol/dan/1,73 m2 telesne površine (1000 mg/dan/1,73 m2), in dobimo ocenjeno dnevno proteinurijo [g/dan/1,73 m2]. Proteinurijo delimo na blago (150 mg do 1 g

114 115


proteinov v 24-urnem urinu), zmerno (1–3 g proteinov v 24-urnem urinu) in nefrotsko (nad 3 g proteinov v 24-urnem urinu ali nad 3,5 g/dan/1,73 m2) (14).

1.2.2 Mehanizmi proteinurije

Glomerulno filtracijsko bariero sestavljajo 3 plasti – endotelij z glikokaliksom, glomerulna bazalna membrana in podociti (glomerulne epitelijske celice) – ki prispevajo k prepustnosti albumina. Povečana glomerulna prepustnost nastane zaradi okvar v glomerulni barieri ali povečanega filtracijskega tlaka (13). Prehod proteinov ovirajo tudi podociti. Prekomerni oksidativni stres sproži poškodbo podocitov, kar vodi do proteinurije (15).

1.2.3 Škodljivo delovanje proteinurije

Proteini v urinu spodbujajo izražanje vnetnih in fibroznih mediatorjev in tako povzročajo intersticijsko vnetje in fibrozo. Proteinurija je dejavnik tveganja napredovanja kronične ledvične bolezni, ledvične odpovedi in srčno-žilnih dogodkov, zato je zmanjšanje proteinurije ali albuminurije terapevtska tarča za kronično ledvično bolezen (16).

1.2.4 Zniževanje proteinurije

Povečana proteinurija je povezana s hitrejšo izgubo ledvične funkcije, zato postane njeno zmanjšanje pomemben cilj zdravljenja ledvične proteinurične bolezni (17). Čim bolj znižamo proteinurijo, tem boljša je prognoza napredovanja kronične ledvične bolezni in nastopa ledvične odpovedi. Od vseh antihipertenzivnih zdravil so zdravila, ki vplivajo na renin-angiotenzin-aldosteronski sistem, najbolj znana po antiproteinuričnem učinku (18). Drugi antiproteinurični ukrepi, ki nimajo vpliva na krvni tlak, so nizko-proteinske diete (18) in nekirurška izguba telesne teže pri prekomerno prehranjenih bolnikih (19).Kortikosteroidno zdravljenje je učinkovito pri zmanjšanju proteinurije (20).

1.3 Vitamin D

Vitamin D3 nastaja v koži. Sončno ultravijolično B sevanje pretvori 7-dehidroholesterol v previtamin D3, ki se s toploto hitro pretvori v vitamin D3. Vitamin D iz kože in prehrane se v jetrih presnovi v 25-hidroksivitamin D [25(OH)D], ki se v obtoku kompleksira z vezavnim proteinom za vitamin D (DBP). 25(OH)D–DBP kompleks se filtrira v glomerulih in nato reabsorbira preko megalin-posredovane endocitoze v proksimalnih tubulih, pri čemer ledvična 1α-hidroksilaza pretvori 25(OH)D v 1,25-dihidroksivitamin D [1,25(OH)2D] (16,21).Hormonska oblika vitamina D, 1,25(OH)2D, povzroča mineralizacijo okostja in poveča serumski koncentraciji kalcija in fosforja z absorpcijo kalcija in fosfata v prebavilih, mobilizacijo kalcija iz kosti in reabsorpcijo kalcija v distalnih ledvičnih tubulih. Vitamin D hormon deluje preko vitamin D receptorja, ki se nahaja v enterocitih, osteoblastih in celicah distalnega ledvičnega tubula. Inhibira sintezo renina, povečuje miokardno kontraktilnost (21) in ima pomemben vpliv na imunski sistem (22).

1.3.1 Pomanjkanje vitamina D

Pomanjkanje vitamina D je opredeljeno kot serumska raven 25(OH)D manj kot 50 nmol/L. Raven 52–72 nmol/L 25(OH)D kaže insuficienco vitamina D in raven nad 75 nmol/L predstavlja zadostno količino vitamina D. Zastrupitev z vitaminom D je redka.Pomanjkanje vitamina D ogroža mineralizacijo kosti.Bolniki s kronično ledvično boleznijo imajo pogosto pomanjkanje 25(OH)D. Ob napredovanju kronične ledvične bolezni se zmanjša aktivnost ledvične 1α-hidroksilaze, kar vodi v pomanjkanje 1,25(OH)2D (23).

1.3.2 Renoprotektivno delovanje vitamina D

Aktivna oblika vitamina D deluje renoprotektivno preko receptorja za vitamin D (VDR) z regulacijo renin-angiotenzin-aldosteronskega sistema. Kronična ledvična bolezen in pomanjkanje vitamina D aktivirata lokalni renin-angiotenzin-aldosteronski sistem v ledvicah, kar poveča lokalno koncentracijo

116 117


angiotenzina II, ki spodbuja ledvično poškodbo. Vitamin D zavira izražanje renina. Kombinirano zdravljenje z RAAS zaviralci in vitaminom D ima dodatne terapevtske učinke pri zmanjšanju ledvične poškodbe in proteinurije, ker vitamin D blokira kompenzacijsko indukcijo renina, ki jo povzročajo RAAS zaviralci (16). Vitamin D lahko zmanjša proteinurijo z učinki na citokine (9). Zmanjša izražanje vnetnih in profibroznih citokinov in tako izboljša ledvično poškodbo (24).

1.3.3 Kalcitriol in holekalciferol

Zdravljenje s kalcitriolom, aktivno obliko vitamina D, je značilno zmanjšalo proteinurijo in serumsko raven TGF-β pri bolnikih z IgA nefropatijo preko inhibicije renin-angiotenzin-aldosteronskega sistema. Terapija s holekalciferolom je učinkovito zmanjšala albuminurijo tudi pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz 3–4, ki so imeli nizke ravni 25(OH)D in visoke ravni parathormona (25).

2. Namen študije

Namen študije je bil opredeliti učinkovitost zdravljenja s holekalciferolom na zniževanje proteinurije pri bolnikih z IgA nefropatijo.Z raziskavo smo želeli preveriti hipotezo, da zdravljenje s holekalciferolom zmanjša proteinurijo pri bolnikih z IgA nefropatijo.Z raziskavo smo želeli tudi preveriti:• spremembo proteinurije glede na jemanje ali ne jemanje ACE zaviralca,

blokatorja angiotenzinskega II receptorja (sartana), zaviralca renina (aliskirena), kalcitriola in holekalciferola,

• statistično značilnost sprememb parametrov po uvedbi holekalciferola – ocenjene dnevne proteinurije, razmerij proteinov, eritrocitov in levkocitov v urinu, koncentracij albumina in kreatinina v serumu, ocenjene glomerulne filtracije, serumskih koncentracij vitamina D, korigiranega kalcija in fosfata, ter telesne teže in krvnega tlaka,

• korelacije serumske koncentracije vitamina D z ocenjeno glomerulno filtracijo, ocenjeno dnevno proteinurijo, razmerji proteinov, eritrociti in levkociti v urinu, koncentracijami albumina, kreatinina, korigiranega kalcija in fosfata v serumu, telesno težo, indeksom telesne mase in krvnim tlakom,

• korelacijo krvnega tlaka z ocenjeno dnevno proteinurijo, korelacije starosti s krvnim tlakom, ocenjeno glomerulno filtracijo in ocenjeno dnevno proteinurijo.

3. Materiali in metode

Podatki o preiskovani populacijiV študijo smo vključili 18 bolnikov, ki se zdravijo na kliničnem oddelku za nefrologijo Interne klinike Univerzitetnega kliničnega centra v Ljubljani. Skupina je bila sestavljena iz 14 moških in 4 žensk, s poprečno starostjo 47.06 let, standardno deviacijo 10.08 in razponom med 25 in 66 let.

Uporabljene laboratorijske metodeVse laboratorijske določitve biološkega materiala smo izvedli s priporočenimi metodami na Kliničnem inštitutu za klinično kemijo in biokemijo UKC Ljubljana.

