S

II r' i L

r L

r j u

Fernando Reynoso Pohlenz

TELEFONO PARTICULAR: 5-63-55-71

MATRICULA:. 79334051

CLAVE: 3-3.3.53 0

/CARRERA: I n g e n i e r í a B i o q u h i c a I n d u s t r i a l

TRIMESTRE:

HORAS S&U.NA:

86-1

20

LUGAR DONDE SE LLEVARA Labora to r i o de F i t o q u k c a (S-153),

IZTAPALAPA

27 de octubre 1986

A CABO: U.IV3RSID-0 AUTOhTMA ME(CROPOL1TANA-

FECHA DE IN IC IO :

fECHA DE TEBMINACION: 31 de A b r i l 1987

/ lpoldBRE DEL TUTOR INTERNO: Dr. Aiejanaro Hernándee R. P r o f e s o r

T i t u l a r de l a d i v i s i ó n de CBS

/ TITULO: A d l i s i s . d e l a a c t i v i d a d d e l material

enzimático e x t r a i d o - d e l fruto del Cuaguay o t e

I. Titulo. Anfiisis de l a act ividad de l mater ia l enzimático

obtenido d e l f r u t o de l Cuaguayote.

2. J u s t i f i c a c i ó n y naturaleza d e l Proyecto. En 1942 Castañeda y sus colaboradores reportaron la pre-

senc ia de una enzima p r o t e o i í t i c a de los frutos d e l P i leus

ifiexicanus (i), que r e s u l t ó s e r mas activa que i a papaina,

su obtenci6n s e d i f i c u l t a porme e l latex no f luye como en

e l caso de l a papaya p o r la presencia de polisac&ridos que

provocan su coagulación; s i n embargo, l a enzima s e encuen-

tra d i s t r i b u i d a en los t e j i d o s d e l f r u t o verde, incluyendo

l o s semillas. Nos oroponemos separar la enzima de l mater ia l

seco a f i n de u t i l i z a r su acc ión p r o t e o i í t i c a para posterior-

mente medir lz actividad enzimática.

Es te Proyecto es basicamente de n a t u r d e z a aplicada.

3.. introducción

L a ptipaína es s i n duda una de ES enzimas p r o t e o i í t i c a s

d s u t i l i z e d z s en l a industr ia , su consumo se ha incrementado

en :léxico y con e s t o su importacibn, de 18,790 Kg. en 1C68 a

C5,CCO Kg. en 1983; desgraciadamente en nuestro país , a pesar

üe producirse le pmaya perfectamente en d i ferentes regiones,

sólo e x i s t e n dos f a h r i c e s de p a p a i m , "Xixin, S.A" y "Travenol,

S..;?' que sólo producen 5 toneladas anuales.

Probablemente l a escasa producción s e deba a que e l f r u t o

reyaio pierde su v a l o r comercial , o b ien, al hecho de que por

c n d a hectarea sólo puede c u l t i v a r s e 9CO árboles , aue cada

á r b o l sólo produce 6CC g de l a t e x y que cada hectzrea sólo produce 54 Kg de l a t e x .

-- ''-- I

4.1 Antecedentes.

A partir de 1942 en que fué reportada l a presenc ia de la

Mexicaina en el f r u t o de Cuaguayote,.-se publicaron d i f e r e n t e s

t r a b a j o s en los que s e demostraba l a actividad de e s t a enzima,

su r e l a c i ó n con l e presenc ia de ácido ascbrbico , su poder de

ooaerse c r i s t a l i z a r , e t c . Pero todo e s t o ~610 s e ha real izado

con el l a t e x d e l c u a l s610 puede obtenerse G.35 sobre peso f res -

co & e l f r u t o , hace noco tiempo en nuestro l a b o r a t o r i o s e v i 6 l a p o s i b i l i d a d de separar un m a t e r i d enzimático al hácer l a

e x t r a c c i ó n de l a grasa de la cascarilla d e l Cuaguayote.

5- Objetivos.

Ans i izar l a actividad enzimática d e l m a t e r i a l obtenido

e. p á r t i r d e l f r u t o d e l Cuaguayote por d i f e r e n t e s métodos.

6, PY0gt-m~. y metodología e e l Trzbajo.

A par t i r de los f r u t o s de Cusguayote (también denominados

bonetes) s e desarro l larán dos métodos; uno que p e m i t a separ&r

&el f m t o seco y liolido d e l m a t e r i a l enzimático de l o s productos

c e l u l ó s i c o s y en generzl de s u s t a n c i a ineo lubles , y en o t r o , en

m e s e t r r t e de a i e o l v e r Is enzima y los pol i sacar idos ciel f r u t o

f r e s c o pstra hacer seperaciones pos ter iores .

L o s d e t a l l e s de ambos métodos ser& o b j e t o de una patente que

s e cionad a l a Universidad -or lo aue no podrán s e r publicados

hazt:. obtener e l nÚiiero de r e g i s t r o .

Una ve% obtenidas las enzimzs p o r l o s d i f e r e n t e s métodns, s e

procederá a medirles l a actividad. Los métodos u t i l i z a d o s para

medirla serán e l de B a i l s ( 2 ) y el de Kunitz (3) , y s e proseders

2 compkrarlas con l a s d e l l:?-tex seco de Cuaguayote, y urn muestre

de püpdns y o t r a de t r i p s i n a .

1 ,

ci

.- E Ii

. , yl

ANALISIS DE LA ACTIVIDAD DEL MATERIAL . ENZIMATICO OBTENIDB DEL FRUTO DEL CUAGUAYUTE

INTRODUCCION*

ES a veces d i f f c i l de creer que l a enzimologfa es un - tema de 'reciente crecimiento; los iniciadores de esta cien- cia se remontan a principios del s ig lo diecinueve, pero su gran desarrollo two lugar en los últimoe cuarenta años. A

pesar de que los fendmenos de fermentación y digestidn se - conocen desde hace mucho, e l reconocimiento más claro de -

(1 1 una enzima fué realizado primeramente por Payen y Bersoz en 1833, cuando encontraron que un precipitado alcohólico -

. de extracto de malta conteasSla_ung-sustancia termoldbil, l a cual convertía e l almidón ea adcar. Esta sustancia, l lama - da por e l los 'diastasa' , de didstasis (separación) , por su poder de separar dextrina soluble de los granos insolubles de almidbn. E l nombre aiastasa posteriormente fue usado co - mo término general de enzimas. Ducaux propuso en 1898 el - uso de l a ;terminacidn 'asa:, con ei nombre del sustrato pa- ra denaminax l a enzima. Esto etsó una base para l a ncnnencia - tura de las enzimas, l a cual está todavía en - uso; algunos nombres terminan con 'ina' y estos fuerbn da-- dos a enzimas digestivas, y de l a misma manera siguen sien- do utilizados. Cospo e l número de enzimas conocidas ha au-- mentado, ha si& necesario indicar el nombre no sdlo por l a naturaleza de l a sustancia sobre Is que actúa, sino también por l a naturaleza de l a reac«tbn.

