mục lục - tỉnh giấc · web viewhóa học: các phản ứng hóa học xảy ra dưới...

Enzyme Glucoamylase GVHD: PGS.TS Lê Văn Việt Mẫn

Mục lục

Lời nói đầu.....................................................................................................................................2

I. Tổng quan về nguyên liệu......................................................................................................2

1. Enzyme glucoamylase.........................................................................................................2

1.1 Cấu tạo hóa học enzym glucoamylase.........................................................................2

1.2. Cấu trúc không gian enzym glucoamylase...................................................................2

1.3 Các tính chất của glucoamylase..................................................................................2

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme glucoamylase......................2

1.5. Tính chất của glucoamylase.........................................................................................2

1.6. Ứng dụng của enzym glucoamylase.............................................................................2

2. Nấm mốc Aspergillus niger.................................................................................................2

2.1. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger......................................................................2

2.2. Vị trí phân loại của Aspergillus niger..........................................................................2

2.3. Đặc điểm sinh hoc của Aspergillus niger.....................................................................2

2.4. Sinh trưởng của nấm mốc A.Niger...............................................................................2

2.5. Tiêu chí chọn giống.....................................................................................................2

3. Môi trường lên men.............................................................................................................2

4. Phương pháp nuôi cấy........................................................................................................2

II. Quy trình công nghệ............................................................................................................2

1. Trộn.................................................................................................................................... 2

2. Tiệt trùng............................................................................................................................ 2

3. Quá trình nhân giống..........................................................................................................2

4. Cấy giống............................................................................................................................2

5. Lên men...............................................................................................................................2

6. Nghiền.................................................................................................................................2

7. Trích li................................................................................................................................ 2

8. Li tâm..................................................................................................................................2

9. Siêu lọc UF......................................................................................................................... 2

1


10. Sắc kí lọc Gel....................................................................Error! Bookmark not defined.

11. Thẩm thấu ngược RO........................................................Error! Bookmark not defined.

12. Sấy thăng hoa..................................................................................................................2

13. Phối trộn......................................................................................................................... 2

14. Đóng gói..........................................................................................................................2

III. Sản phẩm............................................................................................................................ 2

1. Mô tả sản phẩm và chỉ tiêu chất lượng sản phẩm...............................................................2

2. Các phương pháp bảo quản enzyme glucoamylase.............................................................2

Tài liệu tham khảo......................................................................................................................... 2

2


Lời nói đầu

Việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật trên thế giới đã được tiến hành ở mức độ công nghiệp, với qui mô lớn – hàng nghìn tấn mỗi năm, sản phẩm thu được là các chế phẩm enzyme khác nhau, ở dạng thô dùng cho chăn nuôi, và các ngành công nghiệp dệt, thuộc da,… hoặc dạng tinh khiết cho thực phẩm, y dược học. Nhật là một trong những nước đi đầu trong lĩnh vực này với hơn 20 công ty sản xuất chế phẩm enzyme. Hàng năm Nhật sản xuất 9850 tấn amylase, 8906 tấn protease, 2200 tấn glucoamylase, 100 tấn lipase, 200 tấn các enzyme khác … Ở các nước phát triển như Đức, Hungary, Pháp, Anh, Đan Mạch, v.v… ngành công nghiệp sản xuất enzyme cũng được chú ý và phát triển khá mạnh.

Hệ enzyme amylase là một trong số các hệ enzyme được sử dụng rộng rãi nhất trong công nghiệp, y học và nhiều lĩnh vực khác. Theo tính chất và cơ chế tác dụng lên tinh bột của amylase người ta phân biệt amylase gồm các loại α – amylase, β – amylase, γ – amylase hay glucosamylase, oligo – 1,6 – glucosidase, transglucosyldase. Trong đó glucoamylase được sử dụng nhiều trong công nghiệp thực phẩm.

Hiện nay Glucoamylase là một enzyme chiếm vị trí hàng đầu trong sản xuất công nghiệp, đặc biệt là trong công nghiệp lương thực thực phẩm và dược phẩm. Do khả năng thủy phân triệt để, sản phẩm cuối của phản ứng xúc tác chủ yếu là α – glucose, nên Glucoamylase được sử dụng trong quy trình sản xuất α – glucose. Glucose có thể được dùng bổ sung vào một số dược phẩm, hay làm cơ chất cho công nghiệp sản xuất rượu bia, nước giải khát, chế biến thực phẩm. Sử dụng Glucoamylase trong sản xuất rượu bia giúp thay thế một lượng lớn malt bằng các loại tinh bột khác rẻ tiền hơn như bột gạo, bột mì… giúp giảm bớt chi phí sản xuất và giảm giá thành sản phẩm, nhất là đối với những nước phải nhập khẩu nguồn malt nguyên liệu như Việt Nam.

3


I. Tổng quan về nguyên liệu

1. Enzyme glucoamylase

Giới thiệu chung

Glucoamylase được các nhà khoa học Nhật tách ra lần đầu tiên từ Aspergillus awamori (Katihara, Kurushima, 1966). Sau đó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và các nhóm vi sinh vật khác cũng như ở mô động vật.

Glucoamylase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động rất lớn từ 27.000 đến 112.000 Dal, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme. Các glucoamylase chủ yếu được tạo nên từ hai iso enzyme I và II khác nhau ở khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng. Glucoamylase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại glucoamylase II không có cả hai tính chất này.

1.1 Cấu tạo hóa học enzym glucoamylase

Glucoamylase I và glucoamylase II. Cả hai dạng glucoamylase đều là những chuổi glyco – protein, trong phân tử có chứa D – gluco, D – maltose, D – galactose, thành phần carbonhydrate trong phân tử glucoamylase I chiếm khoảng 18%, còn với phân tử glucoamylase II là 10%.

Phân tử carbonhydrate tham gia trong thành phần cấu tạo enzyme glucoamylase đóng vai trò giúp ổn định cấu trúc enzyme. Ngoài ra chúng còn giúp tạo liên kết với cơ chất là các phân tử polysaccharide giúp cho vùng xúc tác trên enzym gần với cơ chất hơn, do đó quá trình thủy phân của enzyme thuận lợi hơn.

Thành phần acid amine tham gia tạo thành chuổi polypeptid trong phân tử glucoamylase cũng khác nhau khi enzyme glucoamylase được thu nhận từ các nguồn khác nhau

Số lượng acid amine tham gia vào chuổi polypeptid cấu tạo nên phân tử glucoamylase thu nhận từ nấm mốc Aspergillus niger và Aspergillus awamori khoảng 650 – 700 acid amin.

Các acid amin chính tham gia trong trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase bao gồm acid glutamic, tryptophan, tyrosin, asparagin, acid aspatic, lysin, serin. Trong đó acid glutamic ở vị trí thứ 179 và 400 đóng vai trò chính trong việc xúc tác thủy phân liên kết O – glucozit của cơ chất.

4


Hình 1.1: Sơ đồ cấu tạo trung tâm hoạt động của enzyme glucoamylase

1.2. Cấu trúc không gian enzym glucoamylase

Trong không gian, phân tử glucoamylase được chia làm ba vùng với chức năng riêng biệt:

- Vùng SBD (Starch binding domain: vùng gắn kết với tinh bột) có kích thước khoảng 30 A0. Giữ chức năng liên kết với phân tử cơ chất.

- Vùng CD (Catalyse Domain: vùng xúc tác) có kích thước khoảng 60 A0, giữ chức năng xúc tác phản ứng thủy phân liên kết O – glucozit.

- Vùng Linker có độ dài khoảng 100 A0 liên kết hai vùng trên lại với nhau.

