RESUMEN

En el laboratorio se estudi la cinemtica de enzima, velocidad de las reacciones catalizadas enzimticamente Las enzimas son catalizadores especficos, cada enzima cataliza un solo tipo de reaccin, y casi siempre acta sobre un nico sustrato o sobre un grupo muy reducido de ellos. Para ello se realiz en condiciones ptimas de pH, temperatura, y previamente se efectu el anlisis del efecto de la concentraciones de sustrato, efecto del fosfato, magnesio y citrato sobre la actividad enzimtica. Se preparan cinco tubos con las diferentes disoluciones y nuestro blanco, para cada anlisis agregando la cantidad correspondiente de cada solucin como se indica en las diferentes tablas, luego se procede a hacer una pre incubacin por tres minutos, pasado este tiempo se procede a adicionar la enzima FAL (fosfatasa alcalina) con un intervalo de 1 en cada tubo y se lee en el espectrofotmetro.

Los resultados obtenidos La velocidad Vs concentracin de sustrato se observa un incremento a mayor concentracin del sustrato mayor ser la velocidad de la reaccin. En estas condiciones, la velocidad de la reaccin observada es la velocidad mxima (Vmax) dando un valor de 0.032 y la Km de 0.921. El estudio de la cintica enzimtica permite explicar los mecanismos catalticos, ya que podemos determinar la Km y Vmax, son importantes a la hora de comprender el funcionamiento de las enzimas en el control del metabolismo.

Palabras claves: catalizadores, concentracin, enzimtica, sustrato, velocidad

INTRODUCCIN

Las propiedades catalticas de las enzimas y por ende su actividad reciben la influencia de numerosos factores que deben ser controlados y optimizados en su totalidad si se desea que las mediciones de la enzima tengan sentido y sean reproducibles.1

Por un lado, al interactuar con el sitio activo de la enzima, el sustrato forma con esta un complejo enzima-sustrato (ES), en donde el sustrato reacciona mucho ms fcil y rpidamente que en ausencia de la enzima, por una disminucin de la energa de activacin. A partir del complejo enzima-sustrato resultan los productos de la reaccin y la enzima queda en su condicin original para aceptar otra molcula de sustrato.

De acuerdo con la ley de accin de masas, la velocidad de la reaccin ser proporcional a la concentracin [ES], la cual depende de [E] y [S]. Como la enzima vuelve a quedar disponible al final de la reaccin, se puede concluir que la velocidad de la reaccin es directamente proporcional a [S]. Por tanto:

1. A baja concentracin de sustrato [S], v es directamente proporcional a [S].

2. A muy alta [S], v es independiente de (S) y por tanto v= Vmax.

3. Existe un valor de [S] en el que v=Vmax/2 y ese valor recibe el nombre de Km (abreviatura de constante de Michaelis: la concentracin de sustrato con la cual la velocidad de reaccin enzimtica alcanza un valor igual a la mitad de la velocidad mxima)

4. Si se aumenta la enzima al doble, los valores de v en cada punto, y por tanto tambin de la Vmax, se duplican pero la Km no cambia.

Por otro lado, eldiagrama de Lineweaver-Burkse emplea como herramienta grfica para calcular los parmetroscinticosde unaenzima. Su utilidad consiste en emplear el recproco de lacintica de Michaelis-Menten en el cual se obtiene una funcin lineal en cuanto se representa la inversa de la velocidad inicial (1/ Vo ordenada) con respecto a la inversa de la [S] (1/S, Abscisa).De esta forma, puede determinarse fcilmente los parmetros cinticos Km y de los cortes al extrapolar los ejes de este diagrama.2

Se buscar entonces, a travs de este experimento, determinar Km y la Vmax de la fosfatasa alcalina utilizando la ecuacin de Linerweaver-Burk, adems se identificar el tipo de inhibicin efectuada por el fosfato inorgnico y el citrato de sodio sobre la actividad enzimtica de la Fosfatasa Alcalina.

MTODO

Efecto de la concentracin de sustrato

Se preparan 6 soluciones con agua, buffer barbital pH 9.6 y PNFP a diferentes concentraciones, as:

Solucin

Tubo (ml)

1

2

3

4

5

6

Agua Destilada

1.35ml

1.3ml

1.2ml

1.1ml

0.8ml

0.5ml

Buffer Barbital pH 9.6

1.5ml

1.5ml

1.5ml

1,5ml

1.5ml

1.5ml

PNFP 1 mM

0.05ml

0.1ml

0.2ml

0.30ml

0.60ml

0.9ml

Enzima FAL

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

Se hace la preincubacin de los tubos con las soluciones en el bao mara durante 3 minutos a 37C.