Durante los inicios del descubrleiiento de l a s enaimas, muchos investigadores habSan visto un paralelismo entre l a acción de estas sustancias y l a fermentact6n por levaliuras. E l nanbre 'fermento' fue consecuentemente ussdo para las en - zimas. Durante l a segunda mitad del s ig lo diecimeve, -

I

c

6 " .

r-

F

i

L

e-

L

i c

c c c P

L .

I

2

existió mucha controversia acerca de las abservaciones de Liebig, quien sostenía que la fermentación y procesos simg lares se llevan a cabo por sustancias químicas, y las de - Pasteur, quien sostenía que la fermentación no se podía - llevar a cabo fuera de las células vivas. Los oombres - 'fermentos no organizados' y 'fermentos organizados', fueron usados para denotar lo que ahora es llamado enzimas ex traídas y microorganismos respectivamente. Para evitar es tos nombres insatisfactorios, W. Kuhne (2)introdujo el "0% bre de enzima en 1878. .

La controversia entre Pasteur y Liebig terminó, cuan- . . do Buchner pudo obtener una fermentación de levadura en un extracto libre de células, pero el nombre 'fermento' para las enzimas ha persistido en Alemania'haata hace apenas p-

! cos años. ~

í Hasta finales del siglo dpecinueve, se increm-tó el

conocimiento de la estructura &$mica de las sustancias de inrerés biológico, 'haciendo posible el estudio de.1 rango - de acción o especificidad de las enzimas, Esto fué gra---

que tuvp la idea de especificidad cias a Fail Fischer enzimática y la cerrada relac& estdrica entre enzima y - sustrato. En base .a sus observdciones con austratos de eg tructuni conocida. Fischer .de&rso,llÓ mu famosa analogfa . '

'cerradura y llave', con l a in~~accián'.enzima-.su.strato.

( 3 )

UM consecuencLa 'de la c rrada conexión entre enzi-- 7 mas y sustratos, .es que cada enzima actúa sobre un r@.ngo l& mitado de sustratos; esto impiica la existencia de una gran cantidad de enzimas diferentes. Estudios adecuados de la :especificidad ~enzimática so& .dependientes de la separa-- ciÓn de las enzimas.

- . I

. c II

.

3

La verdadera purificación en enzimas no se llevó a cabo hasta 1920. La mayoría de las primeras purificaciones se - llevaron a cabo por ~iiistatter(4)~ sus colaboradores entre

1922 y 1928. Pocas purificaciones fueron hechas por otros - investigadores durante este período. El siguiente paso im-- portante de desarrollo fue su preparación en forma cristali- na. La primera enzima cristalizada fue la ureasa (Cumner en 1926) a pesar que los primeros cristales estuvieron lejos de estar en forma pura, Este trabajo fue seguido por la cl& sica separación sus colaboradores. enzimas purificadas era muy bajo, pero ahora el nhero de enzimas obtenidas puras y cristalizadas sobrepasa las sei8 cientas.

( 5 )

de enzimas proteolíticas por Northrop ( 6 ) y

Hace apenas tres .. decadas, el número de- -

/-

El principal-interés durante los primeros días de la ob tención cristalina fue centrado en las enzimas de digestión y fermentación; fue hasta después que la importancia de las enzimas in4racelulares fue reconocida. Hasta 1937, la puri-

nzimas intraceiulares tuvo lugar. El gran in-- f cremento en el conocimiento de las enzimas de material vivo ha dado una mayor explicación del mecanismo de muchos proce- sos vitales fundamentales, especialmente metabólicos.

_ _

La cinética enzhatica que ha tenido un gran desarrollo !

I desde el trabajo clásico de Be- y Michaelis a principios de siglo. ha alcanzado un estado avanzado y está activamente l mejorando, con objeto de encontrar la naturaleza de catá- lisis enzimátiea. El mecanismo enzimático de catálisis es I

también estudiado por métodos más directos, incluyendo espe- cialmente el uso de isótopos.

- I

4

Existen se i s grandes clases de reacciones en l a s cuales

las enzimas catalisan. Estas unidades forman l a base del - eistema de l a Comisión de Enzimas (Enzyme Comission, E.C) - para c l a s i f i c a r y asignar con nQmros a todas l a s enzimas.

A pesar de esto l a nomenclatura común de l a s enzimas usada - en e l pasado se sigue utilizando en vez de l o s nanbres ofi-- c i a l e s , el sistema E.C da una tabulación y orghnización con-

venientes a l a s funciones variadas de l a s enzimas.

1.

2 .

3.

CLASIFICACION INTERNACIONAL DE ENZIMAS

Oxidoreductasas

(Reacciones de oxidacidn reducci6n) 1.1 Actuán sobre -CH-OH

1 . 2 Actudn sobre -C=O

1 .3 Actuán sobre -CH=CH-

1 .4 Actúan sobre -CH-NH?

1 . 5 Actfan sobre -6H-NH-

1 . 6 Actffan sobre NADH; NADPH

I

I

I

Transfer asas

(Transferencia de grupos funcionales) 2 .1 Grupos de un carbono 2 .2 Grupos aldehfdicos o cet6nicos

2 .3 Grupos a c i l o

2.4 Grupos glucosilo

2 . 5 Grupos fosfato 2 . 6 Grupos que contienen azufre

Hidrolasas

(Reacciones de h idró l i s i s ) 3 . 1 Esteres 3 . 2 Enlases Glucósidos 3.3 Enlaces peptidicos 3.4 Otros enlaces C-N 3.5 Anhldridos de ácido.

4 .

5.

6.

5

Liasas

( Adicidn a dobles enlaces) I 1

4.1 -C=C- 4.2 -C=O 4 .3 -C=N-

I

I

Isonierasas

(Reacciones de isomerizacibn)

5 .1 Racemasas

Ligasas

(Formacibn de enlaces con ruptura de ATP)

6 .1 C-O 6 . 2 C-S 6.3 C-N 6.4 C-C

Fijando nuestra atencidn sobre l a s hidbcolasas y en espe - cia1 en l as proteinasas, grupo 3 . 4 , l a s enzñmas proteol ft i - -

cas o proteinasas son hidrolasas que acttiam sobre proteínas

o péptldos, y puede haberlas de cuatro tipos:

1) Las que poseen un residuo del aminoáci& serina en su - centro activo.

Las que tienen un residuo activo de ckte ína .

de un i6n metálico. Las proteinasas que acttian en un medio muy ácido.

2) 3 ) Aquellas cuya funcidn cata l f t ica depenck de l a presencia

4 )

Los datos experimentales reunidos hasta e l momento ac-- tual , gracias a l a labor de muchos investiapdores, permiten

suponer que l a s enzimas pertenecientes a l pimero y segundo grupo operan por mecanismos similares en t a t o que e l terce- ro y cuarto lo hacen de modo dist into.

