libro de microbiologia industrial

Microbiologa Industrial y Alimentaria

Que es la microbiologa industrial? La microbiologa industrial es la microbiologa que estudia la aplicacin de la biotecnologa de los microorganismos en la industria. Esto implica la utilizacin de sistemas biolgicos en diferentes procesos industriales. En general puede abarcar diferentes mbitos:

- Fabricacin de diferentes compuestos orgnicos.

- Transformacin de productos, hecho que cada da tiene ms importancia, puesto que las reacciones mediadas por los seres vivos ocurren en condiciones de presin, temperatura,... normales. Por lo tanto puede ser ms barato el uso de seres vivos, ya que no se requieren condiciones especiales. Adems, en muchos casos sern reacciones ms eficaces que las qumicas. Se ha de tener en cuenta siempre que la industria buscar la mayor eficiencia posible y la reduccin de costes, ya que lo que interesa es tener beneficios.

- Reacciones con compuestos inorgnicos, como puede ser el caso de la lixiviacin de metales.

- Produccin de biomasa, con diferentes finalidades. A menudo el producto final de las reacciones son los propios microorganismos, por su valor en alimentacin humana, como Saccharomyces,... o animal, como las SCP.

- Degradacin de sustancias, como puede ser la depuracin de aguas, el tratamiento de residuos,...

- Biosensores, determinacin de la presencia de sustancias, mediante sistemas biolgicos. Tambin puede servir en los controles de calidad. Est adquiriendo una gran importancia en los ltimos aos, ya que es una muy importante herramienta de anlisis.

Microbiologa Industrial Microbiologa Alimentaria

Considera la parte positiva de los microorganismos, sus posibles aplicaciones. La microbiologa industrial va encaminada a 3 grandes reas:

- Servicios, como eliminacin de residuos

- Produccin de sustancias de inters econmico

- Anlisis, en el desarrollo de biosensores

La microbiologa industrial se centra en los posibles beneficios que se pueden obtener del uso de microorganismos en procesos industriales.

Considera la parte negativa de los microorganismos. La microbiologa alimentaria aborda principalmente 2 problemas.

- Los alimentos no pueden causar enfermedades al ser ingeridos. Es bsica en un alimento su inocuidad, que no provoquen perjuicios al ser humano, por la presencia de organismos patgenos en ellos.

- Los alimentos han de poder conservarse durante un cierto tiempo, no se pueden estropear por la accin de organismos en ellos, o como mnimo retrasar la degradacin.

La microbiologa alimentaria se preocupa por la alteracin de los alimentos por la accin de los microorganismos desde el punto de vista sanitario y organolptico.

Biotecnologa Ambos tipos de microbiologa abarcan diferentes aplicaciones de la biotecnologa. La idea de la biotecnologa surge en los aos 20, ligada a la produccin de alimentos. Tuvo su auge en los aos 50, centrada en la produccin de plsticos e hidrocarburos. La biotecnologa ser por lo tanto el uso integrado de la bioqumica, la biologa y la ingeniera qumica para conseguir aplicaciones tecnolgicas de los sistemas biolgicos y los cultivos celulares. Una nueva definicin de biotecnologa actualmente dice que la biotecnologa es el conjunto de procesos industriales donde se utilizan organismos obtenidos mediante DNA recombinante y otras tcnicas genticas.

1


Existen diferentes definiciones de biotecnologa:

Biotecnologa

Manipulacin de organismos vivos, sobre todo a escala gentica, para obtener productos tiles. Segn esta definicin, parece que la microbiologa industrial no sera biotecnologa.

Combinacin de procesos industriales donde se usan sistemas biolgicos obtenidos mediante DNA recombinante u otras tcnicas de manipulacin gentica. Se aproxima ms a la microbiologa industrial, pero no es adecuada aun.

Uso integrado de la bioqumica, microbiologa y de la ingeniera qumica con el fin de obtener productos tiles y aplicaciones tecnolgicas de los microorganismos, cultivos celulares y otros sistemas biolgicos. Esta es la definicin ms adecuada a los contenidos de la microbiologa industrial y alimentaria.

De hecho distinguimos 2 clases de biotecnologa.

Biotecnologa tradicional o clsica (Industrial)

Es la rama de la biotecnologa que obtiene produccin a gran escala, con costes reducidos. Sus principales productos son alimentos o ingredientes saborizantes, alcohol industrial, antibiticos y cido ctrico. Se trata de produccin en toneladas y se valora en aproximadamente 31010 $ anuales

Nueva biotecnologa o biotecnologa fina

Se concentra en la fabricacin de productos al detalle. Produccin de tan solo kilogramos al ao, pero son productos de un gran valor aadido, como pueden ser insulina, interfern, enzimas,... Se requiere el uso de tcnicas ms nuevas de ingeniera gentica y de la fusin de clulas para obtener organismos capaces de generar los productos deseados. Hacia 1989 la biotecnologa fina generaba aproximadamente 109 $ al ao, pero cada vez representa una mayor fraccin de la industria total.

Esta divisin no quiere decir que la biotecnologa clsica no utilice las ms modernas tcnicas de ingeniera gentica, ya que si son necesarias, se usan. Ni tampoco quiere decir que en la biotecnologa fina no se usen los conocimientos adquiridos tras tantos aos de trabajo en la biotecnologa tradicional.

En realidad, el ser humano aprovecha las reacciones mediadas por los microorganismos desde hace siglos:

Ao Producto, proceso o descubrimiento

20000 aC Bebidas alcohlicas por fermentacin de diferentes zumos de frutas en pueblos primitivos

6000 aC Cerveza y pan en Mesopotamia, Egipto y China Cultivo de via en el sur del Cucaso

3000 aC Leches fermentadas y quesos en oriente medio Tecnologas de vinos y cervezas en Egipto y Sumeria Vinagre a partir de zumos fermentados

2600 aC Tecnologa del vino fermentado en Egipto 1800 aC Vino: No, babilonio Upnapishtim 1100 aC Cerveza en el Segri 79 dC Quesos azules 1070 Queso Roquefort 1133 Cerveza con lpulo: Santa Hildegarda 1150 Espritu del vino

Arnau de Vilanova: alcohol 1300 Vinagre industrial en Orlens 1650 Cultivo de championes en Francia

2


1680 Leeuwenhoek: visin de clulas de levaduras 1700 Primeras cerveceras industriales S. XIX Nacimiento de la microbiologa con Pasteur S. XX 1920 1 Guerra Mundial. Los alemanes ponen a punto la tecnologa necesaria para la

fermentaciones a escala industrial, para la produccin de disolventes orgnicos. 1940 2 Guerra Mundial. Fleming descubre la penicilina. Se hacen importantes

descubrimientos en ingeniera, como tcnicas de esterilizacin y se perfeccionan las tcnicas de mejora de cepas.

1940 1960 El producto estrella de la biotecnologa son los antibiticos. Tambin se desarrolla la transformacin de los esteroides y se perfeccionan los cultivos de clulas animales para el desarrollo de vacunas vricas.

1960 1970 En Japn se desarrolla la tecnologa para la produccin de aminocidos y 5 nuclesidos, estimulantes del sabor. Se perfecciona la produccin de enzimas, as como las tcnicas de inmovilizacin de clulas y enzimas. Se mejoran las fermentaciones en continuo, para la produccin de SCP.

1975 Aparicin de la tecnologa del DNA recombinante. Produccin de insulina humana en E. coli.

Aplicaciones de los microorganismos en la industria Produccin de metabolitos primarios y de productos relacionados Bebidas alcohlicas Vinos

Cervezas Etanol Etanol industrial

Saccharomyces

cido lctico Lactobacillus Leches fermentadas

Quesos Embutidos

Productos lcticos

Vegetales fermentados: col cida,...

Bacterias lcticas

cido actico Vinagre Acetobacter cido ctrico Aspergillus cido propinico Quesos Emmental Propionibacterium Alimentos orientales fermentados Salsa de soja, miso, kimchi, sutu,

tempeh,... Floriduras y bacterias lcticas

Aminocidos L Glutmico L Lisina

Corynebacterium

Produccin de metabolitos secundarios Antibiticos lactmicos

Tetraciclinas Peptdicos Aminoglicsidos

Penicilium Streptomyces Bacillus Streptomyces

Alcaloides Ergotamina Claviceps Pigmentos Astaxantina Phaffia Produccin de otros componentes biolgicos Polisacridos Dextrano

Xantano Leuconostoc Xanthomonas

Bioplsticos Polihidroxialcanatos Alcaligenes Vitaminas B12

Riboflavina Pseudomonas Ashbya

Transformacin de esteroides Floriduras Streptomyces

3


Aplicaciones ambientales Depuracin de aguas residuales Fangos activos Bacterias aerobias

Protozoos Depuracin de materia orgnica

semislida Biodigestin anaerobia Bacterias anaerbicas

Arqueas Metangenes

Biodegradacin de xenobiticos Biodegradacin de hidrocarburos Pseudomonas Aplicaciones analticas Biosensores Anlisis de glucosa Aspergillus Bioensayos Tests de Toxicidad ambiental Photobacterium Tests mutagnicos Test de Ames Salmonela Produccin de biomasa microbiana Levadura de panificacin Saccharomyces Protena unicelular bacteriana Methylophilus Protena unicelular de levaduras Candida

Microorganismos unicelulares

Microalgas Chlorella Scenedesmus Spirulina

Esporas bacteriana Bioinsecticidas Bacillus Protena unicelular fngica Paecilomyces

Biomasa fngica Cultivo de setas Morchella

Produccin de enzimas y otras protenas Amilasas Aspergillus

Enzimas Proteasas Bacillus

Hormonas Insulina humana Escherichia Otras protenas Interfern humano Escherichia

Sistemas biolgicos usados en la microbiologa industrial Un biocatalizador es un agente biolgico que se utiliza en la obtencin de un producto o servicio de inters biotecnolgico. En la microbiologa industrial se usan diferentes tipos de agentes biolgicos.

Microorganismos: Son los sistemas biolgicos ms usados en la microbiolgica industrial. Se trata de bacterias, hongos, protozoos y virus.

Esporas: En ocasiones el sistema biolgico de inters para producir el producto o el servicio son las esporas, como en el caso de los bioinsecticidas. Obtendremos las esporas a partir de cultivos celulares.

Enzimas y otras protenas.

Cultivos celulares. Podemos usar cultivos celulares vegetales o animales para la fabricacin de productos o la obtencin de servicios, como por ejemplo el uso de hibridomas para la obtencin de anticuerpos monoclonales. En ocasiones se pueden usar solo algunos orgnulos.