4. Rezultati in razprava

4.1 Vrednosti proteinurije pred in po uvedbi holekalciferola

Preglednica 1. Povečanje/zmanjšanje ocenjene dnevne proteinurije po uvedbi holekalciferola.Table 1. Increase/decrease in the estimated daily proteinuria after the introduction of cholecalciferol

BolnikoDP [g/d/1,73]

pred po razlika

12 3,835 6,873 3,038

17 3,643 4,657 1,014

4 0,567 1,195 0,628

5 0,329 0,509 0,180

*tabela se nadaljuje na naslednji strani

118 119


BolnikoDP [g/d/1,73]

pred po razlika

1 1,940 2,036 0,096

18 0,408 0,413 0,005

14 0,952 0,854 -0,098

11 2,881 2,616 -0,265

13 0,489 0,221 -0,268

2 0,880 0,586 -0,294

3 1,018 0,666 -0,352

10 1,428 0,968 -0,460

7 0,727 0,099 -0,628

15 1,215 0,552 -0,663

6 2,590 1,905 -0,685

16 0,971 0,264 -0,707

9 2,964 1,509 -1,455

Slika 1. Povečanje/zmanjšanje ocenjene dnevne proteinurije po uvedbi holekalciferola.Figure 1. Increase/decrease in the estimated daily proteinuria after the introduction of cholecalciferol

4.2 Vrednosti proteinurije glede na jemanje zdravil

Preglednica 2. Odmerki zdravil in ocenjena dnevna proteinurija bolnikov ob petih pregledih.Table 2. Doses of drugs and estimated daily proteinuria of patients at five inspections.

boln

ik

t

ACE

sart

an

alis

kire

n

kalc

itri

ol

hole

kalc

ifero

l

oDP

boln

ik

t

ACE

sart

an

alis

kire

n

kalc

itri

ol

hole

kalc

ifero

l

oDP

mg mg mg μgšt. kpl/teden

g/d/1,73 mg mg mg μgšt. kpl/teden

g/d/1,73

1 -2 0 100 0 0 0 2,703 10 -2 10 100 0 0 0 1,320

1 -1 0 0 0 0 0 1,964 10 -1 10 100 0 0 0 1,438

1 0 0 0 0 0 0 1,153 10 0 8,49 100 0 0 0 1,525

1 1 0 0 0 0 35 0,655 10 1 8,49 0 0 0 15 0,985

1 2 2 0 0 0 35 3,416 10 2 8,49 0 0 0 15 0,950

2 -2 4 0 0 0 0 1,261 11 -2 40 0 0 0 0 2,573

2 -1 0 80 0 0 0 0,381 11 -1 30 0 0 0 0 3,538

2 0 0 80 0 0 0 0,997 11 0 30 0 0 0,25 0 2,531

2 1 0 80 0 0 35 0,732 11 1 30 0 0 0,25 35 2,414

2 2 0 80 0 0 35 0,440 11 2 30 0 0 0,25 35 2,817

3 -2 12 -2

3 -1 12 -1 20 0 0 0 0 3,091

3 0 0 0 0 0 0 1,018 12 0 20 0 0 0 0 4,578

3 1 0 40 0 0 35 0,279 12 1 20 0 0 0,125 70 6,909

3 2 0 40 0 0 35 1,053 12 2 20 0 0 0,125 70 6,836

4 -2 13 -2

4 -1 0 80 0 0 0 0,676 13 -1

4 0 0 80 0 0 0 0,457 13 0 0 120 0 0 0 0,489

4 1 0 80 0 0 35 1,881 13 1 0 120 0 0 35 0,330

4 2 0 160 0 0 35 0,509 13 2 0 120 0 0 35 0,112

5 -2 14 -2 0 160 150 0 0 0,857

5 -1 20 50 0 0 0 0,368 14 -1 0 160 150 0 0 1,580

5 0 20 50 0 0 0 0,290 14 0 0 160 150 0 0 0,418

5 1 20 50 0 0 35 0,237 14 1 0 160 150 0 35 0,999

5 2 0 50 0 0 35 0,780 14 2 0 160 150 0 35 0,708

6 -2 15 -2 0 80 0 0 0 1,305

6 -1 5 0 0 0 0 2,827 15 -1 0 160 0 0 0 1,390

*tabela se nadaljuje na naslednji strani

120 121

7. Jesenovčevi dnevi Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine 7. Jesenovčevi dnevi Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicinebo

lnik

t

ACE

sart

an

alis

kire

n

kalc

itri

ol

hole

kalc

ifero

l

oDP

boln

ik

t

ACE

sart

an

alis

kire

n

kalc

itri

ol

hole

kalc

ifero

l

oDP

mg mg mg μgšt. kpl/teden

g/d/1,73 mg mg mg μgšt. kpl/teden

g/d/1,73

6 0 5 0 0 0 0 2,352 15 0 0 160 0 0 0 0,950

6 1 5 0 0 0 35 1,084 15 1 0 160 150 0 35 0,414

6 2 5 0 0 0 35 2,725 15 2 0 160 150 0 35 0,689

7 -2 16 -2 2 0 0 0 0 1,159

7 -1 0 40 0 0 0 1,309 16 -1 4 0 0 0 0 1,159

7 0 0 80 0 0 0 0,145 16 0 8 0 0 0 0 0,594

7 1 0 80 0 0 35 0,099 16 1 8 0 0 0 35 0,430

7 2 16 2 8 0 0 0 35 0,098

8 -2 40 0 0 0 0 11,784 17 -2 0 0 0 0 0 4,336

8 -1 40 0 0 0 0 4,653 17 -1 0 0 0 0 0 3,578

8 0 0 0 0 0 0 3,081 17 0 5 0 0 0 0 3,015

8 1 17 1 3,4 0 0 0 35 5,644

8 2 17 2 3,4 0 0 0 35 3,669

9 -2 18 -2 5 0 0 0 0 0,502

9 -1 18 -1 7,5 0 0 0 0 0,313

9 0 0 50 0 0 0 2,964 18 0

9 1 4,5 0 0 0 35 1,040 18 1

9 2 4,5 0 0 0 35 1,978 18 2 10 0 0 0 35 0,413

Zapis časa pred, ob in po uvedbi holekalciferola smo prekodirali v -2 za 2. pregled pred uvedbo, -1 za 1. pregled pred uvedbo, 0 za pregled ob uvedbi, 1 za 1. pregled po uvedbi in 2 za 2. pregled po uvedbi. Prazna polja pomenijo, da pri posameznem bolniku ni bilo podatka o določenem pregledu ali zgolj ni bilo podatka o dnevni proteinuriji.Recording time before, during and after the introduction of cholecalciferol are transcoded to -2 for the second review before, -1 for the first review prior to the introduction, 0 for the check at the introduction, 1 for the first review after the introduction and 2 for the second review after the introduction. Empty fields mean that an individual patient has not been given information on the review, or simply there was no data on a daily proteinuria

Preglednica 3. Rezultati regresije s fiksnimi učinki.Table 3. Results of regression with fixed effects

122 123


4.3 Vrednosti parametrov pred in po uvedbi holekalciferola

Preglednica 4. Vrednosti biokemičnih parametrov, meritev krvnega tlaka in telesne teže pred in po uvedbi holekalciferola, standardna deviacija in statistika (parni t-test).Table 4. The values, standard deviation and statistics (paired t-test), of the biochemical parameters, measurement of blood pressure and body weight before and after the introduction of cholecalciferol.

povprečna vrednost

standardni odklon P-vrednost

parameter enote pred po pred po

oDP g/d/1,73 1,58 1,52 1,16 1,79 0,8226

U-IgG/albumin 0,04 0,05 0,02 0,02 0,3506

U-albumin/kreatinin

g/mol 134,63 132,01 102,36 158,12 0,9398

U-IgG/kreatinin g/mol 5,39 8,16 5,49 16,29 0,5056

U-NAG/kreatinin μkat/mol 6,26 12,89 2,12 12,12 0,1443

U-α1-mikroglobulin/

kreatining/mol 2,63 3,13 1,61 2,71 0,4980

U-eritrociti (SW) 10^6/L 123,82 46,41 319,56 75,17 0,2966

U-levkociti (SW) 10^6/L 31,53 14,41 106,21 40,49 0,3004

S-albumin g/L 40,94 42,78 3,80 3,99 0,0086

S-kreatinin μmol/L 189,11 206,44 143,18 178,81 0,1245

oGFmL/

min/1,7343,67 43,28 21,51 24,82 0,8813

S-25(OH)D3 nmol/L 40,50 65,00 17,62 27,25 0,0164

S-korigirani kalcij mmol/L 2,31 2,31 0,11 0,10 0,8502

S-fosfat mmol/L 1,13 1,11 0,25 0,20 0,7368

telesna teža kg 82,83 81,88 18,57 18,22 0,2763

sistolni krvni tlak AMB

mmHg 139,50 136,33 16,44 15,40 0,3330

diastolni krvni tlak AMB

mmHg 84,50 85,28 9,13 10,14 0,7023

4.4 Vrednosti korelacij med parametri

Preglednica 5. Korelacijski koeficienti med posameznimi parametri.Table 5. Correlation coefficients between parameters.

parameter a parameter b korel. koef.