.. ...- 4-h _I , , 1 1 V , m -i

$I - graciadamente en nuestro país, a pesar de producirse la papa

6

Al primer grupo corresponden proteinasas de origen ani-

encontramos la mayoría de mal y microbiano, como la tripsina, quimotripsina, trombina y subtilopeptidasa; en el segundo, las proteinasas de procedencia vegetal, por ejemplo la papa2 na, la ficina, la bromelina, la mexicaína, etc. Las enzimas de los dos primeros grupos hidrolisan enlaces en el interior de las cadenas peptídicas, por lo cual son llamadas endopep- tidasas. A diferencia de estas, las del tercer grupo o exo- peptidasas, Únicamente pueden actyar sobre el enlace extremo de la cadena, bien sea carboxílico (carboxipeptidasas) o el amínico (aminopeptidasas). Finalmente, como ejemplo del - cuarto grupo, podemos citar la pepsina del jugo gástrico de los mamíferos.

Ahora centraremos nuestra atención en las proteinasas del segundo grupo, en donde la mayoría son de origen vegetal, entre ellas como ya vimos se encuentra la papaina, que sin duda es una de las enzimas proteolíticas más utilizada en la Indusfria, en México se incrementó su consumo y con esto su importación, de 18,790 Kg. en 1968 a 36,300 Kg. en 1978; des

-

ya perfectamente en diferentes regiones, sÓ1o:existen dos fa bricas de papaína, "Mixin, S.A." y "Travenol, S.A.", que sólo producen 5 toneladas anuales. f

. ,

Probablemente la escasa producción'se deba a que el frg to rayado pierde su valor comercial, o bien, al hecho de que por cada hectárea sólo puede cultivarse 900 ákboles, que cada árbol sólo produce 600 g. de latex y una hectarea sólo pro- duce 54 Kg. de papaína.

En 1942 Castaiieda y sus colaboradores reportaron la prs , ( 7 ) sencia'de una enzima en los frutos de Pileus mexicanus

observando que era más activa que la papaína, y le dieron el nombre de Mexicaína.

I

7

La Mexicaina está como ya vimos dentro del mismo grupo

de l a papalna, o sea, es una endopeptidasa con un residuo ac - t ivo de cisteína, y participa en varias propiedades de l a pa - paina, entre e l l a s , la de poseer un grupo t io l por molécula.

Esta enzima se encuentra en el latex de l cuaguayote - [ P i t h ¿ t t ~ & a b ] , este es un árbol grande de t i e r r a caliente,

de 5 a 1 2 m. de a ltura y de un t a l l o muy grueso en l a base - que produce un fruto semejante a l a papaya. Su tronco es e6 - nice y ramificado, cubierto de una epidermis g r i s y provisto.

de una médula muy gruesa; su madera es poco consistente.

Las hojas alternas, son pecioladas, digitadas, compues-

tas de s iete f o l í o l o s acuminados, e l central es mayor que - los otros, midiendo unos diez centímetros de largo por se is

de ancho. Las f lores masculinas están en racimos compuestos,

ax i lares y terminales; su cá l i z e s pequeño, pubescente y con

cinco divisiones; l a corola mide unos 2 2 milímetros de largo y es de color amarillo pálido y presenta cinco divisiones.

Las f l o r e s femeninas están en diferentes árboles, pues

l a planta es dioica. Son terminales y más grandes l as mascu - l inas , provistas de cinco pétalos verdosos. Florece en ene-

ro.

E l fruto madura en primavera antes de que se renueven - l a s hojas; es una baya de 15 a 20 centímetros de largo por - diez o doce de ancho; oblonga o conical con cinco cos t i l l a s que llevan en l a base otros tantos apéndices, por cuya pa r t i - cularidad se l e ha dado e l nombre de bonete.

Unos frutos poseen c o s t i l l a s rectas y otras poseen cos-

t i l l a s curvas. Su color es verde con manchas ro j izas . La - puipaes pastosa y comestible, aunque menos agradable que l a de l a papaya, y cuando está verde produce latex. Se u t i l i z a para hacer dulces y conservas . (8)

8

Entre otras cualidades favorables de l a Mexicafna, se - ha v isto que esta es más estable a l a oxidación que l a papaf - na; puede considerarse que aunque semejantes no son idénti-- cas.

Diferentes métodos han sido propuestos para l a obten--- cion de estas enzimas proteolfticas de origen vegetal. Para

l a papafna se tienen l o s métodos de Ba l l s y Lineweaver , y e l de Kimnel y Smith (lo)'(ll) fundamentalmente. La papafna - por cualquiera de los métodos es muy sensible a l a oxidacidn y poco después de a is larse pierde su actividad. Para acti--

var la requiere l a presencia de un agente reductor y de una o más sustancias capaces de eliminar l a s impurezas de metales

ya que son fuertes inhibidores.

( 9 )

A causa de que l a papafna e s muy sensible a l a oxida---

ción, ésta debe ser ut i l i zada rápidamente en l a industria.

La actividad m6s a l t a obtenida ha sido lograda con cis -

tefna y versenato, como agentes reductores.

1 0

MATERIAL Y METODOS,

La materia prima ut i l izada en este estudio fue e l f ruto de cuaguayote (PXeu¿ mexicanus), que se u t i l i zó de dos maneras,

una como mater ia l f rescoy otra donde se sec6 antes de l a ex-

traccibn.

Para rea l izar l a s pruebas se u t i l i z ó un cuarto de en--- friamiento que se mantuvo de -5 a -10 grados centígrados, - con e l f i n de que l a enzima no se desnaturalizara en algunas

etapas de l a extraccidn.

Para rea l i za r l a s pruebas de actividad fue necesario un baño María para mantener l a prueba a l a temperatura requeri-

da. También se requir ió un espectrofotdmetro de l u z ultra--

v io leta.

A part i r de l o s frutos de cuaguayote (también denomina-

do como bonete) se desarrollaron dos métodos; uno que permi- te separar del f ruto seco y molido del material enzimdtico de

l o s productos ceiui6sicos y en general de sustancias insolu-

b l es , y otro, enque se trató de disolver l a enzima y los po- l isacáridos del fruto fresco para hacer separaciones poste--

r iores .

1) METODO CON MATERIAL SECO.

1 0 Kg. de cuaguayote verde se desmenuzaron con un apara - to Salad Master, procurando que e l tamaño de los trocitos ob - tenidos no fuera mayor de 2 cm.

E l material se secó en un horno de a i re caliente a una

temperatura no mayor de 30 grados centfgrados, y posterior-- mente se molió en un molino de discos, obteniéndose 1 7 . 8 % de material seco e l cual se u t i l i z ó como punto de partida para hacer l a s diferentes pruebas de separacidn de l a enzima.

' I

11

2 ) METODO CON MATERIAL FRESCO

El fruto de bonete o cuaguayote fue desmenuzado como en el caso anterior y posteriormente se hornogenizó en presencia de una solución 0 . 3 % de cloruro de sodio en un mezclador Wa- ring Blendor. El homogenizado se pasó a través de un filtro prensa de laboratorio "Calver" obteniéndose un líquido viscg so que se usó para hacer las diferentes pruebas de separa-- ciÓn de la enzima.

--

I

1 2

PARTE EXPERIMENTAL

Una vez obtenidas l a s enzimas po r los d i f e r e n t e s méto-- dos mencionados se procedi6 a med i r l es l a ac t i v i dad . Los m é todos u t i l i z a d o s para medir la , fueron e l de B a l l s y e l de Ku n i t z , comparándolas con l a s del l á t e x seco de cuaguayote, - con una muestra d e papalna y una muestra de t r i p s i n a .

