Periferik kandan DNA izolasyonu

KO TIP FAKLTES

TIBB BYOLOJ ANABLM DALI

DNEM I RENC LABORATUVARI / 2KANDAN DNA ZOLASYONU VE ELEKTROFOREZ KESM HARTALANMASI VE BLOTLANMASI KAN

Kan bir sv dokudur. Su ierii fazla olan plazma, yedi tip hcre ve hcre fragmentlerinden meydana gelir.

Krmz kan hcreleri (alyuvar) veya eritrositler (red blood cells (RBCs) veya erythrocytes)

Be tip beyaz kan hcreleri (akyuvar) ve lkositler (white blood cells (WBCs) veya leukocytes)

tip gronlosit (granulocytes) Ntrofiller (neutrophils)

zonofiller (eosinophils)

Bazofiller (basophils)

Sitoplzmalarnda granlosit iermeyen lkositlerin iki tipi

Lenfositler (lymphocytes)

Monositler (monocytes)

Eer bir kan rnei, phtlamay nleyici kimyasallarla (EDTA gibi) muamele edilip santrifj edilirse; Alyuvarlar tpn dip ksmna, akyuvarlar ise kann en stte toplanan plazma ksm ile alyuvarlar arasna yerleir.

Figr 1. Kann santrifj sonu meydana getirdii gradient.

Eritrositler (erythrocytes)

Kanda en ok bulunan hcre tipidir. Kadnlarda ortalama 4.8 x 106 hcre/ mm3 Men average about 5.4 x 106 hcre/ mm3 Bu deerler salk ve yaanlan ykseklie gre deiir. (Perulularda mikrolitrede 8.3 x 106 RBCs vardr)

Alyuvarlar hcre nkleusu iermezler.

Oksijen ve karbondioksit tanmndan sorumludurlar.

Lkositler (leukocytes)

Sayca alyuvarlardan daha azdrlar (kisi arasndaki oran yaklak 1/700dr).

Nkleuslar vardr.

Organizmann infeksiyona kar savunmasnda rol alrlar.

Sitoplazmalarnda herhangi bir granl olmayan Lenfositler ve monositlerle, sitoplazmas granllerle dolu olan tip gronlositten oluur.

Lenfositler

Pek ok lenfosit tipi vardr. Her birinin farkl bir ilevi olan lenfositlerden en yaygn olanlar:

B lenfositleri ("B cells"). Antibodileri retiler.

T lenfositleri ("T cells").

nflammatory T hcreleri Ntrofil ve makrofajlarla birlikte enfeksiyon veya dier doku hasarlarnda savunmada grev yapar. Sitotoksik T lenfositleri (CTLs) Enfekte olmu hcreleri ldrr.

Yardmc T hcreleri B hcrelerinin antibodi retimine destek olur.

Figr 2. Lkositler

Kan pulcuklar (Platelets)

Kan pulcuklar megakaryositler tarafndan retilen hcresel fragmentlerdir. Kan phtlamasnda ve damar yaralanmalarnda grev yapar.

Plazma (Plasma)

Kan hcrelerinin iersinde bulunduu, ak sar renkli sv yapdr. Plazma hcrelerin ihtiyac olan ve uzaklatrlmas gereken maddelerin tanmnda grev yapar.

erii%

Su~92

Proteinler68

Tuzlar0.8

Lipidler0.6

Glukoz (kan ekeri)0.1

DNA ZOLASYONUnsan genomik DNAs 3x 109 nukleotid uzunluundadr. Genomik DNA btn nkleusu bulunan hcrelerde bulunur ve bu hcreler genomik DNA analizleri iin kullanlabilir. rnein; prenatal tan iin amniyotik svdaki fetal hcrelerden veya koryonik hcrelerde genomik DNA elde edilebilir. Erikinlerde periferal kandaki lkositler en kolay ulalabilen DNA kaynadr. EDTAl tplere alnan 10 ml kan yaklak olarak 108 beyaz kan hcresi ierir ve bu miktar hcreden elde edilecek genomik DNA pek ok genetik test iin yeterlidir. DNA izolasyonu iin pek ok metod vardr. Geleneksel izolasyon yntemlerinin yannda pek ok firma tarafndan retilen DNA izolasyon kitleri DNA izolasyonunda kullanlmaktadr. Ayrca mRNA kullanarak sentezlenen cDNAda bir dier DNA kaynadr. DNA degredasyona kar dayankl bir polimerdir ve uygun saklama artlarnda uzun yllar korunup tekrar tekrar analizlerde kullanlabilir. Tbbi Biyoloji laboratuarnda yaygn olarak kullanlan amonyum asetat yntemi ile DNA izolasyonu aada aklanmtr.