Posteriormente, y con un intervalo de 1 min entre cada tubo, se agrega la enzima sin sacar el tubo del bao mara y se agita por 5 segundos.

Finalmente, se incuban por 3 minutos a 37C y se procede a leer la Absorbancia.

Efecto del fosfato sobre la actividad enzimtica

Se preparan 5 soluciones con agua, buffer barbital a pH 9.6 y Fosfato 0.1M a diferentes volmenes. Y el Blanco para calibrar el espectrofotmetro, as:

Solucin

Tubo (ml)

Blanco

1

2

3

4

5

Agua Destilada

2.7ml

1.5ml

0.4ml

0.1ml

0.3ml

---

Buffer Barbital pH 9.6

0.3ml

1.0ml

1.0ml

1.0ml

1.0ml

1.0ml

Fosfato 0.1 M

---

---

0.3ml

0.6ml

---

0.3ml

Enzima FAL

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

Se hace la preincubacin de los tubos con las soluciones en el bao mara durante 3 minutos a 37C.

Posteriormente, y con un intervalo de 1 min entre cada tubo, se agrega la enzima sin sacar el tubo del bao mara y se agita por 5 segundos.

Finalmente, se incuban por 3 minutos a 37C y se procede a leer la Absorbancia.

Efecto del Magnesio y el Citrato sobre la actividad enzimtica

Se preparan 5 soluciones con agua, buffer barbital a pH 9.6 y Fosfato 0.1M a diferentes volmenes. Y el Blanco para calibrar el espectrofotmetro, as:

Solucin

Tubo (ml)

Blanco

1

2

3

4

5

Agua Destilada

0.3

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Buffer Barbital pH 9.6

2.7

1

0.8

0.6

0.7

0.4

PNFP 1mM

---

0.9

0.9

0.9

0.9

0.9

Citrato de Sodio 0.2M

---

---

0.2

0.4

---

0.4

Cl2mg 0.1M

---

---

---

---

0.3

0.2

Enzima

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

0.1

Se hace la preincubacin de los tubos con las soluciones en el bao mara durante 3 minutos a 37C.

Posteriormente, y con un intervalo de 1 min entre cada tubo, se agrega la enzima sin sacar el tubo del bao mara y se agita por 5 segundos.

TALLER

1. Realice la curva de Calibracin de PNFP Absorbancia vs Concentracin

2. Grfica de A Vs. Temperatura

a) Cul es la temperatura ptima de la enzima?

37C

b) Relacione esta temperatura con la temperatura corporal?

Se encuentra dentro del rango que la temperatura corporal normal. Es decir, que la enzima a 37C acta con su mxima eficacia, y se alcanza la Vmax de reaccin.

3. Grfica de A Vs. pH

c) Cul es el pH ptimo de la enzima?

pH 10.8

d) Tiene alguna relacin este pH con el sitio donde se encuentra la enzima. Explique

S. Porque la fosfatasa alcalina alcanza un pH ptimo prximo a 9.0. Y en ciertos lugares del cuerpo, como en el estmago se tiene un pH demasiado cido (ms o menos pH 1), mientras que la sangre suele ser ms alcalina (ms o menos 7.5).

e) Explique cmo es la afinidad de la enzima por el pNFP.

Es alta. Lo cual se puede evidenciar porque la Absorbancia (que es una medida indirecta de la cantidad de producto formado) aumenta a medida que se incrementa la concentracin de PNFP.

f) Para realizar la grfica de Velocidad Vs Concentracin:

Clculo de la Concentracin de PNFP utilizando la frmula ViCi= VfCf; despejando

Para todos los tubos: Ci=2.0mM y Vf=3.1ml

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

=0.019

=0.039

=0.058

=0.097

Clculo de la Velocidad utilizando la frmula:

Tubo 1

Tubo 2

Tubo 3

Tubo 4

=0.006

=0.013

=0.019

=0.032

g. Vmax = 0.032 Concentracin del sustrato: 0.039 V: 0.013

0.013Km+ 0.013x0.039=0.032x0.039

0.013 Km = (0.032x0.039)- (0.013x0.039)= 0.011973

Importancia Clnica:

Cul es la especificidad como biomarcador de la fosfatasa alcalina para el diagnstico de enfermedades?

