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BULLETIN DE LIAISON DU CTSCCV / VOL.12 N° 3/2002

ÉTUDES

INTRODUCTION

Programme ACTIA* 99-2 "Effet de la congélationet de la décongélation sur différentes floresmicrobiennes dans différentes matrices alimen-taires". État d'avancement des travaux

Il est actuellement préconisé (norme AFNOR NFV04-501) de congeler les produits si leur analysemicrobiologique ne peut pas être réalisée dans

les 24 heures qui suivent leurréception au laboratoire ouleur prélèvement.

Cependant, de nombreusesobservations expérimentalesrévèlent l'effet négatif des

opérations de congélation et de décongélationqui induisent un état de stress, voire détruisentles micro-organismes présents dans le produit.Les cellules survivant à la congélation ont alorssubi un stress. On parlera de cellules viables noncultivables. Ces cellules ne seront donc pasdétectables par les techniques classiques d'ana-lyses. Cependant, elles sont capables de restau-rer leur activité métabolique dans l’aliment etpeuvent donc être à l’origine d’altérations duproduit ou d’intoxications alimentaires. Lesrésultats obtenus après congélation risquentd'apporter une fausse sécurité car le respect descritères réglementaires peut s'avérer satisfaisantalors que la population microbienne est élevée.

Dans le cadre de cette étude, nous avons examiné l’impact de la congélation sur différents germesdans du jambon cuit et de la mêlée de saucisse.Dans un premier temps, nous avons étudié l’évolution de la flore naturellement présente dans lesproduits. Dans la chair à saucisse, nous avons observé une diminution du nombre dePseudomonas lors de la conservation à –20°C, alors que la flore lactique ne semble pas affectéepar la congélation.Dans un deuxième temps, nous avons étudié l’effet de la conservation de jambon cuit à +4 et–20°C sur Listeria, E. coli et Salmonella. Nous avons ainsi montré que la sensibilité des micro-organismes au froid, et plus particulièrement à la congélation, varie en fonction del’espèce. Ainsi, Listeria semble insensible au froid (positif et négatif) ; Salmonella est stresséepar la congélation et E. coli est en partie détruite lors de la conservation à –20°C.Par conséquent, dans certains cas, la contamination microbienne des produits est sous-estiméequand ceux-ci sont congelés.

La congélation des produitsmodifie-t-elle les résultatsd’analyses microbiologiques ?

PASCAL GARRY CTSCCV, 7 avenue du Général de Gaulle, 94704 Maisons-Alfort Cedex

Laboratoire de microbiologie

RÉ

SU

MÉ

SIGLES, ABRÉVIATIONS

* ACTIA : Association deCoordination Techniquepour l’Industrie Agro-alimentaire.

ÉVOLUTION DE LA FLORE NATURELLEMENTPRÉSENTE DANS LES MATRICES

PROTOCOLES

Enrichissement naturel des échantillons

Les échantillons ont été conservés pendant8 heures à 20°C de manière à enrichir naturelle-ment leur flore microbienne, ceci afin de pouvoirobserver un effet de la congélation.

Conservation des échantillons

Les échantillons ont été conservés soit 7 jours à4°C, soit 21 jours à -20°C.

Analyse des échantillons

Pour les échantillons congelés, la décongélationavant analyse s'effectuait à 4°C pendant 5 heu-res 30.

Pour les deux températures de conservation, àchaque point d'analyse, 3 échantillons étaientanalysés.

Les échantillons conservés à 4°C ont été analy-sés à J0, J2, J3, J4, J6, J7.

Les échantillons conservés à -20°C ont été ana-lysés à J0, J2, J3, J4, J6, J7, J14 et J21.

Méthodes de dénombrement

Nous avons recherché et/ou dénombré les floressuivantes selon les normes AFNOR en vigueurou par des méthodes validées par l’AFNOR.

• Flore totale mésophile aérobie à 30°C

• Coliformes totaux à 30°C

• Coliformes thermotolérants à 44°C

• Staphylocoques à coagulase positive

• Clostridium perfringens

• Salmonella selon la méthode alternative dumini VIDAS (Bio Mérieux)

• Listeria monocytogenes selon la méthodealternative du mini VIDAS (Bio Mérieux)

• Flore lactique

• Pseudomonas (pour la mêlée de saucisse)

La congélation des produits modifie-t-elleles résultats d’analyses microbiologiques ?