5


Hình 1.2: Sơ đồ cấu trúc không gian Enzyme Glucoamylase

1.3 Các tính chất của glucoamylase

Enzym glucoamylase có mã số EC: 3.2.1.3

Tên khoa học: glucan 1,4 – α – glucohydrolase

Ngoài ra enzym glucoamylase còn có các tên gọi khác như: amyloglucosidase; γ – amylase; lysosomal α – glucosidase; acid maltase; exo – 1,4 – α – glucoside; glucose amylase; γ – 1.4 – glucan glucohydrolase.

Đặc trưng phản ứng: enzyme glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân liên kết 1,4 – 1,6 o – glucoside và tách tuần tự từng gốc gluco từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide.

Enzym glucoamylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột và tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của chuổi polysaccharide. Gốc gluco từ đầu không khử được gọi là glycone, còn chuổi oligosaccharide sau khi gluco được tách ra thì được gọi là Alglycone.

Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết o – glucozit là do hoạt động chủ yếu của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết o – glucozit). Acid glutamic ở vị trí thứ 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucozit của phân tử cỏ chất sẽ bị phá vỡ.

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme glucoamylase

I.4.1. Nhiệt độ

6


Nhiệt độ là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzym, khi tăng nhiệt độ lên 100C thì vận tốc phản ứng của enzyme tăng lên gấp đôi, nhưng khi tăng nhiệt độ lên quá cao vượt quá nhiệt độ tối ưu thì enzyme bắt đầu biến tính, do đó vận tốc phản ứng của enzyme cũng giảm xuống. Mỗi enzyme sẽ hoạt động trong khoảng nhiệt độ nhất định, enzyme glucoamylase hoạt động trong khoảng 200C – 750C. Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của enzym glucoamylase: 400C – 650C.

1.4.2 pH

pH cũng là yếu tố có ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng của enzym, là do pH thay đổi có ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa tham gia trong trung tâm hoạt động của enzym như nhóm α – COOH, ω – COOH, – NH2, – OH. Vòng imodazol… cũng như trạng thái ion hóa của cơ chất và của phức chất trung gian ES.

Khoảng pH mà enzym glucoamylase hoạt động được là từ 2 – 8, pH tối ưu: 4 – 5.5

1.4.3 Các chất ức chế

Enzyme glucoamylase sẽ bị ức chế bởi các ion kim loại như Al3+, Hg2+, Pb2+, Ni2+,Cu2+. Ngoài ra, khi cơ chất là tinh bột thì schardinger dextrin sẽ hoạt động như một chất ngăn cản khả năng taog phức hợp giữa enzyme glucoamylase và tinh bột. với cơ chất là maltose thì trong môi trường có sự hiện diện của gentitobiose, mantitol với nồng độ khoảng 20mM sẽ ức chế hoạt động của enzyme glucoamylase

1.4.4 Các chất hóa học

Khi cho thêm vào môi trường phản ứng các dung môi như: chloroform, hexane, n – deoecane với nồng độ khoảng 50% sẽ làm tăng hoạt tính glucoamylase lên 2 lần so với môi trường chỉ có nước là chất dung môi duy nhất. Các chất 2,2’ – dipyridyl, iodoacetamyde sẽ làm tăng hoạt tính enzym glucoamylase.

1.5. Tính chất của glucoamylase

Cơ chế tác động

Enzym glucoamylase có khả năng thủy phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside của phân tử tinh bột.

7


Hình 1.3: Sơ đồ phân giải của enzyme glucoamylase

Khả năng thuỷ phân mạnh mẽ liên kết – 1,4 lẫn – 1,6 glucoside glucoamylase để tạo thành glucose đã đưa enzyme này lên hàng đầu về hiệu lực xúc tác thuỷ phân tinh bột. Vì thế việc dùng chế phẩm glucoamylase từ các chủng vi sinh vật trong việc sản xuất bia, rượu, mật, glucose… có một ý nghĩa triển vọng rất lớn. Enzyme glucoamylase xúc tác tách tuần tự từng gốc glucose từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Gốc glucose từ đầu không khử được gọi là glycone, chuỗi oligosaccharide sau khi glucose được tách ra gọi là alglycone.

Cơ chế xúc tác thủy phân liên kết O – glucoside là do hoạt động chủ yếu của một cặp acid amin đóng vai trò như một cặp acid – base. Khi tương tác với cơ chất, acid glutamic ở vị trí thứ 179 đóng vai trò như một chất xúc tác acid, nó sẽ proton hóa oxi – glycosidic (phân tử oxi ở vị trí liên kết o – glucoside). Acid glutamic ở vị trí 400 đóng vai trò như một chất xúc tác base, acid amin này sẽ thu hút và tạo liên kết với proton H+ của phân tử nước làm giải phóng gốc OH-, gốc OH- này sẽ tấn công vào vị trí carbon glycosidic và như vậy liên kết o – glucoside của phân tử cơ chất sẽ bị phá vỡ.

Glucoamylase phân thuỷ phân tinh bột thành những dextrin có phân tử thấp, liên tục tách gốc glucose và cuối cùng tạo sản phẩm là glucose. Glucoamylase thuỷ phân tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loạt ở các liên – 1,4 và – 1,6 glucoside. Nó có giá trị đặc biệt trong ngành sản xuất rượu, chuyển những dextrin có phân tử lượng cao không lên men thành những hợpchất lên men được và do đó nâng cao hiệu suất lên men rượu từ các nguyên liệu là tinh bột.

Các chế phẩm enzyme glucoamylase tách chiết từ các tế bào vi sinh vật tuy có những điểm giống nhau, song chúng cũng có một vài điểm khác nhau. Ngay cả các chế phẩm được tách từ các chủng của nấm mốc Aspergillus cũng khác nhau, thậm chí ngay cả các chủng cùng loài cũng khác nhau về các đặc điểm về tính chất lý, hoá, phân tử lượng, thành phần acid amin, tính đặc hiệu với cơ chất và điều kiện hoạt động. Khi nghiên cứu các cơ chế của sự thủy phân một số oligosaccharide và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Backer và cộng sự thấy rằng sự thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế “đa mạch” chứ không phải theo cơ chế đơn mạch. Sơ đồ thủy phân tinh bột bởi glucoamylase:

8

Glucoseamylase kiểu Asp.niger khác nhauTinh bột hay oligosaccharide Glucose


Phản ứng cho ra 80 – 85 % glucose

1.6. Ứng dụng của enzym glucoamylase

Chế phẩm glucoamylase từ nấm mốc Aspergillus, Rhizopus … được thay thế malt làm tác nhân đường hóa tinh bột trong sản xuất rượu, bia từ nguyên liệu có bột. Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật thay malt đã tiết kiệm được hàng vạn tấn đại mạch loại tốt, giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản xuất.

Trong giai đoạn đường hóa, glucoamylase chiếm vị trí hàng đầu và đóng vai trò quyết định trong việc chuyển hóa tinh bột thành đường để lên men, do đó cần chọn chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh nhiều enzym glucoamylase. Trong sản xuất rượu người ta thường dùng hỗn hợp canh trường bề mặt của Aspergillus Usamii và Aspergillus Balatae.