S-25(OH)D3 pred oGF pred 0,1755

S-25(OH)D3 pred oDP pred -0,1551

S-25(OH)D3 pred U-IgG/albumin pred -0,0592

S-25(OH)D3 pred U-albumin/kreatin in pred -0,1474

S-25(OH)D3 pred U-IgG/ kreatin in pred 0,1008

S-25(OH)D3 pred U-NAG/ kreatin in pred -0,0762

S-25(OH)D3 pred U-α1 mikroglobulin/ kreatin in pred -0,1819

S-25(OH)D3 pred U-eritrociti (SW) pred -0,1086

S-25(OH)D3 pred U-levkociti (SW) pred -0,1143

S-25(OH)D3 pred S-albumin pred 0,1876

S-25(OH)D3 pred S-kreatin in pred -0,0277

S-25(OH)D3 pred S-korigirani kalcij pred -0,0729

S-25(OH)D3 pred S-fosfat pred 0,1857

S-25(OH)D3 pred telesna teža pred -0,1412

S-25(OH)D3 pred ITM -0,2223

S-25(OH)D3 pred sistolni krvni tlak AMB pred -0,0406

S-25(OH)D3 pred diastolni krvni tlak AMB pred -0,0396

oDP pred sistolni krvni tlak AMB pred 0,4721

oDP pred diastolni krvni tlak AMB pred 0,3919

oDP po sistolni krvni tlak AMB po 0,3769

oDP po diastolni krvni tlak AMB po 0,3705

starost sistolni krvni tlak AMB pred -0,1070

starost diastolni krvni tlak AMB pred -0,1652

starost oGF pred -0,1761

starost oDP pred -0,1671

124 125


4.1 Vrednotenje proteinurije

Po uvedbi holekalciferola se je ocenjena dnevna proteinurija 6 bolnikom povečala, 11 bolnikom pa zmanjšala (Preglednica 1, Slika 1). Uvedba holekalciferola torej vpliva na delež bolnikov, ki se jim je ocenjena dnevna proteinurija zmanjšala. Zato lahko trdimo, da holekalciferol značilno poveča delež bolnikov, pri katerih pride do zmanjšanja proteinurije. Ti rezultati so v skladu z antiproteinuričnim delovanjem vitamina D (9, 16, 24). Podobno je pri bolnikih z diabetično nefropatijo in bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz 3–4 holekalciferol statistično značilno zmanjšal razmerje albumin/kreatinin v urinu (24, 25). Antiproteinurične učinke holekalciferola nam potrjujejo tudi blago negativne korelacije serumske koncentracije vitamina D z ocenjeno dnevno proteinurijo in razmerji proteinov v urinu, razen za razmerje IgG/kreatinin, kjer smo lahko zaradi majhnega števila bolnikov dobili šibko pozitivno korelacijo (Preglednica 5).Na delež bolnikov, ki se jim je proteinurija zmanjšala, so lahko poleg holekalciferola vplivala tudi druga zdravila in spremembe njihovih odmerkov. Pri vrednotenju antiproteinuričnega učinka holekalciferola smo želeli izključiti vpliv ACE zaviralca, sartana, aliskirena in kalcitriola na proteinurijo. V ta namen smo naredili regresijo s fiksnimi učinki po bolnikih. Izračunani regresijski koeficienti (Preglednica 3) za ACE zaviralec, sartan, kalcitriol in holekalciferol so pozitivni (β = 0,0711 za ACE zaviralec, β = 0,0014 za sartan, β = 3,5095 za kalcitriol in β = 0,0255 za holekalciferol) in čeprav niso statistično značilni (P-vrednosti > 0,05), so ti rezultati v nasprotju s pričakovanim delovanjem teh zdravil na zmanjšanje proteinurije. Vzroka za takšne rezultate sta lahko majhen vzorec bolnikov in njihova heterogenost. Bolniki, ki so imeli bolj izraženo bolezen in višjo dnevno proteinurijo, so namreč dobili večji odmerek zdravil. Poleg tega sta kalcitriol prejemala samo 2 bolnika, zaradi česar rezultat ni relevanten. Regresijski koeficient za aliskiren pa je statistično značilno negativen (β = –0,0044, P-vrednost [0,007] < 0,05), čeprav sta zdravilo prav tako prejemala samo 2 bolnika. Tudi časovni trend je značilno negativen (β = –0,3733, P-vrednost [0,025] < 0,05), kar nam potrjuje, da zdravljenje z vsemi zdravili vpliva na zniževanje proteinurije. Da bi izključili vpliv drugih zdravil od učinka holekalciferola, pa bi morali v raziskavo vključiti večje število bolnikov s podobno stopnjo proteinurije, ki bi jih razdelili v holekalciferolno in kontrolno skupino.

4.2 Vrednotenje ostalih parametrov

V Sloveniji je pri odrasli populaciji referenčna vrednost za S-25(OH)D3 50–107 nmol/L (pomladi) in 114–172 nmol/L (jeseni) (26). Vrednosti koncentracij S-25(OH)D3 so bile pred uvedbo holekalciferola v območju 18–77 nmol/L, kar predstavlja pomanjkanje ali insuficienco vitamina D. Spremembo koncentracije S-25(OH)D3 po uvedbi holekalciferola pa bomo vrednotili v nadaljevanju.Pri bolnikih z IgA nefropatijo se je koncentracija S-25(OH)D3 po uvedbi holekalciferola statistično značilno povečala (P-vrednost [0,0164] < 0,05). Pri bolnikih z diabetično nefropatijo in bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz 3–4 se je podobno serumska koncentracija vitamina D izboljšala z dopolnjevanjem holekalciferola (24, 25). Vitamin D povečuje koncentracijo kalcija in fosfata v serumu (22). Korelacija koncentracije S-25(OH)D3 s koncentracijo S-fosfata (r = 0,1857) je v skladu z delovanjem vitamina D, za koncentracijo S-korigiranega kalcija (r = –0,0729) pa smo pričakovali pozitivno korelacijo. Pri naših bolnikih sta koncentraciji S-korigiranega kalcija in S-fosfata po uvedbi holekalciferola v povprečju ostali enaki. Spremembi seveda nista statistično značilni (P-vrednosti [0,8502 in 0,7368] > 0,05). V raziskavi bolnikov z diabetično nefropatijo holekalciferol prav tako ni imel vpliva na serumski koncentraciji korigiranega kalcija in fosfata (24). V raziskavi bolnikov s kronično ledvično boleznijo faz 3–4 tudi niso potrdili korelacij serumske koncentracije vitamina D s koncentracijama S-korigiranega kalcija in S-fosfata (25). Pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz 3–4 pa so v holekalciferolni skupini opazili značilen dvig fosfata in kalcij–fosfat produkta (25).Vitamin D vpliva ugodno na ledvično delovanje (zmanjša vnetje in glomerulosklerozo, poveča sintezo nefrina) (9, 16), s tem se zmanjša izguba albumina v urin in lahko izboljša očistek kreatinina. Po uvedbi holekalciferola smo opazili statistično značilno povečanje koncentracije S-albumina (P-vrednost [0,0086] < 0,05), koncentracija S-kreatinina pa se ni statistično značilno spremenila (P-vrednost [0,1245] > 0,05). Učinek holekalciferola na albumin in kreatinin v serumu nam nakazujeta tudi pozitivna korelacija koncentracije S-25(OH)D3 s koncentracijo S-albumina (r = 0,1876) in negativna korelacija koncentracije S-25(OH)D3 s koncentracijo S-kreatinina (r = –0,0277). Korelacija koncentracije S-25(OH)D3 z ocenjeno glomerulno filtracijo je sicer šibko pozitivna (r = 0,1755), a bolnikom se je glomerulna filtracija zelo malo zmanjšala, njena sprememba ni statistično značilna (P-vrednost [0,8813] > 0,05). Z našo raziskavo torej nismo potrdili renoprotektivnega učinka