- -

El método de B a l l s consiste en tomar 20 gramos de polvo de l e che entera , l a cua l se prepara en forma d e pasta con un regulador a pH de 4 . 6 de ace ta to (preparado con 2 vo- lúmenes d e CH3COOH l M y un voldmen de NaOH l M). Diez m i l i l i t ros de este regulador es d i l u i d o a 85 ml. y añadido a l - polvo d e l e che para da r un volúmen f i n a l de 1 0 0 m l . La le-- che r e cons t i tu ida es f i l t r a d a a t r a v é s de una manta d e c ie lo para poder ser usada.

-

Var i a s muestras d e un mi l i l i t ro con d i f e r e n t e s concen-- t r ac i ones d e enzima fueron probadas incubando en tubos d e en saye d e 1 5 mm. de diámetro a 35 grados cent í g rados con 1 0 ml. d e l e c h e preparada. Cuando los tubos muestran una coagula-- c i 6n inc ip i en t e , l a reacc ión se considera completa.

-

La o t r a t é cn i c a o método de Kunitz (13) c o n s i s t e en de-- j a r actuar una cant idad apropiada de enzima (por.e jemplo 25

o 50 microgramos/ml d e concentración f i n a l ) sobre un sustra- t o de caseína, 2 m l . a l 1% de concentración d i s u e l t a en regu l ado r de f o s f a t o s a pH 7.6 y previamente desnatural izada por e l c a l o r (30 minutos en baño de agua a e b u l l i c i ó n ) . E l t i e m PO de acc ión sobre e l sus t ra to fué de 1 0 minutos a una tempe ra tura de 35 grados cent ígrados , suspendiéndose l a h id ró l i - - s is por l a ad ic ión de 3 m l . de ác ido t r i c l o r o a c é t i c o a l 5%. Con l a ad i c i ón d e l ác ido p rec ip i t an l a s pro te ínas y quedan - en l a solución los productos de l a h i d r ó l i s i s ; aminoácidos - l i b r e s y algunos pépt idos pequeños.

-

- -

13

Después de reposar una hora, l o s tubos fueron c e n t r i f u - gados a 2 O00 RPM durante 30 minutos; separando e l sobrena-- dante por medio de una pipeta. Posteriormente s e leyó l a ab - sorvancia d e cada una de l a s soluciones a 280 nanómetros en un espectrofotbmetro. Esta longitud de onda es en l a que - los aminoácidos aromáticos t ienen un mdximo de absorción. Paralelamente a l a prueba s e prepararon t e s t i g o s a l o s que - se agregaron en e l mismo orden, 2 m l . de casefna, 3 m l . de - ácido t r i c l o r o a c é t i c o y finalmente l a enzima o e x t r a c t o enzi - mático. La actividad p r o t e o l f t i c a e s proporcional a l incre- mento de densidad ópt ica en l a s soluciones con re ferenc ia a l t e s t i g o .

Con o b j e t o de r e f e r i r resultados de l a actividad en am-

bos métodos, en re lac i6n a l contenido de nitrógeno de l a s d i - ferentes enzimas, se l l evó a cabo l a determination de e s t e - elemento por e l método de Kjeldahl nuación :

Se pesaron . 5 g. de polvo del papel l i b r e de nitrógeno (papel de y se colocb en e l fondo del matraz g . de su l fa to cúprico, 2 1/2 g. de

que se descr ibe a cont i - -

producto a ana l izar sobre arroz) previamente tarado Kjeldahl , se gregaron 0 .1

su l fa to de sodio anhidro, 20 m l . de ácido su l fúr ico concentrado y 3 gránulos de Hengar. Se colocb e l matraz en e l digestor Labconco N 38000 y se ca- l ento hasta que l a mezcla pas6 a formar un lfquido verde c l a - ro. Terminado l a digest ión, e l matraz se dejo e n f r i a r y s e añadieron 200 m l . de agua, granal las de z i n c , 5 m l . de sulfu - ro de sodio a l 10% y 5 m l . de hidróxido de sodio a l 4 0 % por cada m l . de ácido su l fúr ico empleado en l a digest ión. Este último debe agregarse lentamente procurando que l a solución de sosa quede e s t r a t i f i c a d a , en seguida se conectó e l matraz a l a alargadera del sistema de condensación del aparato y se empezó a ca lentar recibiendo e l condensado en un matraz E r l e - nmeyer que contenía 75 m l . de ácido b6r ico a l 4 % con unas go - t a s de r o j o de meti lo como indicador, que con l a s primeras -

6' I! L"

c c

F-

ir-

r" L.

r'

1. ..

i"' L..

14

gotas no dieron reaccidn alcal ina y entonces se r e t i r ó e l ma - traz recibidor. Se t i tu ld posteriormente en ácido c lorhfdri - co 0 . 1 N usando como indicador una gota de azul de metileno a l 0 . 1 % para observar e l v i r e claramente, e l porcentaje de - nitrdgeno s e determinó con l a siguiente fórmula:

%N= ml de HC1 x N x .O14 x 100

muestra en g'

RESULTADOS,

1 5

%

A continuacidn se presentan l o s resultados, explicando

brevemente los métodos uti l izados, ya que éstos fueron men--

clonados anteriormente.

EXTRACCION. En l a tabla No. 1se presentan los pasos de algunos fru--

tos y l a cantidad de material enzimdtico que resulta de 6s-- tos.

EXTRACCION DE LATEX

g 257 .1 286.5

259.6 286.4

281.1 259.4

347.5 313.3

2290.9 g. totales

7.36 g. látex seco

Rendimiento sobre peso fresco

0.32 %

TABLA No. 1

METODO No. 1

g 374.2 382.9

357.5 289.3

386.2 264.3

226.4 253.7

2534.5 g. totales

1

1

1

452.18 g. f ruto seco

24.41 g. mexicaína seca

Rendimiento sobre peso fresco

0.96 B

METODO No. 2

308. 0 352.1

380.2 263.2

286.8 384.9

260.3 256.3

2491.8 g. totales

22.42 g. mexicaína seca

Rendimiento sobre peso fresco

0;89 %

1 6

La cant idad de enzima presente en un t e j i d o en un pro--

ducto enz imát ico , se mide p o r e l resu l tado que produce cuan- e

do todos los f a c t o r e s que pueden tener alguna i n f l u enc i a so-

b r e e l l a se mantienen constantes, a este resul tado también - se l e l lama a c t i v i dad enz imát ica , y és ta , se ha expresado en unidades a r b i t r a r i a s por l o que existen v a r i a s unidades para

una misma enzima, dependiendo d e l métodos que se haya emplea - do en l a s determinaciones.

Algunos ejemplos de unidades de ac t i v i dad enz imát ica - son l a s s i gu i en t es :

La unidad para l a ereps ina (d ipept idasa ) según Schmidt- L e i t z y Shaf fner (14) es i d én t i c a con K, l a constante monomo-

l e c u l a r para h i d r b l i s i s de l a q l i c i l g l i c i n a por efecto de es - t a enzima.

