laboratÓrios de engenharia genÉtica - w3.ualg.ptw3.ualg.pt/~jbelo/documentos/labprotocols-leg...

Laboratórios de Engenharia Genética – 2006/07 página 1 de 40

PROGRAMA E PROTOCOLOS PRÁTICOS DA DISCIPLINA DE

LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA

José António Henriques de Conde Belo

Faculdade de Engenharia de Recursos Naturais

Faro, Fevereiro de 2007



Objectivos gerais dos trabalhos práticos A construção de uma molécula de DNA recombinante que permitirá a produção e inactivação in vitro de uma proteína. OBJECTIVOS ESPECÍFICOS 1. Inserir um “Tag” numa sequência de um cDNA específico. 2. Subclonar este fragmento modificado do gene Cerl2 de ratinho no vector plamídico

de expressão pCS2+. 3. Transformar a estirpe XL-1 de E. coli com o DNA recombinante e seleccionar as

colónias transformadas. 4. Induzir a expressão/inactivação desta proteína recombinante em Reticulócitos de

coelho . 5. Análise de proteínas em gel de poliacrilamida. Objectivos Adquirir experiência em: • isolar DNA plasmídico em pequena escala. • utilizar enzimas de restrição e DNA ligase. • transformação de bactérias • sequenciação de DNA • produção/inactivação de proteínas em bactérias. • visualisação de proteínas em geis de poliacrilamida. • planeamento de experiências e interpretação de resultados. Sumário das aulas: A primeira tarefa será a preparação e análise por enzimas de restrição de um plasmideo contendo o cDNA de interesse. A este cDNA será inserido uma “tag” por PCR na sua região 3’ de modo a poder ser produzida uma proteína recombinante. Este “tag” codifica um epitopo de 19 aminoácidos contra o qual existe um anticorpo monoclonal específico. Este fragmento de PCR será posteriormente digerido com enzimas de restrição de modo a originar extremidades coesivas (EcoRI e XbaI) para ligar no vector de expressão. De modo a analizar-se a eficiência da digestão, e de modo a obter-se o fragmento de DNA a subclonar, o DNA digerido será corrido em gel de agarose. O fragmento desejado deverá nesta altura ser isolado do gel. O fragmento isolado e o vector linearisado, com as mesmas enzimas, serão então misturados e a ligação fragmento-vector efectuada por adição de DNA ligase. A mistura de ligação assim obtida será utilizada na transformação


de células de E. coli competentes, e a selecção de colónias transformadas com o DNA recombinante será feita por plaqueamento em meio contendo ampicilina. Este cDNA recombinante será introduzido no vector de expressão pCS2+ e posteriormente digeridos com estas endonucleases de restricção de modo a verificar a eficiência da clonagem. Em seguida será sequenciado para confirmação de que a sequência recombinante está correcta. Este vector de expressão recombinante será utilizado para induzir a expressão desta proteína em reticulócitos de coelho. Este sistema in vitro de transcricção/tradução é muito utilizado devido á sua elevada eficiência e fiabilidade. Ao mesmo tempo que estaremos a activar esta transcricção/tradução da proteína recombinante de interesse iremos testar a eficácia de um “Oligonucleótido Morfolino” especifico para impedir a tradução e consequente produção da proteína recombinante. Estas proteínas serão então analisadas em gel de poliacrilamida por coloração com Azul de Bromofenol. Simulação em computador – “Gene Isolation and Characterization” da Biotol. Propriedades importantes do plasmídeo pBlueScript KS (pBS KS; ver Anexo 1). 1. Contém vários locais unicos de digestão para diversos enzimas de restrição,

agrupados numa região do plasmídeo denominada local multiplo de clonagem (LMC).

2. O plasmídeo pBS contém o gene de resistência à ampicilina, permitindo que as células transformadas sejam seleccionadas em placas com meio contendo ampicilina. A E. coli é sensível à ampicilina e não pode crescer na presença desta droga, e apenas as células que incorporaram o plasmídeo (células transformadas) conseguem crescer.

Propriedades importantes do plasmídeo pCS2+ (ver Anexo 2).

1. Contém vários locais unicos de digestão para diversos enzimas de restrição, agrupados numa região do plasmídeo denominada local multiplo de clonagem (LMC).

2. contém um local de ligação á RNA polimerase 6 (SP6) na regiao 5’ do LCM e um local de PoliAdenilação a 3’.


“FLOW CHART” DAS AULAS PRÁTICAS

Trabalho 1: Isolamento de DNA plamídico contendo o cDNA (pBS-Cerl2) de culturas de E. coli. (14/03)

Digestão do DNA com enzimas de restricção. (15/03) Análise do DNA em gel de agarose.

Trabalho 2: Estratégia de cloning e “tagging” deste cDNA por PCR. (16/03)

Análise e extração do fragmento de PCR em gel de agarose. (19/03) Digestão do produto de PCR. Digestão do vector pCS2+.

Trabalho 3: Análise e extração dos fragmentos de DNA em gel de agarose. (20/03)

Ligação do fragmento de DNA ao vector digerido.

Trabalho 4: Preparação de células competentes (21/03) Transformação de células competentes com a mistura de ligação. (22/03)

Plaqueamento das células em meio contendo ampicilina.

Trabalho 5: Análise dos transformantes; lançamentos das culturas (23/03); (25/03–Prof) Isolamento de DNA plamídico da aula anterior, de culturas de E. coli. (26/03)

Digestão do DNA com enzimas de restricção. Análise do DNA em gel de agarose. (27/03)

Trabalho 6: Reacção de sequênciação dos clones positivos da aula anterior. (27/03) Limpeza dos produtos de PCR da reação de sequenciação. (28/03)

Trabalho 7: Análise das reações de sequenciação. (29/03) Expressão/inactivação da proteína em Reticulócitos de coelho.

Trabalho 8: Análise das proteínas em geis de poliacrilamida. (30/03) Análise dos géis e discussões sobre os trabalhos (10/04)

Trabalho 9-10: Simulação em computador utilizando o programa “Gene Isolation and

Characterization” da Biotol. (11, 12/04)


LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA TRABALHO PRÁTICO 1

EXTRACÇÃO, RESTRICÇÃO E ELECTROFORÉSE DE DNA PLASMÍDICO DE E. COLI Trabalho Prático 1 – Isolamento do plamídeo contendo o cDNA (pBS-Cerl2).

- Digestão do DNA com enzimas de restricção. - Análise do DNA em gel de agarose.

Objectivos Pretende-se com este trabalho isolar o vector plasmídico contendo o cDNA (pBS-Cerl2; ver Anexo 3 e 4), que estão presentes em células transformadas de E. coli. Introdução Existem vários métodos de extracção de DNA plasmídico. O método utilizado neste trabalho consiste numa modificação do método de lise alcalina (Birnboim & Doly, 1979). O processo, que permite a extracção de DNA plamídico de células de bactéria, consiste em provocar a lise destas numa solução fortemente alcalina (de hidróxido de sódio) contendo SDS (dodecil sulfato de sódio). Esta solução causa simultaneamente a dissolução da membrana plasmática, a desnaturação de macromoléculas (proteínas e DNA) e a hidrólise do RNA. As macromoleculas são depois precipitadas por adição de acetato de potássio (KAc), e devido ao pH ácido desta solução o pH do lisado é neutralisado. O reequilíbrio do pH permite a renaturação do DNA plasmídico, restabelecendo a sua conformação original. O DNA genómico, devido às suas dimensões e estrutura, não consegue voltar à sua forma nativa, permanecendo sob a forma de agregados complexos. Após a adição do KAc é pois possivel, por centrifugação, separar um sedimento, constituído por membranas, proteínas e DNA cromossómico, de um sobrenadante onde o DNA plamídico se encontra dissolvido. Uma desproteinização mais profunda desse sobrenadante pode posteriormente ser levada a cabo utilizando-se uma mistura de fenol-clorofórmio (1:1), de modo a obter DNA plasmídico suficientemente puro e assim adequado a servir de substrato para os enzimas de restrição. No final, o DNA plasmídico purificado é precipitado com etanol, seco sob vácuo, e ressuspenso em tampão TE. Birnboim, HC & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7: 1513-1523.