Los microorganismos presentan una serie de ventajas sobre los otros posibles sistemas biolgicos.

- Tienen una elevada diversidad metablica y una gran plasticidad. Siempre existir algn microorganismo que pueda hacer la reaccin que se desea en un determinado momento. El nico problema es que se ha de encontrar el microorganismo ms adecuado. Se cree que se conocen tan solo 1/3 de los microorganismos existentes en el mundo.

- Son extremadamente fciles y baratos de cultivar.

o Crecen sobre sustratos baratos. En ocasiones pueden crecer sobre residuos de otras empresas, como papeleras, crnicas,...

4


o Las condiciones de cultivo son baratas de obtener y mantener, en comparacin con las que se necesitara para las transformaciones qumicas. No es necesario normalmente incrementar la temperatura ni la presin. En muchos casos son los propios organismos los que provocarn un cambio de la temperatura. En ocasiones ser incluso necesario refrigerar.

Productos y servicios que puede ofrecer la microbiologa industrial

1. Produccin de clulas, como por ejemplo levaduras o algas con diferentes finalidades. La levadura ser necesaria para la produccin de pan. Las clulas se usan generalmente para la alimentacin, tanto humana, como en el caso de hongos o algas, como animales, como es el caso de la SCP, para formar parte del pienso, o para ser directamente el pienso. Otras veces se producirn clulas, pero slo se aprovechar una parte, como puede ser el caso de las esporas para los bioinsecticidas.

2. Enzimas y otras protenas de elevado valor aadido. Existen muchos enzimas que pueden entraar inters para su produccin industrial, y con diferentes usos posibles. Incluso otros tipos de protenas pueden ser tiles, como la insulina, el interfern,...

3. Metabolitos primarios y secundarios. Tanto un tipo como el otro pueden tener inters aplicado. Los metabolitos primarios son componentes relacionados con la sntesis de clulas microbianas, con su crecimiento. Aumentan en paralelo al crecimiento celular, o incluso de manera solapada. Son por ejemplo los productos finales de las fermentaciones como el etanol o los cidos orgnicos. Los metabolitos secundarios suelen acumularse en la fase que sigue a la fase de crecimiento activo, la trofofase, que es la que se denomina idiofase. Las sustancias que se producen en la idiofase no tienen relacin directa con la sntesis de materiales celulares, ni con el crecimiento. Son sustancias que no son bsicas para el crecimiento. La trofofase y la idiofase no son fases del crecimiento bacteriano, sino que son solo fases de la produccin de metabolitos, pueden coincidir con las fases de crecimiento, pero no son lo mismo.

4. Otros productos. Los anteriores son los productos de mayor importancia, pero existen otros productos, como:

- polisacridos, que tienen muchos usos, como por ejemplo aditivos alimentarios.

- Bioplsticos

- Ciertas vitaminas

- Transformacin de microorganismos. Se obtienen un producto, pero el microorganismo no lo ha sintetizado todo, sino que tan solo ha realizado un par de reacciones sobre l. Es el caso de los esteroides, cidos grasos,... Pueden tener un gran valor aadido.

5. Depuracin de residuos. Los ecosistemas tienen inercia y plasticidad. Cuando sufren alteraciones tienden a recuperarse. La actividad humana altera los ecosistemas, mediante la industria, por ejemplo. La industria que se instala al lado de un ro y usa el agua de este como refrigerante est produciendo en el ro una contaminacin fsica, ya que est alterando un factor bsico, como es la temperatura del ro. El ro continuar fluyendo y pasados unos kilmetros, habr vuelto a la temperatura que tena antes de pasar por la fbrica, ha conseguido restaurar el factor temperatura. Los ecosistemas tienen capacidades de regeneracin y recuperacin, pero la actividad humana actualmente ha superado con creces esta capacidad, por lo que los ecosistemas estarn permanentemente contaminados. Todo esto ha llevado al desarrollo de tecnologas de depuracin, que tratan de reducir el impacto de la actividad humana sobre los ecosistemas. Estas nuevas tcnicas se basan en la mimetizacin de los procesos que tienen lugar en el ro, pero aumentando la concentracin o la intensidad, como en el caso de las plantas de lodos activos.

- Aguas residuales. En los pases desarrollados hay una elevada produccin de aguas residuales, ya sean de origen domstico o industrial. Un elevado porcentaje de esta agua ser tratado biolgicamente. El objetivo de estos procesos es la eliminacin de la materia orgnica del agua, que no eliminarla directamente. Actualmente las aguas residuales se tratan siguiendo una serie de procesos aerbicos clsicos, como son:

o Lodos activos o Lechos bacterianos o Lagunas facultativas o Reactores de clulas inmovilizadas

5


Estos procesos hacen que la materia orgnica en suspensin en el agua se elimine por procesos de sedimentacin. Esto genera lodos, lo que implica que las plantas de depuracin de aguas eliminan residuos lquidos, pero los producen slidos, que debern ser tratados como otros residuos slidos.

- Residuos slidos. Son otro gran problema de los pases desarrollados. Estos residuos pueden ir desde la simple basura del hogar, hasta los lodos resultantes de la depuracin de aguas, pasando por residuos agrcolas e industriales. Los residuos slidos se someten normalmente a procesos de digestin anaerobia. Este tipo de digestin reduce el volumen de los residuos. En condiciones de anaerobiosis, una buena parte del sustrato a partir del cual crecen las bacterias deber ser dedicado a la obtencin de energa, de manera que el crecimiento de bacterias a partir del sustrato es bajo. Los residuos orgnicos pasan a ser casi totalmente CH4 y CO2, lo que se conoce como biogas. El metano producido puede ser un combustible, por lo que puede ser usado como fuente de energa, pero puesto que el principal objetivo es la reduccin del volumen de residuos y su estabilizacin, la produccin de metano no est optimizada, aunque se debe aprovechar el que se produzca.

- Xenobiticos. Adems de los residuos cotidianos, eventualmente se producen vertidos puntuales de xenobiticos. Se trata de productos producidos qumicamente por el hombre, no producidos por ningn ser vivo, y que no pueden ser degradados por ningn ser vivo. Tambin pueden darse vertidos de sustancias recalcitrantes, que son de difcil y lenta degradacin. Se han descubierto una serie de organismos capaces de degradarlos, que son inoculados cuando se produce un vertido. El problema de los xenobiticos se est haciendo desgraciadamente cada da ms comn. Un problema que se encuentra tambin es que para recalificar el suelo industrial a urbanizable, mucho ms rentable, este debe estar limpio de productos xenobiticos.

6. Aplicaciones analticas. Existe la posibilidad de usar microorganismos como biosensores. Se pueden usar tanto los microorganismos vivos, como sus enzimas u orgnulos unidos a electrodos de manera que las reacciones biolgicas devengan corrientes elctricas. Esto permite medir concentraciones de compuestos especficos en diferentes entornos, detectando contaminantes, aditivos en alimentos,... Los biosensores han despertado un gran inters, pero an se estn poniendo a punto.

Otro uso analtico de los microorganismos son los bioensayos, que consisten en la determinacin de una sustancia biolgicamente activa, ya sea conocida o no, sobre material vivo. No todos los bioensayos implican el uso de microorganismos. Antes de producir una sustancia a escala industrial, deberemos realizar con ella una serie de bioensayos, que mida una serie de factores de dicha sustancia.

- Biodegradabilidad. Toda sustancia que sea producida a gran escala industrialmente, en cantidades de toneladas, ha de ser biodegradable, porque si no lo fuese se acumulara muy rpidamente en los ecosistemas. Se han de hacer una serie de ensayos en el laboratorio que demuestren dicha biodegradabilidad. En trminos legales, cuando hablamos de biodegradable, en realidad nos referimos a que el 70% del producto es biodegradable, pasando a ser tan solo agua y dixido de carbono. El 30% restante no se degradar y su composicin permanecer desconocida. Esto es lo que estipula la ley.

- No toxicidad al medio. Las sustancias que van al medio no han de alterar la salud del ecosistema. Existen dos tipos diferentes de ensayos de toxicidad.

o Agudos: Se expone al ser vivo al producto en cuestin a una concentracin muy elevada, durante un perodo breve de tiempo de su vida, por ejemplo, si calculamos una vida de 40 aos, el perodo breve seran 5 minutos

o Crnicos: Se expone al individuo a concentraciones bajas del producto durante un largo perodo de su vida, pudiendo incluso llegar a tratar a sus descendientes para ver el efecto en estos.

Se han de hacer pruebas para evaluar el efecto de un producto sobre el ecosistema. En teora debera haber una serie de tests que permitiesen evaluar la toxicidad sobre todos los niveles del ecosistema, hasta llegar al hombre. Pero no sale rentable, por lo que se realizan muchos

6


tests sobre bacterias, de manera que si es txico para la bacteria no se comercializar. Pero pese a no ser txico para la bacteria podra ser txico para otros organismos.

- Mutagenicidad. Es un factor que se ha de tener muy en cuenta. El problema que presenta la mutagenicidad es que los efectos se pueden producir muy adelante, incluso en la descendencia, por lo que los ensayos que comprueban esto son muy largos y complejos. El test ms empleado actualmente es el que se conoce como test de Ames. Ames obtuvo mutantes His- de S. typhimurium. Este mutante tiene una tasa de reversin elevada de aproximadamente 10-4, que Ames tena muy bien medida. Esta bacteria se pona en contacto con la sustancia a comprobar. Si aumentaba la tasa de reversin, se trataba de un producto mutagnico, en caso de no aumentar era no mutagnico. El problema radica en que muchas sustancias son premutgenos, que en su forma inicial no son mutagnicas, pero que al llegar al hgado se activan y pasan a ser mutgenos. Para comprobar que la sustancia no es un premutgeno se le administraba a una rata. Despus se sacrificaba, se extraa el hgado y se someta a ste a una centrifugacin diferencial. Aslas entonces las fraccin microsomal, que contendr premutgenos activados y la compruebas con S. typhimurium.

7. Lixiviacin. Podemos usar los microorganismos para la recuperacin de metales a partir de minerales y restos de minas, con contenidos de metales demasiado bajos para la fundicin, el mtodo tradicional. La biolixiviacin la realiza Thiobacillus ferrooxidans.