126 127


holekalciferola. Podobno so pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz 3–4 po terapiji holekalciferola opazili neznačilno zmanjšanje glomerulne filtracije tako v holekalciferolni kot v kontrolni skupini (25), pri bolnikih z diabetično nefropatijo pa holekalciferol ni imel vpliva na ledvično funkcijo (24).Korelaciji koncentracije S-25(OH)D3 z U-eritrociti (SW) in U-levkociti (SW) pa sta blago negativni (r = –0,1086 za eritrocite in r = –0,1143 za levkocite v urinu). Po uvedbi holekalciferola sta se številčni koncentraciji eritrocitov in levkocitov v urinu v povprečju zmanjšali, vendar zaradi velikih standardnih odklonov med bolniki spremembi nista statistično značilni (P-vrednosti [0,2966 in 0,3004] > 0,05). Spremembi v eritrocituriji in levkocituriji tako nista vplivali na zmanjšanje proteinurije, je pa sicer neznačilno zmanjšanje eritrociturije lahko povezano z zmanjšanjem vnetja zaradi učinka holekalciferola.Za zmanjšanje proteinurije bi bilo ugodno tudi zmanjšanje telesne teže in krvnega tlaka (13, 19). Korelacije koncentracije S-25(OH)D3 s telesno težo, indeksom telesne mase, sistolnim in diastolnim krvnim tlakom so sicer blago negativne (korelacijski koeficienti so –0,1412, –0,2223, –0,0406 in –0,0396), vendar nismo pričakovali, da bo holekalciferol vplival na telesno težo in krvni tlak. Zmanjšanje telesne teže po uvedbi holekalciferola namreč ni bilo statistično značilno (P-vrednost [0,2763] > 0,05). Sistolni krvni tlak se je po uvedbi holekalciferola v povprečju zelo malo zmanjšal, diastolni krvni tlak pa celo povečal. Spremembi nista statistično značilni (P-vrednosti [0,3330 in 0,7023] > 0,05). S tem smo izključili vpliv telesne teže in krvnega tlaka na spremembo proteinurije. Pri bolnikih z diabetično nefropatijo po zdravljenju s holekalciferolom podobno niso opazili sprememb krvnega tlaka (24), pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo faz 3–4 pa prav tako ni bilo sprememb telesne teže in krvnega tlaka (25).Povečanje krvnega tlaka lahko vpliva na povečanje proteinurije (13). To povezavo smo potrdili s srednje močno pozitivnimi korelacijami krvnega tlaka s proteinurijo (korelacijska koeficienta sistolnega in diastolnega krvnega tlaka z ocenjeno dnevno proteinurijo [oDP] pred uvedbo holekalciferola sta 0,4721 in 0,3919, korelacijska koeficienta sistolnega in diastolnega krvnega tlaka z oDP po uvedbi pa sta 0,3769 in 0,3705). S starostjo se povečuje krvni tlak in slabša ledvična funkcija, s tem se poveča tudi proteinurija (27,28). Izračunane korelacije starosti s sistolnim in diastolnim krvnim tlakom ter ocenjeno glomerulno filtracijo [oGF] in ocenjeno dnevno proteinurijo so šibko negativne – korelacija starosti z oGF je pravilno negativna (r = –0,1761), ostale korelacije pa so v nasprotju s pričakovanji (r = –0,1671 za oDP, r = –0,1070 za sistolni in r = –0,1652 za diastolni krvni tlak).

5. Sklep

Bolnikom z IgA nefropatijo se je z dopolnjevanjem vitamina D v obliki holekalciferola zvečala serumska koncentracija vitamina D. Z raziskavo smo dokazali, da zdravljenje bolnikov z IgA nefropatijo s holekalciferolom poveča delež bolnikov, pri katerih pride do zmanjšanja proteinurije. Antiproteinurične učinke holekalciferola nam potrjujejo tudi negativne korelacije serumske koncentracije vitamina D z ocenjeno dnevno proteinurijo in razmerji proteinov v urinu. S korelacijo krvnega tlaka z ocenjeno dnevno proteinurijo pa smo potrdili povečanje proteinurije zaradi večjega krvnega tlaka, kar potrjuje dosedanje ugotovitve, da je pri terapiji IgA nefropatije zelo pomembna ureditev arterijskega krvnega tlaka.

Literatura

1. Ferluga D, Vizjak A. Histopatologija in patogeneza glomerulonefritisa. Medicinski razgledi 2005; 44: 265–290.

2. Donadio JV, Grande JP. IgA Nephropathy. N Engl J Med 2002; 347: 738–748.3. Szeto CC, Chow KM, Kwan BC, Chung KY, Leung CB, Li PK. Oral calcitriol for the

treatment of persistent proteinuria in immunoglobulin A nephropathy: an uncontrolled trial. Am J Kidney Dis 2008; 51: 724–31.

4. Yano N, Endoh M, Miyazaki M, Yamauchi F, Nomoto Y, Sakai H. Altered production of IgE and IgA induced by IL-4 in peripheral blood mononuclear cells from patients with IgA nephropathy. Clin Exp Immunol 1992; 88: 295–300.

5. Floege J. The pathogenesis of IgA nephropathy: What is new and how does it change therapeutic approaches? Am J Kidney Dis 2011; 58(6): 992–1004.

6. Glassock RJ. The pathogenesis of IgA nephropathy. Curr Opin Nephrol Hypertens 2011; 20: 153–160.

7. Akira S, Hemmi H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunology Letters 2003; 85: 85–95.

8. Ju T, Cummings RD. A unique molecular chaperone Cosmc required for activity of the mammalian core 1 β3-galactosyltransferase. Stuart A. Kornfeld, Washington University School of Medicine, St. Louis, 2002; 99: 16613–16618.

9. Shin JI, Lee JS. The beneficial effect of oral calcitriol treatment on proteinuria in IgA nephropathy: another point of view. Am J Kidney Dis 2008; 52: 804–5.

10. Feehally J, Floege J. IgA nephropathy and Henoch-Schönlein nephritis. In: Floege J, Johnson RJ, Feehally J, eds.: Comprehensive clinical nephrology, 4th ed., St. Luis, Elsevier Saunders, 2010; 270–81.

11. Rivera F, Lopez-Gomez JM, Perez-Brea MF, et al. Clinicopathologic correlations of renal pathology in Spain. Kidney Int 2004; 66: 898–904.

12. Pozzi C. Current treatment of IgA nephropathy. 5. slovenski nefrološki kongres z mednarodno udeležbo, Univerzitetna knjižnica Maribor, Ljubljana, 2012; 52–54.

128 129


13. Gorriz JL, Martinez-Castelao A. Proteinuria: detection and role in native renal disease progression. Transplant Rev (Orlando) 2012; 26: 3–13.

14. Lindič J. Pregled seča. V: Kovač D, Lindič J, Malovrh M, Pajek J, ur.: Bolezni ledvic, 2. izdaja, Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana, 2009; 19–35.

15. Chen S, Meng X-F, Zhang C. Role of NADPH oxidase-mediated reactive oxygen species in podocyte injury. BioMed Research International 2013; ID 839761.

16. Li YC: Vitamin D. roles in renal and cardiovascular protection. Curr Opin Nephrol Hypertens 2012; 21: 72–79.

17. Liu LJ, Lv JC, Shi SF, Chen YQ, Zhang H, Wang HY. Oral calcitriol for reduction of proteinuria in patients with IgA nephropathy: a randomized controlled trial. Am J Kidney Dis 2012; 59: 67–74.

18. de Zeeuw D. Targeting proteinuria as a valid surrogate for individualized kidney protective therapy. Am J Kidney Dis 2008; 51: 713–716.

19. Floege J, Eitner F. Current therapy for IgA nephropathy. J Am Soc Nephrol 2011; 22: 1785–94.20. Pozzi C, Bolasco PG, Fogazzi GB, et al. Corticosteroids in IgA nephropathy: A randomized

controlled trial. Lancet 1999; 353: 883–887.21. Holick MF. Vitamin D deficiency. N Engl J Med 2007; 357: 266–81.22. DeLuca HF. Overview of general physiologic features and functions of vitamin D. Am

J Clin Nutr 2004; 80: Suppl: 1689S–96S.23. Matias P, Ferreira A. 25-hydroxyvitamin D and chronic kidney disease. Port J Nephrol

Hypert 2011; 25(4): 253–261.24. Kim MJ, Frankel AH, Donaldson M, Darch SJ, Pusey CD, Hill PD, Mayr M, Tam FWK.

Oral cholecalciferol decreases albuminuria and urinary TGF-β1 in patients with type 2 diabetic nephropathy on established renin-angiotensin-aldosterone system inhibition. Kidney Int 2011; 80: 851–60.

25. Molina P, et al. The effect of cholecalciferol for lowering albuminuria in chronic kidney disease: a prospective controlled study. Nephrol Dial Transplant 2014; 29: 109–118.

26. Osredkar J, Marc J. Vitamin D in presnovki: fiziologija, patofiziologija in referenčne vrednosti. Medicinski razgledi 1996; 35: 543–565.

27. Lindič J. Preiskave ledvičnega delovanja. V: Kovač D, Lindič J, Malovrh M, Pajek J, ur.: Bolezni ledvic, 2. izdaja, Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana, 2009; 9–17.

28. Hitij JB. Primarna arterijska hipertenzija. V: Kovač D, Lindič J, Malovrh M, Pajek J, ur.: Bolezni ledvic, 2. izdaja, Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana, 2009; 225–232.

130 131


Mikroskopski pregled sedimenta seča

/ Microscopic examination of urine sediment /

Mateja ŠterUniverzitetni klinični center Ljubljana, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Njegoševa 4, 1000 Ljubljana

Povzetek

Mikroskopski pregled sedimenta seča je preiskava, katere začetki segajo daleč v zgodovino in je danes še vedno ena od najpogosteje izvajanih analiz bioloških vzorcev. Odvzem vzorca seča in priprava sedimenta seča morata biti izvedena po standardiziranih postopkih, pregled sedimenta seča pa je priporočljivo izvesti s fazno-kontrastnim mikroskopom. Sestavine prisotne v sedimentu seča so lahko zelo številne in raznolike: hematopoetske in epitelijske celice, lipidi, cilindri, sluz, kristali ter kontaminanti in artefakti. Celice so lahko prisotne v značilnih morfoloških oblikah ali pa so spremenjene zaradi različnih pogojev, lastnosti seča, staranja vzorca, priprave vzorca ali zaradi bolezenskih stanj. Značilne spremembe sedimenta seča so povezane z različnimi boleznimi, predvsem ledvic in sečnih poti. Dobro prepoznavanje normalnih, bolezensko spremenjenih celic in raznih patoloških najdb v sedimentu seča je še vedno osnoven in zanesljiv način odkrivanja in spremljanja bolezni ledvic in sečnih poti.