Nếu coi tổng lượng đường maltose, glucose, saccharose, fructose là 100% thì khi đường hóa bằng malt ta có 71% maltose, 24 – 28% glucose, còn khi đường hóa bằng amylase nấm mốc sẽ có 14 – 21% maltose, 80 – 85% glucose, sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân bởi amylase nấm mốc chủ yếu là glucose – đường dễ lên men, do vậy sự lên men rượu xảy ra nhanh hơn

Glucose được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như y học, trong công nghiệp thực phẩm. ngày nay việc sản xuất glucose đa số được sử dụng công nghệ enzyme. Enzyme glucoamylase là enzyme chủ yếu cho quá trình đường phân tinh bột để tạo thành glucose. Tinh bột có chỉ số DE khoảng 4 – 8, sau khi thủy phân bằng enzyme glucoamylase thì chỉ số DE tăng lên 96 – 98. Dung dịch sau thủy phân có thể trực tiếp được sử dụng để sản xuất siro giàu fructose hoặc là sản xuất glucose ở dạng tinh thể.

Trong công nghiệp dược phẩm, enzyme glucoamylase còn được bổ sung vào một số loại thuốc giúp tăng khả năng tiêu hóa cho cơ thể.

Ngày nay, enzyme glucoamylase còn được sử dụng kết hợp với các enzyme cellulase và protease dưới dạng canh trường nấm mốc bổ sung vào trong thức ăn gia súc, làm tăng quá trình đồng hóa giúp cho gia súc tăng trọng nhanh hơn.

2. Nấm mốc Aspergillus niger

2.1. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger

Giống Aspergillus có khoảng 200 loài phân bố khắp nơi trong tự nhiên, trong đó có các

loài Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae,…có giá trị sử dụng trong sản xuất

enzyme, rượu, axit hữu cơ…

Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc Aspergillus niger

từ hạt chứa nhiều dầu như: hạt đậu nành, đậu phộng, hạt ngũ cố, hạt bắp…; Aspergillus niger

9


cũng được phân lập từ các sản phảm lên men cổ truyền

2.2. Vị trí phân loại của Aspergillus niger

Giống Aspergillus do Michelli mô tả lần đầu vào năm 1729. Năm 1901 Wehmer đã cho

ra đời một chuyên luận phân loại giống nấm bất toàn này.

Raper and Fennell (1965) chỉ dùng một tên Aspergillus cho tất cả các loài tạo thành bào tử trần. Như vậy Aspergillus niger có vị trí phân loại như sau:

Bảng 1.1: Phân loại Aspergillus niger

Giới Fungi Lớp Fungi imperfectiBộ MonilialesHọ AspergillaceaeLoài Aspergillus niger

Khuẩn ty phân nhánh có vách ngăn, bào tử đính không nằm tron bọc bào tử, cuống sinh

thể bình phình ra rõ rệt ở đầu tạo thành bọc lớn hình cầu 5 – 6 x 20 – 30µm, đôi khi 6 – 10 x 60 –

70µm màu nâu đen

Hình 1.4: Nấm mốc Aspergillus Niger

2.3. Đặc điểm sinh hoc của Aspergillus niger

Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6 – 80C và tối đa là 45 – 470C,

tối ưu ở 28 – 350C, trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ ẩm môi trường thích hợp để

lên men bán rắn của Aspergillus niger là 60 – 65%, nó chỉ sinh trưởng và phát triển khi có mặt

10


O2 ở pH tối ưu là 4 – 6.5, cũng có những chủng Aspergillus niger sinh trưởng được ở pH 2. Sự

thay đổi pH của môi trường nuôi cấy từ 3 đến 6.5 làm thay đổi đáng kể hình thái của Aspergillus

niger.

2.4. Sinh trưởng của nấm mốc A.Niger

Asp.niger có nhiều kiểu sinh sản khác nhau: Sinh sản sinh dưỡng, sinh sản vô tính bằng bào tử hoặc sinh sản hữu tính.

2.4.1. Điều kiện sinh trưởng

Nhiệt độ

Nấm mốc có nhiệt độ phát triển tốt ưu là 28 – 320C, trong quá trình sinh trưởng và phát triển vi sinh vật đồng hóa chất dinh dưỡng và thải ra một lượng nhiệt khá lớn. Do đó trong quá trình nuôi cấy cần phải có những trang thiết bị phù hợp để duy trì và ổn định nhiệt độ canh trường.

11


Hình 1.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính enzyme glucoamylase

Độ ẩm

Độ ẩm tối ưu trong quá trình nuôi cấy nấm mốc là 65 – 70%. Tuỳ theo điều kiện khí hậu và điều kiện vô trùng của mỗi phòng thí nghiệm của mỗi quốc gia mà lựa chọn độ ẩm cho thích hợp, độ ẩm thường khống chế ở 50 – 60%, thường sử dụng 58 – 60%. Độ ẩm mà tăng quá 55 – 70% sẽ làm giảm độ thoáng khí, còn thấp hơn 50 – 55% thì kìm hãm sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo Enzyme Glucoamylase. Trong điều kiện tiệt trùng tốt (môi trường trong bình tam giác, trong tủ ấm phòng thí nghiệm hoạt lực Glucoamylase cao nhất thu ở độ ẩm 65 – 68%). Cần nhớ rằng khi nuôi trong điều kiện không được vô trùng tuyệt đối (trên các khay), thì độ ẩm môi trường không được vượt quá 60%, vì cao hơn nữa sẽ dễ bị nhiễm khuẩn. Tuy vậy, việc giữ được độ ẩm cao (việc phòng ngừa và hạn chế sự hư hỏng của canh trường) trong suốt quá trình sinh trưởng của nấm sợi lại còn có ý nghĩa to lớn hơn đối với sự tạo thành Enzyme.

pH

Khi nuôi cấy trên môi trường bán rắn theo phương pháp bề mặt thì pH ít ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của nấm mốc, thường người ta sử dụng pH tự nhiên vào khoảng 5.5 – 6.

12

UI (Hoạt độ enzyme)

t0


Hình 1.6:Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme glucoamylase

Cung cấp Oxy

Trong quá trình phát triển và tích tụ enzyme nấm mốc rất cần oxy, khi nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt nấm mốc dễ dàng tiếp xúc với không khí qua hệ thống sợi tơ và micell vì thế đòi hỏi môi trường phải xốp giúp cho nấm mốc tạo nhiều hệ sợi và tích luỹ nhiều enzyme. Nếu môi trường dính bết, không đủ độ xốp, không khí sẽ ít tiếp xúc vi sinh vật xảy ra hô hấp yếm khí ảnh hưởng đến việc tích luỹ enzyme. Độ hoà tan của oxy vào môi trường nuôi cấy phụ thuộc rất nhiều yếu tố: nhiệt độ, nồng độ chất và phương pháp thổi khí, nhiệt độ cao thì khả năng hoà tan oxy kém, nồng độ chất tỷ lệ nghịch với khả năng hoà tan của oxy, ngược lại cũng có một số yếu tố làm tăng khả năng hoà tan của oxy: ete, rượu, acid hữu cơ…

I.4.2. Nguồn cơ chất

Nguồn C

Thường là hợp chất hữu cơ trong đó chủ yếu là gluxit Đối với các hệ vi sinh vật sinh enzyme amylaza: Tinh bột, dextrin, maltoza vừa là chất cảm ứng vừa là nguồn cacbon tốt nhất để sinh tổng hợp amylaza. Khi nuôi cấy theo phương pháp bề mặt nếu dùng cám thì không cần bổ sung tinh bột, ngoài cám có thể dùng bột ngô, bột mì, bo bo. Cần chú ý trong đa số trường hợp, một số loại đường điển hình, nhất là glucose lại kìm hãm

13


pH


sinh tổng hợp các enzyme thủy phân nói chung (chẳng hạn theo cơ chế trấn áp phân giải do làm giàu lượng AMPV trong tế bào) Ngoài nguồn gluxit là chủ yếu còn phải kể đến các nguồn cacbon khác như: ‒ Các axit béo phân tử lượng lớn (Oleic, stearic, miniotic). Ví dụ: axit oleic có tác dụng kích thích tổng hợp glucoamylaza lên 2.5 – 3.5 lần so với nồng độ thích hợp 2 – 3%. ‒ Etanol và glyxerin trong nhiều trường hợp nuôi cấy được dùng làm cacbon bổ sung.