Breve historia de la biotecnologa

Podemos dividir la historia de la humanidad en tres perodos, considerando la manera de conseguir los alimentos. En una primera etapa de cazadores recolectores, el hombre deba perseguir y buscar los alimentos. En una segunda etapa de agricultores ganaderos, el hombre cultiva los alimentos, lo que implica un aumento de la poblacin, as como de la esperanza de vida, pero a la vez genera un problema, puesto que habr pocas del ao en las que no se podr recolectar alimento, por lo que el que se recoja en tiempos de disponibilidad deber durar todo el ao. Se empezaron a desarrollar mtodos de conservacin rudimentarios. Adems, debido a la accin microbiolgica, se desarrollaron otras tcnicas de conservacin, como pueden ser el queso, el yogurt, los embutidos,... En lo que respecta al vino y a la cerveza, se ha de tener en cuenta que hasta hace poco eran la forma ms sana de beber agua, ya que haba una gran posibilidad de que estuviese contaminada. Actualmente estamos en una tercera etapa, en la que somos ya gourmets, ya que en la alimentacin humana el problema no lo representa ya la disponibilidad de alimentos, sino que actualmente los alimentos han de ser saludables y sabrosos.

Indicadores de desarrollo y calidad de vida

Tpicamente, un indicador del desarrollo de un pas y de su calidad de vida suele ser la renta per cpita, el PIB,... pero la produccin de basuras por habitante y da puede ser un indicador tan bueno como cualquier otro. Una produccin de basura superior a 1Kg al da indica una buena situacin econmica, mientras que valores inferiores indican una situacin econmica peor.

Otro valor que puede ser de inters es el consumo de agua diario. Un ser humano necesita estrictamente 1,5 l de agua al da, que es la que ha de beber, pero en la prctica, el consumo de agua por individuo al da es muy superior, sobre todo en pases desarrollados. En pases en vas de desarrollo el consumo diario oscila entre los 20 y los 40 litros diarios por persona. En pases ms desarrollados se alcanzan valores ms elevados. En Barcelona se oscila entre los 170 250 litros al da por habitante, pero considerando la totalidad de Espaa se alcanzarn valores cercanos a los 300, ya que se considerarn tambin todos los campos de cultivo. Los pases ms desarrollados tienen un consumo diario aproximado de 350 litros por habitante.

Cada vez se usa ms agua, por lo que nos enfrentamos a un problema, ya que la precipitacin anual en Barcelona es de 400 550 mm. Bsicamente se siguen dos tcnicas para poder tener el agua necesaria. En primer lugar el agua se reutiliza, y en segundo lugar puede ser necesario traer agua de otras cuencas ms ricas.

7


Fermentaciones Industriales I En los temas siguientes veremos todas las etapas que componen una fermentacin industrial. En la tabla las vemos todas resumidas.

Etapa Curso de la fermentacin

I Preservacin del inculo

II Multiplicacin del inculo a. Cultivo en matraces agitados

b. Formacin de esporas en medio slido

III Cultivo de prefermentacin 1 3 cultivos de prefermentacin

IV Fermentacin de produccin a. Fermentacin discontinua

b. Fermentacin continua

Conservacin del inculo El problema de trabajar con microorganismos es su bajo tiempo de vida, ya que para poder trabajar con ellos son necesarias sucesivas generaciones del organismo que se mantengan idnticas entre s. Esto puede presentar una serie de problemas.

La conservacin de cepas de produccin a lo largo de un perodo largo de tiempo es un requerimiento bsico para la fermentacin industrial. El objetivo no ser solo la supervivencia del organismo, sino que este mantenga sus capacidades de produccin despus de la conservacin. El objetivo de la conservacin es mantener las cepas sin cambios celulares tanto tiempo como sea posible. Ha de encontrarse el mtodo ms adecuado para cada cepa.

1. Subcultivos. Es el mtodo ms fcil. Los microorganismos se mantienen como cultivo por picadura en agar o en cultivo lquido en nevera, pero presenta dos incovenientes:

- Tiene elevados costes.

- Peligroso: Existe un elevado riesgo de contaminacin y de mutacin, ya que se producir una mutacin cada 8 16 semanas, o alguna al ao. Incluso pueden morir todas las clulas al haber tardado en hacer un nuevo subcultivo.

En estos casos los cultivos se mantienen a bajas temperaturas, entre 2 y 6 C, para que las sucesivas resiembras estn espaciadas en el tiempo, hasta semanas, pero se han de hacer en un momento u otro.

Una variante de este mtodo es el uso de medios pobres, ya sean medios mnimos o tan solo agua y agar. Al tener a los microorganismos en medios tan pobres, el crecimiento se ver ralentizado mucho, pudiendo llegar a alargar el tiempo entre las siembras a meses, entre 3 y 5, pero los riesgos son los mismos que se han dicho.

2. Esporulacin. Solo se puede usar en microorganismos esporulantes. En estos organismos habr suficiente con inducir la esporulacin Las esporas se almacenan entonces en un medio mineral, estril y seco, para que no germinen. Esto permite mantener los microorganismos viables durante mucho ms tiempo, incluso dcadas. Los esporuladores son los nicos organismos que no dan problemas de conservacin.

3. Almacenamiento por congelacin. Un descenso de la temperatura de 10 C supone un descenso de la velocidad metablica del 50%. A temperaturas de ultracongelacin el metabolismo estar totalmente frenado, incluso la actividad qumica. Existen diferentes temperaturas de congelacin.

- Suave: -18 C, congelador domstico - Fuerte: -80 C, congelador de 2 compresores

8

- Ultracongelacin: -196 C, congelacin en N lquido.


La congelacin en nitrgeno lquido permite conservar incluso microorganismos delicados ms de 15 aos. Se ha de tener en cuenta, antes de usar este medio, que es caro, ya que se necesita electricidad para mantenerlo y que el nitrgeno lquido se va perdiendo, por lo que se deber ir renovando. En N liquido el organismo no se alterar, pero se ha de considerar si no existe un medio ms econmico de conservacin, acorde con el valor del cultivo.

La congelacin ha de ser rpida pero gradual, para lo que se han de tener en cuenta las siguientes consideraciones.

a. Los microorganismos deben estar en un medio rico y lquido, donde crecern en la fase exponencial hasta llegar a su Nmax, justo antes de llegar a la fase estacionaria.

b. La concentracin de microorganismos ha de ser elevada, para lo que se eliminar el medio por filtracin y se repartir el cultivo en 50 100 viales.

c. Adicin del crioprotector que evitar la formacin de cristales en el interior de la clula, que puede ser glicerol o DMSO, ya que son los ms usados. La concentracin de estos crioprotectores ha de estar entre el 5 y el 20%, ya que concentraciones ms elevadas daran problemas de toxicidad al descongelar.

d. Se congela lo ms rpidamente posible.

e. Al cabo de 10-15 das, una vez se haya estabilizado la congelacin, se debern coger 4 o 5 viales al azar, que se cultivarn. Esto es el control de calidad o control de viables y es bsico, ya que as podremos conocer el nmero aproximado de viables que habr en cada vial, ya que al congelar se habr reducido este nmero. El nmero de viables no ha de ser menor del 70 80% del nmero de viables original. Si se recuperan menos, significar que algo no habr ido bien.

f. Si el control de viables da los resultados deseados, se reparten los viales restantes en 2 congeladores, por seguridad.

4. Liofilizacin. Es el mejor mtodo de conservacin existente. Conserva tan bien como la congelacin, pero presenta la ventaja de que no es necesaria la conservacin a bajas temperaturas, con lo que resulta ms barato y seguro. En la liofilizacin o desecacin por congelacin trabajamos sobre el punto triple del agua, para pasar del estado slido al gaseoso sin pasar por el lquido, en un proceso de sublimacin. En primer lugar se congela y despus se pasa al vaco provocando la sublimacin del agua.

El protocolo de liofilizacin es bsicamente idntico al de congelacin, hasta el apartado c, aunque en la liofilizacin no se usan ni glicerol ni DMSO como crioprotectores, debido a su toxicidad, ya que al eliminar el agua su concentracin sera txica para el microorganismo. En lugar de estos crioprotectores se usan azcares o leche. Entonces congelamos las muestras, nunca a temperaturas superiores a 50 C, y si son inferiores mejor. Eliminamos entonces el agua congelada al crear el vaco en la muestra. Para mantener la muestra liofilizada es bsico impedir que se pueda rehidratar, ya que sin agua no hay metabolismo. Una vez se ha deshidratado se ha de sellar hermticamente la botella. La temperatura ptima de almacenamiento est entre 0 y 18 C, pero nunca menor, ya que no se ha de congelar, y siempre en oscuridad. Una vez liofilizado se ha de hacer un control de calidad, como en el caso de la congelacin.

La liofilizacin es el mtodo que se emplea en la conservacin de las grandes colecciones tipo, porque cuando se puede hacer, hay algunos organismos que no la toleran, es el mtodo ptimo. Permite mantener la viabilidad a largo plazo, con costes reducidos, y menos trabajo que la congelacin en N lquido, el segundo mtodo con mayor viabilidad a largo plazo.

9


Medios de cultivo Los medios de cultivo usados para hacer crecer los microorganismos han de tener todos los elementos necesarios en la forma y las proporciones adecuadas para la sntesis de material celular y la produccin de metabolitos. En un laboratorio se pueden usar productos qumicos, de composicin conocida, para la obtencin de medios de cultivo, que son medios sintticos, pero en las fermentaciones industriales los medios han de ser lo ms baratos posibles. En microbiologa industrial raramente se usan medios ptimos, equilibrados o definidos, sino que en muchos casos los medios usados estn formados a partir de subproductos de otras industrias. Sern medios muy variados en su composicin, nunca ptimos ni equilibrados, ni mucho menos definidos. Esto presenta una serie de consecuencias sobre el desarrollo de los organismos y sobre el control de la fermentacin.

I. Un medio de cultivo ptimo y ms o menos equilibrado es obligatorio para conseguir la mxima produccin. Es necesario por lo tanto optimizar los medios industriales, lo que no es tarea fcil, teniendo en cuenta los ingredientes de los que se parte, muy complejos y variables. Los medios de cultivo industriales pueden optimizarse usando mtodos estadsticos, mediante programas diseados con ordenador. En caso de ser necesario pueden aadirse suplementos de elementos crticos ausentes o insuficientes en el medio.

II. Control de calidad. Los medios se disean para conseguir la mxima produccin. En todos los casos, los nuevos sustratos han de ser evaluados precisamente antes de iniciar la produccin industrial, mediante fermentaciones prueba.

III. Represin por el catabolito. Consiste en la represin de la sntesis de determinadas protenas como consecuencia de la presencia de una determinada fuente de carbono y energa, como puede ser la glucosa. La existencia de una fuente de carbono y energa ptima en el medio puede provocar que algunas protenas no se expresen, lo que puede reducir la eficacia de ciertas reacciones de inters industrial, o incluso impedirlas. La represin por el catabolito o por el producto puede eliminarse optimizando los nutrientes en el medio, de manera que no haya glucosa, por ejemplo, o por gestin adecuada del fermentador, de manera que se aada la glucosa poco a poco al medio. Si no funcionase esta aproximacin, deberan usarse cepas mutantes desreguladas para la produccin.