Plasmid Miniprep Cada grupo vai fazer 2 extracções (2 tubos Eppendorf iniciais). Em cada tubo: 1. Centrifugar 1,5 ml da cultura de E. Coli, durante 5 min. a 2,000 rpm; eliminar o

sobrenadante e adicionar 200ul GTE

2. Vortex durante 2 min. para ressuspender o “pellet e adicionar 5ul Rnase A (solução

stock a 10mg/ml).

3. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.

4. Adicionar 400ul, de uma solução 0.2M NaOH / 1% SDS (preparado na altura);

5. Misturar por inversão e colocar os tubos em gelo durante 5 min.

6. Adicionar 300ul acetato de potássio (3M, pH 4,5);

7. Misturar por inversão e colocar os tubos em gelo durante 10 min.

8. Centrifugar o lisado durante 10 minutes a 12,000 rpm;

9. Transferir 0,7 ml do sobrenadante para novos tubos de microcentrifuga, contendo

0,8 ml de etanol arrefecidos a 4oC,

10. Misturar por inversão e colocar os tubos em gelo durante 15 - 30 min. para

precipitação do DNA.

11. Separar o precipitado por centrifugação, durante 10 min. a 12,000 rpm.

12. Deitar fora o sobrenadante, invertendo o tubo em cima de uma toalha de papel, e

batendo ligeiramente no tubo. É preciso cuidado tanto ao despejar o sobrenadante como

posteriormente, para não perder a pellet.

13. Lavar o sedimento de DNA plasmídico com 1ml de etanol a 70%.

14. Separar o precipitado por centrifugação, durante 10 min. a 12,000 rpm

15. Retirar o excesso de etanol com uma micropipeta

16. Secar o “pellet” ao ar livre (aproximadamente 15 min.)

17. Adicionar 50 ul de TE

18. Guardar a –20ºC e/ou prosseguir para digestão com enzimas de restrição.

Soluções: TE: 10 mM Tris 1 mM EDTA, pH 8.0


RESTRICÇÃO E ELECTROFORÉSE DE DNA DE PLASMÍDEO Os objectivos deste trabalho são visualizar o DNA de plasmídeo extraído previamente. Pretende-se fazer estimativa do tamanho das moléculas e da quantidade de DNA obtida, através de comparação com marcadores de tamanho e de marcadores de peso molecular, após electroforése em gel de agarose. Tem-se também em vista a observação das diversas conformações que o DNA de plasmídeo pode apresentar através da mobilidade diferencial daquelas formas sujeitas a electroforése.

1. Digestão de DNA de plasmídeo com EcoRI/XbaI e com HindIII :

Estas enzimas são endonucleases de restricção presentes no polylinker do plasmídeo. A digestão do DNA com esta enzima vai conduzir ao aparecimento de 2 bandas, o que vai ser observado após electroforése.

1.a) Preparar as seguintes reacções de digestão

Amostra DNA (ul) EcoRI/XbaI (ul) HindIII (ul) Buffer10x (ul) H2O (ul) Total (ul)

DNA p 1.0 0.5/0.5 ----- 1.5 11.5 15.0

DNA p 1.0 ----- 0.5 1.5 12.0 15.0

DNA p 1.0 ----- ----- 1.5 12.5 15.0

DNAp – DNA plasmídico

b) Incubar a reacção no banho a 37° C, durante pelo menos 60 min. 2. Parar a reacção de digestão juntando 2 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um

dos tubos. 3. Preparação do gel de agarose:

Preparar 80 ml de 1.0 % agarose em TBE, a partir de TBE 10x. Aquecer no micro-ondas até dissolver a agarose, com agitação. Arrefecer (até cerca de 50° C). Adicionar 4.0 µl de Brometo de Etídeo do stock (a 10mg/ml). O brometo de etídeo é um agente mutagénico forte e deve ser manipulado sempre com luvas e muito cuidado.


Enquanto a solução de agarose arrefece, preparar o tabuleiro com dois pentes e fita adesiva. Despejar devagar solução de agarose suficiente. Deixar solidificar durante 20-30 min. Retirar a fita e os pentes e introduzir o tabuleiro com o gel na tina contendo TBE (300 ml), com os poços onde vão ser colocadas as amostras perto do eléctrodo negativo (azul).

4. Electroforése em gel de agarose:

Os plasmídeos encontram-se geralmente em várias conformações, tais como a forma circular fechada super-enrolada (“supercoiled”) que é compacta e tem maior mobilidade no gel do que as outras formas; a forma circular aberta que tem pelo menos um corte numa das cadeias (a forma menos móvel); e a forma linear em que os cortes ocorreram nas duas cadeias num sítio próximo, como é o caso das moléculas digeridas com uma enzima de restrição.

a) As amostras de DNA vão ser introduzidas no gel, ao lado do marcador de tamanho (1 kb Plus DNA Ladder), para fazer uma estimativa do tamanho e da quantidade das moléculas de DNA. Usar 5,0 µl do 1 kb ladder (contendo um total de 500 ng de DNA)

b) Correr o gel a 100V, durante 30-60 min.

c) O gel corado com brometo de etídeo pode ser visualizado sobre uma fonte de UV, com uma máscara protectora, e fotografado.

Restricção e electroforése de DNA de plasmídeo:

DNA do plasmídeo pBS-Cerl2 foi extraído de E. coli e submetido a electroforése em gel de agarose. A amostra foi também analisada por electroforése após digestão do DNA de plasmídeo com endonucleases de restricção cujas sequências de reconhecimento são únicas no plasmídeo.

Da observação do gel, pretende-se: 1. Identificar os padrões de tamanho (1kb Plus DNA Ladder) e de peso molecular e

as amostras correspondendo ao DNA do plasmídeo digerido com as endonucleases de restricção.

2. Identificar as diversas conformações presentes no DNA de plasmídeo tais como a

molécula linear, as formas superenroladas, circulares abertas, e os múltiplos. 3. Estimar o tamanho e a quantidade do DNA de plasmídeo através da comparação

com os padrões de tamanho e peso molecular conhecidos. 4. Referir a concentração das amostras analisadas em µg/µl.


Soluções: TBE 10x, pH 8.3:

0.89 M Tris.base 0.89 M Ácido Bórico

0.02 M Na2EDTA.2H2O Gel loading buffer: 0.25% azul bromofenol 40% glicerol

NOTA: Para fácil referência, há uma dupla de bandas mais afastadas das outras, a 2,000 e

a 1,650 pb. A banda de 1,650 pb contém aproximadamente 10% do total de DNA

presente em todas as bandas.



“TAGGING” DO CDNA POR PCR Trabalho Prático 2 – Estratégia de cloning e “tagging” deste cDNA por PCR. - Análise e extração do fragmento de PCR em gel de agarose. - Digestão do produto de PCR.

- Digestão do vector pCS2+. Objectivos Pretende-se com este trabalho inserir um “tag” no porção 3’ do cDNA presente no vector plasmídico pBS-Cerl2. O método de PCR, introduzido inicialmente por Saiki et al. (1985) e Mullis & Faloona

(1987), foi utilizado para tentar obter uma ampliação selectiva de genes de interesse.