Ključne besede: sediment seča, osnovna urinska analiza, eritrociti, cilindri, bolezni ledvic in sečnih poti.

Abstract

Microscopic examination of urine sediment is laboratory test with its beginnings far in history and it is now one of the most performed tests of biological fluids. Urine collection and preparation of urine sediment should be performed by

standardized procedures, for examination of urine sediment it is recommended to use phase contrast microscope. The formed elements in urine sediment are numerous and diverse: hematopoietic and epithelial cells, lipids, casts, mucus, crystals, contaminants and artifacts. Cells are present in characteristic morphological shapes or they may be changed because of different conditions: urine properties, sample ageing, specimen preparation, diseases and conditions. Characteristic changes of urine sediment are caused with various clinical conditions, mainly kidney and urinary tract. Correct identification of normal, disease altered cells and various pathological findings in urine sediment is still basic and reliable method for detection and monitoring of kidney and urinary tract diseases.

Key words: urinary sediment, urinalysis, erythrocytes, casts, kidney diseases, urinary tract diseases

1. Uvod

Začetni poskusi mikroskopiranja vzorcev seča segajo daleč nazaj v zgodovino v prvo polovico 17. stoletja, kar je bilo samo nekaj desetletij po tem, ko so postali v Evropi dostopni prvi mikroskopi. Prvo mikroskopiranje seča je verjetno izvedel Francoz Nicolaus Fabricius de Pieresc (1580- 1637) leta 1630, ki je v seču našel veliko romboidnih kristalov in jih opisal z besedami »a heap of rhomboidal bricks«. Do konca 18. stoletja so v seču opisane samo najdbe kristalov. V prvi polovici 19. stoletja, ki je bilo najpomembnejše obdobje v razvoju mikroskopiranja seča, pogojeno z izboljšanimi mikroskopi, sta Pierre Rayer (1793-1867) in Eugene Napoleon Vigla (1813-1872) iz Pariza uvedla mikroskopiranje seča v vsakodnevno klinično prakso. Opisala sta postopek priprave vzorca seča in veliko število formiranih elementov seča: kristale, ploščate in okrogle epitelijske celice, sluz, levkocite, eritrocite, lipide, spermije in glive. Obenem pa sta povezala veliko najdb v seču pri zdravih ljudeh in bolnikih z različnimi boleznimi. Nemški raziskovalci pa so naredili pomemben prispevek z opisovanjem cilindrov. Prvi jih je opazil v ledvičnih tubulih Gabriel Gustav Valentin (1810-1883) leta 1837, leta 1842 pa jih je Johann Franz Simon (1807-1843) lepo nazorno opisal in narisal. Njegove risbe so tudi najzgodnejše znane risbe cilindrov. Za drugo polovico 19. stoletja je značilen velik tehnološki napredek, uporaba centrifug in uvedba apokromatskih objektivov. Tako so bili

132 133


proti koncu 19. stoletja opisani že vsi formirani elementi v seču. Med njimi je bilo zadnje odkritje leta 1872 dismorfnih eritrocitov in akantocitov, ki jih je odkril Anglež George Harley (1829-1896) (1,2).

2. Priprava in pregled sedimenta seča

Najprimernejši vzorec za analizo je prvi ali drugi jutranji seč, vzorec, ki je zadostno koncentriran in svež, hitro dostavljen v laboratorij (3) - najkasneje v dveh urah od odvzema vzorca (4). Laboratorij mora imeti standardizirane postopke priprave sedimenta seča. V Sloveniji uporabljamo Priporočene postopke za odvzem, zbiranje, hranjenje, stabiliziranje in transport urina (5) in Priporočene postopke za osnovno analizo urina (4). Za pregled sedimenta seča je priporočena uporaba fazno-kontrastnega mikroskopa (3,6), ki omogoča boljšo razpoznavnost bakterij, hialinih cilindrov, eritrocitov ter bolje vidne celične značilnosti. Priporočljivo je mikroskop tudi opremiti s polarizirano svetlobo za potrditev lipidnih delcev in kristalov (6). Referenčne vrednosti za eritrocite so do 3 in za levkocite do 5, oboje v vidnem polju pri 400× povečavi. Sediment seča lahko poleg tega vsebuje še malo sluzi, epitelijskih celic in kristalov sečnih kamnov (brez patoloških kristalov) na vidno polje pri večji povečavi (400×) ter do 2 hialina cilindra na vidno polje pri manjši povečavi (100×) (5). Ledvične tubulne in prehodne epitelijske celice niso normalno prisotne v vidnem polju pri večji povečavi (400×) (6).

3. Sestavine sedimenta seča

V seču je lahko prisotno zelo veliko število različnih neraztopljenih sestavin – formiranih elementov. To so celice, hematopoetske in epitelijske, lipidi, cilindri, sluz, kristali, mikroorganizmi ter kontaminanti in artefakti.

3.1 Celice

• ERITROCITIEritrociti so majhne okrogle celice povprečnega premera 6,6 μm (od 4 do 10 μm) brez jedra z gladko površino in bikonkavno obliko. Velikost, oblika

in lomni količnik eritrocitov so spremenljivi, odvisni od različnih pogojev. V hipotoničnem seču so eritrociti povečani – napihnjeni, lahko tudi izgubijo hemoglobin (izluženi eritrociti). V hipertoničnem seču pa postanejo eritrociti skrčeni, nagubani, na površini membran imajo vidna zrnca. Spremembe v obliki eritrocitov zaradi osmotskih vplivov nimajo diagnostičnega pomena (7).Vzroki za eritrociturijo (hematurijo) so ledvične bolezni, okvare, infekcije, tumorji ali lezije, tvorbe kamnov, generalizirane krvavitve ali pa motnje koagulacije zaradi uporabe antikoagulantov (8).

Oblika eritrocitov v seču je lahko zelo spremenjena. Eritrociti nepravilnih oblik, s spremenjeno celično membrano, z granulacijami v citoplazmi se imenujejo dismorfni eritrociti (Slika 1) in so značilni za glomerulne krvavitve. Med dismorfne eritrocite uvrščamo tudi akantocite (Slika 1), ki so eritrociti z enim ali več izrastki na površini. Eritrociti se poškodujejo, spremenijo pri prehodu skozi glomerulno membrano in ob nadaljnjem prehodu tubulnega sistema ledvic. Za glomerulno hematurijo je značilna prisotnost vsaj 5% akantocitov ali vsaj 40% dismorfnih eritrocitov (7,9).

Slika 1. Dismorfni eritorciti, dva akantocita (puščici) (fazni kontrast, x400)Figure 1. Dysmorphic erythrocytes, two acanthocytes (arrows)(phase contrast, x400)

134 135


• LEVKOCITINajpogosteje so v seču prisotni nevtrofilni granulociti, ki merijo v premeru okoli 10 do 12 μm (2). So brezbarvni, okroglih oblik, imajo drobne citoplazemske granulacije in običajno segmentirano jedro. Tudi velikost in izgled nevtrofilcev se lahko spremeni, v hipertoničnem seču so citoplazemske organele zbite in jedro težko vidno, v hipotoničnem vzorcu so večji in nabrekli, jedro in citoplazemske organele so vidne, slednje se lahko gibljejo (Brownovo gibanje). Nevtrofilni granulociti zelo hitro razpadajo, včasih imajo lahko v seču tudi spremenjeno obliko – podolgovato ali z izrastki. Njihovo združevanje v skupke je najpogosteje posledica okužb sečil (8). Najpogostejši vzroki za levkociturijo so bakterijske okužbe sečnega mehurja (cistitis) in ledvic (pielonefritis). Med neinfekcijskimi vzroki pa so najpogostejši glomerulonefritis, intersticijski nefritis, policistična bolezen ledvic in urološke bolezni (7).

V seču so lahko prisotni tudi eozinofilni granulociti in limfociti, ki jih zanesljivo prepoznamo samo s citološkimi tehnikami in barvanjem. Eozinofilurija danes velja za nespecifično najdbo z manjšim pomenom kot v preteklosti. Prisotna je pri z zdravili povzročenim intersticijskim nefritisu, pri preobčutljivosti na nekatera zdravila, pri akutnih urogenitalnih infekcijah in nekaterih drugih vzrokih. Limfociturija je prisotna pri kroničnih vnetnih stanjih in virusnih okužbah, v prvih nekaj tednih po transplantaciji ledvic pa je lahko prvi znak zavrnitvene reakcije organizma (3).