La fosfatasa alcalina cataliza la hidrlisis de una gran variedad de monosteres fosfricos, a pH alcalino. Es una enzima ubicua que se encuentra principalmente en hgado, hueso, placenta e intestino, con un rol fisiolgico no completamente conocido. Es una ectoenzima involucrada en el transporte de grupos fosfato de compartimientos intracelulares al espacio extracelular.

Las fosfatasas alcalinas humanas constituyen una familia de enzimas. Es un grupo heterogneo formado por:

FAL tejido inespecfico: constituida por las formas mltiples: heptica, sea, renal, pulmonar y leucocitaria. Su origen es el mismo gen ancestral, diferencindose por modificaciones post-traslacionales.

FAL placentaria: derivada del sincicio trofoblstico de la placenta. El gen codificador presenta una gran variacin allica.

FAL intestinal: localizada en la membrana de las clulas con ribete en cepillo del intestino, con una posible variante en los tbulos renales.

FAL de clulas germinales: isoenzima presente en baja concentracin en las clulas germinales (testculo y ovario). Es sintetizada por las clulas de ciertos procesos tumorales.

La actividad total de la FAL srica refleja cambios en la produccin y en la liberacin de la enzima (fisiolgicamente, el recambio celular normal).3

El aumento en concentracin de la Fosfatasa Alcalina en el plasma qu causa?

Ante una concentracin aumentada de fosfatasa alcalina en sangre puede considerarse la posibilidad de que la enzima provenga de tejidos no hepticos. Para confirmar el origen hepatobiliar de la fosfatasa alcalina se puede medir la concentracin de otras enzimas procedentes del tracto biliar, como la 5-nucleotidasa o la glutamiltranferasa: una concentracin en el plasma de cualquiera de las dos indica que la fosfatasa alcalina es de procedencia hepatobiliar y no sea.

La concentracin de fosfatasa en plasma es la magnitud bioqumica con mayor sensibilidad diagnostica de la colestasis. Cuando se produce una obstruccin hepatobiliar, se induce la sntesis enzimtica de los hepatocitos adyacentes al canculo biliar y se forma una mayor cantidad de fosfatasa alcalina, que pasa a los sinusoides. Este aumento se refleja en una concentracin en el plasma elevado. Las elevaciones ms acusadas se dan en las obstrucciones extrahepticas, ya que sea por clculos biliares o por cncer de la cabeza del pncreas.4

La disminucin en concentracin de la fosfatasa Alcalina en plasma, qu causa?

La fosfatasa alcalina baja puede producirsntomastales como la fatiga, la taquicardia (pulso superior a 120 latidos por minuto), la dificultad para respirar, la intolerancia al fro, estreimiento o prdida de peso importante.Posibles causas

Deformacin de loshuesospor la edad

Postmenopausia en mujeres que se administran estrgenos para laosteoporosis

Enfermedades como laceliaqua, elhipotiroidismo, laenteritis

Carenciasde magnesio y zinc, de protenas

Lamalnutricin

En los nios puede ser debido a enfermedades congnitas, como elcretinismo y la acondroplasia

Ciruga cardaca

Lahipofosfatasiaes una enfermedad gentica metablica de los huesos cuya incidencia es muy baja, pero es muy grave. Cursa con niveles bajos de fosfatasa alcalina. Algunos de los sntomas son la baja mineralizacin del esqueleto, leves problemas respiratorios, osteomalacia progresiva. Quien la sufre suele perder sus dientes de leche mucho antes de la edad normal.

La fosfatasa alcalina disminuida tambin puede indicar unadisfuncin hepticagrave denominada insuficiencia hepatocelular que puede ser causada por lacirrosis(enfermedad en la que se destruyen de las clulas del hgado), o por unahepatitis(inflamacin del hgado).Tanto laanemiaperniciosa como la anemia aplsica suelen presentar valores bajos de fosfatasa alcalina. Laanemia aplsicaes la incapacidad del cuerpo para formar suficientes clulas sanguneas nuevas. Los sntomas son: fatiga, debilidad y hemorragias incontroladas. La mayora de los pacientes que sufren anemia aplsica suelen tener bajos niveles de fosfatasa alcalina pero no se sabe todava el por qu.Laleucemia mielgena crnicaes un tipo de cncer que progresa a un ritmo ms lento en comparacin con la leucemia. Este trastorno es tambin conocido por leucemia mieloide crnica o leucemia granuloctica crnica y afecta generalmente a personas mayores, su aparicin en los nios no es muy comn.