(15) es l a c a n t i dad de enzima capaz de l i b e r a r d e l a cas lna, grupos carbox i - los equ iva lentes a 1.05 m l . de á c i do 0.2 N en un l apso de 20 minutos, cuando se incuba a 30 grados cent í g rados una prepa- rac idn enz imát ica con case inato de sodio , o b ien , seqún e l - Nat iona l Formulary XIII, una unidad de a c t i v i dad de t r i p s i n a cuando se hace actuar sobre ester e t l l i c o de l a N-benzoil-L- Arg in ina es l a a c t i v i dad que causa un cambio de 0.003 por m i - nuto de abcorvancia ba j o l a s condic iones e spec i f i cadas en e l ensayo.

En l a t r i p s i na , l a unidad de W i l l s t a t t e r -

Para l a ureasa l a unidad es tá dada por l a cant idad de - enzima capaz de l i b e r a r un miliqramo de n i t rdgeno amoniacal cuando actíia sobre l a urea durante 5 minutos a 20OC. y a un pH de 7.0 (16)

La unidad d e ca ta l asa se expresa como constante d e l a

reacc ión mononuclear extrapo lada a tiempo cero en l a descom- pos i c i ón d e l peróx ido de hidrógeno ba j o condic iones normales.

Todo esto ind ica que es d i f í c i l establecer unidades com - pa ra t i v a s en l a s d i f e r e n t e s enzimas y que para hace r l o en - l a s enzimas per tenenc ientes a un mismo grupo es necesar io re - f e r i r l a s siempre a un mismo método. Así por ejemplo, e n ca- so d e l a s proteasas , cuando se u t i l i z a e l método de Kunitz para medir su ac t i v i dad , l a unidad se encuentra dada por e l coeficiente angular de l a tangente trazada a l a curva que - pa r t e d e l origen, como puede verse en l a g r á f i c a No. 7 , en - e l método d e Anson (17), en donde se hace actuar l a prote ina- sa sobre una so luc ión de hemoglobina desnatural izada y se m i de l a concentración de t i r o s i n a que se l i b e r a , l a unidad es d e f i n i d a como l a cant idad de enzima que da un color equiva-- lente a un m i l i m o l de t i r o s i n a po r minuto, en e l método de - B a l l s (I2) en donde se mide e l tiempo de coagulación de l a - l e che , debe a p l i c a r s e l a fórmula s i gu i en t e :

(U l

-

(Fórmula 1) E = K/t

En donde E es l a cant idad de preparación enz imát ica u t i - l i z a d a , y l a unidad es tará dada por l a cant idad de enzima - que coagula l a l e che en un minuto .

Algunas proteasas t a l e s como l a t r i p s i na y quimotr ips i - na que poseen además una a c t i v i dad d e estearasas, s e hacen - reacc ionar sobre sustratos d e t i p o ester sintéticos, t a l e s - como e l ester e t í l i c o de Benzoi l -L-Arginina( BAEE) , e l e s t e r metíl ico d e l a p-toiuensuifonii-L-Arginina (TAME), y e l es-- ter e t f l i c o de l a N-Bensoil-L-Tirosina (BTEE) etc; los cua-- l es pueden ser d e s c r i t o s por l a fórmula genera l R-CO-X, don- d e l a e spe c i f i c i dad d e l a enzima t e ác ida ( R-CO4 y l a natura leza

e s t á determinada por l a par - de X que puede ser -

I”’

I._

18

P

L

F-

e

c- c ’ ’

c

c c c

p e p t f d i c a , a m f d i c a o ester ica , l a a c t i v i d a d se mide por méto - d o s p o t e n c i o m é t r i c o s o e s p e c t r o f o t o m é t r i c o s y l a unidad está dada por l a c a n t i d a d de enzima que produce l a h i d r d l i s i s d e

un micromol d e sustrato por minuto.

x

E x p r e s a r en a l g u n a d e estas u n i d a d e s l a a c t i v i d a d d e - las p r e p a r a c i o n e s enzimáticas o b t e n i d a s en este t raba jo re-- su l tar fa muy a v e n t u r a d o , por l o c u a l s610 se h a r á n compara--

ciones con l a a c t i v i d a d d e o t ras p r o t e a s a s y su c o n t e n i d o de n i t r d g e n o .

En l a tab la ndmero 2 se dan los r e s u l t a d o s d e los por-

centajes d e n i t r 6 g e n o d e l a s d i f e r e n t e s enzimas así como d e

l a h a r i n a d e b o n e t e o cuaguayote que se u t i l i z a en e l método

numero uno.

TABLA No. 2

MATERIAL % N

1 ) H a r i n a d e b o n e t e 2 . 1 5 6

2 ) L a t e x de b o n e t e 6 . 7 2 0

3 ) M e x i c a í n a e x t r a í d a 5 .012 (Método No. 1 )

4 ) M e x i c a í n a e x t r a í d a (Método No. 2 )

4 . 1 1 6

5) T r i p c i n a cruda 1 0 . 0 8 0

6 ) P a p a í n a cruda 6 .020

\

' 19

Las enzimas p r o t e o l í t i c a s pueden t ene r su o r i g e n tanto en tejidos animales (pepsina, t r i p s i n a , quimotr ipsina) como en t e j i d o s v ege ta l e s , d e e s t a s ú l t imas se pueden mencionar a l a papafna, mexicaína, f i c i n a , bromelina, asc lepa ína, p ingu i - nafna, sayina, euphorbina, etc. Entre todas e l l a s hay dos - grupos, uno que requ ie re grupos CH l i b r e s para su ac t i v i dad y que neces i tan un pH dptimo menor d e 7 para d i g e r i r hemoglo - bina, caseína, albúmina d e huevo, etc, o para coagular l a l e - the con una fuerte a c t i v i d a d y e l otro grupo, con escasos - grupos a c t i v o s SH, con un pH óptimo más a l c a l i n o y un menor ,

poder d e coagulacidn de l a leche .

En genera l todas l a s enzimas p r o t e o l í t i c a s son capaces en mayor o menor grado como l o demostrd

(12) aprovechando e s t a c a r a c t e r í s t i c a - e s t a b l e c i d un método c u a n t i t a t i v o en e l que demuestra que e l

t iempo requer ido para l a coagulacidn es inversamente propor- c i o n a l a l a cant idad d e enzima presente.

La r e l a c i d n entre e l tiempo de coagulacidn y concentra- c i b n enzimatica e s por l o tanto una l í n e a r e c t a , cuando E es e l peso d e l a enzima en mg. y t e l tiempo en minutos E=K/t.