Makrofagi v seču so okrogle celice z zelo različnim premerom, od 13 do 95 μm. Imajo eno ali več jeder, ki ležijo centralno ali periferno, pogosto pa jedra niso vidna, zaradi granul, vakuol in ostalih delcev v citoplazmi. V seču so najpogosteje prisotni pri proliferativnem glomerulonefritisu, IgA nefropatiji, polioma BK infekciji po transplantacijah ledvic (7) in pri okužbah sečil (3).

• EPITELIJSKE CELICEPloščate epitelijske celice izvirajo iz končnih delov sečnice (uretre) in iz nožnice. So največje epitelijske celice v seču, premera od 17 do 118 μm (7). So tanke, poligonalnih oblik z veliko citoplazme ter majhnim centralno ležečim jedrom. Zaradi stalnega obnavljanja epitelija se stare celice izločajo v seč in so pri ženskah običajno vedno prisotne v majhnem številu. Pri neustreznem zbiranju seča (vaginalni izločki) so lahko prisotne v zelo velikem številu (10).Prehodne epitelijske (uroepitelijske) celice pokrivajo večplastni epitelij sečil od ledvičnih čašic do mehurja pri ženskah in do zgornjega dela sečnice pri moških. Celice različnih plasti se razlikujejo, celice iz površinskih plasti so

večje, okroglih do ovalnih oblik, premera od 17 do 43 μm, za celice iz globjih plasti pa je značilno, da so najpogosteje podolgovate ali ovalne ter imajo vzdolžni premer od 10 do 38 μm. Celice iz površinskih plasti so najpogostejše pri pacientih s cistitisom, celice iz globjih plasti pa pri poškodbah zaradi ledvičnih kamnov in pri karcimomu mehurja (7).

Ledvične tubulne epitelijske celice (Slika 2) izvirajo iz različnih segmentov nefrona, ledvičnih tubulov in zbirnih kanalčkov. Imajo okroglo, ovalno, večkotno ali podaljšano obliko in granulirano citoplazmo. Velike so od 9 do 25 μm. V seču so prisotne pri aktivnem ledvičnem obolenju tubulov: akutni tubulni nekrozi, akutnem intersticijskem nefritisu, zavrnitveni reakciji po presaditvi ledvice in tudi pri pri glomerulnih boleznih (7).

Slika 2. Skupek ledvičnih tubulnih epitelijskih celic (fazni kontrast, x400)Figure 2. A clump of renal tubular epithelial cells (phase contrast, x400)

Raziskave kažejo, da z natančnim pregledom sedimenta seča ter z uporabo fazno-kontrastnega mikroskopa lahko v sedimentu seča prepoznamo tudi neobičajne, spremenjene celice, ki jih sicer ocenjujemo v preparatih, pripravljenih s citološkimi tehnikami in barvanjem, kot so maligne urotelijske

136 137


celice (11) in celice inficirane s polioma virusom (Decoy celice). Slednje so lahko prisotne po transplantacijah ledvic in povzročajo zaplete, ki se lahko končajo z izgubo presajene ledvice (7).

3.2 Lipidi

V seču najdemo lipide kot proste maščobne kapljice, ovalna maščobna telesca, maščobne cilindre in kristale holesterola. Proste maščobne kapljice (Slika 3 in slika 4), posamezne ali v skupkih, so okrogli delci, zelo različnih velikosti s svetlo rumeno barvo. Imajo velik lomni količnik (pri mikroskopiranju so dobro vidne). Najdbo maščobnih kapljic potrdimo s polarizirano svetlobo mikroskopa (v kapljicah holesterola so vidni malteški križi) ali z barvilom Sudan III. Ovalna maščobna telesca so z maščobo napolnjene ledvične tubulne epitelijske celice ali makrofagi. Maščobni cilindri vsebujejo maščobne kapljice, ki jih je lahko od samo nekaj pa vse do številnih, lahko popolnoma prekrijejo matriks cilindra. Kristali holesterola so zelo redki (7). Lipidne delce najdemo pri pacientih z nefrotskim sindromom, kliničnim sindromom, ki je rezultat velike prepustosti glomerulne membrane za plazemske proteine. Prisotni so tudi pri bolnikih s primarnimi anomalijami presnove maščob (Fabrijeva bolezen), pri nekaterih glomerulnih boleznih in pri policistični bolezni ledvic (10).

Slika 3. Proste maščobne kapljice (fazni kontrast, x400)Figure 3. Free lipid droplets (phase contrast, x400)

Slika 4. Proste maščobne kapljice (polarizirana svetloba, x400)Figure 4. Free lipid droplets (polarized light, x400)

3.3 Cilindri

So odlitki ledvičnih tubulov, cilindrični formirani elementi, ki nastajajo v distalnih tubulih in zbirnih kanalčkih. Sestavljeni so iz beljakovine uromodulin (Tamm-Horsfallov glikoprotein, THG). Pri določenih fizioloških in patoloških stanjih se fibrile THG prepletajo in združujejo v lumnu tubulov. Cilindri pogosteje nastajajo v kislem seču, pri večji koncentraciji topljencev, zmanjšanem pretoku seča in ob prisotnosti plazemskih beljakovin. So različni po velikosti in obliki, ki je odvisna od mesta nastanka. Imajo različen premer, običajno so ožji, razširjeni pa so prisotni pri tubulni atrofiji ali ledvični obstrukciji. Osnova je hialini cilinder, ki je sestavljen samo iz THG in ima zelo nizek lomni količnik. V hialino osnovo pa so lahko vključene še druge sestavine kot so celice, lipidi, granule, kristali ali mikroorganizmi. Katerekoli sestavine, ki so prisotne v tubulnem lumnu, se lahko vključijo v cilinder. To pojasnjuje veliko različnih vrst cilindrov, različne morfologije, sestave in diagnostičnega pomena (12).

Hialini cilindri so lahko prisotni pri naslednjih fizioloških stanjih: po naporu, dehidraciji, pri povišani telesni temperaturi. Nastanejo tudi pri večini ledvičnih bolezni in pri kongestivni srčni odpovedi.

138 139


Eritrocitne cilindre najdemo pri glomerulnih krvavitvah, zelo redko pri intersticijskem nefritisu.

Levkocitni cilindri so prisotni pri akutnem pielonefritisu, tubulnointersticijskih boleznih ali glomerulonefritisu.

Epitelijski cilindri imajo vključene ledvične tubulne epitelijske celice. Nastanejo pri hujših tubulnih okvarah kot je akutna tubulna nekroza in akutni intersticijski nefritis. Prisotni tudi pri glomerulnih boleznih.

Granulirani cilindri (Slika 5) so cilindri z vključenimi granulami. Njihovo število, velikost in obarvanost so lahko različni. Razlikujemo drobno ali grobo granulirane cilindre. Prisotni so pri številnih glomerulnih in tubulnih boleznih.Maščobni cilindri so prisotni v seču skupaj z ostalimi lipidnimi delci, pri nefrotski proteinuriji.

Voščeni cilindri (Slika 6) so dobili ime po svojem izgledu, ki spominja na stopljen vosek. Imajo homogen izgled, izrazite ostre robove, ki so pogosto zamaknjeni in prelomljeni. Pogosto imajo večji premer in so lahko temnejše barve. Še vedno ni znano kako nastanejo in iz česa so sestavljeni. Povezani pa so z večjimi koncentracijami serumskega kreatinina in z različnimi vrstami kroničnih in hitro napredujočih ledvičnih bolezni (13).

Pigmentni cilindri so značilno obarvani. Hemoglobinski cilinder nastane z razpadom eritrocitov v cilindru, redko pa z intravaskularno hemolizo. Mioglobinski cilindri so prisotni pri akutnih ledvični bolezni zaradi rabdomiolize. Pri ljudeh s povišano koncentracijo direktnega (konjugiranega) bilirubina v seču se cilindri (hialini, granulirani, celični, voščeni) zaradi bilirubina obarvajo značilno rumeno – bilirubinski cilindri (3).

Mešani cilindri so sestavljeni iz različnih sestavin, med njimi so daleč najpogostejši hialino-granulirani cilindri. Prisotni so pri bolnikih z različnimi oblikami glomerulonefritisov in akutnega intersticijskega nefritisa (12).

Slika 5. Drobno granulirani cilinder (fazni kontrast, x400)Figure 5. A finely granular cast (phase contrast, x400)

Slika 6. Voščeni cilinder (fazni kontrast, x400)Figure 6. A waxy cast (phase contrast, x400)

140 141


3.4 Sluz

Sluz ali mukus je pogosta sestavina seča, ki pa nima diagnostičnega pomena. Ima zelo majhen lomni količnik in vlaknasto strukturo, vlakna so večja in rahlejše sestave kot hialini cilindri (10).