Nguồn Nitơ

Ở nhiều loại nấm mốc, nguồn nitơ tốt nhất là NaNO3 và NH4NO3, nhưng khi nồng độ nitơ dưới 0.05% nấm mốc vẫn phát triển được nhưng sinh tổng hợp amylaza rất kém. Các muối amoni vô cơ, một số nguồn nitơ hữu cơ (gelatin, cazein, cao ngô) cho hiệu quả sinh tổng hợp amylaza thấp.

Trong thực tế, người ta thường dùng nguồn nitơ là các axit amin có nguồn gốc từ dịch thủy phân protein (dịch tự phân nấm men, nước chấm, cao ngô, dịch chiết malt), đây vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon và chất cảm ứng sinh enzyme. Các axit amin có tác dụng tốt nhất trong những trường hợp này là asparagin, axit glutamic; D,L serin, histamin, alanin. Trong khi casein thậm chí là ức chế thì dịch thủy phân casein lại cảm ứng sinh tổng hợp amylaza lên gấp 2 lần so với ban đầu. Trong số các nguồn nitơ vô cơ thì NH4, H2PO4 là tốt cho nuôi cấy vi sinh vật hơn cả. Các muối amon và nitrat khác đều làm giảm hoạt lực enzyme. Các axit amin có ảnh hưởng rõ rệt nhất đến quá trình sinh tổng hợp enzyme vi sinh vật nói chung. Nhiều acid amin lại có tác dụng ức chế sinh tổng hợp enzyme như valin, axit glutamic, izolơxin, treonin.

Nguồn các nguyên tố khoáng và các yếu tố (chất) kích thích sinh trưởng

Muối khoáng rất cần thiết cho hoạt động của vi sinh vật, đặc biệt là đối với các quá trình

sinh tổng hợp các enzyme kim loại. Để sinh tổng hợp glucoamylaza, nồng độ MnSO4 thích hợp

nhất là 0.05%. Nếu thiếu muối này và muối photphat kali thì vi sinh vật không thể sinh tổng hợp

được dextrinaza. Hoạt lực glucoamylaza được nâng cao ở nồng độ KCl 0,05%

Ion Mg2+ có tác dụng sinh tổng hợp và ổn định các enzyme có hoạt tính ở nhiệt độ cao.

Lưu huỳnh S với nguồn chủ yếu là các axit amin chứa S như metionin, cystein, sistin, và các muối sunphat (CuSO4). Các muối khoáng có Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzyme. Trong đa số trường hợp biotin (vitamin H) và một số vitamin cũng rất cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp enzyme.

2.5. Tiêu chí chọn giống

14


Giống nấm mốc sử dụng phải đạt những chuẩn mực nhất định mới được phép sử dụng.Các yếu tố cơ bản đối với giống nấm mốc sử dụng lên men thu nhận chế phẩm glucoamylase gồm:

- Giống nấm mốc phải có khả năng sinh tổng hợp enzyme glucoamylase mạnh, sản phẩm này phải có chất lượng và số lượng cao hơn hẳn các sản phẩm từ các giống nấm mốc khác.

Hình 1.7: So sánh hoạt tính enzyme glucoamylase sinh ra từ các giống nấm mốc khác nhau

- Giống phải có khả năng sử dụng các nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm tại địa phương nơi nhà máy hoạt động, các phụ phẩm của các nhà máy.

- Chế phẩm enzyme cần thu nhận do giống đang áp dụng trong sản xuất phải dễ dàng tách ra khỏi các tạp chất môi trường và sinh khối của nấm mốc giống.

- Giống nấm mốc sử dụng phải là chủng thuần khiết, không nhiễm các sinh vật lạ.

- Giống phải có tính thích nghi cao, đặc biệt phải thích nghi với điều kiện sản xuất công nghiệp, trong đó có sự ổn định về nhiệt độ, pH, độ ẩm…

15


- Giống phải có tốc độ sinh sản và phát triển rất mạnh trong điều kiện môi trường công nghiệp. Tính chất này rất quan trọng vì khi nhiễm các vi sinh vật lạ thì giống dung trong sản xuất phải có khả năng lấn át sự phát triển của vi sinh vật lạ.

- Tốc độ trao đổi chất mạnh để nhanh tạo ra sản phẩm mong muốn, giúp ta tăng nhiều chu kỳ sản xuất.

- Giống phải ổn định trong bảo quản và dễ dàng bảo quản, ít bị thoái hóa

3. Môi trường lên men

Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo Glucoamylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết các vi sinh vật tạo glucoamylase đều hấp thụ carbon chủ yếu ở các dạng hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin…), hyđro ở dạng H2O và của các hợp chất hữu cơ, oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử.

Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo Glucoamylase bằng phương pháp lên men bề mặt là cám mì, cám gạo. Cám mì, cám gạo là nguyên liệu hoàn hảo và có thể là một cấu tử duy nhất của môi trường để nuôi vi sinh vật không cần bổ sung thêm các chất khác nữa. Cám mì có 16 – 22% tinh bột, 10 – 12% protein, trong đó các amino acid quan trọng như methionine (0,19%), cystine (0,3%), arginine (1%), lysine (6%), tryptophan (0,3%), 3 – 4% chất béo, 10,3% celulose, các nguyên tố trơ (Na – 0.09% , K – 1% , Ca – 0.16% , P – 0.94%) và các nguyên tố vi lượng cùng các chất khác. Cám gạo có khoảng 20% tinh bột 10 –15% chất béo, 10 – 14% protein, 8 – 16% celulose, các chất hoà tan không chứa nitơ (37 – 59%).

Bảng 1.2: Thành phần hóa học của cám mì

Thành phần % Khối lượngĐộ ẩm 13Tinh bột 16 – 22Protein thô 10 – 12Béo thô 3 – 4Xơ thô 10 – 11Canxi 0.16Phospho tổng 0.94Natri 0.09K 1

16


Bảng 1.3: Thành phần hóa học của cám gạo

Thành phần % Khối lượngTinh bột 20Chất béo 10 – 15Protein 10 – 14 Cellulose 8 – 16Cấu tử hòa tan không chứa Nito 37 – 59

Chất lượng của cám gạo, cám mì có ảnh hưởng lớn tới hoạt lực của enzyme. Cám không được chứa tinh bột dưới 20 – 30%. Nên dùng cám tốt, cám mới không có vị chua hay vị đắng, không hôi mùi mốc. Độ ẩm của cám không quá 15%, tạp chất độc không quá 0,05%... Tuy là phế liệu của công nghiệp xay xát, nhưng cám cũng tương đối đắt tiền, hơn nữa trong quá trình nuôi vi sinh vật, các chất dinh dưỡng không được sử dụng hết, vì thế có thể thay cám bằng một số cấu tử rẻ tiền hơn. Cấu tử này thường là mầm mạch (15 – 20%), trấu (2 – 5%), mùn cưa (5 – 10%)… Có thể dùng cặn bã canh trường rắn (sau khi cách ly Enzyme) là cấu tử chính của môi trường (Silova, Fenikxov) 1967, đảm bảo chế độ tiệt trùng. Cám và các chất phụ gia chứa nhiều bào tử vi sinh vật khác nên cần phải tiệt trùng để đảm bảo chủng nuôi phát triển bình thường và canh trường sản xuất không chứa vi sinh vật ngoại lai. Cần thanh trùng dưới áp suất hơi 1 – 5atm trong vòng 4 – 6 giờ, có thể thanh trùng bằng hơi nóng ở nhiệt độ 1200C trong 90 phút. Khi thanh trùng cho vào 0,2% formalin (40%) và 0,8% HCl kỹ thuật theo khối lượng môi trường.