De acuerdo con e s t a ecuación E = K cuando t = 1, y por l o tan to l a ac t i v i dad por mg. 1/E es 1/K, e s t a expres ión es

suficientemente exacta en una determination cuant i t a t i va , p e ro en so luc iones enzimáticas d i l u i d a s e l tiempo de coagula-- c i o n es muhco mayor que l o esperado en algunas enzimas, y e l sistema actGa como s i una pa r t e d e l a enzimas no tomara par- t e en l a reaccidn, evidentemente l a l eche cont iene una sus-- t anc ia capaz d e i n h i b i r pa r t e d e l a enzima y esto provoca - que l a g r á f i c a obtenida en t r e E y i/t no pasa por e l o r i g en , esto no sucede en l a s enzimas que no son inhib idas t a l e s co- mo l a t r i p s i n a , quimotr ipsina y renina, pero s i n con l a s pro teasas v e g e t a l e s como papaína, mexicaína, bromelina, etc.

-

20

La cant idad d e enzima inac t i va durante l a coagulaci6n - puede s e r medida en una preparación pa r t i cu l a r y é s t a es - constante para cada muestra, pues s i se representa por o l a cant idad inhib ida, l a ecuación propuesta será (E-c) t K y c se puede determinar resolviendo l a s ecuaciones simultáneas - para v a r i o s puntos, o b i en determinando l a intersección en - e l eje E cuando l/t es g r a f i c ado cont ra E, y s i l a cant idad de enzima inhib ida (c) es mul t ip l i cada po r l a unidad d e a c t i - v idad (1/K) e l producto (c/K) equ i va l e a l a inhibition por - unidad d e ac t i v idad .

En este t r aba j o a l a p l i c a r e l método d e B a l l s se ha g ra - f i c a d o e l contenido d e n i t rogen0 d e l a s d i f e r e n t e s muestras u t i l i z a d a s cont ra l a inversa del tiempo ya que e l n i t rógeno representa una forma más r e a l d e pro te ína a c t i v a .

A cont inuación se encuentran t a b l a s que corresponden a l a tabulac ión de l a cant idad de enzima en mg. ( E ) cont ra e l tiempo en minutos ( t), a s í como l a cant idad d e n i t rógeno en la enzima en mg., representado por ( E mg N ) conta l/t.

Seguidos por su representac ión g r á f i c a , donde s e incluyen - (R2), que se refiere a l coeficiente de c o r r e l a c i ón d e l a rec - t a , (K) que s e r í a l a pendiente, (c ) e l peso d e enzima i n h i b i - da, (cm que es i gua l a l a i nh i b i c i ón por unidad de a c t i v i -

dad.

Para poder i n t e rp r e t a r l a s g r á f i c a s d e una forma más - c l a r a , é s t a s se han numerado de l a s i gu i en t e manera:

Grá f i ca No. 1 Curva u t i 1 izando t r i p s ina Grá f i ca No. 2 Curva u t i l i z a n d o papaína Grá f i ca No. 3 Curva u t i l i z a n d o l á t e x d e bonete Grá f i ca No. 4 Curva u t i l i z a n d o mexicaína

ex t ra ída (Método 1) Grá f i ca No. 5 Curva u t i l i z a n d o mexicaína

Grá f i ca No. 6 Curva u t i l i z ando v a r i a s enzimas ex t ra ída (Método 2 )

(Comparativa) .

TRIPSINA.

E mg

2.0

4.0

6. O

10. o 12.0

16. O

18.0

20. o

METODO DE BALLS

(N 10.08%

E mgN

0.202

0.403

0.605

1.008

1.210

1.613

1 .814

2.016

t (min. )

5.13

2.62

1.61

1.02

0.84

O. 62

O. 56

O. 50

l/t

0.195

0.381

0.622

O. 979

1.185

1.610

1.770

1.987

21

.

22

METODO DE BALLS

PAPAINA. ( N 6.02%)

2. o 4. O

6. O

8.0

10.0

14.0

16. O

20.0

0.120

0.241

0.361

0.482

0.602

0.843

O. 963

1.204

t (min. )

10.00

6.13

3.89

2.35

1.94

1.44

1.24

1.03

l/t

o. 100 0.163

O. 257

0.425

O. 516

0.693

0 . 8 0 0

0.975

r- e.

0-

Y

c

I

I

23

METODO DE BALLS

LATEX. (N 6.72%)

E mg E mgN t ( m i n . ) 1 /t

2.0 1.134 15.38 0.065

6 .0

8 .0

10.0

1 4 . 0

16.0

18.0.

20.0

0.403

O. 538

0.672

O . 941

1 .075

1.210

1.341+

4.17 0.240

2.90 0..345

2.36 O. 423

1.83 o. 545

1 .49 0.673

1 . 4 2 0.705

1 .21 0.825

I’

P-

SI

il

METODO DE BALLS

24

MEXICAINA EXTRAIDA POR E L METODO 1. (N 5.02%)

E mg E mgN

20.0 1.004

30. O 1.506

40. o 2.008

50.0 2.510

' 60.0 3.012

80. O 4.016

100.0 5.020

t (min) l/t

3.08

1.74

1.12

0.98

0.83

O. 60

0.49

0.325

0.575

0.892

1.024

1.203

1.680

2.047

...

L

F

L.

II

Y-

T

c:

I.

r- &..

c ' !

L,. %

r

I

i

-u 2;

I

B

3

Y..

r L .

METODD DE BALLS

MEXICAINA MTRAIDA POR E L METODO 2.

(N 4.116%)

E mg

4. O

1 0 . 0 .

12 .0

16.0

18. O

20.0

30.0

40.0 ,

E mgN

0.165

0.412

.0.494

O . 659

0.741

0.823

.1 .235

1.646

t ( ínin.)

25.00

5.24

4.55

2.99

2.86

2.38

1.57

1 . 1 2

25

1 / ?

0.040

0.191

0.220

0.335

0.350

0.420

0.635

0.894

F 1 L

F u..

i y-.

i L-

P i' .L

67 E H (E a 3

.

26

METODO DE KUNITZ

Cuando se a p l i c d e l Método d e K u n i t z para l a detennina- c idn d e l a a c t i v i dad enzimática de l a s mismas muestras en - l a s que se a p l i c o e l método d e Ba l l s , se u t i l i z a r o n solucio- nes en l a s que l a concentración Correspondía a 0.01 mg/ml.

E l sus t ra to a l cua l se l e añadieron, estaba cons t i tu ido por 2 m l . de case ína a l 1% de concentracidn f inal d i s u e l t a en un regu lador de f o s f a t o s a pH 7.6 y previamente desnatura l i zada por c a l o r (30 minutos en baño d e agua a ebu l l i c i6n ) . E l t i e m - pa de acc i ón de l a enzima sobre e l sus t ra to fue d e 1 0 minu-- tos, a una temperatura d e 30 grados cent ígrados, suspendién- dose l a h i d r d l i s i s por l a ad ic idn de 3 m l . d e ác ido triclo-- r o a c é t i c o a 5%. Después de reposar una hora, los tubos fue- ron cent r i fugados a 2000 RPM durante 35 minutos; separando - e l sobrenadante por medio d e una p ipe ta . Posteriormente se l e y 6 l a absorvancia de cada una d e l a s soluciones a 280 nand metros en un espectro fo t6metro .

-

A todas l a s muestras se les h i z o e l mismo tratamiento , además de ser ac t i vadas con b i su l f i t o d e sod io a l 0.3% en l a muestra de concentraci6n conocida.