Este método utiliza uma enzima DNA polimerase termoestável para copiar in vitro uma

determinada região da molécula de DNA, região esta que é condicionada pelo uso de

pequenos “primers” que hibridam com locais individualizados dos cadeias de DNA

delimitando assim o fragmento a amplificar. Este técnica permite amplificar uma

molécula vários biliões de vezes em poucas horas (Eidne, 1991), sendo particularmente

útil quando se analisa tipos de mRNA pouco abundantes ou quando as quantidades de

tecido disponível são limitadas (Dallman & Porter, 1993).

O PCR é um processo cíclico em que os seguintes passos, são repetidos durante um

número determinado de vezes: A cadeia dupla de DNA é desnaturada por aquecimento,

obtendo-se duas cadeias simples; os primers introduzidos na reacção ligam-se com zonas

homologas em cada uma destas cadeias; a DNA polimerase cataliza a produção de novas

cadeias complementares. Cada uma destes ciclos, que demora apenas alguns minutos,

duplica a quantidade da DNA pretendida, deixando-a como uma cadeia dupla.

Os reagentes necessários são, para além da enzima, primers e DNA, nucleótidos livres

(dNTP) para construção das cadeias e uma solução-tampão da reacção buffer, que

estabelece as condições óptimas para a enzima.


O “tag” a adicionar, na região 3’’ do cDNA de Cerl2, vai codificar para o epitopo

designado “FLAG” (contra o qual existe um anticorpo monoclonal), cuja sequência de

aminoácidos é: DYKDDDDK. Para visualização do produto final pretendido ver Anexo5.

Objectivos:

• Aprendizagem da técnica PCR

• Adicionar uma sequencia de nucleotídeos ao cDNA de Cerl2 contido no

plasmideo pBS SK.

Protocolo

Amostras: DNA plasmídico do pBS-Cerl2. 1. Retirar a amostra de DNA plasmídico que deverá estar guardada no congelador.

2. Deixar descongelar à temperatura ambiente

3. Preparar 1 tubo de PCR com as quantidades de reagentes indicadas na tabela 1,

4. Adicionar a amostra de DNA plasmídico (200 ng) ao tubo preparado em 3. A

quantidade de amostra a usar será dada pelo prof. pois poderá ter de proceder a

uma diluição

5. Adicionar aos tubos 1 gota de óleo mineral antes de os colocar no aparelho PCR

Tabela 1 - Quantidades (em µ l) de reagentes utilizados em cada tubo de reacção dNTPs

10mM

10XPCR

buffer

Enzima

Taq

Primer F

20pmol

Primer R

20pmol

H2O

esterile

DNA

PBS-

Cerl2

1.0 2.5 0.4 1.0 1.0 18.1 1.0

PRIMERS UTILIZADOS:

Primer Forward: T3 – AATTAACCCTCACTAAAGGG

Primer Reverse: cerl2-Flag-XbaI (5’CCGCTCGAGTCACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCT

CCTCCTCCCAGCTTCGGGCGGCACTGACACTTCTGG-3’).


Programa PCR

1 ciclo → desnaturação inicial 94oC, 2 min

20 ciclos→ desnaturação 94oC, 30 segundos

hibridação 55oC, 30 segundos

extensão 72oC, 1 min

1 ciclo→ extensão final 72oC, 10 min

1 ciclo→ Manutenção 4oC, 24 Horas

6. Parar a reação definitivamente adicionando 3.0 µl de GLB. ------------------------------- ANÁLISE E EXTRAÇÃO DO FRAGMENTO DE PCR. NOTA: Começar por fazer um Gel de agarose 1% Método de “QIAquick Gel Extraction Kit” 1- Preparar um gel de 1.0 % agarose em TBE 2- O volume total das amostras obtidas pela reação de PCR são introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 µl de DNA Ladder. Correr a 100V durante 1 hora. 3-Cortar a banda do gel e colocar num tubo eppendorf. 4- Adicionar 300 µl Buffer QG. 5- Incubar a 50ºC durante 10min ou até ao gel se dissolver completamente. (vortexar ao fim de 5min). Protocol 6. Place a QIAquick spin column in a provided 2 ml collection tube.

7. To bind DNA, apply the sample to the QIAquick column, and centrifuge for 1

min.

The maximum volume of the column reservoir is 800 µl. For sample volumes of more

than 800 µl, simply load and spin again.

8. Discard flow-through and place QIAquick column back in the same collection

tube.


Collection tubes are re-used to reduce plastic waste.

9. (Optional): Add 0.5 ml of Buffer QG to QIAquick column and centrifuge for 1

min.

This step will remove all traces of agarose. It is only required when the DNA will

subsequently be used for direct sequencing, in vitro transcription or microinjection.

10. To wash, add 0.75 ml of Buffer PE to QIAquick column and centrifuge for 1

min.

Note: If the DNA will be used for salt sensitive applications, such as blunt-end ligation

and direct sequencing, let the column stand 2–5 min after addition of Buffer PE, before

centrifuging.

11. Discard the flow-through and centrifuge the QIAquick column for an additional

1 min at 13,000 rpm (~17,900 x g).

IMPORTANT: Residual ethanol from Buffer PE will not be completely removed unless

the flow-through is discarded before this additional centrifugation.

12. Place QIAquick column into a clean 1.5 ml microcentrifuge tube.

13. To elute DNA, add 50 µl of Buffer EB (10 mM Tris·Cl, pH 8.5) to the center of

the QIAquick membrane and centrifuge the column for 1 min. Alternatively, for

increased DNA concentration, add 30 µl elution buffer to the center of the

QIAquick membrane, let the column stand for 1 min, and then centrifuge for 1 min.

IMPORTANT: Ensure that the elution buffer is dispensed directly onto the QIAquick

membrane for complete elution of bound DNA. The average eluate volume is 48 µl from

50 µl elution buffer volume, and 28 µl from 30 µl. Elution efficiency is dependent on pH.

The maximum elution efficiency is achieved between pH 7.0 and 8.5. When using water,

make sure that the pH value is within this range, and store DNA at –20°C as DNA may

degrade in the absence of a buffering agent. The purified DNA can also be eluted in TE

(10 mM Tris·Cl, 1 mM EDTA, pH 8.0), but the EDTA may inhibit subsequent enzymatic

reactions.

13- Usar 2.0µl deste DNA + 1 µl de GLB + 7.0µl H2O. Correr em gel de agarose para verificar a eficiência da extração.


DIGESTÃO COM ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Pretende-se agora digerir o produto de PCR e o vector de expressão pCS2+ com enzimas de restrição de modo a que se possa proceder á clonagem do fragmento no novo vector.

1.a) Preparar as seguintes reacções de digestão

Amostra DNA (ul) EcoRI (ul) XbaI (ul) Buffer10x (ul) H2O (ul) Total (ul)

PCR 10.0 1.0 1.0 2.0 6.0 20.0

DNA p 5.0 1.0 1.0 2.0 11.0 20.0

DNAp – DNA plasmídico pSC2+; PCR- fragmento de PCR.

b) Incubar a reacção no banho a 37° C, durante a noite (ON). 2. Parar a reacção de digestão juntando 2 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um

dos tubos.



PREPARAÇÃO DE REAÇÕES DE LIGAÇÃO Trabalho Prático 3 – Análise e extração dos fragmentos de DNA em gel de agarose. - Ligação do fragmento de DNA ao vector digerido. Objectivos: pretende-se preparar os fragmentos de DNA necessários para proceder á

reação de ligação que permitirá subclonar o fragmento de DNA recombinante resultante do PCR, no novo vector de expressão pCS2+.