Tiêu chuẩn chọn nguyên liệu: Tiêu chuẩn chất lượng cám mì, cám gạo theo qui định của Bộ Nông nghiệp – phát triển nông thôn.

Độ ẩm: < 12%

Không mùi chua mốc

Độc tố Aflatoxin: không quá 50 ppb

Tỉ lệ cám mì/Cám gạo = 7/3

Bảng 1.4: Thành phần dinh dưỡng của hỗn hợp nguyên liệu cám gạo – cám mì

Thành phần dinh dưỡng % Khối lượng

Độ ẩm 11Protein thô 16.5Xơ thô 9.75NDF (Hàm lượng chất xơ trung tính) 42

17


ADF (Hàm lượng xơ acid dễ tiêu hóa) 16Hàm lượng tro và khoáng 4.75

Bảng 1.5: Chỉ tiêu nước sạch trong công nghiệp

Chỉ tiêu vật lí

- Mùi vị

- Độ trong (ống Dienert)

- Màu sắc (thang màu Coban)

Tiêu chuẩn

- Không mùi

- 100 ml

- 50

Chỉ tiêu hoá học

- pH

- Độ cặn cố định (đốt ở 600C)

- Độ cứng toàn phần (độ Đức)

- Độ cứng vĩnh viễn

- CaO

- MgO

- Fe2O3

- MnO

- BO4-3

- SO4-2

- NH4+

- NO2-

- NO3-

- 6 ÷ 8,5

- 75 ÷ 150 mg/lít

- Dưới 150

- 70

- 50 ÷ 100 mg/lít

- 50 mg/lít

- 0.3 mg/lít

- 0.2 mg/lít

- 2.5 mg/lít

- 0.5 mg/lít

- 0.3 mg/lít

- Không có

- Không có

18


- Pb

- As

- Fe

- Zn

- 0.1 mg/lít

- 0.05 mg/lít

- 0.3 ÷ 0.5 mg/lít

- 5.00 mg/lít

Chỉ tiêu vi sinh vật

- Tổng số vi sinh vật hiếu khí

- Chỉ số Coli

- Vi sinh vật gây bệnh

- Dưới 100 cfu/ml

- Dưới 20 cfu/ml

- Không có

Các chất bổ sung môi trường lên men bán rắn:

K2HPO4, MgSO4, FeSO4.7H2O, NaNO3

Chất độn: Mùn cưa

Bảng 1. 6: Hàm lượng các chất bổ sung trong nguyên liệu

Chất bổ sung % (Khối lượng)K2HPO4 0.001MgSO4 0.005NaNO3 0.9FeSO4.7H2O 0.1Mùn cưa 10

Bảng 1.7: Chỉ tiêu cho phép của MgSO4

Độ tinh khiết > 99.5 %Asen < 3 ppm

19


Selen < 30ppmChì < 10 ppm

Bảng 1.8: Chỉ tiêu cho phép của KH2PO4

Độ tinh khiết > 98 %Asen < 3 ppmFlo < 10 ppmClo < 0.03%Sulfate <0.1 %Sắt <0.003 %Chì < 5 ppm

Bảng 1.9: Chỉ tiêu cho phép của FeSO4.7H2O

Độ tinh khiết > 99.5 %Asen < 3 ppmThủy ngân < 3 ppmChì < 10 ppm

4. Phương pháp nuôi cấy

Ở đây, ta sử dụng phương pháp nuôi cấy bề mặt

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường rắn hoặc lỏng (vì vậy còn gọi là phương pháp nổi). Các môi trường rắn trước khi nuôi cấy vi sinh vật cần được làm ẩm. Thường dùng cám, đôi khi dùng gạo tấm, ngô, bã bia, bã củ cải đường, khoai tây, lõi ngô…hoặc hỗn hợp những nguyên liệu này.

Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật mà trong đó vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường hay phát triển trên hạt, trên môi trường bán rắn.

Nguyên liệu dùng để nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp này thường là môi trường cám trấu, cám gạo, cám mì, bột ngô, hạt kê. Để làm tăng độ xốp của môi trường từ các nguyên liệu trên, người ta thường bổ sung vào các thành phần làm xốp như trấu, lõi ngô được làm nhỏ. Tuy nhiên, các thành phần trên là các thành phần chứa rất ít chất dinh dưỡng vì vậy cần phải bổ sung vào môi trường một lượng phụ liệu trong khoảng 15 – 20%. Mặc khác, để tăng cường quá trình sinh tổng hợp enzyme thì cần phải bổ sung vào môi trường nuôi vi sinh vật những chất cảm ứng để cảm ứng tổng hợp enzyme.

20


II. Quy trình công nghệ

21

Nguyên liệu

Nhân giống

Nấm mốc

Trộn

Tiệt trùng

Cấy giống


1. Trộn

Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình lên men

Quá trình trộn làm cho nguyên liệu phân tán đều vào nhau, đảm bảo thành phần dinh dưỡng ở mọi vị trí là gần như nhau để thích hợp cho vi sinh vật sử dụng.

Các biến đổi của nguyên liệu: do đây là quá trình phối trộn vật liệu rời nên trong quá trình phối trộn thường không tạo ra biến đổi nào đáng kể.

Vật lí: nhiệt độ môi trường tăng

Hóa học: thành phần hóa học của môi trường thay đổi

22

Trích liNước Bã

Sấy thăng hoa

Phối trộn

Chất độn

Đóng góiBao bì

Chế phẩm enzyme

Li tâm Bã

Lên men

Nghiền

Siêu lọc UF


Hóa lí: không có biến đổi đáng kể.

Hóa sinh: phản ứng do enzyme xúc tác

Sinh học: Hỗn hợp cám mì, cám gạo là môi trường giàu dinh dưỡng thích hợp cho vi khuẩn, nấm mốc phát triển nên trong quá trình phối trộn có thể bị nhiễm vi sinh vật

Thiết bị: thiết bị phối trộn dạng thùng quay

Hình 2.1: Thiết bị phối trộn dạng thùng quay

Thiết bị trộn dạng thùng quay, bên trong thùng có thể lắp thêm các thanh chặn để làm tăng hiệu quả của quá trình phối trộn. Nguyên liệu thường được cho vào với thể tích khoảng 50 – 60% thể tích thùng, rồi điều chỉnh tốc độ quay của thùng và thời gian phối trộn cho phù hợp

Thông số công nghệ:

- Tỉ lệ phối trộn: cám mì/cám gạo = 7/3

- Tốc độ quay của thùng = 1/2 tốc độ giới hạn (tốc độ mà vật liệu bắt đầu di chuyển trên thành thùng do lực ly tâm)

- Nhiệt độ phối trộn: 28 – 30oC

- Thời gian phối trộn: 15 phút

2. Tiệt trùng

Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình lên men

23


Quá trình tiệt trùng sẽ làm giảm lượng vi sinh vật có trong nguyên liệu, tức là giảm các yếu tố cạnh tranh và các yếu tố làm thay đổi thành phần dinh dưỡng môi trường lên men, nhằm tạo điều kiện tốt cho Aspergillus Niger phát triển và tạo hệ enzyme glucoamylase

Các biển đổi của nguyên liệu:

- Vật lí: trong quá trình tiệt trùng, biến đổi vật lý quan trọng nhất là sự tăng nhiệt độ của nguyên liệu, có sự giảm nhẹ khối lượng do sự bay hơi nước trong nguyên liệu.