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Dans le cadre de ce programme financé parl'ACTIA, cinq centres (ADIV, CTSCCV, ISHA,ADRIA Normandie et AGROHALL) étudient l'effetde la congélation et de la décongélation sur lesflores naturellement présentes dans différentesmatrices alimentaires ou sur des flores réintro-duites dans le produit. Il s'agit de vérifier s'il nevaut mieux pas conserver les produits à tempé-rature positive proche de 0°C plutôt que de lescongeler, afin d'éviter une sous-estimation de lacontamination microbienne.

Cependant dans certains cas, il n'est pas possi-ble de s'affranchir de la congélation, commedans le cas d'expertises où les échantillons doi-vent être conservés plusieurs semaines voireplusieurs mois. C'est pourquoi, dans undeuxième temps, il est envisagé de mettre enplace des protocoles de congélation et décon-gélation, ainsi qu’un protocole de revivificationdes germes stressés par la congélation.

Cette seconde partie du programme devraitaboutir à la rédaction d'un protocole minimisantl'effet de ce mode de conservation. Il devrait parailleurs permettre d'aboutir à un consensus surles méthodes de revivifications à appliquer afinde récupérer les germes stressés présents dansun produit alimentaire. Cette méthode de revivi-fication s'appuiera sur celle mise au point aucours d'un programme précédent : mise enplace de recommandations pratiques de revivifi-cation de micro-organismes stressés en vue deleur détection et de leur numération (le stressétudié lors de ce programme de recherche étaitun stress thermique chaud).

Chacun des centres participant au programme achoisi deux matrices alimentaires. Pour sa part,le CTSCCV a choisi le jambon cuit entier et lamêlée de saucisse.

ÉTUDES

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FIGURE 1. Évolution de la flore mésophilenaturellement présente dans le jambon cuit entier (valeurs moyennes).

FIGURE 2. Évolution de la flore lactiquenaturellement présente dans le jambon cuit entier (valeurs moyennes).

* UFC : unité formant colonie

RÉSULTATS

Jambon cuit

Le jambon a été divisé en échantillons de 10 gavant conservation à 4°C ou -20°C. Seules lesflores lactique et mésophile aérobie (30°C) ontpu être suivies. En effet, les autres flores n'é-taient pas présentes dans le produit analysé ouà des taux inférieurs aux seuils de détection desdifférentes méthodes utilisées.

Les résultats obtenus pour la flore mésophileaérobie sont présentés sur la figure 1 et ceuxpour la flore lactique sur la figure 2.

A 4°C comme à -20°C, il est difficile de voir une évo-lution de la flore car le niveau de contamination estélevé dès J0. Ceci est lié au fait qu'avant stockageà 4°C et -20°C, nous avons procédé à un "enrichis-sement naturel" en laissant le produit à 20°C.

De plus, les résultats sont très hétérogènes, ceciest dû à l'échantillon lui-même. En effet, un jam-bon cuit entier a une masse importante compriseentre 4 et 5 kg. En fonction du lieu de prélève-ment, la contamination peut donc varier et lesmicroorganismes peuvent avoir subi un traite-ment thermique différent en fonction de leurlocalisation à cœur ou en surface du jambon.

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Mêlée de saucisse

La chair à saucisse a été divisée en échantillonsde 10 g avant conservation à 4°C et -20°C.Seules la flore lactique et les Pseudomonas ontpu être suivies. Les autres flores n'étaient pasprésentes dans le produit analysé ou à des tauxinférieurs aux seuils de détection des différentesméthodes utilisées.

Les résultats obtenus pour la flore lactique sontprésentés sur la figure 3 et pour lesPseudomonas sur la figure 4.

Contrairement au jambon cuit entier, nous n'a-vons pas observé de problème d'hétérogénéitéde l'échantillonnage. A 4°C, nous observons uneévolution rapide de la contamination de la mêléepar les Pseudomonas et la flore lactique.

A -20°C, à partir du 4e jour, nous observons unediminution de plus d'un log de la contaminationpar Pseudomonas, puis une augmentation trèsvisible à J21.

Ce phénomène pourrait s'expliquer par un stressdes cellules lors de la congélation, ce qui entraîne-rait leur non cultivabilité, puis par une "revivification"qui leur permettrait d'être à nouveau cultivables.