Método de “QIAquick Gel Extraction Kit” 1- Preparar um gel de 1.0 % agarose em TBE 2- O volume total das amostras obtidas pela reação de restrição da aula Prática 2, são adicionadas introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 µl de DNA Ladder. Correr a 100V durante 1 hora. 3- Prosseguir com o método de ““QIAquick Gel Extraction Kit”” de acordo com o

protocolo da aula Prática 2 de modo a isolar as duas bandas de DNA. 4- Ressuspender os produtos em 30.0µl de Buffer EB. REACÇÃO DE LIGAÇÃO 1- Proceder á reação de ligação do seguinte modo: TUBO PCR (ul) vector (ul) DNA ligase (ul) Buffer 5x (ul) H2O (ul) Total (ul)

1 6.0 6.0 0.5 4.0 3.5 20.0

PCR - fragmento de PCR digerido; vector – pCS2+ digerido;

b) Incubar a reacção a 16° C, durante a noite (ON) ou 2 horas TA.



TRANSFORMAÇÃO DO CDNA RECOMBINANTE Trabalho Prático 4 – Preparação de células competentes

- Transformação de células competentes com a mistura de ligação. - Plaqueamento das células em meio contendo ampicilina.

PREPARAÇÃO DE CÉLULAS COMPETENTES DE E. COLI

Certas estirpes de E. coli podem-se tornar competentes para transformação com DNA plasmídico através de tratamento com catiões, tais como Ca2+, Mn2+ ou Co3+. Uma solução 0.1M de CaCl2 é utilizada frequentemente para este fim. O objectivo deste trabalho é a obtenção de células competentes de E. coli para transformação genética. 1. Preparar uma cultura de E. coli em meio LB com uma densidade óptica a 550 nm

(A550) de 0.4-0.6, o que corresponde à fase logarítmica de crescimento. (Requer a inoculação da cultura no dia anterior e diluição 1:500 no dia de utilização.)

2. Transferir assepticamente 25 ml de cultura para tubo esterilizado. Reduzir a

temperatura da cultura para aprox. 0° C, mantendo o tubo no gelo durante 10 min. As células devem ser mantidas a baixas temperaturas e manuseadas com cuidado durante todo o procedimento, porque o tratamento necessário para as tornar competentes torna-las mais frágeis.

3. Centrifugar a cultura a 1 000 rpm e a 4° C, durante 10 min. 4. Despejar o sobrenadante e adicionar 10 ml de CaCl2 0.1M frio. Agitar com cuidado

para ressuspender a pellet (sobre gelo). Após ressuspensão, incubar no gelo durante 20 min.

5. Centrifugar novamente as células a 1 000 rpm e a 4° C, durante 10 min. 6. Despejar o sobrenadante e ressuspender a pellet em 1 ml de CaCl2 0.1M frio. Incubar

no gelo durante 10 min. 7. Neste ponto, as células estão competentes e prontas a ser transformadas. Podem

também ser armazenadas a -70° C durante alguns meses, sem grandes perdas de competência. Distribuir as células em aliquotas de 200 µl, em tubos Eppendorf previamente identificados e congelar rapidamente em azoto líquido.


TRANSFORMAÇÃO GENÉTICA DE E. COLI

Transformação genética pode ser definida como a incorporação estável e hereditável de DNA exógeno por células de um hospedeiro. Em certas bactérias, a transformação ocorre naturalmente o que contribui para o aumento da variabilidade genética das populações. Outras bactérias, tais como a E. coli, têm que ser tornadas competentes para transformação antes de poderem ser transformadas (Prática 3). Com este trabalho vamos colocar células competentes de E. coli em presença de DNA exógeno, com o fim de obter células transformadas. 1. Cada grupo vai fazer três transformações- com a reacção de ligação da Prática 3 , um

controlo constituído por células competentes com DNA circular e um controlo constituído por células competentes sem DNA. Descongelar/utilizar portanto, 3 tubos com 200 µl de células competentes, no gelo.

2. Etiquetar cada tubo e adicionar 10.0µl do DNA ou H2O no fundo de cada tubo,

“mexendo” brevemente com a ponta. Incubar no gelo durante 30 min. 3. Remover os tubos do gelo directamente para um banho aquecido a 42° C, incubar

durante 90 segundos a 42° C, e de novo no gelo durante 2 min, causando um choque térmico.

4. Adicionar 700 µl de meio SOC a cada tubo, e incubar a 37° C durante 45 min. Este é

o período de recuperação das células. 5. Transferir aliquotas de 100 µl de cada transformação e do controlo para uma placa de

Petri contendo meio LB com 50 µg/ml ampicilina e para uma placa contendo meio LB sem antibiótico. O antibiótico permite seleccionar as células transformadas através do gene de resistência presente no plasmídeo.

6. Espalhar o inóculo na superfície do meio com um espalhador esterilizado à chama, e

manter a placa semi-aberta na câmara de fluxo laminar durante 15-20 min até que o líquido seja absorvido pelo meio de cultura.

7. Incubar as placas de Petri invertidas, numa estufa a 37° C durante 18-24h.


Soluções: Meio de cultura SOC (1l): Triptona 20 g Extracto de levedura 5g NaCl 0.5g glucose 20 mM Meio de cultura LB

(1l): Triptona 10 g Extracto de levedura 5g NaCl 10g



TRABALHO PRÁTICO 5

ANÁLISE DOS RESULTADOS DA TRANSFORMAÇÃO

Trabalho Prático 5 – Calcular a eficiência de transformação.

- Isolamento de DNA plamídico da aula anterior, de culturas de E. coli.

- Digestão do DNA com enzimas de restricção. - Análise do DNA em gel de agarose.

Transformação genética de E. coli

Para efectuar a transformação genética, células competentes da bactéria são postas em contacto com DNA exógeno (DNA de plasmídeo). Após um período de recuperação, em que as células são submetidas a condições óptimas de crescimento, as células são incubadas no meio de selecção. Cada célula transformada exibe o fenótipo de resistência ao antibiótico de selecção, conferido pelo gene presente no plasmídeo, e vai formar uma colónia no meio de cultura.

O sucesso da transformação é medido através da eficiência de transformação,

definida como o número de células hospedeiras transformadas por micrograma de DNA:

no de células volume final da Eficiência transformadas suspensão celular (ml) de = x Transformação µg de DNA usado volume de suspensão usado (ml)

Da análise das placas de Petri com as transformações e o controlo incubadas em meio LB com ou sem antibiótico, observar:

1. A viabilidade das células competentes através do crescimento do controlo em

meio LB. 2. A ausência de resistência à ampicilina das células competentes indicada pela

ausência de crescimento em meio com antibiótico.


3. A incorporação do plasmídeo pelas células competentes indicada através da

aquisição de resistência à ampicilina. 4. Cálculo da eficiência de transformação.

ISOLAMENTO DE DNA PLASMÍDICO Plasmid Miniprep Cada grupo vai fazer 2 extracções (2 tubos Eppendorf iniciais) de duas colónias

individuais resultantes da reação de ligação/transformação da aula Prática 4. 1- Proceder á extração de DNA plasmídico de acordo com o Protocolo Plasmid Miniprep da aula Prática 1. 2- Ressuspender o DNA plasmídico num volume final de 50.0µl de TE. 3- Preparar as seguintes 2 reacções de digestão

Amostra DNA (ul) EcoRI/XbaI (ul) Buffer10x (ul) H2O (ul) Total (ul)

DNA p 1.0 0.5/0.5 1.5 11.5 15.0

DNAp – DNA plasmídico

4- Incubar a reacção no banho a 37° C, durante pelo menos 60 min. 5- Parar a reacção de digestão juntando 2 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um

dos tubos. 6- Preparar um gel de 1.0 % agarose em TBE 7- O volume total das amostras obtidas pela reação de restrição da no ponto 5, são introduzidas no gel. Adicionar numa linha, 4.0 µl de DNA Ladder. Correr a 100V durante 1 hora. 8- Tirar fotografia e analisar o padrão das bandas de DNA.