1. EDTAl tpte bulunan 10 ml periferik kan herhangi bir kontaminasyonu nleyecek zenle 50 mllik falkon tpne aktarlarak zerine 1:3 orannda eritrosit lizis tamponu eklenir. +4oCde 20 dakika bekletilip, 1500 rpmde 10 dakika santrifj edilir.

2. rnek santrifjden alnarak zerindeki spernatant atlr. Pellet sspanse edilir ve zerine 20 ml eritrosit lizis tamponu eklenir. Tekrar 1500 rpmde 10 dakika santrifj edilir ve spernatan atlr.

3. Pelet tamamen sspanse edilip zerine 500 (l SDS (%10luk), 50(l proteinaz K (20mg/ml) ve 9.4 ml WBL (White Blood-Cell Lysis) tamponu eklenerek 56oCde su banyosunda gece boyu bekletilir.

4. nkbasyon sonras zerine 3700(l Amonyum asetat (9.5 M) eklenip iyice kartrlr.20 dakika +4 oC ve 4500 rpmde santrifj edilir.

5. st ksmda kalan pellet olmayan temiz sv ksm aktarlarak yeni bir falkon tpe alnr, altta kalan pellet ksm atlr. Ayr tpe aktarlan supernatann zerine -20 oCde beklemekte olan %99luk etanolden 20 ml eklenir ve DNAnn yzeyde toplanmas beklenir.

6. Toplanan DNA pipet yardmyla alnarak iersine 400(l %70 etanol olan bir eppendorf tpe aktarlr.

7. Maksimum hzda (13.000 rpm) 10 dakika santrifj edilerek DNA ktrlr ve spernatan atlr.

8. Istc blokta kurutularak DNA zerinde kalan alkol uzaklatrlr.

9. Elde edilen DNAnn miktarna gre 100300(l kadar TE (Tris-EDTA) tamponu eklenir.

10. 56oCde 1 saat bekletilerek DNAnn TE tampon iersinde iyice zlmesi salanr.

11. Azlar iyice kapatlm olan eppendorf tpteki stok DNAlar +4oCde deneylerde kullanlmak zere ismlendirilerek muhafaza edilir.

PCR

Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) bir in vitro ve in vivo DNA amplifikasyon metodudur, reaksiyonlar farkl scaklklardaki olayn sikluslar halinde tekrarna dayanmaktadr. PCR ile DNA fragmentleri oaltlabilir ve ok kk rneklerden analizler iin yeterli miktarlar elde edilebilir.

Gerekli olan reaktifler:

1) kalp olarak kullanlacak DNA (genomik DNA);

2) iki tane tek iplikli sentetik DNA oligonkleotidi (forward ve reverse primer), PCR yaplmak istenen gen dizisini belirler;

3) drt tip deoksiribonkleotid trifosfat (dNTPs);

4) yksek sda alabilecek bir DNA polimeraz (Taq DNA pol.).

PCR ana siklusun tekrarlarndan meydana gelir:

denatrasyon 94Cde ift iplikikli DNAnn iki tek iplikie ayrlmas;

annealing (eleme) 50-60Cde primerlerin tek iplikik halindeki kalp DNAya spesifik olarak balanmalar;

extension (sentez) 72Cde, primerlerle snrlandrlm olan blgenin Taq pol. tarafndan amplifikasyonu.

Deneturasyon ve extension fazlarndaki slar deizmezken annealing (eleme) ss istenen DNA dizisinin AT/GC ieriine gre deiir. Sikluslar yaklak 30 defa tekrar edilir. Yeni sentezlenen fragmentler bir sonraki siklusta kalp grevi grrler bylelikle her siklusta oaltlmak istenen dizinin logaritmik (2n, n=30-35 dng) bir art sz konusudur. PCR ile 1503000 nkleotidlik diziler oaltlabilir.primerler 1 mM