También se h i c i e r o n t e s t i g o s para cada caso, donde se agregaron: 2 m l . d e soluci6n d e caseína a l i%, 3 m l . d e á c i - do t r i c l o r o a c é t i c o y f ina lmente l a enzima o e x t r a c t o enzimá

tito. -

En l a g r á f i c a 7, se puede observar una curva de l a a c t i - v idad estandard para l a h i d r d l i s i s d e caseína por t r i p s i n a .

De acuerdo a Kunitz (13) una unidad ("Ocas) es l a can t i - dad d e enzima, l a cual (20 min. de incubaci6n

dent ro d e determinadas condic iones - para t r i p s i n a , 1 0 nin. d e incubation

27 -«

e- para l a papafna, volúmen f i n a l d e incubación: 2.0 m l . des---

pues d e l a ad i c i ón de 5 m l . de ác ido t r i c l o r o a c é t i c o ) , l i b e - r a s u f i c i e n t e s productos d e l a h i d r ó l i s i s so lub l es en ác ido

II- t r i c l o r o a c é t i c o , de t a l manera que l a densidad ó p t i c a a 280

pl nantimetros aumenta 1 unidad por minuto .

*_

c

P‘

L.

c

c r I

i. ..

i L

r”

u.,.

r- L-

Ejemplo: La a c t i v i dad en TUcas/mg de enzima para t r i p - s ina s e r f a :

De acuerdo a l a f i g u r a 7 (F6rmula 2 )

TUcas /mg. t r i p c i n a = 0 . 2 6 - 7

1.8 x 10 -3 x S O

O sea 1 mg. d e t r i p s i n a c r i s t a l i z a d a tiene 7 TUcas

Donde: 0.26 = E 280/20 min. 1.8 = Mg tripsina/ml.

20 = conversión de E/20 min. a E/min .

La abs isa de a r r i b a d e l a f i g u r a tiene v a l o r e s d e TUcas correspondiente a l a ordenada ( E/20 min . ) . Esta es indepen d i e n t e de l a pureza d e l a preparación enzimática. La a c t i v i dad d e muestras no conocidas pueden ser medidas directamente en TUcas.

- -

Para conocer por e jemplo l a a c t i v i dad d e l a mexicaína - ex t ra ída por e l método 2 (Grá f ica l a , se ve que e l punto en donde se in t e r cep ta 0.06 de densidad óp t i c a , y 0.288 d e MgN/ m l , se encuentra todav ía en una l í n e r e c t a . Por l o tanto .

TUcas /mgN = 0.06 - = 2 0 . 8 3

2.88 x 10 -4 x 10

Es Q

*-, 28

I. METODO DE KUNITZ

i

I” .

L<.

I.

e..

I”

P‘

L.

c c c

TRIPSINA. (N 10.08%)

Concentración Concentración mg/ml micro g N / ml

o. O 0 1

0.002

0.003

o. O04

0.006

O. 008

0.101

o. 202 O. 302

O.gO3

0.605

0.806

Abcorvancia

0.062

0.120

0.172

0.212

0.275

0.317

r- t ” rl.

L..

r- L..

c

D .

. 3 . 3 . t . 3 . a . * e

PAPAINA (N 6.02%)

Concentración mg / m i

o. O02 O. 003

0.004

o. O05 O. 006

0.008

30

METODO DE KUNITZ

Concentración Absorvancia micro g N 1 m i

0.120

O. 1 8 1

0.240

0.301

0.362

0.482

0.060

0.092

1.125

0.142

0.157

0.180

, ,_. . . . .-

LATEX (N 6.72%)

Concentracion m g h l

0.002

O . 003

0.004

O. 005

O. 006

0.008

29

METODO DE KUNITZ

Concentracion micro g N 1 ml

0.134

o .202

0.268

O. 336

0.403

0.538

Absorvancia

0.035

0.052

0.070

0.092

0.305

0.130

B .

t .

a .

J .

I .

31

FETODO DE KUNITZ

MEXICAINA EXTRAIDA POR EL METODO 1 (N 5.02%)

concentracion Concentracion Absorvancia mg/mi micro g N / m l

O. 005 0.251 0.025

O. 0 0 6

O. 007

0.008

0.009

O'. 3 O 1

0.351

0.402

0.452

0.032

0.037

0.042

0.050

METODO DE K U N I T Z

32

MEXICAINA EXTñAIDA POR EL METODO 2 (N 4.116%)

C o n c e n t r a c i ó n mg/mi

. 0.005

O. 006

0.007

0.008

o. O09

C o n c e n t r a c i ó n micro g N / r n l

0.206

O . 247

0.288

0.329

0.370

Abcorvancia

0.043

0.050

0.060

0.068

0.075

.. .

+ d

\ 8

' 8 I 8 .

8 8

8 . <? . ' + . \

8

\ \

8 8

8 . .

'

33

DISCUSION,

Los i n t en tos de separar l a mexicaína del mater ia lno p r o teico contenido en e l f r u t o verde d e l PCepIL6 mexiicanub, con mé todos que pudieran ser ap l i cados en gran esca la , s i n tener - que recurrir a equipos complicados que aunientarlan e l costo del producto obtenido, han s i do hasta cierto punto exitosos; ya que l a preparacidn enzimdtica a i s lada se encuentra impuri f icada pr incipalmente con un mater ia l de natura leza po l i sacá rids;

- -

- -

La enzima obtenida puede considerarse como un mate r i a l crudo capaz d e p u r i f i c a r s e por métodos convencionales u t i l i - zados con o t r a s enzimas p r o t e o l l t i c a s , aunque en este caso, t an to l a p r e c i p i t a c i ón con s u l f a t o de amonio a l 40% de satu- rac idn o e l cloruro de sod io a l lo%, también provocan l a pre c i p i t a c i ó n de los po l i sacdr idos en su mayor par te , por l o - que se hace necesar io r e p e t i r e l proceso va r i as veces a f i n de obtener una pro te lna más pura. En 1975 Sor iano et. al. p u r i f i c a n l a mexicaina extrayendo e l l a t e x con cioruro de - sodio 0.1 M y haciendo una cromatoqra f la del ex txac to sobre so fadex G-75 y reguladores d e f o s f a t o a pB d e 7 , pero este - método s i n duda no podr ía ser ap l i cado en cant idades mayores.

-

( 19)

E l p rop6c i to d e este t r a b a j o es s610 demostrar l a a c t i - v idad p r o t e o l í t i c a de l a enzima obtenida por algún método - que evite l a mano d e obra exces i va que representa e l rayado y raspado de cada uno de los frutos d e l cauquayote y aprove- char a l máximo l a cant idad de p ro t e ína ac t i va que pudiera - permancer en los t e j i d o s d e l mismo.

F".

*_.

C"

-<.

"Y

.... c

I,.

"I.

-..

c

I

w.1

a"-

!" !!

T'

.- LA

[

c i: r: c [:

c

c r

r L.

i !. ,.