PREPARAÇÃO DE REAÇÕES DE SEQUENCIAÇÃO Trabalho Prático 6 – Reacção de sequênciação dos clones positivos da aula anterior.

- Limpeza dos produtos de PCR da reação de sequenciação. Objectivos Pretende-se com este trabalho determinar a sequência de nucleótidos correcta do cDNA recombinante contido no vector pCS2+-Cerl2-Flag. Introdução A determinação da sequência de nucleótidos que compõem um fragmento de DNA clonado representa um dos processos finais na análise de DNA. A capacidade de sequenciar DNA rapidamente teve um impacto revolucionário na Biologia. Crucial para os processos de sequenciação, foi o desenvolvimento de electroforese em gel de acrilamida vertical que permite separar cadeias de DNA com centenas de nucleótidos e com apenas um nucleótido de diferença entre elas (a mais ou a menos). O método laboratorial mais comum de sequenciação de DNA, conhecido como o método de Sanger ou método de terminação de cadeias. Este envolve a síntese de novo de uma série de cadeias simples de DNA, usando como molde a cadeia de DNA que se quer sequenciar. As cadeias sintetizadas são terminadas prematuramente nos vários tamanhos possíveis. A síntese começa sempre num ponto definido (por um primer) e termina por incorporação de nucleótidos terminadores. Estes são derivados didesoxi dos nucleótidos normais que, não possuindo um grupo hidroxilo na posição 3’ da desoxirribose, impedem as ligações fosfodiestéricas do DNA. Consequentemente, termina a incorporação de nucleótidos à cadeia de DNA que está a ser sintetizada. Os quatro terminadores serão abreviadamente designados ddA, ddC, ddG e ddT. Um fragmento de DNA clonado num plasmídeo representa um substrato típico para sequenciação. O primeiro passo é a separação (desnaturação) das cadeias de DNA. Em seguida, um pequeno oligonucleótido primer (aproximadamente 20 resíduos) é emparelhado numa zona adjacente ao DNA clonado, normalmente em sequências conhecidas do plasmídeo. Uma DNA polimerase é utilizada para sintetizar DNA a partir do primer. Hoje em dia, para que o DNA fique marcado utilizam-se compostos que emitem fluorescência a cores diferentes em cada um dos terminadores utilizados e depois são analisados num aparelho chamado “Sequenciador Automático”. A função deste aparelho é resolver as diferentes emissões que vão passando ao longo do tempo num detector Laser e interpretar assim a sequência de nucleotides continda na amostra de DNA analisada.


PROTOCOLO PARA SEQUENCIAÇÃO CICLICA Este protocolo utiliza uma mistura de reacção (BigDye Terminator v1.1) que por adição

da amostra e primers especificos, permite a determinação da sequência de nucleótidos após uma reacção de PCR e análise num Sequenciador Automático

1- Para cada reacção de sequenciação misturar os seguintes componentes: a) Terminator Ready Reaction Mix 4.0µl b) Amostra de DNA pCS2+-Cerl2-Flag (300-500ng) 1.0µl c) Primer de sequenciação SP6 (3.2pmol) 1.0µl d) H2O 4.0µl Volume final 10.0µl 2- Misturar bem e colocar os tubos no aparelho de PCR. Programa para Sequenciação por PCR:

1 ciclo → desnaturação inicial 96oC, 1 min

25 ciclos→ desnaturação 96oC, 10 segundos

hibridação 50oC, 10 segundos

extensão 60oC, min

1 ciclo→ Manutenção 4oC, 24 Horas

PURIFICAÇÃO DAS REAÇÕES POR PRECIPITAÇÃO COM ETANOL/NaAc. 1- Retirar os tubos do Termociclador e centrifugar por instantes 2- adicionar a cada tubo: 10.0µl de H2O 2.0µl de 3M NaAc, pH 4.6 50.0µl de 95% Etanol. 3- Transferir para um tubo eppendorf e e misturar bem. 4- Incubar a TA durante 30 minutos para precipitar os produtos de extensão.


5- Centrifugar a 4ºC durante 10 min. a 14,000 rpm. 6- Retirar o sobrenadante com uma micropipeta e deitar fora. 7- Lavar o sedimento com 250µl de etanol a 70%. 8- Centrifugar a 4ºC durante 10 min. a 14,000 rpm. 9- Retirar o sobrenadante com uma micropipeta e deitar fora. 10- Secar o “pellet” ao ar livre (aproximadamente 15 min.). 11- Guardar a –20ºC. As amostras estão agora prontas para serem analisadas no Sequenciador Automático.



TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO IN VITRO Trabalho Prático 7 – Análise das reações de sequenciação.

- Expressão/inactivação da proteína em Reticulócitos de coelho. Objectivos Pretende-se com este trabalho determinar a sequência de nucleótidos correcta do cDNA recombinante contido no vector pCS2+-Cerl2-Flag. Pretendese depois utilizar este cDna recombinante num sistema de transcrição/tradução in vitro (sistema “TNT” da Promega) para testar a produção da proteína e sua inactivação por “Oligonucleótidos de Morfolino” especificos. Introdução Quando a região codificante de um cDNA é clonada num plasmídeo, adjacente a um promotor, a respectiva proteína pode ser expressa in vitro por sistemas de transcrição e tradução. Estes sistemas são menos eficientes do que a expressão in vivo, obtendo-se muito menos proteína. No entanto, a proteína pode ser marcada por incorporação de aminoácidos radioactivos, uma marcação que é específica e facilita a sua detecção. Nos sistemas de transcrição são utilizados promotores víricos, como os dos fagos T7, T3 e SP6, pois as RNA polimerases envolvidas actuam exclusiva e eficientemente nos respectivos promotores. O mRNA, codificado pelo cDNA, é sintetizado numa reacção in vitro que contém o plasmídeo recombinante isolado e a correspondente RNA polimerase purificada. A transcrição na presença de nucleótidos radioactivos permite a marcação do mRNA, com alta actividade específica, e a sua utilização como sonda em experiências de hibridação. Alternativamente, o mRNA pode ser traduzido in vitro para produzir a respectiva proteína. Os sistemas de tradução utilizam extractos celulares, como lisados de reticulócitos de coelho, que contêm grandes quantidades de todos os componentes necessários à síntese de proteínas. A utilização destes extractos celulares envolve um tratamento prévio para destruir o mRNA endógeno que eles possuem. Assim, quando um mRNA específico é adicionado aos extractos, como o obtido por transcrição de um plasmídeo recombinante, apenas é produzida a proteína desejada. Estas proteínas marcadas podem ser usadas em diversos tipos de experiências, tais como estudos de processamento, interacções com outras proteínas ou moléculas, distribuição celular e muitas outras.


OLIGONUCLEÓTIDOS MORFOLINO Estes são compostos sintéticos de bases ribonucleicas. Isto confere bastante estabilidade a estes pequenos oligos de RNA. Ver o WebSite http://www.gene-tools.com/. Desenhando um oligo, normalmente 19-25 mer, com a sequência anti-sense do mRNA que queremos inibir, este oligo ao emparelhar com o mRNA (Figura 1) vai impedir a sua tradução a nivel dos ribossomas não havendo assim produção da respectiva proteína (Figura 2). Este é um metodo que começa a ser cada vez mais utilizado em estudos de actividae genética pois permite inferir de um modo bastante acessivel, o resultado da falta de actividade de um determinado produto genético.

Figura 1

Figura 2 Utilizando um Morfolino contra Cerl2 (ver Anexo4, região a verde e sublinhada) podemos testar este efeito conjugado com o sistema de Trancrição/Tradução in vitro (Figura 3).