Sustratos usados como fuente de Carbono y de Nitrgeno

Los carbohidratos son las fuentes de energa por excelencia en la industria de la fermentacin. Por razones econmicas, la glucosa o la sacarosa son usadas muy raramente como nica fuente de C, excepto en procesos que requieran un control muy preciso de la fermentacin. Los sustratos usados ms abundantemente en las fermentaciones son:

- Melazas. Subproducto de la industria azucarera, son los restos del refinado del azcar. Son una de las fuentes ms baratas de carbohidratos. Adems de una elevada cantidad de azcares contienen sustancias nitrogenadas, vitaminas y elementos traza. En cualquier caso, su composicin vara en funcin de la materia prima usada para la obtencin del azcar, las condiciones climticas, la localidad y el proceso usado en la industria azucarera.

- Extracto de malta. Es el extracto acuoso de la cebada malteada. Se trata de un sustrato excelente para muchos hongos, levaduras y actinomicetes. El extracto seco de malta contienen entre un 90 y un 92 % de carbohidratos, concretamente hexosas, que son glucosa y fructosa, disacridos como la maltosa y la sacarosa, e incluso trisacridos como la maltotriosa. Las sustancias nitrogenadas en el extracto de malta incluyen pptidos, protenas, aminocidos, purinas, pirimidinas y vitaminas. La composicin de aminocidos vara en funcin del grano usado, pero la prolina siempre constituye ms de un 50%.

Uno de los problemas que presentan los sustratos ricos en azcares es lo que se conoce como reaccin de Maillard, que se da a bajo pH y elevadas concentraciones de azcares reductores. Los grupos NH2 de las aminas, aminocidos y protenas reaccionan con los grupos CHO de los azcares reductores, lo que resulta en la formacin de productos de condensacin de color tostado, empeorando el aspecto del producto y que no pueden ser usados por los microorganismos, restando as nutrientes.

10


- Almidn y dextrinas. Pueden ser metabolizados directamente por los organismos productores de amilasas. El almidn ha adquirido importancia en la produccin de etanol.

- Lquidos sulfticos de las papeleras. Se trata de productos residuales que contienen azcar de la industria del papel. Los lquidos sulfticos de conferas contiene entre el 2 y 3 % de azcares, de los cuales el 80 % son hexosas y el resto pentosas. En el caso de los rboles de hoja caduca, el contenido es principalmente de pentosas.

- Celulosa. Debido a su gran disponibilidad y bajo coste, la celulosa est siendo utilizada como sustrato de fermentacin. Proviene de la paja, restos de mazorcas, turba, papel,... A menudo no puede ser utilizada directamente como fuente de carbono, por lo que se deber hidrolizar en primer lugar, ya sea qumica o enzimticamente, dando el jarabe de glucosa, que se usa en la produccin de etanol, butanol, acetona e isopropanol.

Fuentes de Carbono y energa diferentes de los carbohidratos

- Aceites vegetales, como aceite de soja, de algodn o de palmera. Son usados como ingredientes secundarios, cuando se usa ya una fuente de carbohidratos como principal aporte de energa.

- Etanol. Es el producto de la fermentacin del almidn sacarificado o de la celulosa y puede ser usado como nica fuente de carbono o como fuente complementaria para muchos organismos.

- Alcanos. Alcanos de 12 a 18 C son rpidamente metabolizados por muchos microorganismos. Estos alcanos son residuos del refinado del petrleo y su uso como alternativa a los carbohidratos depende de su precio.

En lo que respecta a los sustratos usados como fuentes de nitrgeno, en muchos procesos industriales se usan los siguientes.

- NH4+, sales, urea o NH4+ gaseoso.

- Lquido de maceracin del maz. Se trata de un subproducto de la produccin de almidn a partir del maz. El extracto concentrado tiene un 4% de N y numerosos aminocidos, como son: Ala, Arg, Glu, Ile, Tre, Val, Fenil Alanina, Met y Cis.

- Extracto de levaduras. Es un sustrato excelente para muchos microorganismos. Se produce a partir de levaduras de panificacin, induciendo su autlisis a 50 55 C o por plasmlisis en alta concentracin de NaCl. Contiene aminocidos, pptidos, vitaminas solubles en agua y carbohidratos. El glucgeno y la triohalosa se hidrolizan a glucosa durante la produccin del extracto.

- Peptonas. Se trata de hidrolizados de protenas, de manera que contendr aminocidos y pptidos. Pueden ser usadas por muchos microorganismos, pero son bastante caras para la produccin industrial, aunque pese a este su uso est muy extendido. Las peptonas pueden tener dos orgenes.

o Protenas animales. Casena, gelatina, queratina. o Protenas vegetales. Semillas de cacahuete, harina de soja, semillas de algodn y

girasol. Todo esto an retiene mucho nitrgeno, aun siendo subproductos de otras industrias.

La composicin de aminocidos y de pptidos variar segn el origen. Por ejemplo, la gelatina es rica en prolina e hidroxiprolina, pero casi no contiene aminocidos con azufre. En cambio los pptidos de la queratina tienen una elevada concentracin en prolina y cistena, pero carecen de lisina. La composicin del producto final est determinada tambin por el tipo de hidrlisis a que se someta, que puede ser cida o enzimtica. Especialmente afectado se ve el contenido en triptfano, ya que la hidrlisis cida reduce su nivel mucho.

11


Para poder conocer los componentes que tenemos disponibles para confeccionar nuestro medio, existe lo que se conoce como la bolsa de residuos, que es un rgano pblico, donde las empresas deben declarar sus residuos. Los objetivos de la bolsa son:

- Censar los residuos que se producen, para saber donde se producen exactamente y en qu cantidad los diferentes tipos de residuos.

- Solucionar el transporte y la reutilizacin cuando se pueda. Muchos residuos de los que se producen pueden no tener utilidad para la empresa, pero s tenerla para otras empresas, lo que pueden implicar el reaprovechamiento.

Prospeccin y mejora En el momento de fabricar un producto o proporcionar un servicio, se ha de encontrar un microorganismo que permita realizar este proceso. A excepcin de algunos productos de la industria alimentaria, donde se usan cepas silvestres, en la mayora de los casos, es necesario buscar microorganismos y despus mejorarlos. El protocolo clsico que se ha de seguir para realizar la mejora deseada consta de 3 pasos: prospeccin, seleccin y mejora.

Caractersticas generales

Como resulta evidente, el principal factor implicado en el xito o fracaso de un proceso de fermentacin es el microorganismo. Una cepa econmicamente rentable deber cumplir una serie de atributos generales, independientemente del proceso en que est implicada.

1. Tiene que estar disponible en cultivo puro, libre de otros organismos.

2. Tiene que ser capaz de producir fcilmente clulas vegetativas y/o esporas u otras unidades de propagacin, para aumentar su valor.

3. Tiene que crecer vigorosamente una vez introducida en el fermentador, ya que no todos los organismos crecen adecuadamente en volmenes grandes, y usar sustratos baratos.

4. Tiene que formar un producto conveniente, preferiblemente uno solo, fcilmente recuperable y, si es posible, en ausencia de productos colaterales txicos.

5. Tiene que producir la sustancia deseada en un tiempo corto, a ser posible menor a 3 das.

6. Es mejor si tiene proteccin contra posibles contaminaciones, ya sea por crecer a pH cido, o a elevadas temperaturas,...

7. Tiene que ser modificable, mejorable mediante agentes mutagnicos, pero ha de ser genticamente estable en ausencia de stos.

8. Tiene que ser fcilmente conservable en perodos largos de tiempo.

Prospeccin

Los microorganismos pueden aislarse a partir de:

- Colecciones tipo o similares. Las colecciones de cultivos actan como fuentes de cepas de referencia o como lugares de depsito de cultivos. Los cultivos de inters industrial se conservan permanentemente. Los cultivo de investigacin acabados de descubrir se guardan hasta descubrir aplicaciones futuras.

- De la naturaleza. Si no se encuentra nada en las colecciones tipo, se puede pasar a buscar en la naturaleza. Siempre es necesario buscar con criterio. Para encontrar organismos poco corrientes, es necesario buscar en nichos ecolgicos poco corrientes. Las fuentes ms comunes de los microorganismos industriales son suelos, lodos, lagos y ros.

La bsqueda de fuentes de microorganismos es tan solo un primer paso del proceso de prospeccin. Al buscar se encuentran cepas salvajes, de las cuales alguna puede tener inters, mientras que otras no lo tendrn. Una vez se tienen algunas muestras, se han de seleccionar las que tengan inters. Se han de realizar en primer lugar una serie de mtodos de enriquecimiento para aislar los microorganismos ms infrecuentes y dbiles, y potencialmente tiles. Se realiza entonces un proceso de seleccin primaria, que es nicamente un test cualitativo, para saber si cumple la funcin deseada. Generalmente se hace en medio slido.

12


Existen una serie de recomendaciones que se han de seguir.

- Usar medios selectivos para el tipo de organismo deseado

- Usar desde el principio, o lo antes posible, el medio que se usar para la fermentacin, de manera que podemos ver si se adapta.

- Cultivar en unas determinadas condiciones ambientales

- Deteccin de productos o actividades especficas. La muestra deber ser plaqueada en medios diseados especficamente para detectar la actividad deseada. La deteccin ha de ser rpida, para poder hacer el mayor nmero de tests posibles en el menor tiempo. Algunos de los tests que se han diseado son:

o Produccin de productos antimicrobianos mediante la tcnica de la placa superpoblada.

o Produccin de enzimas extracelulares. o Produccin de inhibidores enzimticos. o Produccin de productos especficos detectables porque provocan cambios en el

medio.

o Produccin de metabolitos primarios, como aminocidos, vitaminas,... por la tcnica de la doble capa.

Seleccin

Una vez realizada la prospeccin tendremos cientos de cepas, de las cuales solo mantendremos unas decenas despus de la seleccin primaria. La seleccin primaria est diseada para aislar organismos potencialmente interesantes. La seleccin primara ideal debe cumplir una serie de requisitos.

Predictiva Barata Sensible Adaptable a un nmero elevado de muestrasRpida Especfica para las actividades deseadas

La seleccin primaria en placa permite detectar rpidamente microorganismos potencialmente interesantes, pero tiene como limitacin el hecho de que se hace en medio slido, mientras que para el crecimiento usaremos medio lquido. Deberemos hacer por lo tanto una seleccin secundaria, donde se valorar la produccin deseada, a nivel cuantitativo. Generalmente se hace en medio lquido, con las condiciones que habr en el fermentador, para determinar la cepa que producir mas, no la que producir ms rpido. Tambin permitir ver la que crecer mejor en el fermentador y la facilidad de separacin del producto.