dNTPs 2 mM

10 X Buffer (MBI) 1x

MgCl 1.50 mM

Taq(MBI) 1U

DNA 100 ng

Figr 3. PCRRFLP

Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analizi restriksiyon endonkleazlarn ift iplikli DNAy spesifik tanma blgelerinden kesmesi temeline dayanmaktadr. Endonkleazlar bakteriler tarafndan bakteriyofaj infeksiyonuna kar savunma amacyla retilirler. Bu enzimler bakteriyofaj DNAsn tanyp paralarken bakterinin kendi DNAsna zarar vermezler. Her bir restriksiyon endonkleaz spesifik palendromik ksa DNA dizisini tanr ve keser. PCR ile oaltlan DNA blgesi restriksiyon enziminin kesimine tabi tutulur. Oluan DNA fragmentleri jel elektroforezi ile fragment byklklerine gre ayrlrlar. DNA mutasyonlar enzimin kesme noktasn ortadan kaldrabilir veya yeni bir enzim kesme noktas oluturabilir, bylelikle kesim sonucu oluan fragment saysn deitirirler. Restriksiyon blgeleri arasndaki insersiyon veya delesyon mutasyonlar da fragment byklklerini deitirirler. Genomda kodlama yapan ve yapmayan blgelerde restriksiyon enzim tanma blgelerinin dalm insanlar arasnda farkldr. Bu farkllklar doal genomik eitlilii yanstr ve genellikle fenotipik bir sonucu olmayan RFLPleri oluturur. Bunun yannda RFLP analizleri genetik hastalklarn association ve linkage almalarnda ska kullanlmaktadr. Hastalkla ilikilendirilen aday gendeki RFLPler, etkilenmi bireyler ve kontroller arasndaki allel frekanslar dikkate alnarak ilgili mutasyon ve genin hastalkla ilikisini ortaya koymada olduka kullanl bilgi vermektedir. Kesim rnlerinin poliakrilamid jel elektroforezi

Hazrlanan jelin elektroforezi iin dikey elektroforez cihaz kullanlr. Jelin kalnl 0.5 mm olarak ayarlanr. Yzde sekizlik non denatre PAGE stok solsyonuna sras ile % 10luk APS stoundan %1 hacim ve TEMEDden %0.1 hacim ilave edilip 0.5 mmlik cam aralna dklr. Polimerizasyonun tamamlanmas iin en az 1/2 saat beklenir.

Polimerizasyon sonras camlar elektroforez cihazna yerletirilir, 1X TBE ieren yrtme tamponu ilave edilip rnekler jel kuyucuklarna yklenir. Ykleme tamponu iinde bulunan ve elektrik alanda hareket eden DNA brom fenol mavisi ve ksilen siyanol boyalar yardmyla jel zerinde takip edilir.

Figr 4. Restriksiyon kesimi ve jel grnts.

GENETK POLMORFZMGenetik terminolojisinde belirli bir kromozomal lokasyondaki (locus), belirli DNA dizilerinin farkl versiyonlarna allel ad verilir ve genetikiler polimorfik terimini, populasyonda yaygn olarak iki veya daha ok alleli bulunan bir geni tanmlamada kullanrlar. Monomorfik gen, bir populasyonda arlkl tek allel olarak bulunan gendir. Bir allelin populasyondaki yaygnl en az %99 orannda bulunuyorsa bu gen monomorfiktir. Dier bir anlatmla, polimorfik gen iki veya daha fazla allele sahip olmal ve bu alleller populasyonda %1den fazla oranda bulunmaldr. Bunlara karlk populasyonda %1den daha az gzlenen allele ise nadir varyantlar (rare variant) ad verilir. Baz alleller, genler arasndaki veya intronlar iersindeki DNA dizilerindeki deiikliklerle oluurlar, bu deiimlerin genin fonksiyonu zerine bir etkisi yoktur, bu tip alleller sadece direkt DNA analizi ile belirlenebilirler. Kodlama yapan diziler iersindeki deiimler sonucu oluan alleller farkl protein varyantlarnn oluumuna neden olup ciddi fenotipik bozukluklar, deiimler ortaya karabilirler. Genetik hastalklara sebebiyet veren ou mutasyon (hepsi deil) nadir varyantlardr ve bu alleller genetik diversitenin en belirgin formlardr. Doadaki pek ok populasyonda, genlerin byk bir yzdesi polimorfiktir. Bununla birlikte, kk populasyonlarda (rnein; nesli tkenmekte olan) genetik varyasyonun ok dk olmas beklenir nk gen havuzu az saydaki bireylerden meydana gelmitir.