Figura 3. Comparação de Sistema TNT de Lisados de Reticulócitos Integrado com o Sistema Rápido Integrado de Transcrição/Tradução. PREPARAÇÃO DE REAÇÃO TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO 1- Preparar as seguintes 4 reacções TUBO Nº

TNT® Quick

Master Mix (ul)

PCs2-Cerl2-Flag (ul)

(500.0ng/µl)

Morpholino

Oligo

H2O

(ul)

Total

(ul)

1

2

3

4

20.0

20.0

20.0

20.0

2.0

0.0

2.0

2.0

0.0

0.0

1.0 (CoMo)

1.0 (Cerl2Mo)

8.0

10.0

7.0

7.0

50.0

50.0

50.0

50.0

2- Incubar a reacção no banho a 30° C, durante pelo menos 60 min. 3- Parar a reacção de digestão juntando 5 µl de gel loading buffer (GLB) 10x a cada um dos tubos. 4- Guardar a –20ºC.



TRANSCRIÇÃO/TRADUÇÃO IN VITRO Trabalho Prático 8 – Análise das proteínas em geis de poliacrilamida. Objectivos Pretende-se com este trabalho determinar a eficiência do sistema de transcrição/tradução in vitro (sistema “TNT” da Promega) para testar a produção da proteína recombinante e sua inactivação por “Oligonucleótidos de Morfolino” especificos. Introdução As proteínas celulares constituem uma vasta classe de biomoléculas que desempenham na célula funções muito diversas. Para analisar simultaneamente um tão grande e variado grupo de compostos, é necessário recorrer a técnicas que utilizem uma propriedade comum a todos esses compostos, mas que simultaneamente evidenciem pequenas variações no seu comportamento, de modo a que as várias moléculas sejam diferenciadas. As técnicas de electroforese caem nesta categoria, e são largamente utilizadas pois baseiam-se no facto de todas as proteínas apresentarem uma carga eléctrica global quando colocadas num meio de pH diferente do seu ponto isoeléctrico. Deste modo é possivel provocar a migração de proteínas sugeitando-as a um campo electrico. Essa migração variará de acordo com a proteína, uma vez que é influenciada pelo tamanho, carga, forma e composição química de cada molécula. Grosseiramente, pode-se considerar que a migração electroforética duma molécula é apenas função da sua densidade de carga, ou seja , da respectiva razão carga/massa. Assim as proteínas separar-se-ão de acordo com o respectivo valor desta razão: quanto maior ela for, maior será a velocidade de migração da molécula.

A electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é um método rápido e sensível para

analisar a composição de misturas proteicas complexas. A PAGE utiliza um suporte em que os monómeros de acrilamida, ao polimerizarem, formam longas cadeias, as quais se ligam entre si por crosslinking (“ligações cruzadas”), através dos resíduos de bis-acrilamida, também nelas incorporados. O processo de polimerização consiste numa reacção em cadeia de radicais livres, iniciada pelo persulfato de amónio (PSA) e pelo N,N,N’,N’-tetrametilinediamina (TEMED), os quais se encontram presentes na mistura de polimerização. P PSA activa o TEMED, deixando-o com um electrão desemparelhado. Este radical reage então com uma molécula de acrilamida, transformando-a também num radical. Este, por sua vez, reage com um outro monómero de acrilamida (ou, ocasionalmente, com a bis-acrilamida), dando origem a novo radical, e assim sucessivamente até se formar um polímero com ligações cruzadas (crosslinked). O


numero de ligações cruzadas (quantidade de crosslinking), controla o tamanho dos poros do gel, e consequentemente determina o intervalo de massa molecular das proteínas que podem ser separadas nesse gel. Isto quer dizer consoante o numero de ligações cruzadas assim se separam as proteínas com baixa massa molecular ou com elevado massa molecular. O conteudo total de acrilamida de um gel pode variar entre 3 e 30%, correspondendo o valor da percentagem ao total das moleculas de acrilamida (i.e. acrilamida e bis-acrilamida, p/v).

O gel em placa é, na realidade, constituido por dois geis: o gel de separação, no qual

as proteínas são separadas, e o gel de concentração (ou “stacking gel”), no qual se dá a compressão da amostra antes desta entrar no gel de separação. Por isso se chama a este sistema um sistema descontínuo. Devido à elevada resolução obtida com os sistemas descontínuos, o sistema SDS-descontinuo (um sistema em que o detergente aniónico dodecilsulfato de sódio é adicionado a todas as soluções), é normalmente escolhido para a separação de elevada resolução de misturas proteicas. Nesta técnica as misturas são primeiramente desnaturadas por aquecimento, a cerca de 100ºC, durante 2-5min, na presença dum excesso de SDS e dum reagente tiólico (b-mercaptoetanol, que desfaz a maior parte das ligações persulfureto presentes nas moléculas proteicas). O SDS liga-se fortemente às proteínas desnaturando-as. Estudos realizados mostram que este detergente, quando presente em largo excesso, liga-se às proteínas numa proporção constante de 1,4g de SDS para 1g de proteína. Isto equivale aproximadamente a uma molécula de SDS para cada dois resíduos de aminoácidos na proteína. Esta elevada taxa de ligação, e sendo as moléculas de SDS carregadas negativamente, faz com que a carga intrínseca da proteína se torne insignificante quando comparada com a carga total proveniente do SDS a ela ligado. Simultaneamente, como esta taxa de ligação é constante, os diferentes complexos SDS-proteína possuem densidades de carga essencialmente idênticas migrando , nos geis de poliacrilamida, em função do respectivo valor de massa molecular. A separação de uma mistura de proteínas no sistema SDS-PAGE é pois um reflexo da diferença dos respectivos tamanhos. A massa molecular da(s) proteína(s) em questão pode ser estimada por comparação da respectiva mobilidade electroforética (Rf), com a de proteínas de massa molecular conhecida (padrões).

A simplicidade e rapidez desta técnica, adicionadas ao facto de que apenas é

necessária uma pequena quantidade de amostra (alguns microgramas), tornam a electroforese em gel de poliacrilamida no método mais utilizado para a análise de misturas proteicas complexas. Uma vez que as proteínas de práticamente todas as origens são fácilmente solubilizadas pelo SDS, a técnica possui aplicação generalizada.

As proteínas separadas no gel de poliacrilamida podem ser fácilmente coradas com uma solução contendo azul de Coomassie. Este composto permite visualizar quantidades de proteína da ordem de 0,1 � g. Apesar deste método permitir detectar praticamente todos os constituintes da maior parte das amostras proteicas, surgem por vezes situações em que é necessária uma maior sensibilidade, a qual pode ser alcançada recorrendo-se ao método de coloração com nitrato de prata.

POÇOS PARA APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS


Preparação do gel de SDS-poliacrilamida

1. Limpe muito bem, com a mistura etanol-éter (2:1, v/v), todo o material de electroforese, onde vai formar os geis (placas de vidro e de alumina, espaçadores e pentes).

2. Monte as diferentes sanduíches, constituidas por duas placas (uma de vidro e outra de alumina), intercaladas com um par de espaçadores. Coloque as molas que apertam o sistema.

3. Introduza o pente na sanduíche até os dentes entrarem completamente e marque, na placa de vidro, um traço 0,5cm abaixo do nível inferior do pente.

4. Prepare as soluções, de resolução e de concentração, sem adicionar os agentes polimerizantes TEMED e PSA, de acordo com as quantidades indicadas nos quadros 1 e 2.

(Atenção: a acrilamida é neurotóxica, portanto deve ser tomado o cuidado máximo na manipulação das soluções deste composto. É aconselhável o uso de luvas. Uma vez polimerizada a acrilamida não é tóxica.)