Diversos mtodos de seleccin primaria de cepas productoras

Producto buscado Mtodo en placas de agar con: Deteccin de colonias productoras por: Antibiticos Microorganismos sensible a

antibitico Halos de inhibicin del crecimiento del microorganismo sensible.

Proteasas Casena Halos claros sobre placas turbias. Amilasas Almidn Halos no teidos al aadir yoduro. Lipasas Emulsin de aceite Precipitacin de cidos grasos libres con

Calcio. Fosfatasas Fenolftalena difosfato e indicador de

color Cambio de color.

Aminocidos Microorganismo auxtrofo del aminocido en medio mnimo

Halos de crecimiento del auxtrofo.

13


Optimizacin del producto y del biocatalizador

Una vez tenemos el organismo que forma el producto de inters en elevada cantidad, es necesario conseguir que sea capaz de producirlo a nivel industrial. Se ha de incrementar la productividad de la cepa seleccionada, lo que puede conseguirse de dos maneras:

- Modificando el medio y las condiciones de cultivo

- Modificando el genoma del microorganismo. El aumento de productividad de una cepa se ve limitado por su genoma, por lo que modificamos el genoma.

Podemos realizar 3 tipos bsicos de manipulaciones genticas en el organismo.

- Mutagnesis al azar

- Fusin de protoplastos

- Tcnica del DNA recombinante

Hasta los aos 80 90, lo que se haca principalmente, debido a la falta de conocimientos genticos adecuados, era la mutagnesis al azar. Esta tcnica, al igual que la fusin de protoplastos implica seleccin posterior, debido al fuerte componente aleatorio. En cambio, las tcnicas que implican DNA recombinante son dirigidas, por lo que no requieren seleccin posterior.

Mutagnesis al azar

Se trata de mutaciones en el material gentico no producidas por recombinacin. Son mutaciones que se dan de manera natural pero en una frecuencia muy baja. Se calcula que de manera natural se producira una mutacin de inters industrial cada 20.000 aos. No es nada prctico, por lo que es necesario inducirlas, para que se produzcan ms mutaciones en general, de las que podamos extraer las mutaciones prcticas. Distinguimos diferentes tipos de mutaciones.

Tipo de mutacin Cambios Efectos Substituciones: Depende del codn:

Diferente AA Protena no funcional

Transiciones AG TC

Stop (mutacin non-sense) Protena incompleta Mismo AA (mutacin silenciosa)

Transversiones AT GC

Protena normal.

Microinserciones ATG GCT GTC ... ATG AGC TGT C...

Mutaciones puntuales de una sola base

Microdeleciones ATG GCT GTC ... ATG CTG TC...

Mutacin de corrimiento de la pauta de lectura (Frameshift)

Deleciones Prdida de muchas bases

Prdida de funcin de los genes

Inserciones Transposones Diversos efectos Inversiones Cambio de sentido de

un fragmento Prdida de funcin de los genes

Mutaciones de muchas bases

Translocaciones Cambio de lugar de un fragmento

Diversos efectos

14


Podremos aumentar la frecuencia de mutaciones mediante el uso de agentes mutgenos, que pueden ser o bien qumicos o bien fsicos, cuya presencia daa, altera o interfiere en la reparacin del DNA. Se pueden emplear diferentes tipos de agentes mutagnicos:

Agente mutgeno Forma como acta Tipo de mutacin Radiaciones Ultravioleta Formacin de dmeros de

pirimidina Radiaciones ionizantes (X, ) Rotura de cadenas del DNA

La reparacin puede causar sustituciones o microdeleciones

Anlogos de bases 5 bromouracilo Incorporado en lugar de T 2 - aminopurina Incorporado en lugar de A

Transiciones

Agentes alquilantes Monofuncionales: Etilmetanosulfonato Metilacin de G Transiciones Bifuncionales: mostazas de nitrgeno,

mitomicina, nitrosoguanidina Metilaciones, entrecruzamiento de cadenas Mutaciones puntuales y deleciones

Colorantes intercalantes Acridinas, Bromuro de etidio,... Insercin entre 2 pares de

bases Microinserciones y microdeleciones

Otros compuestos cido nitroso Desamina A y C Hidroxilamina Reacciona con C

Transiciones

Como se ve en la tabla, cada agente mutgeno tiene caractersticas y efectos diferentes, por lo que se deber elegir siempre el que ms se ajuste a las necesidades.

Despus del tratamiento obtendremos 3 tipos de organismos:

- Parentales: el tratamiento no les ha afectado, no han sufrido mutacin.

- Mutantes no viables: organismos a los que la dosis del mutgeno ha causado tantas mutaciones que ya no son viables.

- Mutantes viables

Los ms numerosos suelen ser siempre los no viables, por lo que ser necesario ajustar la dosis de mutgeno que se aplica para que quede un porcentaje de viables adecuado. Una vez pasado el tratamiento, se han de hacer crecer las clulas en medio rico, para incrementar la viabilidad de los mutantes viables, para recuperarlos del tratamiento. Llegados a este punto podemos empezar a aplicar tcnicas de enriquecimiento de los mutantes. De todos los mutantes obtenidos se deber seleccionar el mutante que resulte ms ventajoso.

15


Se pueden obtener muchos tipos de mutantes:

Tipo de mutantes Causa Forma de deteccin No capsulado Prdida de la cpsula Colonias pequeas y rugosas en

lugar de grandes y lisas No mvil Prdida de flagelos Colonias compactas, en lugar de

dispersas Despigmentado Prdida de un enzima en la ruta biosinttica

del pigmento Prdida o cambio de color de las colonias

Colonias rugosas Prdida o cambio del lipopolisacrido de la pared

Colonias granulares e irregulares, en lugar de lisas

Fermentacin de azcares

Prdida de un enzima de una ruta metablica No hay cambio del color del agar con el azcar y el indicador de pH

Auxtrofo de un nutriente

Prdida de un enzima en una ruta biosinttica de nutrientes

No crece en el medio sin el correspondiente nutriente

Sensible al fro Alteracin de una protena esencial, que pasa a ser ms sensible a temperaturas ms bajas que las ptimas

No crece a temperaturas fras, a veces no crece ni a 20 C

Termosensible Alteracin de una protena esencial que pasa a ser ms termosensible

No crece a temperaturas elevadas

Resistente a drogas o anlogos

Alteracin de la permeabilidad o del enzima diana o detoxificacin de la droga

Crece en presencia de una concentracin antes inhibitoria de una droga o anlogo

Resistente a virus Prdida del receptor del virus Crece en presencia de una alta concentracin del virus

De todos estos, los mutantes auxtrofos pueden ser de los ms interesantes, mutantes que necesitan la adicin de un metabolito al medio, ya que no pueden sintetizarlo. En estos mutantes la va de sntesis del metabolito se puede ver afectada, lo que puede implicar la acumulacin de productos en esa va. Si deseamos uno de esos productos tenemos una mayor produccin. Otra posibilidad es que, debido a que se forma el nutriente, no se forma otra sustancia, que nosotros deseamos. Si cortamos la posibilidad de que se forme el nutriente, la sntesis se desviar hacia el producto deseado. No obstante se ha de tener en cuenta que no todos los auxtrofos para un metablitos sern de inters, puesto que dependiendo del enzima afectado puede no formarse el producto deseado.

La deteccin de mutantes auxotrficos es sencilla, puesto que las bacterias que crezcan en medio rico, pero no en medio mnimo sern auxotrficas. Hasta aqu bien, pero se ha de tener en cuenta, que una vez tengamos estas bacterias, no sabremos para que nutriente son auxtrofas, por lo que deberemos ir haciendo diferentes pruebas hasta identificar el nutriente en cuestin.

Otro punto que se ha de tener en cuenta es que en muchos casos habr mecanismos de regulacin en la bacteria, que no permitirn la acumulacin de intermediarios, por lo que lo que nos interesar sern mutantes desregulados, que no tengan regulacin, de manera que la acumulacin de un producto no interfiera con la sntesis final.

El mtodo para aislar mutantes resistentes a anlogos consiste en determinar la concentracin inhibitoria del anlogo, para despus plaquear bacterias tratadas con el agente mutgeno, en medios con concentraciones crecientes de inhibidor. De esta manera, las bacterias que crezcan en estas concentraciones mayores, estarn desreguladas. Las causas de la desregulacins pueden ser:

- Se produce una mutacin en la regulacin de un gen, de manera que debido a una menor sntesis, es menos sensible a la incorporacin del anlogo.

- Puede tener una capacidad disminuida de incorporar el anlogo.

- ....

Los mutantes resistentes a anlogos suelen ser sobreproductores, pero no siempre, porque no estn sujetos a regulacin por sustrato. Si es auxotrfico puede sobreproducir intermediarios de la va en lugar del metabolito final.

16


Una misma ruta metablica puede tener regulacin de diferente complejidad en diferentes cepas bacterianas, de manera que en el momento de producir una determinada sustancia, trabajaremos con el microorganismo que facilite el trabajo.

Al igual que tener el tratamiento mutagnico adecuado, es necesario que tengamos un mtodo preciso para la determinacin y aislamiento del mutante. Pero en caso de que no se pueda detectar mediante ninguno de los mtodos tpicos, de podrn analizar diferentes clones en fermentaciones lquidas para ver cual de ellos sera mejor para la fermentacin deseada.

Fusin de protoplastos

Hasta principios de los aos 90, la mutagnesis al azar era el mtodo ms empleado, pero a partir de entonces se han introducido nuevos mtodos de modificacin gentica de microorganismos, como el de la fusin de protoplastos, que consiste en una trasferencia gnica precedida por la fusin en s. Requiere tambin requiere un proceso de seleccin posterior al tratamiento, ya que la recombinacin que se da es al azar.

Los protoplastos se generan por el tratamiento de las clulas con enzimas lticos diversos, que degraden la pared. Ser necesaria la presencia de un estabilizador osmtico para evitar la lisis. La fusin es potenciada por la accin del polietilenglicol, PEG, o mediante electrofisin, y la recombinacin puede ser potenciada mediante el uso de cepas que tengan mutaciones que favorezcan este proceso. La fusin de protoplastos se usa mucho en la mejora de hongos y levaduras, ya que en muchos casos son organismos asexuales. Otra de las ventajas que presenta la fusin de protoplastos es que se pueden fusionar clulas de taxones muy alejados, aunque cuanto ms alejados, menor la viabilidad del hbrido.