SNPSNPler DNA dizisindeki varyasyonlardr, genomdaki dizide meydana gelen tek nkleotidlik (A, T, G veya C) deiim sonucu meydana gelir. rnein bir SNP DNA dizisini AAGGCTAAdan ATGGCTAAya evirebilir. Bir varyasyonun SNP olarak kabul edilebilmesi iin, populasyonda en az %1 orannda izlenebiliyor olmas gerekmektedir. Her SNPden ikisi sitozinin (C) timinle (T) yer deitirmesinden oluur. SNPler bir genin hem kodlama yapan hem de kodlama yapmayan blgesinde bulunabilir. Pek ok SNPnin hcresel fonksiyon zerine bir etkisi yok iken, bir ksmnn hastalklarda etkisi olduu gsterilmektedir. nsan DNA dizisinin %99dan daha fazlasnn ayn populasyonda ayn olmasna ramen, DNA dizilerindeki varyasyonlarn insanlarn hastalklar, virus, bakteri, toksinler, kimyasallar gibi evresel faktrlere, ilalara ve dier terapilere nasl cevap verecei zerine nemli etkileri vardr. Bunlar da SNPlerin allmasn biyomedikal aratrmalar veya tbbi tehisler asndan ok deerli yapmaktadr. SNP haritalarnn, kanser, diyabet, vaskular hastalklar, nrodejeneratif hastalklar ve zek bozukluklar gibi pek ok karmak hastalkla ilikili genlerin belirlenmesine yardmc olacaktr. SNPler evrimsel olarak mikrosatellit markerlarna gre daha stabildirler, daha dk mutasyon oranna sahiptirler. Bir generasyondan dierine deiimleri az olduundan populasyon almalarnda kullanlmalar daha kolay ve bilgilendiricidir. Bunun yannda SNPlerin saylarnn fazla oluu hastalk ve allel korelasyonunun kurulmasnda ans ve avantaj dourmaktadr.

SSCP (single strand conformation polymorphism)

- PCR ile 200-800 bplik DNA dizisi oaltlr.

- PCR rn formamid ykleme tamponu ile kartrlp 95(Cde 5 dk denatre edildikten hemen sonra buz zerine alnarak soutulur.

- Denatre haldeki PCR rnleri vakit kaybetmeden poliakrilamid non-denatre jele yklenir.

- Tek zincirli rnler elektroforez ile birbirinden ayrlr.

- Tek zincirli DNAnn elektroforezdeki hareketi yapsal konformasyonuna baldr. Tek bazlk fark bile konformasyonunu deitirir ve elektroforezdeki hareketinde farkllk yaratr.

- Elektroforez sonucunda jel gm nitrat boyas ile boyanr.

Figr 5. SSCP analiziGENEL ANLAMDA JEL ELEKTROFOREZ

Elektroforetik teknikler makromolekllerin karekterizasyonu ve saflk derecelerinin llmesi amal kullanlan temel tekniklerdendir. Tekniin temel prensibi DNA, RNA ve protein molekllerinin zerinde tadklar yk kullanarak bu moleklleri elektrik alan ierisinde hareketlendirmektir. Bu hareketlenme ile birlikte molekller byklklerine gre jel zerinde sralanrlar. Byk molekller jel zerinde yrmekte zorluk ekerken kk molekller daha hzl ve rahat hareket edebilirler. Molekln anoda m (+ kutup) yoksa katoda m (- kutup) doru hareket edecei molekl zerindeki net yk ile belirlenir. DNA ve RNA moleklleri serbest fosfat gruplarndan dolay eksi ykl molekllerdir. Bu nedenle jel zerinde katoddan anoda doru hareketlenirler. Protein moleklleri zerlerinde hem art hem de eksi ykler tadklarndan dolay zerlerindeki net yk miktar ortamn pH deitirilerek istenirse art istenirse eksi hale getirilebilir. Mesela ortam pHnn 5den byk olduu durumlarda proteinler eksi yklenirler ve jel zerinde anoda doru hareketlenirler.