5. Transfira a solução do gel resolvente para um goblet e adicione os agentes polimerizantes (TEMED e PSA). Agite. Coloque imediatamente a solução, com auxílio de uma pipeta e evitando a formação de bolhas, entre as placas de vidro até à marca traçada préviamente.

6. Muito devagar, coloque com auxílio de uma seringa, um pouco de água destilada sobre a superfície da solução do gel de resolução. (A água vai evitar que a superfície de polimerização fique irregular).

7. Deixe em repouso até a acrilamida polimerizar (vísivel pela formação de uma linha de interfase gel-água (demora cerca de 10min)).

8. Uma vez polimerizado o gel, inverta a sanduiche, de modo a escorrer toda a água que se encontra na superfície do gel.

9. Transfira a solução do gel de concentração para um gobelet e adicione os agentes polimerizantes TEMED e PSA. Agite. Deite imediatamente na sanduiche até ao cimo (ou seja até começar a escorrer por fora).

10. Deixe em repouso até polimerizar (cerca de 15 min). (Aqui não é necessário adicionar água para obter uma superfície de polimerização lisa).

11. Após o gel ter polimerizado retire o pente (com cuidado para não destruir os poços).


Preparação e aplicação das amostras no gel.

1. Adicione a cada amostra de proteína um volume idêntico de tampão de amostra.

2. Ferva 2min e coloque em gelo até a aplicação no gel.

3. Com a ajuda de uma pipeta automática, aplique as amostras e padrões no gel que foi já préviamente preparado. (Não se esqueça de anotar a ordem de aplicação das amostras e padrões).

4. Coloque a solução de electroforese (já diluída) nas tinas superior e inferior do aparelho de electroforese.

5. Coloque a tampa da camara de electroforese, fazendo a conexão dos electrodos.

6. Ligue os electrodos à fonte de electroforese, tendo em atenção à respectiva polaridade. (Por convenção, o vermelho é o positivo e o preto é o negativo). As proteínas irão migrar para o polo positivo.

7. Coloque o botão que regula a voltagem no máximo, de forma a esta não ser limitante.

8. Regule o botão da intensidade de corrente para um valor correspondente a 20mA por gel.

9. Deixe que a migração do azul de bromofenol atinja o fim do gel de resolução.

10. Desligue a fonte de energia, desligue os electrodos, remova a tampa da câmara, despeje a solução de electroforese, e remova a sanduiche retirando as respectivas molas.

11. Com o auxilio de um espaçador (ou de qualquer outro objecto de plástico), separe as duas placas (a de vidro e a de alumina).

Colorir as proteínas no gel

1. Coloque cuidadosamente o gel numa caixa contendo solução corante com azul de Coomassie.

2. Deixe a corar durante 15-20min.

3. Retire o gel para outra caixa contendo água destilada. Escorra a água e lave novamente com água destilada.

4. Escorra a água e adicine solução descorante. Agite durante 5-10min.

5. Repita o ponto anterior até observar nítidamente as bandas correspondendo às várias proteínas.

6. Coloque o gel sobre um pedaço de papel de filtro grosso (3MM), cubra com “Larfilm” e seque no secador de geis.


Quadro 1 – Solução do gel de resolução 10ml Tris-HCl 1.5M pH8,8 2,5ml SDS 10% (p/v) 0.1ml Sol. Acri-Bis1 3.3ml Água destilada 4.1ml TEMED 6µl PSA 10% (p/v) 20µl 1 Solução contendo 30% de acrilamida (p/v) e 0.8% de bis-acrilamida (p/v)

Quadro 2 – Solução do gel de concentração 10ml Tris-HCl 0.5M pH6,82, 5ml SDS 10% (p/v) 0,1ml Sol. Acri-Bis1 1,7ml Água destilada 5,7ml TEMED 26µl PSA 10% (p/v) 40µl 1 Solução contendo 30% de acrilamida (p/v) e 0.8% de bis-acrilamida (p/v)

Soluções

Tampão do gel de resolução: Tris 1.5M pH8.8, SDS 10%

Tampão do gel de concentração: Tris 0.5M pH6.8, SDS 10%

Solução de acrilamida/bis-acrilamida: acrilamida 30% p/v, bis acrilamida 0.8% p/v.

Persulfato de amónio 10%

Tampão de electroforese: Tris 0.25M pH 8.3, glicina 1.92M, SDS 1%.

Tampão para as amostras: 2ml glicerol, 1ml b-mercaptoetanol, 5ml SDS 10%, 2.5ml

tampão gel de concentração, 2mg azul de bromofenol.

Solução corante: Coomassie Blue R-250 0.3%, ácido acético 5%, metanol 25%.

Solução descorante: Ácido acético 7.5%, metanol 45%.


LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA TRABALHO PRÁTICO 9-10

IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE GENES

Objectivos:

O obectivo deste trabalho é a aquisição de experiência nas estratégias a seguir para o isolamento de um gene correspondente a uma proteína de interesse industrial.

A actividade de um investigador numa empresa de Biotecnologia é simulada através

de um programa de computador – “Gene Isolation and Characterization” da Biotol. O investigador é responsável pela produção de uma proteína nova com propriedades anti-microbianas, tendo disponíveis laboratórios onde se podem efectuar um determinado número de técnicas, e uma biblioteca. Ao longo do trabalho, vão ser tomadas, pelo investigador, decisões relativas à investigação e ao desenvolvimento do novo produto, através da identificação, caracterização, e expressão do respectivo gene.

Execução: A empresa pretende explorar as propriedades de uma planta que contém uma

proteína com propriedades anti-fúngicas, comprovadas medicamente. O trabalho envolvido no desenvolvimento da produção da proteína pela empresa encontra-se dividido em 3 partes:

Fase 1: O investigador tem que identificar os tecidos da planta responsáveis pela actividade anti-microbiana e determinar o tamanho da(s) proteína(s) envolvida(s). Com base nisto, escolhe uma estratégia para clonar e isolar o respectivo gene.

Fase 2: Tomada de decisões respeitantes à extracção de ácidos nucleicos e

construção de um banco de clones adequado. Estas técnicas são aspectos fundamentais da aplicação da Biologia Molecular à Biotecnologia.

Fase 3: O investigador conduz a pesquisa do banco de clones e identificação do

gene que codifica a proteína. O gene é caracterizado e introduzido num vector de expressão para produção da proteína em larga escala.


Calendarização: Aula 9: Fase 1: Determinação da estratégia de clonagem

1.1 Análise da actividade anti-microbiana 1.2 Abordagens para a clonagem do(s) gene(s) envolvido(s)

Fase 2: Construção do banco de clones de DNA 2.1 Extracção de ácidos nucleicos 2.2 Construção do banco de clones

Aula 10: Fase 3: Identificação e caracterização do gene

3.1 Transferência do DNA para suporte sólido 3.2 Isolamento, caracterização e expressão do gene


Fontes de informação/técnicas e protocolos:

- Tecnologia DNA Recombinante; Protocolos Práticos, A.

Cravador

- Bioquímica; Protocolos Práticos, A. Tavares

- Birnboim, HC & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction

procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic

Acids Res. 7: 1513-1523

- Quiagen, QIAquick Gel Extraction Kit Protocols

- Applied Biosystems, BigDye Terminator v1.1 Protocols

(http://ifr31.toulouse.inserm.fr/PFT/BM/Mediabm/bd1versusbd

3.pdf)

- Gene Tools, Morpholino oligonucleotides (http://www.gene-

tools.com/)

- Promega, “TNT Quick” Protocols

(http://www.promega.com/tbs/tm045/tm045.html)



ANEXO 1



ANEXO 2



ANEXO 3 CONSTRUCT NAME: mCerl2-CDNA

VECTOR: pBluescript II KS+

INSERT: EcoRI/XbaI 0.8 Kb fragment with mCerl2 cDNA

ANTISENSE PROBE: Cut with EcoRI, transcribe with T7 RNA Pol.