Tecnologa del DNA recombinante

Se conoce como tecnologa del DNA recombinante al conjunto de tcnicas que permiten la manipulacin de los genes como unidades bioqumicas e incluye tcnicas como:

- Recombinacin in vitro

- Clonacin gnica

- Manipulacin gnica

- Ingeniera gentica

Permiten la introduccin de secuencias especficas de DNA en organismos procariotas o eucariotas y la posterior replicacin y expresin de estas secuencias para llevar a cabo la informacin codificada en estas secuencias. Seguimos un protocolo, como se ve a continuacin:

1. Aislamiento de la secuencia de DNA de inters para su clonacin posterior

Las endonucleasas de restriccin, ER, son enzimas bacterianos que las protegen de la invasin de DNA ajeno. Cortan DNA bicatenario en secuencias especficas, generalmente palindrmicas, de 4 a 11 nucletidos, generando extremos romos o cohesivos.

Cuando no conocemos la secuencia de DNA que queremos clonar, la estrategia consiste en hacer una genoteca, y posteriormente seleccionar con el mtodo adecuado los clones que presenten el carcter deseado. Si conocemos la secuencia de DNA, la podemos usar como una sonda para encontrar el clon que buscamos.

2. Incorporacin de la secuencia de DNA aislada en un vector

Existe una gran variedad de vectores para la transferencia de DNA. Los ms usados son los plsmidos y los fagos, junto con los csmidos.

Los plsmidos son elementos genticos:

o Circulares, por lo que estn protegidos contra las endonucleasas. o Pequeos, por lo que pueden ser transferidos fcilmente. o Tienen un origen de replicacin, por lo que se pueden replicar en el husped. o Pueden codificar para numerosas funciones celulares, como resistencias o la

capacidad de conjugar con otros organismos.

17


Dependiendo de lo que quieras hacer con el DNA aislado, lo insertars en uno u otro tipo de vector, ya que existen diferentes tipos de vectores, como:

o De clonacin: son vectores usados para amplificar el DNA en la clula husped. o De secuenciacin: son vectores que contienen un elevado nmero de lugares de

restriccin, de manera que al ser cortado se generan fragmentos de tamao variable para ser secuenciados.

o De expresin: adems de un lugar de clonacin, el polilinker, contienen operadores, promotores, terminadores y un ribosome binding site, RBS, para permitir la expresin del DNA clonado.

La introduccin del DNA exgeno al plsmido se hace de diferente manera, en funcin de si al cortar con los enzimas de restriccin se generan extremos romos o cohesivos. Si se generan extremos romos, los extremos 5 se digerirn con una exonucleasa, mientras que los 3 se elongarn mediante una transferasa terminal, con ATP o TTP, generando una cola de poliA o poliT. Se podrn unir entonces y formar el plsmido deseado. En el caso de que se generen extremos cohesivos, cortaremos con dos diferentes enzimas, de manera que el inserto se insertar en la direccin deseada en el plsmido.

3. Incorporacin del vector con el DNA insertado en la clula husped

La eficiencia de la incorporacin del DNA por la clula husped es una fase crtica en la manipulacin gentica. Dentro de las clulas husped podemos encontrar tanto microorganismos como clulas animales o vegetales. Dependiendo de la naturaleza del husped usaremos uno u otro sistema para introducir el DNA, como pueden ser pistolas gnicas, Agrobacterium,...

4. Seleccin de los huspedes que hayan incorporado el vector

Es necesario distinguir los clones que han introducido el DNA exgeno, para lo que podemos examinar diferentes puntos:

o La presencia del vector recombinado, mediante el anlisis de colonias. Para esto se usa la tcnica de la inactivacin del marcador, por ejemplo. Se trata de un vector con dos marcadores, pero que uno de ellos contiene la diana para la incorporacin del DNA exgeno. De manera que, si da negativo para ambos marcadores, no habr incorporado ningn vector, si da positivo en ambos, ha incorporado un vector que no tena el inserto, pero si da positivo en uno y negativo en el otro, habr incorporado el inserto con el DNA ajeno.

o La presencia del DNA exgeno. Se puede hacer mediante la hibridacin de las colonias. Se hace una rplica de la placa con un tampn de terciopelo sobre un filtro de nitrocelulosa, provocando la lisis de las colonias sobre el filtro y desnaturalizando el DNA. Se hace un lavado para eliminar el exceso de protenas y se fija el DNA al filtro calentndolo y se analiza la presencia mediante una sonda para la secuencia especfica.

o Deteccin indirecta del DNA por expresin de la protena, ya sea mediante un Northern, mRNA, o un Western, deteccin de protenas.

18


Aspectos de ingeniera a considerar para una fermentacin industrial con xito Las fermentaciones industriales se definen como procesos industriales, en los que los microorganismos son una parte muy activa del proceso productivo. El microorganismo es lo ms importante en las fermentaciones industriales y los aspectos de ingeniera siempre estn supeditados al organismo. En base a cual y como sea mi biocatalizador, y que producto quiera que sintetice, tendr que elegir, para diferentes aspectos, las condiciones que sean las ms adecuadas para mi biocatalizador. La ingeniera es por lo tanto tan solo una herramienta que facilita el proceso que realiza el biocatalizador, mientras que en otras industrias puede ser la base esencial. Existen una serie de aspectos de ingeniera que se deben considerar.

Salto de escala

Implica el paso en el cual un procedimiento desarrollado con xito en el laboratorio, en volmenes reducidos, es modificado para ser usado en fermentaciones de gran tamao, manteniendo las mismas condiciones.

Implica la modificacin de algunas condiciones de fermentacin necesarias para mantener la productividad al variar algunas condiciones, como suelen ser dimensionales. Es necesario el salto de escala, el reajuste de algunos parmetros, cuando pasamos de laboratorio a planta industrial, debido al gran incremento en las proporciones. Tambin es necesario un reajuste, cuando implementamos el uso de una nueva cepa con un rendimiento entre un 10 y un 20% superior a la anterior, ya que el cambio en la produccin puede implicar cambios en las condiciones.

El problema del salto de escalas viene dado por el hecho de que en las primeras fases se ha de comprobar el funcionamiento de la bacteria en el laboratorio, donde los objetivos son diferentes que en la planta. En el laboratorio se intentan optimizar la produccin en trminos puramente cuantitativos, mientras que en la planta es la optimizacin del rendimiento, considerando tambin los costes. Tener xito en el salto de escala querr decir conseguir la mxima produccin en la planta, en el mnimo de tiempo y con el mnimo de costes.

Tipo de proceso segn la relacin del biocatalizador con el medio y el agua

Dependiendo del tipo de biocatalizador que tengamos, y de las condiciones de este, ser ms rentable usar un tipo u otro de medio y una determinada concentracin de agua, as como inmovilizar el biocatalizador. Distinguiremos por lo tanto entre cultivos sumergidos o en superficie, as como tambin podremos tener el biocatalizador inmovilizado o no. Finalmente, el cultivo podr ser slido, semislido o lquido. Existen numeroso mtodos para inmovilizar clulas, como se ve en la grfica.

19


Tipos de proceso segn la cintica del proceso y la entrada de medio

Una vez decidido como se har, es necesario determinar la dinmica en la que realizars el proceso, lo que depende ms del producto que del microorganismo. Tambin depende del tipo de medio que haya elegido que algunas opciones parezcan un poco sin sentido. Considerando la cintica de la entrada de medio podemos clasificar 3 tipos de cultivo:

- Discontinuos (o batch)

- Discontinuos con alimentacin (Fed batch)

- Continuos

El hecho de decidir uno u otro tipo depende del biocatalizador y del producto que quieras conseguir.

Cultivos continuos

Es la aplicacin del principio del quimiostato a la industria. La solucin nutriente se aade continuamente al biorreactor a la vez que se extrae una cantidad equivalente de medio usado con organismos, una vez alcanzado el equilibrio.

Se usa, o se intenta usar, porque es de difcil aplicacin, cuando el producto de inters se sintetiza en la fase logartmica del crecimiento. Por lo tanto interesa que las bacterias estn en esa fase cuanto ms tiempo mejor, para lo que requieren ms medio. Aunque en teora el funcionamiento podra ser ilimitado, normalmente se considerara un xito el pasar de las 200, puesto que conseguir mantener las condiciones en el interior del fermentador es muy difcil. Presenta una serie de ventajas e inconvenientes:

Ventajas de los cultivos continuos

- Productividad: Si funciona bien, la productividad ser mxima el tiempo que funcione.

- Rentabilidad constante: El tiempo total es el tiempo entre 2 producciones consecutivas. En batch y fed-batch, aparte del tiempo de cultivo se ha aadir el de prefermentacin, por lo que la rentabilidad es menor.

- Aumento de beneficios: Se reducen costes, porque est todo automatizado

Inconvenientes de los cultivos continuos

- Poco verstil: Una vez puesto en marcha no se pueden alterar los parmetros, porque el equilibrio se destruira.

- Tecnologa ms cara

- Duracin real limitada: En muchos casos, en el laboratorio operan de 20 a 200h solo, pero para que fuese rentable tendra que funcionar entre 500 y 1000 horas, lo que no sucede.

- Composicin variable de medios: La entrada de medios es constante, pero la composicin de estos medios es variable, por lo que el equilibrio se ver alterado.

- Contaminaciones: Mantener condiciones estriles a nivel industrial durante largos perodos de tiempo

- Cuando se usan cepas de elevado rendimiento se pueden producir mutantes degenerados que pueden crecer ms rpido que las cepas productoras, con lo que te harn perder dinero y medio.

Cultivos fed batch

Los nutrientes crticos se aaden en baja cantidad al principio, pero continan aadindose en dosis pequeas a lo largo de todo el crecimiento, de manera escalonada. Este sistema se usa a menudo para la sntesis de metabolitos secundarios, la sntesis de los cuales est sometida a represin por el catabolito, o bien cuando el inculo es problemtico.

20


Cultivos discontinuos o batch

Es el ms habitual. En el inicio del cultivo, el medio estril se inocula con un volumen adecuado de microorganismos y se permite que se lleve a cabo la fermentacin en condiciones ptimas. A lo largo del proceso no se aade ningn nutriente, salvo el oxgeno. Llega un momento, por lo tanto, en que los nutrientes son limitantes para el crecimiento, por lo que se dan las fases tpicas de un cultivo bacteriano.

Considerando las cinticas de produccin del producto podemos clasificar en:

- Tipo I: el producto deriva directamente del catabolismo, pudiendo ser incluso la propia bacteria. El consumo de sustrato y el crecimiento, as como la formacin del producto se dan prcticamente de manera simultnea. La trofofase y la idiofase se solapan. Este es el caso de la SCP o del etanol.