3.5 Kristali

Najdbe kristalov v sedimentu seča so dokaj pogoste. Najpogosteje najdemo kristale kalcijevega oksalata, sečne kisline, tripel fosfata (Slika 7 in slika 8), kalcijevega fosfata ter amorfnih fosfatov in uratov, ki so posledica prehodne hipersaturacije seča po določeni hrani, zaradi premajhnega vnosa tekočine ali spremembe pH seča (14). Včasih pa je nastajanje kristalov povezano z nastajanjem ledvičnih kamnov, nastajajo tudi pri akutni uratni nefropatiji po kemoterapiji, pri zastrupitvah z etilenglikolom in pri okužbah sečil (tripel fosfat in amonijev biurat). Patološki kristali holesterola, cistina, leucina, tirozina in 2,8-dihidroksiadenina nastajajo pri presnovnih motnjah in nekaterih drugih boleznih. Kristali lahko nastanejo tudi po terapiji z nekaterimi zdravili (aciklovir, ciprofloksacin, sulfadiazin...), predvsem pri predoziranjih, dehidraciji, hipoalbuminemiji, pri visokem ali nizkem pH-ju seča. Na kristale zdravil pomislimo pri najdbi številnih kristalov z nenavadno obliko. Zaradi precipitacije kristalov v tubulih lahko nastanejo tudi akutne ledvične okvare (15). Prepoznavanje kristalov v seču je diagnostično pomembno. Potrebno je analizirati sveže vzorce seča in poznati značilne morfološke oblike kristalov ter pH seča. Pri mikroskopiranju nam je v pomoč tudi polarizirana svetloba.

Slika 7. Kristali tripel fosfata (svetlo polje, x200)Figure 7. Triple phosphate crystals (bright field, x400)

Slika 8. Kristali tripel fosfata (polarizirana svetloba, x400)Figure 8. Triple phosphate crystals (polarized light, x400)

142 143


3.6 Mikroorganizmi

Bakterije so zelo majhne, po obliki so najpogostejše paličaste in okrogle. Lahko so prisotne posamične, v parih, po štiri ali osem skupaj, v verigah, odvisno od vrste bakterij. Največ okužb sečil povzročajo srednje velike gram-negativne paličaste bakterije Escherichia coli in Proteus sp. (8). Njihova prisotnost je lahko tudi posledica vaginalne kontaminacije. Pri nepravilnem hranjenju vzorcev se bakterije namnožijo. Okužba sečil je zelo verjetna, če so v svežem vzorcu srednjega curka seča skupaj z bakterijami prisotni tudi levkociti.V seču je najpogosteje prisotni parazit Trichomonas vaginalis. Je ovalne ali okrogle oblike, običajno malo večji od levkocita, ima jedro in pet bičkov. V mokrih preparatih ga hitro prepoznamo po gibanju. Njihova prisotnost v seču je najpogosteje posledica kontaminacije seča z genitalnimi izločki, saj so pogost vzrok vaginitisa (ali uretritisa), zato pogosto najdemo tudi številne ploščate epitelijske celice, levkocite, bakterije in/ali glive (8).Glive so enocelični organizmi z izrazito celično steno, težko opaznim jedrom in homogeno citoplazmo brez očitnih organel. So lahko ovalne, okrogle ali podolgovate oblike, kar je značilnost posamezne vrste gliv. Prisotne so v oblikah brstenja ali nitastih struktur - psevdohif. Najpogosteje prisotna vrsta glive v seču je Candida albicans. V seču so običajno prisotne zaradi kontaminacije pri ženskah s primarnim glivičnim vnetjem nožnice. Lahko pa je prisotna primarna okužba sečil z glivami, predvsem pri sladkornih bolnikih, ljudeh s strukturnimi nepravilnostmi sečil, bolnikih z vstavljenim urinskim katetrom, ob daljšem antibiotičnem zdravljenju in zdravljenju z imunosupresivi (7,8).

3.7 Kontaminanti in artefakti

Kontaminanti in artefakti so vsi formirani elementi, ki se pojavijo v seču, potem ko le ta zapusti sečni mehur. Delno se jim je možno izogniti s pravilno pripravo pacienta na odvzem seča in čistimi delovnimi pogoji. Kontaminanti, ki izvirajo od preiskovanca so menstrualna kri, eritrociti, levkociti in bakterije - posledica genitalnih infekcij, spermiji, blato in črevesne celice, vlakna tkanin, škrob, smukec (magnezijev silikat) in delci krem. Iz laboratorija in iz okolja pa izvirajo delci stekla, mehurčki zraka, škrob, pelod, rastlinske celice ter spore gliv (7).

4. Značilni izvidi sedimenta seča pri boleznih ledvic in sečnih poti

S specifičnimi najdbami v sedimentu seča in z oceno proteinurije lahko opredelimo značilne klinične sindrome, ki so povezani z različnimi bolezenskimi stanji (16).

Pri nefrotskem sindromu so za izvid značilni: nefrotska proteinurija (>3,5 g/dan), lipidurija (maščobni cilindri, maščobna ovalna telesca, proste maščobne kapljice), ledvične tubulne epitelijske celice, epitelijski cilindri. Lahko je prisotna tudi mikroskopska hematurija. Vzrok nefrotskega sindroma so večinoma glomerulne bolezni, ki ne povzročajo pomembnega vnetnega dogajanja v glomerulih. Zaradi povečane prepustnosti glomerulne membrane, ki je posledica poškodb in sprememb v električnih nabojih, se filtrirajo beljakovine z večjo molekulsko maso in lipidi, kar povzroča hipoalbuminemijo, dodatno stimulira nastajanje lipidov v jetrih, posledica je tudi nastajanje oteklin (16,17).

Za nefritični sindrom so značilni: proteinurija, glomerulna eritrociturija (dismorfni eritrociti, akantociti), levkociturija, ledvične tubulne epitelijske celice, eritrocitni in epitelijski cilindri (17). Pri nefritičnem sindromu hitro poraste koncentracija kreatinina v serumu, povezan je tudi z nastankom oligurije in hipertenzije. Je posledica primarnih in sekundarnih glomerulonefritisov. Zaradi imunoloških vnetnih dogajanj nastanejo v glomerulni bazalni membrani majhne vrzeli, skozi katere prehajajo eritrociti in levkociti v Bowmanov prostor in v seč (18). Značilnosti nefritičnega in nefrotskega sindroma lahko najdemo pri vseh proliferativnih glomerulonefritisih (17).

Sediment seča s številnimi ledvičnimi tubulnimi epitelijskimi celicami najdemo pri tubulnih poškodbah pri širokem spektru bolezni. Glede na vzrok poškodb so v sedimentu seča sočasno prisotne različne spremljajoče značilnosti:

• pri sočasno prisotnih epitelijskih cilindrih in temnih granuliranih cilindrih je vzrok akutna tubulna nekroza, ki jo povzroči zmanjšana prekrvavitev ledvic – ishemija ali prisotnost nefrotoksičnih snovi,

• pri sočasno prisotnih eritrocitih, levkocitih, levkocitnih cilindrih je vzrok akutni intersticijski nefritis, ki nastane zaradi preobčutljivostne reakcije na zdravila (antibiotiki, nesteroidni antirevmatiki...),

144 145


• ob sočasni najdbi temnih pigmentiranih cilindrov je vzrok hemoglobinurija ali mioglobinurija (rabdomioliza),

• ob sočasno prisotnih kristalih je lahko vzrok za akutne tubulne poškodbe precipitacija kristalov (16).

Sediment seča z eritrociturijoKadar je eritrociturija povezana s proteinurijo je vzrok hematurije običajno glomerulna bolezen. Če pa ni sočasno prisotne proteinurije, je stanje poimenovano izolirana mikroskopska hematurija, ki je povezana z urološkimi boleznimi (najpogosteje z rakom) ali nefrološkimi boleznimi (IgA nefropatija, bolezen tanke bazalne glomerulne membrane). V teh primerih je zelo pomembna ocena morfologije eritrocitov, opredelitev nefrološkega ali urološkega vzroka krvavitve (16,17).

Sediment seča z bakterijami in levkocitiZnano je, da je vzrok bakteriurije in levkociturije okužba sečil. Kljub temu je potrebno izključiti kontamincijo z vaginalnimi izločki pri ženskah (če je prisotno večje število ploščatih epitelijskih celic, lahko tudi glive). Blaga izolirana bakteriurija je običajno posledica nesterilnega odvzema vzorca. Izolirana levkociturija pa je lahko povezana s širokim spektrom bolezni, kot je tudi tuberkuloza sečil, kronični intersticijski nefritis, ledvični kamni (16,19)...