Elektroforez deneyleri tampon zeltileri ierisinde yaplr. Bunun iki temel nedeni vardr. Birinci neden akmn geiini salamak iin ortamn elektrolit miktarn artrmak ikinci nedense ortamn pHnda meydana gelebilecek radikal deiimlere izin vermemektir. Elektroforez deneylerinde elektrik alan farkl ekilde oluturulabilinir. En sk kullanlan metod da (DNA, RNA elektroforezinde) ortama verilen voltaj sabitlenerek akmn (amper) ve gcn (watt) deiimine izin verilir. [Amper X Volt = Watt]. Protein elektroforezinde ise tercih edilen akmn sabitlenip voltun ve gcn deiimine izin verilmesidir. Yksek derecede akm ve voltaj gerektiren deneylerde ise g sabitlenip akm ve voltajn deiimine izin verilir. Bu ilevi gerekletirecek aletler piyasada bulunmaktadr.

AGAROZ JEL ELECTROFOREZAgaroz

Agaroz lineer bir polimer olup D-galaktoz ile L-galaktoz molekullerinin ard sra glikosidik balarla birlemesi sonucu olumutur. Agaroz zincirleri helix ikincil yaplar sayesinde aplar 20 ile 30 nm arasnda deien superkoyllar olutururlar. Bu superkoyllar jelatin eklindeki yaplara dnerek 50 nm ile 200 nm arasnda boluklar ihtiva eden polimere dnrler. Piyasada satlan agaroz polimerlerinin yaklak 880 adet galaktozdan olutuu bilinmektedir. Ancak agaroz saf bir madde deildir. erisinde baka polisakkaritler de ihtiva eder. Dk kalitede bir agaroz ierisinde deiik tuzlar ve iyonlar da bulmak mmkndr. Agaroz ierisindeki bu safszlklar agarozun erime scakln ve DNA molekllerini ayrma kapasitesini etkiler. Bu problemler nedeni ile molekler biyoloji deneylerinde zel hazrlanm agaroz kullanlr.

DNA nn agaroz zerinde migrasyonu

Aada zetleyeceimiz faktrler DNA nn agaroz zerindeki yrme hzn belirler.

1. DNA nn molekler bykl: ift zincirli DNA moleklleri jel matriksleri zerlerinde tadklar baz ifti saysna ters orantl olarak yrrler. Byk molekller yava kk molekller ise hzl bir ekilde ilerlerler.

2. Agaroz konsantrasyonu: Lineer bir DNA molekl farkl konsantrasyonlardaki agaroz jelleri zerinde farkl hzlarda ilerlerler. DNA molekllerinin jel zerindeki elektroforetik mobilitesi ile jel konsantrasyonu arasnda logaritmik bir ilikiden bahsetmek mmkndr.

3. DNAnn konformasyonu: Superhelix DNA, nick olmu DNA ve lineer DNA moleklleri agaroz jel zerinde farkl hzlarda hareket ederler. Her bir DNA formunun jel zerindeki migrasyonu jel konsantrasyonuna ve kullanlan agarozun saflk derecesine baldr. Bunun yan sra kullanlan voltajn miktar, kullanlan tampon zeltinin iyonic gc ve DNA formlarnn younluu nemlidir. DNAnn farkl formlarn ayrt etmenin en gzel yolu izole edilen DNA molekl ile restriksiyon endonklazlar ile kesilmi DNA molekln jel zerinde yan yana yrtmektir.

4. Jel ierisinde etidium bromr olup olmay: Etidium bromr DNA zerindeki negatif yk miktarn azaltt iin DNAnn ilerleme hzn % 15 yavalatr. 5. Uygulanan Voltaj: Dk voltajda DNAnn yer deitirme hz dk olacaktr. Ancak yksek voltajda DNA molekllerinin jel zerindeki znrll azalr. Bu nedenle yksek znrlk istendiinde dk voltaj kullanmakta fayda vardr.

6. Agaroz tipi: ki tip agarozdan bahsetmek mmkn; Satandart agaroz ve low-melting agaroz. Low-melting agaroz standart agaroza gre daha yumuak bir materyal olup 55 derecede svlatrlabilir. Bu zelliinden dolay genomik klonlama deneylerinde zaman zaman kullanlr.

7. Elektroforez tamponu: DNAnn jel zerindeki hareketlilii jelin ierisinde bulunduu elektroforez tamponunun iyonik gcne de baldr. yonlarn olmad bir ortamda elektrik akm olmayacandan DNA moleklleri jel ierisinde yava ilerleyecektir. Eer yksek iyon gc ieren bir tampon zelti kullanlrsa jel ar snmadan dolay eriyecektir.