- Tipo II: El producto es producido tambin durante el metabolismo primario, pero deriva de una va biosinttica lateral dentro del metabolismo primario. El consumo de sustrato y la produccin de producto estn ligeramente separados. En este tipo de fermentaciones, cuando se hacen de manera discontinua, se producen dos mximos. En un primer mximo se alcanza un elevado crecimiento y consumo de sustrato, pero la produccin de producto es baja o nula. En el segundo mximo el crecimiento es menor y la velocidad de consumo del sustrato es elevada, as como la produccin de producto. La trofofase y la idiofase existen en la fase de crecimiento celular, pero separadas la una de la otra. Es el caso del cido ctrico y algunos aminocidos.

- Tipo III: El producto deriva del metabolismo secundario. La trofofase y la idiofases estn en tiempos totalmente separados y en fases diferentes de la curva de crecimiento.

Esta clasificacin no puede ser aplicada a todas las fermentaciones. Segn el metabolismo, la composicin del medio y las caractersticas de la cepa usada, existen muchas formas intermedias, pero en cualquier caso, saber a cual es ms similar la fermentacin en cuestin permitir determinar que cintica de entrada deberemos usar.

Tipo I Continua Tipo II Discontinua o Fed BatchTipo III Discontinua o Fed Batch Depender de las cuestiones de regulacin,...

Equipos

Una vez tenemos el medio y conocemos la cintica de la fermentacin, necesitamos el contenedor donde se realizar la fermentacin en s.

Caractersticas fsicas del fermentador

El biorreactor es todo aquel recipiente donde tiene lugar un proceso industrial hecho por microorganismos. Llegado el momento de decidir o disear el fermentador a usar, se han de tener en cuenta unas caractersticas:

- Relaciones geomtricas: Hasta los 3000 litros los fermentadores pueden ser constituidos uniformemente, pero a partir de aqu las propiedades fsico qumicas del fermentador varan a medida que aumenta el volumen. Se ha de tener muy en cuenta para el salto de escala y en el momento de aadir equipos adicionales.

- Versatilidad: Generalmente no se hacen biorreactores muy optimizados para unas determinadas condiciones a no ser que se tengan las cosas muy claras desde el principio. Un biorreactor debe ser adaptable a diferentes parmetros. El biorreactor ms verstil es el fermentador aireado con agitacin.

- Materiales: Los fermentadores de laboratorio pueden ser de cristal o de acero inoxidable. Para volmenes grandes se hacen siempre de acero inoxidable, teniendo siempre especial cuidado en el sellado para evitar contaminaciones hacia dentro y hacia fuera.

21


Equipos auxiliares

Aunque la cubeta del biorreactor es el principal foco de inters, una instalacin de han de considerar una serie de mecanismos adicionales necesarios para que el sistema funcione.

- Sistema de agitacin: Los biorreactores tienen un gran volumen. Es necesario un sistema para que se homogenice. Existen diferentes tipos de agitadores. El ms habitual es el agitador en disco, que consta de un disco de dimetro apropiada, del que salen de 4 a 8 palas radiales, asociadas a un motor que las hace girar. Las palas pueden tener diferente geometra y diferentes rendimientos.

- Sistema de aireacin: Si se trata de un proceso aerobio, ser necesario que haya oxgeno. Considerando las caractersticas del biorreactor, no podemos poner oxgeno al principio, y ya est, ya que el oxgeno se diluye muy mal. Es necesario un aporte continuado de oxgeno en el medio, que se

mismo

-

e los sensespu

o

o

con el proceso que tiene lugar en el fermentador. Suelen usarse aceites o alcoholes

introducir a travs de una entrada de aire.

Una vez en el interior, el aire se distribuye a travs de placas difusoras, que generan burbujas, que sern destruidas por el sistema de agitacin, que influye de esta manera en la aireacin. El aire que entra debe ser esterilizado, como ya veremos ms adelante, pero se ha tener tambin en cuenta que cada minuto podemos tener que introducir el volumen de aire que de medio hay en el fermentador.

Sistema de eliminacin de espuma: Los medios de cultivo suelen producir espuma, ya que son ricos en materia orgnica. La espuma es un problema, porque puede interferir en la medida d

ores. Podemos eliminar la ma de dos maneras:

Rompe espuma: Es el mtodo ms sencillo, consiste en un sistema similar al agitador. Tambin se puede destruir la espuma gracias a la fuerza

Biorreactor instrumentalizado de laboratorio - OD, T, pH, ES: sensores de O2 disuelto,

temperatura, de pH y de espuma - AE, OH-, H+: recipientes con antiespumante,

lcali y cido - F: Filtros de aire - M: Motor de rompeespumas y de la agitacin

(inferior) - PM: Toma de muestras - B: Rompecorrientes - R: Resistencia trmica

centrfuga.

Adicin de antiespumantes: Se aaden en la interfase entre aire y lquido, para que no se mezclen con el medio. Los agentes qumicos usados como antiespumantes han de ser lo ms inertes posibles, para que no interfieran

22


- Sistemas de control: A lo largo del proceso de fermentacin necesitaremos conocer las condiciones en las que se encuentra el cultivo y el medio. Todos los sensores han de ser esterilizables y estar conectados a un sistema para conocer las condiciones internas.

o Sistema de control de temperatura (Termostato): para que el rendimiento del fermentador sea ptimo, es necesario que el proceso se realiza en una temperatura constante. Dentro del fermentador hay una serie de fuentes de calor, como pueden ser el motor del agitador, de los compresores que introducen el aire y los propios organismos, con su actividad metablica. Existe una cierta prdida de calor por evaporacin y por radiacin, pero no es suficiente, y el sistema se calienta. Por lo tanto es necesario que el termostato est unido a un sistema de refrigeracin, ya sea por camisas de agua o por serpentinas de refrigeracin.

o Sensor pH: el pH es un factor que vara mucho como resultado del crecimiento de las bacterias. Ser necesario medir el pH, a la vez que el sensor est unido a un sistema que aade cido o base para mantener el pH.

o Sensor O2: es necesario determinar la velocidad de consumo de oxgeno, para permitir el crecimiento sin impedimentos. Existen diferentes mtodos de determinacin de la velocidad. Es necesario tener un sensor asociado al sistema de aireacin.

o Sensor CO2 producido: se trata del metabolito gaseoso ms importante que se puede producir durante la fermentacin. Su acumulacin en el medio puede tener efectos negativos, por lo que es necesario controlarlo.

Podemos plantearnos la inclusin de todos los sensores que podamos imaginar, para monitorizar mejor el proceso. Todos los sensores han de ser esterilizables, lo que impide aun el uso de biosensores, de manera que se utilizan electrodos.

- Toma de muestras: Es en cierta manera un sistema de control. La toma de muestras es un dispositivo que permite coger una muestra de medio para analizarla en el laboratorio. Esto implica un riesgo de contaminacin, pero es necesario debido a la necesidad de monitorizar el proceso. La toma de muestras ha de impedir siempre la contaminacin en ambos sentidos. La contaminacin hacia dentro se evita, impidiendo el contacto entre la parte interna del fermentador y la externa, mientras que la contaminacin hacia fuera se impide mediante sobrepresin

Componentes y sustratos

En este aspecto, hemos de considerar:

- Formulacin del medio de cultivo: Tiene que garantizar el crecimiento ptimo.

- Desarrollo del inculo: Se ha de desarrollar el inculo en la etapa de prefermentacin. El cultivo preservado se reactiva inicialmente en cultivo lquido en agitacin o sobre medio slido, en condiciones adecuadas para la fermentacin posterior. Segn el mtodo de preservacin se requerir ms o menos tiempo para la recuperacin del cultivo. Sucesivamente se ir incrementando el volumen del recipiente de cultivo, para conseguir la velocidad de crecimiento adecuada. Es vital ir incrementando el volumen para que a escala industrial se alcancen los resultados ptimos. Si el nmero de clulas no est en el nmero adecuado, la produccin no ser adecuada. Adems, si crece en condiciones diferentes a como crecer despus, existir una fase de latencia en el fermentador, reduciendo la rentabilidad.

23


Esterilizacin

Para una buena rentabilidad, en virtualmente todos los procesos, ser necesario que en todas las etapas estn libres de contaminantes. Tambin depende, no obstante, del campo en que nos estemos moviendo. En el campo medio ambiental, hablar de esterilizacin no tiene mucho sentido, mientras que en el campo alimentario ser esencial. Generalmente, la necesidad de un proceso de esterilidad est en relacin con el valor aadido del producto.

La probabilidad de que exista contaminacin a lo largo del proceso depende de las caractersticas del mismo. La probabilidad de que exista contaminacin en un cultivo mesfilo es mayor que en un cultivo termfilo. Tambin ser ms probable que exista contaminacin en un medio con pH aproximado a 7, ms que a pH cido. La probabilidad de que haya contaminacin ser mayor en los que consuman mucho oxgeno, que en los que consuman menos.

Llegado a este punto hemos de plantear la optimizacin del proceso a nivel de produccin, sino a nivel de seguridad. Si se puede ajustar el pH hacia abajo, mejor, que ser ms seguro.

Durante la fermentacin hemos de observar diferentes puntos para garantizar la esterilidad:

- Esterilidad del medio de cultivo: el medio nutritivo que se prepara inicialmente contendr un elevado nmero de clulas vegetales y otras derivadas ingredientes del medio. Todos estos microorganismos han de ser eliminados por el proceso adecuado antes de la inoculacin. Existen diferentes mtodos, pero normalmente se usa el calor, y raramente otros.

- Pureza del inculo: el inculo representa entre el 2 y el 5% del volumen total del biorreactor, si el cultivo no es puro habr contaminaciones.

- Esterilizacin del aire que fluye: La mayor parte de fermentaciones se dan en condiciones de agitacin vigorosa. El aire que entra ha de ser estril. El aire puede contener entre 10-105 partculas/m3. de los cuales entre 5 y 2000 sern microorganismos, principalmente esporas de hongos, bacterias Gram negativas y fagos en suspensin. La esterilizacin del aire que entra es esencial.

- Construccin apropiada del biorreactor, para que la esterilizacin entre fermentacin y fermentacin pueda servir para prevenir la contaminacin. Cuando decimos biorreactor queremos decir todos que contenedores usados para que tenga lugar la reaccin.