- Hóa học: các phản ứng hóa học xảy ra dưới tác dụng của nhiệt độ như phản ứng Maillard, oxy hóa chất béo, phân hủy một số vitamin… nhưng mức độ các phản ứng xảy ra không đáng kể.

- Hóa lí: biến đổi hóa lý chủ yếu trong quá trình tiệt trùng nguyên liệu là sự bay hơi nước, tuy nhiên độ ẩm ban đầu của nguyên liệu cũng không quá cao nên mức độ bay hơi nước cũng không đáng kể.

- Sinh học: dưới tác dụng của nhiệt độ cao các vi sinh vật sẽ bị ức chế hoặc tiêu diệt. đây chính là mục đích chính của quá trình.

- Hóa sinh: nhiệt độ cao sẽ làm biến tính bất thuận nghịch các enzyme có mặt trong nguyên liệu, do đó chúng sẽ bị vô hoạt.

Thiết bị: Thiết bị tiệt trùng dạng nằm ngang

Hình 2.2: Thiết bị thanh trùng dạng nằm ngang

1 – Vỏ; 2 – Khớp nối để nạp hơi; 3 – Cửa để nạp nguyên liệu; 4 – Van không khí; 5 – Trục nối các cánh; 6 – Khớp nối để mở nước rửa; 7 – Cửa tháo liệu; 8 – Ao nước; 9 – Khớp nối để tháo nước ngưng; 10 – Khớp nối để thải hơi trong áo tơi

24


Trong công nhiệp vi sinh để tiệt trùng các môi trường dinh dưỡng dạng rời, người ta sử dụng rộng rãi các thiết bị tiệt trùng hình trụ dạng nằm ngang có áo hơi. Bên trong thiết bị tiệt trùng được bố trí hai trục với các cánh có thể quay một góc độ nào đó để dễ dàng điều chỉnh.

Điều đó cho phép xác định khe hở cần thiết theo hướng kính giữa các cánh và thành tường của thiết bị, nó phụ thuộc vào các tính chất hoá lý của các cấu tử và thành phần của môi trường. Các trục quay theo các hướng khác nhau làm cho môi trường chuyển đảo liên tục trong những hướng đối nhau. Loại cấu tạo này sẽ đảm bảo sự đảo trộn môi trường, làm giảm đáng kể sự vón cục và đảm bảo sự đồng nhất môi trường có thành phần nhiều cấu tử. Điều đó có ảnh hưởng tốt tới quá trình nuôi cấy.

Hơi có áp suất 0,2 MPa cho vào áo tơi để làm tăng nhanh quá trình đun nóng môi trường. Môi trường được giữ ở chế độ tiệt trùng đã cho khi khởi động chu kì các cơ cấu chuyển đảo. Sau khi tiệt trùng, môi trường sẽ được làm nguội về 38 – 400C và thoát liệu ra ngoài. Tiến hành tháo môi trường dinh dưỡng đã được tiệt trùng qua cửa tháo liệu bên dưới. Cửa tháo liệu có các nắp trong và ngoài được lắp chặt bằng các vít. Ngoài ra, thiết bị tiệt trùng còn có các cửa nạp liệu, nhiều khớp nối để nạp hơi và thải nước ngưng, để nạp và thải nước làm lạnh, cho các dụng cụ kiểm tra và điều chỉnh nhiệt độ, áp suất và có van bảo hiểm.


- Nhiệt độ: 1210C

- Thời gian: 20 – 30 phút

3. Quá trình nhân giống

Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình cấy giống, thu nhận bào tử vi sinh vật chuẩn bị cho quá trình nuôi cấy thu nhận enzyme glucoamylase.

Các biến đổi trong quá trình nhân giống:

- Sinh học: vi sinh vật thực hiện quá trình trao đổi chất và sinh sản tạo ra nhiều tế bào mới.

- Hóa sinh: các phản ứng hóa sinh xảy ra bên trong và ngoài tế bào, hầu hết chúng đều có liên quan đến sự trao đổi chất của tế bào. Các phản ứng này được chia làm hai nhóm:

Phản ứng dị hóa: chuyển hóa cơ chất phức tạp thành cơ chất đơn giản hoặc phân giải cơ chất để tạo ra năng lượng sinh học.

Phản ứng đồng hóa: tổng hợp các polymer sinh học của tế bào từ các hợp chất đơn giản và năng lượng do dị hóa cung cấp.

- Vật lý: có sự tăng nhiệt độ canh trường, do trong quá trình sinh trưởng một phần năng lượng sẽ được vi sinh vật thải ra bên ngoài tế bào dưới dạng nhiệt năng.

25


Nhân giống bao gồm 2 quá trình:

Trong phòng thí nghiệm: Ở số lượng nhỏ. Môi trường nhân giống được đưa tiệt trùng, sau đó cấy giống vi sinh vật vào môi trường và cho sinh trưởng ở điều kiện bình thường.

Trong phân xưởng: Ta sử dụng thiết bị lên men hình trụ, có cánh khuấy, bộ phận sục khí và lớp vỏ điều nhiệt.

Bảng 2.1: Thành phần môi trường nhân giống

Cơ chất Hàm lượngPepton 5g/lGlucose 10g/l(NH4)2SO4 5g/lMgSO4.7H2O 2g/lCaCl2.H2O 2g/lKH2PO4 1,5g/lK2HPO4 0,1g/lNước cất 1000ml


Nhiệt độ môi trường: 28 – 32oC

Độ ẩm môi trường: 60 – 65%

4. Cấy giống

Mục đích công nghệ: Chuẩn bị cho quá trình lên men thu nhận chế phẩm enzyme glucoamylase

Các biến đổi của nguyên liệu: Không có biến đổi đáng kể.

Thiết bị: Thiết bị phun bào tử vi sinh vật

Môi trường sau khi được xử lý sẽ được phân phối vào các khay rồi được đưa vào một thiết bị kín có băng tải, các khay di chuyển trên băng tải, giống được cấy vào môi trường bằng cách phun bào tử lên bề mặt môi trường nhờ hệ thống vòi phun ở phía trên.


- Tỉ lệ giống cấy: 5 – 10% v/v

26


5. Lên men

Mục đích công nghệ: Khai thác, lên men nhằm thu nhận chế phẩm enzyme glucoamylase

Các biến đổi diễn ra trong quá trình lên men:

- Sinh học: biến đổi sinh học quan trọng trong quá trình lên men là sự trao đổi chất và sự sinh trưởng của nấm mốc. Chúng sẽ tiết enzyme phân giải cơ chất trong môi trường tạo nguyên liệu phục vụ cho việc xây dựng tế bào và sản sinh năng lượng trong hoạt động trao đổi chất.

- Hóa học và hóa sinh:

- Hóa lý: một số biến đổi về pha trong quá trình lên men như sự hòa tan một phần oxy do việc sục khí và khuấy trộn canh trường, khí CO2 do vi sinh vật thải ra trong quá trình phân giải cơ chất cũng sẽ hòa tan một phần trong canh trường….

- Vật lý: sự tăng nhiệt độ canh trường do năng lượng được thải ra từ hoạt động sống của vi sinh vật, sự thay đổi về tỷ trọng, khối lượng….