Jel-Ykleme tamponlar

Bu tamponlar DNA rnekleri jel zerine yklenmeden nce DNA rnekleri ile belirli oranlarda kartrlrlar. DNA rneinin younluu bu sayede artrlarak jel zerindeki kuyucuklar ierisine homojen olarak kmesi salanr. Ayrca ykleme tamponu ierisinde bulunan brom fenol mavisi de (BFB) DNA rneklerinin yrme srasnda hangi noktaya kadar ilerleyebilecekleri hakknda bilgi verir. BFB 0.5x TBE ierisinde yrtlen bir jel zerinde 300 bp lik bir DNA paras ile ayn hzda hareket eder. Eer ksilen zayanol renk olarak kullanlacak olunursa, bu renk belirteci 4 kb lik bir DNA molekl ile ayn hzda ilerler.

METOD

1. Plastik jel yrtcsnn kenarlar uygun bir ekilde kapatlr.

2. Yeterli miktarda elektroforez zeltisi hazrlanr. (1x TAE veya 0.5x TBE)

3. Gerekli miktarda agaroz tartlr. Mesela %1 lik 50 ml bir agaroz zeltisi iin 0.5 gr agaroz tartmak gerekir. Tartlan agaroz zerine tampon eklendikten sonra agaroz mikrodalga frnda veya scak bir elektrikli stc zerinde eriyene kadar muamele edilir.

4. Sv hale dnm agaroz zeltisinin scakl elle dokunulabilecek seviyeye geldiinde (istee bal olarak agaroz zelti ierisine etidium bromid eklenebilinir veya jel yrtldkten sonra etidium bromid ile boyanabilir) zelti polimerize olmadan plastik yrtme kab ierisine dklr ve oda scaklnda veya 4 derecede en az 30 dk braklr. Jel zerinde kuyucuklarn olumas iin gerekli olan taran jel polimerize olmadan yrtme sistemi zerine konulmas gereklidir.

5. Agaroz donduktan sonra tarak dikkatli bir ekilde jel zerinden kaldrlr ve jel yrtme tankna yerletirilir.

6. DNA rnekleri ykleme tamponu ile kartrldktan sonra her bir DNA rnei bir kuyucua gelecek biimde ykleme yaplr ve sisteme akm verilerek DNA moleklleri mobilize edilir.

DNA nn Agaroz zerinde grntlenmesi

1. Etidium Bromid ile

DNA molekllerini boyamann en uygun metodu, en ucuz ve en kolay olan etidium bromid metodudur. Etidium bromid l planer bir kimyasal grup ieren madde olup DNA nn baz ksmlar ile etkleir. (Her 2.5 bp DNA molekl / etidium bromid). Heliksin ierisine giren EtBr moleklleri heliks aksisine dik bir pozisyon alarak st ve alt ksmlardaki baz ifleri ile vanDerWaals balar kurar. Bu etkileim boyann floresan zelliinde bir arta sebeb olur. Bu art DNA konsantrasyonu ile doru orantl olduundan jelin DNA ieren ksmlar youn bir floresan zellik gsterir.

2. SYBR gold ile

SYBR gold simetrik olmayan bi siyonid boyasdr. Hem tek zincirli hem de ift zincirli DNA molekllerini boyamada kullanlr. EtBre oranla ok daha duyarl olan bu boya ile 20 pikogramdan daha az DNA miktarn gzlemek mmkndr.

DNA nn jeller zerinde fotoraflanmas

Bu amala transluminatrler kullanlr. Transluminatrler 302 nm de UV yayarlar. DNA ya balanm EtBrn floresan younluu aslnda 254 nm de daha fazla olmasna ramen 302 nm en ok kullanlan dalga boyudur. Bunun ana nedeni DNA zerinde 254 nm de krklarn olumasdr. Gnmzde EtBr ile boyanm DNA molekllerinin grntlerini kaydetmek mmkndr. Kullanlan entegre sistemlerde bir k kayna, bir dijital kamera ve termal yazcdan ibarettir. Daha karmak sistemlerde jel resimleri direk bilgisayar zerinden grntlenebilir.