Minimalne spremembe sečaNeznačilne spremembe seča, ki jih lahko interpretiramo samo v povezavi s kliničnimi informacijami in drugimi diagnostičnimi preiskavami. Prisotnost manjšega števila cilindrov, blaga hematurija in/ali levkociturija s sočasno blago proteinurijo je lahko prisotna pri širokem spektru glomerulnih, intersticijskih, vaskularnih ledvičnih bolezni (16).Sediment seča je biooznačevalec ledvičnih bolezni, diagnostičen je za mesto okvar v nefronu, lahko usmerja terapijo in zagotavlja prognostične informacije o poteku bolezni (20). Za odkrivanje akutnih okvar ledvic, hitrega zmanjševanja ledvičnega delovanja, se uveljavljajo novi biooznačevalci (lipokalin povezan z nevtrofilno gelatinazo, NGAL; interlevkin 18; KIM-1), ki skupaj z mikroskopskim pregledom sedimenta seča omogočajo zgodnje odkrivanje bolezni, razlikovanje predledvičnih okvar in akutne tubulne nekroze, napovedovanje poteka bolezni in ogroženosti bolnika (21).

5. Kakovost

Za izvajanje mikroskopskega pregleda sedimenta seča je potrebno veliko znanja in izkušenj. Pomembno je, da ga opravlja motivirano in dobro izučeno osebje, kar lahko odločilno prispeva k pravočanemu odkrivanju bolezni in odkrivanju napredovanja bolezni. Osebje se mora redno izobraževati, obenem mora biti vzpostavljena tudi redna notranja kontrola – interni nadzor (4). Zagotovljeno mora biti tudi sodelovanje v nacionalnih ali mednarodnih ocenah kakovosti dela in rezultatov: Sneqas (Slovenija) (22), Labquality (Finska), Centre of Biomedical Research (Italija) (23), Instand (Nemčija). Glavni namen teh shem je prepoznavanje predstavljenih sestavin sedimenta seča, tudi manj pogostih in poznanih, obenem pa tudi uporaba pravilnega poimenovanja. Rezultati raziskav kažejo, da prepoznavanje nekaterih sestavin sedimenta seča ni dobro (23, 24). Nekatere sheme vključujejo tudi klinični pomen najdb sedimenta seča – interpretacijo rezultatov. Laboratorijski strokovnjak, specialist medicinske biokemije, ki ima veliko izkušenj pri opazovanju in prepoznavanju sestavin sedimenta seča, lahko podaja natančno in podrobno morfologijo in tudi interpretacijo rezultatov (25). Izredno pomembno pa je dobro medsebojno sodelovanje laboratorijskega osebja in zdravnikov, kar prinaša največjo korist, dobrobit bolnikom.

6. Sklep

Enostavno, neinvazivno pridobljen vzorec seča – tekoča ledvična biopsija nam nudi veliko število informacij o dogajanju v ledvicah, sečnih poteh in celotnem dogajanju v organizmu. Mikroskopski pregled sedimenta seča je preiskava z zelo dolgo zgodovino, ki pa danes marsikdaj ni izvedena optimalno, najboljše. Zato morata biti odvzem vzorca seča in priprava sedimenta seča izvedena po standardiziranih postopkih. Pregled mora biti izveden čim hitreje po odvzemu vzorca, s primerno opremo, predvsem pa le-ta zahteva veliko znanja, ki ga je potrebno vseskozi dopolnjevati, nadgrajevati na izobraževanjih in z udeležbo v zunanjih shemah kakovosti dela in rezultatov.

146 147


Literatura

1. Fogazzi GB, Cameron JS. Urinary microscopy from the seventeenth century to the present day. Kidney Int 1996; 50: 1058–1068.

2. Cameron JS. Historical introduction. In: Fogazzi GB. The Urinary Sediment: An Integrated View, 3rd edition. Elsevier Masson, 2010: 1-15.

3. Kouri T, Gant VA, Fogazzi GB, Hofmann W, Hallander H, Walter GG. European urinalysis guidelines. Scand J Clin Lab Invest Suppl 2000; 231:1-86.

4. Plazar N, Pahor V, Berce K. Priporočeni postopki za osnovno analizo urina. Slovensko združenje za klinično kemijo 2004.

5. Skitek M, Trampuš Bakija A. Priporočeni postopek za odvzem, zbiranje, hranjenje, stabiliziranje in transport urina. Slovensko združenje za klinično kemijo 2001.

6. Fogazzi GB, Garigali G. Collection, preparation and examination of the samples, and report of the urinary findings. In: Fogazzi GB. The Urinary Sediment: An Integrated View, 3rd edition. Elsevier Masson, 2010: 20-38.

7. Fogazzi GB, Garigali G, Croci MD, Verdesca S. The formed elements of the urinary sediment. In: Fogazzi GB. The Urinary Sediment: An Integrated View, 3rd edition. Elsevier Masson, 2010: 41-152.

8. Munson Ringsrud K, Jorgenson Linne J. Urinalysis and Body Fluids, A Colortext and Atlas. Mosby-Year book 1995.

9. Fogazzi GB, Edefonti A, Garigali G, Giani M, Zolin A, Raimondi S, Mihatsch MJ, Messa P. Urine erythrocyte morphology in patients with microscopic haematuria caused by a glomerulopathy. Pediatr Nephrol. 2008 Jul;23(7):1093-100

10. Brunzel NA. Fundamentals of Urine and Body Fluid Analysis. Elsevier Sounders 1994.11. Fogazzi GB, Pallotti F, Garigali G. Atypical/malignant urothelial cells in routine urinary

sediment: worth knowing and reporting. Clin Chim Acta. 2015, 15; 439:107-11. 12. Caleffi A, Lippi G. Cylindruria. Clin Chem Lab Med. 2015.13. Spinelli D, Consonni D, Garigali G, Fogazzi GB. Waxy casts in the urinary sediment of

patients with different types of glomerular diseases: results of a prospective study. Clin Chim Acta. 2013; 23; 424:47-52.

14. Fogazzi GB. Crystalluria: a neglected aspect of urinary sediment analysis.Nephrol Dial Transplant. 1996; 11(2):379-87.

15. Khan M, Ortega LM, Bagwan N, Nayer A. Crystal-induced acute kidney injury due to ciprofloxacin. J Nephropathol. 2015; 4(1): 29–31.

16. Fogazzi GB, Verdesca S. Interpretation of the urinary sediment findings. In: Fogazzi GB. The Urinary Sediment: An Integrated View, 3rd edition. Elsevier Masson, 2010: 211-219.

17. Lindič J, Škoberne A. Preiskave seča. In: Lindič J, Kovač D, Kveder R, Malovrh M, Pajek J, Aleš Rigler A, Škoberne A. Bolezni ledvic, tretja izdaja 2014.

18. King Strasinger S, Schaub Di Lorenzo M. Urinalysis and body fluids. Fifth edition, E.A. Davis Company 2008.

19. UpToDate. http://www.uptodate.com. Dostop: 03-07-2015.20. Perazella MA. The urine sediment as a biomarker of kidney disease. Am J Kidney Dis. 2015.21. Perazella MA, Coca SG. Traditional urinary biomarkers in the assessment of hospital-

acquired AKI. Clin J Am Soc Nephrol. 2012;7(1):167-74. 22. Sneqas. http://www.kikkb.si/sneqas.htm. Dostop: 06-07-2015.23. Fogazzi GB, Secchiero S, Consonni D, Sciacovelli L, Zardo L, Garigali G, Verdesca S,

Messa P, Plebani M. An Italian external quality assessment (EQA) program on urinary sediment. Clin Chim Acta. 2010 3;411(11-12):859-67.

24. Wald R, Bell CM, Nisenbaum R, Perrone S, Liangos O, Laupacis A, Jaber BL. Interobserver reliability of urine sediment interpretation. Clin J Am Soc Nephrol. 2009 Mar;4(3):567-71.

25. Fogazzi GB, Secchiero S, Garigali G, Plebani M. Evaluation of clinical cases in External Quality Assessment Scheme (EQAS) for the urinary sediment.Clin Chem Lab Med. 2014 Jun;52(6):845-52.

148


Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana

Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani

Zbornik predavanj raziskovalnega srečanja6. JESENOVČEVI DNEVI - Raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine

CIP - Kataložni zapis o publikaciji Narodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana

616-074(082)

JESENOVČEVI dnevi (6 ; 2014 ; Ljubljana) 6. Jesenovčevi dnevi : raziskovalni dnevi laboratorijske biomedicine, 30. september 2014, Fakulteta za farmacijo, Aškerčeva 7, Ljubljana : [zbornik predavanj] / [urednika Darko Černe in Milan Skitek ; organizator srečanja Katedra za klinično biokemijo, Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani in Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana]. - Ljubljana : Fakulteta za farmacijo, Katedra za klinično biokemijo : Univerzitetni klinični center, Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, 2014

ISBN 978-961-6378-61-1 (Fakulteta za farmacijo) 1. Dodat. nasl. 2. Černe, Darko 3. Fakulteta za farmacijo (Ljubljana). Katedra za klinično biokemijo 4. Univerzitetni klinični center (Ljubljana). Klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo 275591424

klinični inštitut za klinično kemijo in biokemijo, …. jesenovcevi dnevi_vsebina z...

Documents