Quá trình nuôi cấy nấm mốc thường kéo dài từ 35 – 48 giờ tùy thuộc vào thời gian hoàn thành việc tạo ra enzyme. Ở một số loài Aspergillus, sự tạo thành lượng enzyme tối đa sẽ trùng với sự bắt đầu tạo ra đính bào tử, do đó cho ngừng quá trình phát triển vào lúc này là thích hợp. trong một số trường hợp khác, sự tích lũy enzyme còn tiếp tục được kéo dài trong cả thời gian tạo ra đính bào tử một cách mạnh mẽ. và canh trường nấm mốc hoạt động kiểu này thường có nhiều đính bào tử. do đó khi sấy, nghiền và bao gói sẽ làm cho không khí bị nhiễm bởi đính bào tử của chủng đó. Để tránh hiện tượng này, tất cả các thiết bị phải kín và có cơ cấu hút bụi. tốt hơn cả là trong sản xuất enzyme, chọn những biến chủng tạo đính bào yếu.

Toàn bộ chu kì sinh trưởng của Aspergillus Niger trên cám có thể chia làm 3 thời kỳ:

- Trong 10 – 14 giờ đầu, xảy ra sự trương đính bào tử và bắt đầu mọc nấm. Trong thời kỳ này phòng nuôi cấy cần giữ ở nhiệt độ không dưới 28 – 300C, để không kiềm hãm sự phát triển ban đầu của chúng.

- Qua thời gian trên, hệ sợi nấm bắt đầu phát triển nhanh. Thời kỳ này kéo dài trong khoảng 14 – 18 giờ. Aspergillus niger phát triển mạnh mẽ, sử dụng một lượng lớn các chất dinh dưỡng, hô hấp rất mạnh và một lượng lớn lượng nhiệt tỏa ra nhiều. Vì vậy trong lớp canh trường nhiệt độ tăng lên đến 37 – 400C và có thể còn cao hơn tùy thuộc vào độ dày của lớp. Do đó cần phải thổi không khí điều tiết có nhiệt độ không thấp hơn 28 – 290C và có độ ẩm tương đối cực đại vào.

- Thời kỳ thứ 3 kéo dài trong 10 – 20 giờ. Trong thời kỳ này, quá trình trao đổi chất xảy ra không mạnh mẽ lắm và dần dần yếu đi, lượng nhiệt thoát ra bé hơn, nhưng sự tạo thành

27


enzyme có thể còn xảy ra. Phụ thuộc vào tính chất sinh lý của chúng và sự kết thúc sinh tổng hợp enzyme, mà có thể làm ngừng sự phát triển của Aspergillus niger vào một thời gian bất kỳ.

Hình 2.2: Mối quan hệ giữa thời gian nuôi cấy và hoạt độ enzyme

Thiết bị: Sử dụng buồng nuôi cấy bề mặt

Hình 2.3: Buồng nuôi cấy bề mặt

1. Giá để khay 2. Van hơi nóng để điều hoà nhiệt độ

28


Thời gian (h)


3. Hệ thống phun nước thành bụi

4. Quạt

5. Lọc khí

6. Đường thông khí vào

7. Đường thông khí ra


Buồng nuôi cấy là buồng kín có kích thước 10000×2800×2100 mm với hai cửa, một cửa nối với hành lang thải liệu. Bên trong phòng có ba đoạn ống thông khí để nạp không khí điều hoà từ một hướng, còn từ hướng ngược lại – các ống để thải không khí trong phòng. Diện tích của phòng được tính cho 18 – 20 giàn có khoảng 9 – 10 khay cho mỗi bên. Khoảng cách giữa các giàn 80 – 100 mm, giữa các giàn có khoảng cách rộng 1000 – 1200 mm để đi lại và cách tường 200 – 300 mm.

Các bộ điều hoà độc lập được phân bổ trên các phòng tiệt trùng nhằm để đẩy không khí có nhiệt độ 22 – 320C, độ ẩm tương đối 96 – 98% vào phòng. Không khí tuần hoàn có bổ sung 10% không khí sạch từ bộ điều hoà chính, các hành lang nạp và tháo của các phòng cần phải cách ly các phòng bên cạnh. Điều đó thực hiện được nhờ thông gió hai chiều khi trao đổi không khí nhiều lần (đến 8 lần) và nhờ làm sạch không khí thải khỏi các bào tử.

6. Nghiền

Mục đích công nghệ: chuẩn bị cho quá trình trích ly

Quá trình nghiền làm cho nguyên liệu như cám mì, cám trở nên tơi xốp hơn, làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc và tăng hiệu quả sử dụng cơ chất, đồng đều về kích thước và dễ phối trộn. Ở đây, do cám mì và cám gạo đã ở sẵn dạng bột, ta có thể bỏ qua quá trình nghiền, tuy nhiên nếu nguyên liệu xuất hiện nhiều hạt kích thước lớn do vón cục bởi độ ẩm, ta sẽ phải cho nguyên liệu qua máy nghiền.

Các biến đổi của nguyên liệu:

Vật lí: quan trọng nhất trong quá trình nghiền là kích thước nguyên liệu sẽ giảm, diện tích bề mặt riêng tăng lên. Việc tăng diện tích bề mặt riêng có thể là tăng hiệu quả của quá trình truyền nhiệt và truyền khối. Trong quá trình nghiền, dưới tác dụng của các lực, nhiệt độ của vật liệu sẽ tăng lên, chủ yếu do lực ma sát.

Hóa học: Khi nghiền vật liệu, cấu trúc của vật liệu bị phá vỡ, các thành phần dễ bị oxy hóa trong vật liệu như các acid béo, vitamin,... sẽ có điều kiện tiếp xúc với oxy, do đó các phản ứng oxy hóa sẽ xảy ra, làm giảm giá trị dinh dưỡng của môi trường. Ngoài ra, còn có một số phản ứng hóa học khác diễn ra trong quá trình nghiền do nhiệt sinh ra thúc đẩy các phản ứng hóa học dễ xảy ra hơn.

29


Hóa lí: diện tích bề mặt riêng tăng và nhiệt độ tăng nên tốc độ bay hơi tăng, tổn thất các cấu tử dễ bay hơi. Ngoài ra, việc tăng diện tích bề mặt sẽ làm tăng quá trình hút ẩm của nguyên liệu và việc tăng nhiệt độ có thể làm đông tụ protein.

Sinh học: khi nghiền vật liệu, dưới tác dụng của lực cơ học, vi sinh vật có thể bị tiêu diệt nhưng mức độ không đáng kể. Sau khi nghiền, diện tích bề mặt riêng tăng, mật độ vi sinh vật có thể tăng lên. Đồng thời, các thành phần dinh dưỡng thích hợp của vi sinh vật bên trong nguyên liệu có thể thoát ra bề mặt, làm vi sinh vật phát triền mạnh hơn. Sự phát triển của vi sinh vật có thể làm giảm chất lượng môi trường, ảnh hưởng đến chế độ thanh trùng.

Hóa sinh: các phản ứng oxy hóa được xúc tác bởi enzyme sẽ diễn ra mạnh hơn do tiếp xúc với oxy nhiều hơn.

Thiết bị:

Hình 2.4: Thiết bị nghiền dĩa dạng pin-disc

Đây là 1 dạng của thiết bị nghiền dĩa. Cấu tạo bao gồm 1 dĩa quay và 1 dĩa cố định. Trên mỗi dĩa có các rảnh sâu và các rãnh này ăn khớp với nhau. Hình dạng của các đường gân do rãnh tạo thành có thể khác nhau, tròn, vuông hoặc dạng lưỡi dao. Tốc độ có thể đạt 10.000rpm. Thiết bị có thể có thêm lớp vỏ áo để giải nhiệt.