Adems de reducir los niveles de fosfatasa alcalina, esta enfermedad aumenta los niveles deleucocitosy agranda el tamao del bazo (esplenomegalia). Pero para diagnosticarla es necesaria una biopsia de la mdula espinal.5

Qu funcin hace el Citrato de Sodio y el Cl2Mg en la cintica enzimtica?

Los usos y aplicaciones del citrato de sodio se dan generalmente en tres industrias, la alimenticia, farmacutica y la qumica, pues con este compuesto se elaboran:

- Anticongelante

- Antioxidantes

- Aromticos

- Bebidas gaseosas

- Coagulante

- Colirios

- Enemas

- Gelatinas

- Helados

- Jamones

- Quesos

- Regulador de acidez

DISCUSIN

La actividad enzimtica se ve afectada por la presencia de ciertas soluciones, en este experimento se emple citrato de sodio el cual acta como inhibidor y el Cl2Mg como activador.

El tubo 1 estaba desprovisto de la presencia del citrato de sodio y del Cl2Mg, este present una absorbancia de 0.328; el tubo 2 estaba provisto de citrato de sodio el cual inhibi la actividad enzimtica y por ende se present una absorbancia menor (0.250) a comparacin del tubo 1; el tubo 3, igualmente tenia Citrato de sodio pero a diferencia de del tubo 2 en mayor cantidad por tanto la absorbancia fue menor (0.203); el tubo 4 posea Cl2Mg el cual activ la actividad enzimtica por consiguiente cuando se compara con el tubo 3 se evidencia un incremento de la absorbancia (0.410); y por ltimo, el tubo 5, posea las dos soluciones, el Citrato de sodio en una concentracin mayor (0.4) que el Cl2Mg (0.2) y por consiguiente presento una absorbancia menor que el tubo 4 por la accin inhibitoria del Citrato de Sodio pero con una absorbancia superior a la obtenida en los tubos dos y tres ya que tambin estaba bajo la accin activadora del Cl2Mg.

La fosfatasa alcalina es una enzima que hidroliza y son ms efectivas en un entorno alcalino debido a que el sustrato o producto de la reaccin enzimtica inhibe la actividad. En la inhibicin del sustrato haya una disminucin paulatinamente de la actividad a altas concentraciones de sustrato.

CONCLUSIONES

El valor de Km da nos muestra la afinidad de la enzima por el sustrato, a menor Km, mayor afinidad del enzima por el sustrato la enzima ha desarrollado ya la mitad de la velocidad mxima, y a menor Km, menor afinidad la enzima desarrolla la mitad de la velocidad mxima.

En la actividad enzimtica se necesita cofactores que permitan que la enzima sea activada.

Hay factores que afectan la velocidad de una reaccin enzimtica como concentracin del sustrato, pH , temperatura y presencia de inhibidores.

Los inhibidores pueden detener un sustrato de entrar en el sitio activo de la enzima o dificultar la enzima de catalizar la reaccin.

Referencias

1

2

3. Mara Beatriz Di Carlo, Alejandra Gabriela Gmez, Leticia Bibiana Madalena, Mara Laura Facio, Marco Antonio Pizzolato, Gustavo Alberto Negri. Utilidad de la fosfatasa alcalina urinaria como marcador precoz de lesin tubular renal [en lnea]. Acta bioqumica clnica latinoamericanav.41n.3 La Plata17 de agosto de2007

4. X. Fuentes Arderiu, M.J Castieiras Lacambra, J.M Queralt Campa.Bioqumica clnica y patologa molecular. II, Volumen 2 Reverte, 1998.

5. Cristina Alonso. Cules son las causas de la fosfatasa alcalina baja [En lnea]. < http://salud.uncomo.com/>

Grfica absorbancia Vs concentracion

absorbancia 00.050.10.20.30.607.0000000000000007E-27.5999999999999998E-28.2000000000000003E-29.1999999999999998E-20.14599999999999999

concentracion

Absorbancia

Grfica Velocidad Vs Concentracin

velocidad01.9E-23.9E-25.8000000000000003E-29.7000000000000003E-206.0000000000000001E-31.2999999999999999E-21.9E-23.2000000000000001E-2

Concentracion

Velocidad

efecto del fosfato sobre la actividad enzimtica

absorbancia blanco tubo 1tubo 2tubo 3tubo 5tubo 600.210.170.102999999999999990.250.20699999999999999

efecto del magnesio y el citrato sobre la actividad enzimtica

absorvancia blanco tubo 1tubo 2tubo 3tubo 4tubo 500.328000000000000010.250.203000000000000010.410.25800000000000001