SENSE RNA: Cut with XbaI, transcribe with T3 RNA pol.

DIAGRAM:

NotI

XbaI 0.77

Stop 0.70

SmaI 0.48

BamHI 0.27ATG 0.14EcoRI 0.00EcoRI 0.00

ATG 0.14 BamHI 0.27

SmaI 0.48

Stop 0.70

XbaI 0.77

NotI

XhoISalIClaIHindIIIEcoRV

CDS

T 7

T 3

mCer2/CDS in PBS

3.80 kb


LABORATÓRIOS DE ENGENHARIA GENÉTICA ANEXO 4

G AAT TCA ACT CTC AAG CTG CTT CCA GGA ACA GTA TAA AAA GCA GAC CTC TGA GGG CCG CAC TCC ACA CAC TAG ACA GCA GGG CCC ACT GCG AAG GAC CCT GAG CCC ATT TTA AGA CAA ACA GAC AAA CGA CTG CAC AGC CAA GTG ATG TTC CGT AGC CAG TTC ACC ACG CTG CTG GGT CTG TTC M F R S Q F T T L L G L F AGT GGG GCC TGG CTA CCC ACA GGC TCA GGG AGG CCT GGG GCC CCA S G A W L P T G S G R P G A P GCG ACC CCT GTT CAG TCC GGG ACT GCT ATC AAT CAG AGC TGG ACT A T P V Q S G T A I N Q S W T CTG GAT CCC CTG GTG CCC ATC TCT GCC CTG GGT AGC TGG GAG GCC L D P L V P I S A L G S W E A TTC CTG GGC CTG CAG AAC AAA CAG CAG GGG ACA GGT GAG CTG CAG F L G L Q N K Q Q G T G E L Q GGA GGA GGG CAG AGA GTA GCT GCT GGT GTG CCT TTG CCC TTG GCT G G G Q R V A A G V P L P L A CCT CAA GAA GTG CTT CAG GAG ACT TGT AAA GCT CTG TCC TTT GTT P Q E V L Q E T C K A L S F V CAG GTG ATC TCC AGG CCT GGT TGC ACA AGT GCC CGG GTC CTT AAT Q V I S R P G C T S A R V L N CAT CTC TGT TTT GGC CGC TGT TCC TCC TTC TAC ATT CCC AGC TCA H L C F G R C S S F Y I P S S GAT CCC ACC CCT GTA GTC TTC TGC AAC AGC TGT GTG CCG GCT CGA D P T P V V F C N S C V P A R AAG CGC TGG ACA TCG GTG ACG CTG TGG TGT GGA GCT GGC CAA TTA K R W T S V T L W C G A G Q L GCC TCC CCT CGG CGG GTG AGG ATT TCC ACG GTA TTG GTC CAG AAG A S P R R V R I S T V L V Q K TGT CAG TGC CGC CCG AAG CTG TGA GCT GAG CAT CCT AGA GGA ATG C Q C R P K L * CGC AGG ACA TGA ATG AAC CTT GGC AAG AAG CAG GAG ACG CAA TAG ATC TAG A



ANEXO 5 mCer2-flag cDNA GAATTCAACT CTCAAGCTGC TTCCAGGAAC AGTATAAAAA GCAGACCTCT GAGGGCCGCA CTCCACACAC TAGACAGCAG GGCCCACTGC GAAGGACCCT GAGCCCATTT TAAGACAAAC AGACAAACGA CTGCACAGCC AAGTGATGTT CCGTAGCCAG TTCACCACGC TGCTGGGTCT GTTCAGTGGG GCCTGGCTAC CCACAGGCTC AGGGAGGCCT GGGGCCCCAG CGACCCCTGT TCAGTCCGGG ACTGCTATCA ATCAGAGCTG GACTCTGGAT CCCCTGGTGC CCATCTCTGC CCTGGGTAGC TGGGAGGCCT TCCTGGGCCT GCAGAACAAA CAGCAGGGGA CAGGTGAGCT GCAGGGAGGA GGGCAGAGAG TAGCTGCTGG TGTGCCTTTG CCCTTGGCTC CTCAAGAAGT GCTTCAGGAG ACTTGTAAAG CTCTGTCCTT TGTTCAGGTG ATCTCCAGGC CTGGTTGCAC AAGTGCCCGG GTCCTTAATC ATCTCTGTTT TGGCCGCTGT TCCTCCTTCT ACATTCCCAG CTCAGATCCC ACCCCTGTAG TCTTCTGCAA CAGCTGTGTG CCGGCTCGAA AGCGCTGGAC ATCGGTGACG CTGTGGTGTG GAGCTGGCCA ATTAGCCTCC CCTCGGCGGG TGAGGATTTC CACGGTATTG GTCCAGAAGT GTCAGTGCCG CCCGAAGCTG CCAGAAGT GTCAGTGCCG CCCGAAGCTG TGAGCTGAGC GGAGGAGGAG ATTACAAGGA TGACGACGAT AAGTGATCTA GACGG mcer2-flag-prot MFRSQFTTLL GLFSGAWLPT GSGRPGAPAT PVQSGTAINQ SWTLDPLVPI SALGSWEAFL GLQNKQQGTG ELQGGGQRVA AGVPLPLAPQ EVLQETCKAL SFVQVISRPG CTSARVLNHL CFGRCSSFYI PSSDPTPVVF CNSCVPARKR WTSVTLWCGA GQLASPRRVR ISTVLVQKCQ CRPKLGGGDYKDDDDK

Information on Entire Sequence :

Sequence Length : 196



ANEXO 6 MCerl2-cDNA (in pBluescript KS+) GAATTCAACT CTCAAGCTGC TTCCAGGAAC AGTATAAAAA GCAGACCTCT GAGGGCCGCA CTCCACACAC TAGACAGCAG GGCCCACTGC GAAGGACCCT GAGCCCATTT TAAGACAAAC AGACAAACGA CTGCACAGCC AAGTGATGTT CCGTAGCCAG TTCACCACGC TGCTGGGTCT GTTCAGTGGG GCCTGGCTAC CCACAGGCTC AGGGAGGCCT GGGGCCCCAG CGACCCCTGT TCAGTCCGGG ACTGCTATCA ATCAGAGCTG GACTCTGGAT CCCCTGGTGC CCATCTCTGC CCTGGGTAGC TGGGAGGCCT TCCTGGGCCT GCAGAACAAA CAGCAGGGGA CAGGTGAGCT GCAGGGAGGA GGGCAGAGAG TAGCTGCTGG TGTGCCTTTG CCCTTGGCTC CTCAAGAAGT GCTTCAGGAG ACTTGTAAAG CTCTGTCCTT TGTTCAGGTG ATCTCCAGGC CTGGTTGCAC AAGTGCCCGG GTCCTTAATC ATCTCTGTTT TGGCCGCTGT TCCTCCTTCT ACATTCCCAG CTCAGATCCC ACCCCTGTAG TCTTCTGCAA CAGCTGTGTG CCGGCTCGAA AGCGCTGGAC ATCGGTGACG CTGTGGTGTG GAGCTGGCCA ATTAGCCTCC CCTCGGCGGG TGAGGATTTC CACGGTATTG GTCCAGAAGT GTCAGTGCCG CCCGAAGCTG TGAGCTGAGC ATCCTAGAGG AATGCGCAGG ACATGAATGA ACCTTGGCAA GAAGCAGGAG ACGCAATAGA GCTCTAGATC TAGA

laboratÓrios de engenharia genÉtica - w3.ualg.ptw3.ualg.pt/~jbelo/documentos/labprotocols-leg...

Documents