DNAnn restriksiyon endonukleaz enzimleri ile kesimiGenel BilgiRestriksiyon endonukleazlar ifte sarmal DNA molekllerini 4 ile 8 baz ifti arasnda spesifik blgeleri tanyarak kesen enzimlerdir. Bu gne dein 3 tip restriksiyon endonkleaz enzimi bulunmutur. Tip I ve Tp III endonucleaz enzimleri zerinde hem restriksiyon aktivitesi hemde metilasyon aktivitesi bulunur. Tip I enzimleri DNAy tandklar blgeden yaklak 1000 baz ifti yukarsnda neredeyse geliigzel keserken, tip III enzimlerinde bu say 24 ile 26 baz ifti civarndadr. Tp II restriksiyon enzimleri ise dier iki enzim tipinden ayr olarak DNAy tandklar blgenin tam zerinden seici olarak keserler. Bu zelliklerinden dolay Tip II restriksiyon endonukleazlar molekler biyoloji ve biyotekno- loji laboratuarlarnda sk kullanlrlar. Yaklak 2500 den fazla tip II restriksiyon enzimi bilinmektedir. Tablo da sk kullanlan bu enzimlerden bazlar ve bu enzimlerin DNA zerinde tandklar blgeler ve hangi organizmalar- dan izole edildikleri verilmitir.

Tp II restriksiyon enzimleri DNA zerinde palandromik DNA dizilerini tanrlar. Palandromik bir dizi her iki ynden okunduunda ayn baz sralamasn verir. Tp II restriksiyon enzimleri DNAy kestikten sonra DNA zerinde oluan ular ou zaman yapkan (stiky) ulardr. Ancak baz restriksiyon enzimleri yapkan ular yerine kr (blunt) ular olutururlar.

METOD

Genomik DNA molekllerinin MboII ile kesimi

MboII restriksiyon enzimi DNA zerinde GATC dizisini tanyarak keser. GATC dizisi DNA zerinde ska rastlandndan MboII ile kesilmi bir DNA molekl bir ok blgesinden paralara ayrlacaktr. Aada tarif edilen deneyde insan genomik DNAsnn Mbo II ile kesimi verilmitir.

3.0 mikrolitre genomic DNA (3 mikrogram kadar)

1.0 mikrolitre MboII tampon zeltisi

0.5 mikrolitre Mbo II enzimi

5.5 mikrolitre dd. Su

Karm 37 derecede 15 dakika inkube edildikten sonra agaroz jel zerinde yrtlerek analiz edilir.

BLOTLAMA TEKNKLERNE RNEK

Southern BlotlamasDNA zerinde bulunan zel baz dizileri uygun problar (ksa spesifik DNA paralar) kullanldnda grntlenebilir veya DNA zerindeki herhangi bir genin pozisyonu tespit edilebilir. Bu amala DNA moleklleri ncelikle agaroz zerinden membranlara transfer edilmelidir. Piyasada iki tip membran kullanlmaktadr (Naylon ve Nitroselloz). Bu membranlarn bazlar pozitif ykle donanm iken bazlar ntraldirler. Pozitif ykl membranlara DNAnn transferi ve membran zerine fiksasyonu nispeten kolaydr.

METODJel elektroforezini takiben ifte sarmal DNA yapsn bozmak iin jel 0.5 M NaOH ierisinde tutulur. Daha sonra jel nitroselloz membran zerine yatrlp, membran zerine kaln bir kat havlu tabakas ve uygun bir arlk ilave edilir. Bu yolla jel ierisindeki sv kapileri g ile jel zerinden membrane doru akma eilimine zorlanr. Akan sv ile birlikte DNA moleklleri de

membran zerine aktarlr. Membran kurutulduktan sonra DNA moleklleri membran zerine 80 derecede stlarak veya UV ma ile sabitlenir. Bu noktadan sonra DNA moleklleri uygun bir DNA probu ile hibridize edilip tanmlanacak haldedir.Northern blotlamasSouthern blotlamas ile prensipte ayn olup en nemli fark DNA moleklleri yerine RNA molekllerinin membran zerine transferini ierir.Western blotlamasBu blotlama metodunda proteinler PVDF veya nitroseluloz membrana transfer edilirler. Proteinlerin acrilamid jel zerinden membrana transferi zel bir tampon ierisinde elektrik akm verilerek yaplr. Bu sebeple western transfer ileminde zel tasarlanm aletlere ihtiya vardr.

PAGE 13