Cul ser el mtodo usado para la esterilizacin? Mediante el uso de un agente biocida que inactive los microorganismos. Los agentes biocidas tienen diferentes dianas. Los usados en biotecnologa se clasifican en:

- Agentes qumicos: existe un elevado nmero de desinfectantes qumicos lquidos y gaseosos. Pueden ser sustancias oxidantes como O3, xido de etileno,... En la prctica se usan poco, porque son difciles de eliminar y por lo tanto se corre el riesgo de inhibir el crecimiento de los microorganismos despus, en la fermentacin.

- Agentes fsicos: son los ms habituales.

o Radiaciones ionizantes: Rayos X, UV, o . Aunque ocasionalmente se usan en industria alimentaria, no se usan de manera habitual en fermentaciones industriales por el riesgo que suponen para el manipulador.

o Calor: es el mtodo ms empleado, sobre todo para el medio y para las instalaciones. Usualmente se usa vapor de agua para esterilizar mejor.

o Mtodos mecnicos: Filtracin, Centrifugacin,... La filtracin es la nica que se usa en la prctica. Es til para la esterilizacin de medios con partes sensibles a calor y para esterilizar el aire.

24


Tal y como ya hemos dicho, el calor es el mtodo ms empleado. Los agentes biocidas suelen tener cinticas de primer orden. Se ha de tener siempre en cuenta el factor CT, siendo c la concentracin o intensidad del agente biocida y t el tiempo de tratamiento. Es necesario recordar esto, puesto que se puede conseguir el mismo efecto esterilizando 2 horas a 90 C o 4 horas a 45 C.

En la microbiologa industrial, cuando se habla de esterilizacin, no se considera la esterilidad absoluta, como en el laboratorio, sino que se trata de esterilidad comercia. En muchos productos podemos encontrar microorganismos, pero dado que no tienen efecto sanitario, no resulta rentable eliminarlos.

El calor destruye vitaminas y desnaturaliza protenas, de aqu la importancia del concepto CT. A partir de este concepto surgi la idea de UHT. Se alcanza la misma eficiencia de inactivacin de microorganismos, pero el efecto que tiene sobre las protenas y vitaminas es mucho menor.

Autoclave 120 C 10 15 UHT 140 C Segundos

Como ya hemos dicho, el propio biorreactor se esteriliza mediante vapor de agua, pero los medios no se pueden esterilizar as, porque el vapor de agua condensara, de manera que aumentara el volumen. Adems, resultara muy caro calentar tal volumen de agua, y el tiempo aumentara, porque se tendra que esperar a que se enfriase. Existen diferentes mtodos para esterilizar el medio, aparte de la filtracin. Uno de ellos es el que se conoce como esterilizacin en continuo. Consiste en ir cargando el biorreactor poco a poco con el medio, que se esteriliza por UHT. El medio va pasando por planchas de acero a 140 C. El tiempo que pase por la plancha ser similar al de UHT. El problema es que el medio que salga de aqu estar demasiado caliente, por lo que tendr que enfriarlo, ya que lo quiero a unos 30 C. La solucin es un sistema que hace que pase cerca del medio fresco, an no esterilizado, de manera que antes de la esterilizacin a 140, el medio ya est caliente. Si funciona bien se recupera el 80 90 % de la energa.

Otro problema al que nos enfrentamos es el aire, que es necesario esterilizar, que se suele hacer mediante filtracin. Podemos distinguir entre los filtros de adsorcin, filtros en profundidad. En este caso, todo el volumen del filtro tiene capacidad de filtrado. Est diseado en forma de ovillo o bobina, de manera que tarde o temprano, cualquier partcula en suspensin choque y quede retenida. Los filtros por retencin tienen el tamao de poro ms pequeo, puesto que las partculas quedarn retenidas.

Instrumentacin y control (y Aspectos econmicos)

Desde el punto de vista industrial, la productividad es la produccin por tiempo de fermentacin. El tiempo de fermentacin es el tiempo total, desde el proceso de prefermentacin, hasta el de postfermentacin. Por esto la fermentacin en continuo puede resultar ms rentable, debido a la reduccin del tiempo total.

Pero la productividad no es el nico parmetro a tener en cuenta para medir el rendimiento, la rentabilidad del proceso, tambin es necesario considerar los coeficientes de rendimiento. Se puede considerar el coeficiente de rendimiento como la cantidad de biomasa producida a partir de un nutriente expresado cuantitativamente.

Clulas producidas (Masa) Y = S. Consumido (masa o concentraciones)

Podemos expresar Y en base a un elevado nmero de parmetros diferentes:

- en base a parmetros fsicos y qumicos como consumo de oxgeno, produccin de temperatura,... en tal caso tendr inters desde el punto de vista tcnico.

- en base a nutrientes: Y en relacin con el metabolismo, de manera que nos informar de si se da metabolismo, catabolismo,...

- en relacin al ATP: nos dar una idea del estado energtico del organismo.

25


Para que la productividad y el rendimiento sean mximos, ser necesario que todos los parmetros del fermentador sean ptimos y se mantengan constantes. El control de los parmetros es crucial. Existen una serie de problemas tpicos:

- Problema del calor: El proceso funciona a una temperatura ptima, especfica de cada proceso, si bien normalmente todos estn entre los 20 y los 45 C, rango mesfilo, o a mas de 45 C, rango termfilo. La temperatura ha de ser determinada para que de mximo crecimiento y mxima produccin. Tenemos fuentes de calor ajenas a la fermentacin, como pueden ser motores,... y fuentes internas, como pueden ser los microorganismos oxidando materia orgnica. Es necesario regular el balance para que todo funcione de manera adecuada.

- Problema de la agitacin y de la mezcla: Una fermentacin microbiana puede ser considerada un sistema de 3 fases:

o Lquida: contiene el agua y las sales disueltas, as como los sustratos y los metabolitos. En algunos casos puede existir una segunda fase lquida, si existen sustancias inmiscibles en agua.

o Slida: Consiste en clulas individuales, micelio, sustrato no disuelto o productos del metabolismo que precipiten.

o Gaseosa: Contiene una reserva de oxgeno para la bacteria, siempre y cuando sea aerobio, claro. Tambin hay dixido de carbono y otros gases que se hayan podido formar.

La fermentacin implica reacciones entre las 3 fases. El funcionamiento ptimo de la misma requerir una buena homogenizacin de las 3 fases. La agitacin asegura el transporte de nutrientes dentro del fermentador. La agitacin produce los siguientes efectos en las 3 fases:

o Dispersin del aire en la solucin de nutrientes. o Homogenizacin de la temperatura y de otros factores en el fermentador. o Suspensin de los microorganismos y los nutrientes no disueltos o Dispersin de los lquidos inmiscibles.

Agitar implica transferencia de energa, por lo que requerir a su vez un coste. Es necesario optimizar la agitacin, para lo que se han de tener una serie de parmetros en cuenta.

o N de Reynolds: Se trata de un nmero adimensional, que permite medir si el flujo es laminar o turbulento.

FVD F: Es caracterstico del fluido D: Dimensiones donde est contenido el fluido Re = V: Velocidad del fluido : Viscosidad del fluido Si Re < 2000 Flujo laminar

Si 2000 < Re < 3000 Flujo laminar inestable Si Re > 3000 Flujo turbulento

Una buena homogenizacin viene indicada por Re. Para alcanzar el nmero de Reynolds deseado los parmetros que se han de ajustar principalmente son la velocidad de agitacin y las dimensiones. En un sistema industrial se tienen que optimizar tambin:

Tiempo de mezcla: tiempo necesario para homogenizar el fermentador hasta el grado deseado, hasta el Re deseado. Ha de ser mnimo.

N de potencia, Np: es la energa necesaria para alcanzar el Re. Ha de ser mnimo.

Hemos de usar palas de manera que el nmero de Reynolds sea elevado, pero con tiempo de mezcla bajo y nmero de potencia reducido.

26


La viscosidad puede ser tambin un problema. Una solucin puede ser de dos tipos, en funcin de su comportamiento.

o Fluido newtoniano: Se trata de un fluido, la viscosidad del cual es constante e independiente de la velocidad de cizaa, a temperatura y presin constante. Todos los gases y algunos lquidos lo son.

o Fluido pseudo plstico: Se trata de fluidos en los cuales la viscosidad aparente es baja, pero despus pasa a ser lineal. Es el comportamiento caracterstico de mucho cultivos de floriduras y de actinomicetes.

o Fluido neopctico: Se trata de fluidos que al ser sometidos a tensin de cizaa constante, presentan una viscosidad aparente que baja con el tiempo.

- Problema de la aireacin: uno de los problemas que se presentan en una fermentacin industrial es el suministro de un flujo de gases adecuado. El oxgeno es el sustrato gaseoso ms importante, y el dixido de carbono el producto metablico gaseoso ms importante. Cuando una fermentacin requiere oxgeno como sustrato, normalmente este es uno de los factores ms limitantes del proceso, debido a la baja solubilidad de este gas. Tan solo 9 ppm se disuelven en un litro de agua pura a 20 C, pero la presin de solutos reduce este ndice. Existen numerosas barreras que dificultan la llegada del oxgeno del aire hasta el interior del microorganismo. Aunque insertamos mucho aire, las barreras existentes entre la fase lquida y la gaseosa, as como la membrana del organismo despus hacen difcil la llegada del gas. Es necesario que el flujo de aire insertado sea muy elevado, para que as el gas no sea limitante del crecimiento del organismo.

Recuperacin de productos

Una vez realizada la fermentacin, hemos de recuperar el producto que hemos generado. Las tcnicas para recuperar el producto son similares a las usadas en la industria qumica convencional, pero con la salvedad de que nuestro producto es biolgico, por lo que no podremos usar ninguna tcnica que pueda inactivar el producto. Tambin hemos de tener presente la localizacin de nuestro producto, de manera que si queremos la clula o un producto sintetizado por ella las tcnicas variarn, igual que variarn si el producto es intracelular o extracelular.

Otro aspecto que se ha de tener en cuenta y no olvidar nunca es que estamos en la industria, lo que implica que buscamos rentabilidad, de manera que no podremos usar algunas tcnicas. En general, la recuperacin puede suponer el 20% del coste del producto, pero en productos con un alto valor aadido puede llegar al 95% del total.

La seleccin de las tcnicas a emplear depende de:

1. Naturaleza del producto

a. Localizacin del producto: Variar si es intra- o extracelular.

b. Caractersticas fsicas y qumicas del producto: si tiene carga, PM,...

c. Caractersticas biolgicas: se altera con facilidad?

2. Concentracin en la que se encuentra

3. Presencia de productos laterales

4. Destino del producto: el grado de purificacin ser diferente si se trata de un producto medioambiental, alimentario o sanit

libro de microbiologia industrial

Documents