FIGURE 4. Évolution des Pseudomonasnaturellement présentes dans lamêlée (valeurs moyennes).

FIGURE 3. Évolution de la flore lactiquenaturellement présente dans lamêlée (valeurs moyennes).

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ÉTUDES

Cependant, on peut se demander si les cellulesmicrobiennes peuvent se revivifier à une tempé-rature si basse.

Par contre, la flore lactique semble peu affectéepar la congélation.

ÉTUDE DE L'ÉVOLUTION DE LISTERIAMONOCYTOGENES, SALMONELLA ETE. COLI RÉENSEMENCÉES DANS DUJAMBON

L'ensemble des centres a travaillé sur les mêmessouches. Listeria et Salmonella ont été fourniespar le CTSCCV et E. coli par l'ISHA. Les souchessont conservées sur cryobilles. Les protocolesde préparation des suspensions cellulaires pourListeria monocytogenes et E. coli sont ceuxdéveloppés dans le cadre du programme ACTIA"Challenge test".

PROTOCOLES

Protocole d'obtention de cellules en phase stationnaire

Les cellules de Listeria monocytogenes, E. coli etSalmonella sont obtenues après 3 précultures à37°C en milieu BHI (bouillon cerveau-cœur).

Méthode d'ensemencement

Un jambon entier stérile a été divisé en échan-tillons de 10 g (autant d'échantillons que depoints d'analyses ont été réalisés).

Chacun des échantillons est ensemencé avec0,1 ml d’une suspension à 104 cellules/ml obte-nue à partir de la 3e préculture.

Dans le même temps, la contamination enPseudomonas et Entérobactéries a été suivie surun jambon non stérile.

Conservation des échantillons

Les échantillons ont été conservés soit 7 jours à4°C, soit 21 jours à -20°C.

Analyse des échantillons

Pour les échantillons, la décongélation avantanalyse s'effectuait à 4°C pendant 5h30.

Pour les deux températures de conservation, àchaque point d'analyse, 3 échantillons étaientanalysés.

Les échantillons conservés à 4°C ont été analy-sés à J0, J1, J2 et J7. Pour Listeria monocyto-genes qui peut se développer à 4°C, les pointsJ3 et J4 ont également été analysés.

Les échantillons conservés à -20°C ont été ana-lysés à J0, J1, J2, J7, J14 et J21.

Les flores ont été dénombrées sur PCA et surmilieu sélectif Hektoen pour Salmonella, Palcampour Listeria monocytogenes et Rapid E. coli2pour E. coli.

Les Pseudomonas et Entérobactéries ont étédénombrées sur milieux sélectifs : CFC et BEA.

Calcul des taux de stress

Le taux de stress est estimé à partir des dénom-brements obtenus sur milieu optimal (PCA) et surmilieu sélectif.

Sur milieu sélectif, seules les cellules non stres-sées se multiplient, et sur milieu optimal, les cel-lules stressées et non stressées se développent.

Le pourcentage de stress est calculé à l'aide dela formule suivante :

% de stress = [optimal] - [sélectif] x 100 avec :[optimal]

[optimal] = nombre de cellules dénombrées surmilieu optimal

[sélectif] = nombre de cellules dénombrées surmilieu sélectif

RÉSULTATS

Dans le cas des Pseudomonas et Entéro- bactéries, tous les dénombrements étaient inférieurs au seuil de détection des méthodes (10 UFC/g).

Salmonella

Les résultats des dénombrements obtenus pourSalmonella conservée à 4°C sont présentés surles figures 5 et 6. Les pourcentages de cellulesstressées lors de la conservation à 4°C sont pré-sentés sur la figure 7.

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FIGURE 7. Évolution du pourcentage de stress de Salmonella à 4°C.

FIGURE 5. Évolution de la population de Salmonella, à 4°C(dénombrement sur PCA et Hektoen).

FIGURE 6. Évolution de la population de Salmonella, à 4°C(dénombrement sur PCA).

ÉTUDES

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FIGURE 10. Évolution du pourcentage de stress de Salmonella à -20°C.

FIGURE 8. Évolution de la population de Salmonella à -20°C (dénombrement sur PCA etHektoen).

FIGURE 9. Évolution de la population de Salmonellaà -20°C (dénombrement sur PCA).