34

Los rendimientos que se expresan en l a Tabla No. 1 i n d i - can l a posibilidad de aumentar e l rendimiento global del ma- terial enzimático util izado ya sea en e l fruto fresco, o l a har ina de l fruto seco, en e l l a se observa que por cada 100 - gm. de fruto fresco se pueden obtener 320 mg. de látex seco, en cambio utilizando los métodos que nosotros proponemos se obtienen 960 mg. u 890 mg. de material enzimático sobre l a misma base de te j ido fresco. S i n embargo l a cantidad de es- te material no tendr fa ningún significado s i no tuviera S u f i - ciente actividad proteol í t ica, es por esto que no solo se - trataron de establecer las unidades de actividad enzimática en cada una de las muestras por los métodos de Balls y Ku---

n i t z , sino que se determinó l a cantidad de nitrógeno conteni - do en e l l a s comparativamente con e l que contenía una muestra de tripsina obtenida en e l laboratorio y una muestra de pa-- paína de los laboratorios Travenol a f i n de establecer las - unidades de nitrógeno activo ( los resultados se muestran en l a Tabla No. 2).

En e l método de Balls, como ya se ha explicado, l a uni - dad enzimatica se expresa por l a cantidad mínima de l produc- to capaz de coagular l a leche en un minuto, y de acuerdo a - las gráficas correspondientes. En l a Tabla No. 3 se puede - observar que para l a tripsina l a unidad corresponde a 1 0 mg.,

en cambio en e l látex de mexicaína corresponde a 2 5 mg, y en las mexicafnas obtenidas por nuestros métodos corresponde a

4 5 mg, l o que indica que l a proteína activa se encuentra im- purificada o parcialmente inactivada, es por esto que habien - do determinado e l porcentaje de nitrbgeno en cada enzima aún cuando no todo este correspondiera a l nitrógeno enzimático, podemos expresar en e l segundo renglón de l a misma t ab l a l a cantidaddenitrógeno que corresponde a cada una de las unida - des por peso, a las cuales llamamos unidades enzimbticas en mg. de nitrógeno. Esto quiere decir que en l a tripsina l a -

35

u

ww

1..

6

r L

unidad corresponde a un ag. de nitrógeno y en l a mexicaína

obtenida por e l método No. 2 . corresponde a 1 . 8 4 mg. de n i - trógeno, estas unidades aparentan ser mas reales y manifies - tan menos diferencia entre e l látex seco y l a s mexicalnas - obtenidas.

En e l método de Kunitz se pueden hacer lasmismas consi-

deraciones a l apl icar l a fdrmula No. 2 para calcular l a s - unidades de caseína; tomando en consideraci6n e l porciento

de nitr6geno en lugar de l a cantidad de enzima para obtener

l a s unidades de caseína en mg. de nitrógeno (ni Cas/mg N), en esta forma, s i se toman l a s canitades de nitrógeno y l a s

absorvancias orrespondientes a una misma cantidad de prepa- raciones enzimdticas se pueden obtener l a relación que exis

te entre e l l a s . -

La Tabla No. 3 también demuestra l a relaci6n que exis-

te entre l o s rendimientos de nitrógeno activo cuando se - aplica e l método de Ba l l s y e l de Kunitz y en ambos se ob-- serva que l a cantidad de enzima activa obtenida por los mé- todos que proponemos es superior a l a que se obtiene por e l

método tradicional.

f

c

c

ilnitlad de la enzi na en me;. Unidwl de l a enxi ma en mK. de N.

Unidades enzii~dti cas de N. activo en 3.00 mtr.de enz. Keniiinjcnto de en zima en 100 r-aC;.de te j ido fresco

Unidades c l i i\. As t ivo en 100 gms. de tesido fresco

:Letodo fir Balls

I 12-79 21.41 19.88

j i

37

CONCLUSI ONES

La enzima proteol ft ica contenida en el f ruto del P,ü!eu¿ mu*canud denominada mexicaína, se puede obtener por métodos que permiten manejar grandes cantidades del material fresco

s in tener que u t i l i z a r el rayado y raspado del f ruto que con consumirra mucha mano de obra y que encarecerla e l producto.

La actividad de l a enzima obtenida por los dos m6todos d i f e -

rentes es menor que l a que presenta e i latex, pero i a canti-

dad de unidades enzimdticas que se obtienen siempre es mayor;

por l o que e l Area de Productos Naturales donde se dearrol ló

este trabajo propondrá como patente en dominio de l a Univer- sidad l o s métodos mencionados.

-

c

L 1

38

B I BLI OGRAF I A

Payen, A., and Persoz, J.F. Ann. Chim. IPhys.) 53, 73 (18333

Kuhne, W. Unters, a.d. phyc io l . I n s t i t u t der Univ. Heidelberg, 1, - 291 (1978

F i sche r , E. Bev. dtech. chem. Ges. 27, 2985 (1984) - Haldane, J.B.S. Enzymes (London, Lpngmans, 193 O )

Sumner. J. B. J. bio l . Chem. - 69, 435 (1926)

Northrop, J. H., Kun i t z , M., and Herriott, R. M. C r y s t a l l i n e Ensymec, 2nd edn (Columbia Un i ve r s i t y Press, 1948).

Cstañeda M., Gavarron, F., and Balcazar, M., Science, Science, - 96, 365 (1942)

Mart ínez, Maximino.. . "Plantes U t i l e c d e l a F l o ra Mexicana". Edic iones Botas, México, D.F. (1959)

Bal l s , A.K, Linewerver, H. and Shwimmer" "Drying of Papaya Látex. S t a b i l i t y of papain". Ind. Eng. Chem., 32, - 1277 (1940)

Kimmel, J. R. , Smith, E.L, and Brown, D.M. "C rys ta l l i ne Papain I Preparat ion, S p e c i f i t y and Ac t i va t i on " J. Biol. Chem. 207. _. p 515-532 (1954)

Kimmel, J. R. , Smith, E.L. and Brown , D.M., "C rys ta l l i ne Papain I1 Physcal Studies, The Mercury Complex." J. Biol. Chem., 207, p 533-549 (1954). - Ba l l s , A.K. an Hoover, S.R., Jour. Bio l . Chem. 121, - 737 (1937).

39 *’ 1

(13). Kunitz, M., J. Gen. Physiol. 30, 291( 1 9 4 7 ) n.., - I-

IR ( 1 4 ) . Waldschrnidt-Leitz, E. and Schaffner, A.Z. , Physiol. Chem., 151, 31 ( 1926)

*u

IC.

(15). Wil lstatter R., Waldschmidt-Leitz E . , Dunai Lurria S., w.1 and Kunstner G . , 2 . Physiol, Chem. 161, 191 (1926)

u (16). Srminer. J. B. and Hand D.B., J. Bio l . Chem. *3

76, 149( 1928) IR

Ld (17). Anson M. L. , J. Gen. Physiol. , - 22, 79 ( 1935) y1

, L. (18). Kunitz M., J. Gen, Physiol. 18, - ‘459 (1935)

r I_ (19). Soriano M., Cruz Mat., Bustamante Y . , Del Cas t i l l o

p9 6.143. (1975). L . y Castañeda Agullón, Rev. Latinoamer . Quim.

P

w

Y

c1

w

IR

L..