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FIGURE 11. Évolution de Listeria monocytogenes à 4°C (dénombrement sur PCA etPalcam).

FIGURE 12. Évolution de Listeria monocytogenes à +4°C (dénombrement sur PCA).

FIGURE 13. Évolution du pourcentage de stress deListeria monocytogenes à 4°C.

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ÉTUDES

FIGURE 14. Évolution de Listeria monocytogenesà -20°C (dénombrement sur PCA etPalcam).

FIGURE 16. Évolution du pourcentage de stress de Listeria monocytogenes à -20°C.

FIGURE 15. Évolution de Listeria monocytogenes à -20°C (dénombrement sur PCA).

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FIGURE 19. Évolution du pourcentage de stress de E. coli à 4°C.

FIGURE 17. Évolution de E. coli à 4°C (dénombrement sur PCA et Rapid E. coli2).

FIGURE 18. Évolution de E. coli à 4°C(dénombrement sur PCA).

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ÉTUDES

FIGURE 20. Évolution de E. coli à -20°C(dénombrement sur PCA et Rapid E. coli2).

FIGURE 22. Évolution du pourcentage de stress de E. coli à -20°C.

FIGURE 21. Évolution de E. coli à -20°C(dénombrement sur PCA).

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Pour E. coli, nous n'avons pas observé d'évolu-tion de la population à 4°C. Par contre, il sem-blerait que la souche soit sensible à la congéla-tion puisque l'on observe une diminutionprogressive de la population.

A -20°C, après une augmentation rapide dustress, celui-ci diminue dans le même temps que la mortalité augmente. Il semblerait que lescellules stressées par la congélation meurentprogressivement, ce qui expliquerait la diminu-tion du nombre de cellules stressées.

Par ailleurs, à 4°C le pourcentage de stress aug-mente au cours du temps, ce qui confirmerait lasensibilité de la souche au froid.

CONCLUSION

Les résultats obtenus au cours de cette partie del'étude, montrent que la sensibilité des micro-organismes au froid, et plus particulièrement à lacongélation, varie en fonction de l'espèce. Ainsi,Listeria est insensible au froid (positif commenégatif), Salmonella est stressée par la congéla-tion et E. coli est stressée à 4°C (ce qui entraî-nera une sous-estimation de la population lorsdu dénombrement) et est en partie détruite à -20°C ; là encore, la contamination du produitsera sous-estimée.

Il convient donc de mettre en place non seulementun protocole de congélation / décongélationlimitant l'impact de ce mode de conservation deséchantillons, mais également d'étudier l'intérêt de l'utilisation de cryoprotecteurs lors de la congélation. C'est ce que nous nous proposeronsd'étudier pour la suite du programme.

Nous n'observons pas d'évolution à 4°C, si cen'est une petite chute à J7 lors du dénombre-ment sur PCA. Par contre, nous observons progressivement une augmentation du nombrede cellules stressées (à partir du 4e jour).

Les résultats obtenus à -20°C sont présentés surles figures 8, 9 et 10.

A -20°C, on observe une légère diminution à J1 (et J2 pour le 3e essai), puis pas d'évolutionparticulière. De plus, le nombre de cellules stres-sées augmente rapidement dès la congélation et reste très important tout au long de la conser-vation.

Listeria monocytogenes

Les résultats des dénombrements obtenus pourListeria monocytogenes conservée à 4°C sontprésentés sur les figures 11 et 12. Les pourcen-tages de cellules stressées lors de la conserva-tion à 4°C sont présentés sur la figure 13.

Pour Listeria monocytogenes à 4°C, nous n'ob-servons pas d'évolution de la population jusqu'àJ4 (phase de latence) puis, entre le 4e et le 7e jour,un début de croissance.

Cette croissance était prévisible puisque Listeriamonocytogenes est une bactérie psychrotrophe,ce qui explique que nous n'avons pas mis en évi-dence de cellules stressées.


Par ailleurs, Listeria ne semble pas sensible à lacongélation à -20°C (absence de stress et trèsfaible mortalité).

E. coli

Les résultats des dénombrements obtenus pourE. coli conservée à 4°C sont présentés sur lesfigures 17 et 18. Les pourcentages de cellulesstressées lors de la conservation à 4°C sont pré-sentés sur la figure 19.


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