30


Kích thước vật liệu vào: 4 – 7m

Kính thước vật liệu ra:

Vận tốc lưỡi dao: 5000 – 7000rpm

7. Trích li

Mục đích công nghệ: Khai thác, dùng nước để chiết rút enzyme glucoamylase trong canh trường


- Vật lí: sự khuyết tán các phân tử chất tan từ tâm của nguyên liệu đến vùng bề mặt và dịch chuyển từ vùng bề mặt nguyên liệu vào dung môi (nước). Động lực của sự khuyếch tán là do chênh lệch nồng độ.

- Hóa học: các phản ứng hóa học giữa các cấu tử nhưng không đáng kể do trích ly ở nhiệt độ thường.

- Hóa lí: sự hòa tan các các enzyme và các cấu tử khác vào tan vào nước.

- Hóa sinh: trích ly ở nhiệt độ thường các enzyme trong canh trường sẽ xúc tác phản ứng chuyển hóa cơ chất từ nguyên liệu.

- Sinh học: Thời gian trích ly kéo dài vi sinh vật sẽ phát triển.

Thiết bị: Thiết bị trích ly 1 bậc

Hình 2.5: Thiết bị trích li 1 bậc

Nguyên lý hoạt động:

31


Thiết bị là bể hình trụ đứng, phía bên dưới có một đáy lưới. Người ta sẽ cho nguyên liệu cần trích ly vào thiết bị qua cửa đỉnh. Dung môi sẽ được bơm vào thiết bị qua hệ thống phân phối vào phía dưới đỉnh. Dung môi sẽ được chảy qua lớp nguyên liệu từ trên xuống dưới. Dịch trích được tháo ra ngoài qua của đáy. Dịch trích được hồi lưu lại nhờ vào đường ống dẫn và bơm ở gần cửa đáy.

Để tránh vi sinh vật nhiễm cần thêm vào nước một ít formalin hoặc chất sát trùng khác. Dịch chiết rút đựơc thường trong suốt có màu xám và chứa từ 10 – 15 % chất khô và tất cả các enzyme của nấm mốc.

Dịch chiết được lọc và thu lại trong bình thu rồi được làm lạnh về nhiệt độ 10 – 120C


- Nhiệt độ: tnước = 25 – 280C

- Tỉ lệ nguyên liệu/dung môi (nước) = 1/2 (v/v)

8. Li tâm

Mục đích công nghệ:

Khai thác: Tách sinh khối ra khỏi dung dịch sau trích ly.

Những biến đổi trong quá trình ly tâm

Biến đổi vật lý: Khối lượng giảm dung dịch giảm, nồng độ cấu tử hòa tan tăng

Biến đổi hóa lý: Tách pha.

32


Hình 2.6: Thiết bị ly tâm dạng dĩa

a) Đĩa ly tâm 1. Đĩa ly tâm 2. Kênh thoát cho chất lỏng có tỷ trọng thấp3. Lổ biên 4. Cửa vào cho nguyên liệu

b) Sơ đồ chuyển động giữa các dòng 1. Chất lỏng tỉ trọng thấp2. Chất lỏng tỉ trọng cao3. Dĩa

33


Nhập liệu được phân phối vào ở đáy chén xoay, theo các kênh được tạo thành bởi các lỗ, đi vào khoảng trống giữa các dĩa, tại các khoảng trống này, dưới tác dụng của lực ly tâm, pha nặng sẽ di chuyển ra xa tâm của dĩa. Còn pha nhẹ sẽ di chuyển vào gần tâm của dĩa và được đẩy lên đỉnh của chén xoay để thu hồi. Trong thiết bị này, khoảng các di chuyển của chất lỏng là ngắn hơn so với thiết bị ly tâm ống. ngoài ra trong thiết bị này còn diễn ra quá trình trượt giữa 2 lớp chất lỏng trong quá trình ly tâm, góp phần phá vỡ hệ nhũ tương.

Thông số công nghệ

Nhiệt độ : 15 – 20 oC

- Thời gian : 4 – 5 phút

9. Siêu lọc UF

Mục đích công nghệ:

- Chuẩn bị: Dịch thu được sau khi phân riêng bằng membrane đã được tách một phần nước (cô đặc) chuẩn bị cho quá trình sắc ký trao đổi ion.

- Khai thác: Sau quá trình phân riêng, nồng độ enzyme trong dung dịch sẽ tăng.


- Vật lí: nhiệt độ tăng ít, sau phân riêng độ nhớt, tỷ trọng, độ đục…của hai pha (permeate và retentate) sẽ thay đổi.

- Hóa học: không có biến đổi đáng kể nhưng nồng độ các chất sẽ thay đổi.

- Hóa lí: có sự phân riêng thành hai pha lỏng nhưng không có sự chuyển pha.

- Hóa sinh: các phản ứng thủy phân do xúc tác của hệ enzyme thủy phân: cellulase, amylase, protease,… tiếp tục xảy ra vì vẫn còn cơ chất trong dung dịch.

- Sinh học: không có biến đổi đáng kể.

Thiết bị: Thiết bị mô hình sợi (Hollow fiber module) sử dụng màng siêu lọc (UF)

Hình 2.7: sợi sử dụng trong màng siêu lọc

Cấu tạo:

Thiết bị có dạng hình trụ, bên trong chứa rất nhiều sợi membran xếp song song với nhau, đường kính ngoài 1,6m. Màng lọc đóng vai trò như vật liệu lọc cao cấp với nhiều kích cỡ lỗ màng, từ 0,01µm đến 0,1µm. Kích thước lỗ màng bé có khả năng giữ lại được tất cả những vật chất cần loại bỏ trong nguồn nước, các phần tử có kích thước lớn hơn 0,01 microns.

Trong thiết bị không có khung đỡ. Trong quá trình hoạt động, dung dịch nguyên liệu được bơm vào bên trong các sợi membrane từ một phía, đầu còn lại của các sợi membrane là chỗ thoát của các ratentate. Một số cấu tử sẽ chui qua phần thân của các sợi membrane để tạo ra dòng permeate rồi thoát ra bên ngoài thiết bị hình trụ

Hình 2.7: Thiết bị phân riêng bằng mô hình sợi


Ultra Filtration(UF) là một công nghệ lọc dùng màng áp suất thấp để loại bỏ những phân tử có kích thuớc lớn ra khỏi nguồn nước. Dưới một áp suất không quá 2,5 bars, nước, muối khoáng và các phân tử/ ion nhỏ hơn lỗ lọc (0.01- 0.005 micron) sẽ “chui” qua màng dễ dàng. Các phân tử có lớn hơn, các loại virus, vi khuẩn sẽ bị giữ lại và thải xả ra ngoài.Màng lọc Ultrafiltration có thể hoạt động theo 2 nguyên lý:

Từ ngoài vào trong: Lớp lọc nằm bên ngoài màng. Dòng nước có chất ô nhiễm được đẩy vào từ bên ngoài màng lọc. Nước sạch sau lọc được thu ở bên trong màng lọc

Từ trong ra ngoài: Lớp lọc nằm bên trong màng. Dòng nước có chất ô nhiễm được châm vào từ bên trong màng lọc. Nước sạch sau lọc được thu ở bên ngoài màng lọc

Hình 2.8: Cơ chế thẩm thấu trong màng lọc

Thông số kỹ thuật:

Nhiệt độ làm việc: 28-30oC

Dải pH làm việc: 2~13

Khả năng chịu Clo: 100ppm

Hàm lượng Clo quá mức: 200ppm

Ap lực làm việc lớn nhất: 0.25 Mpa

Độ đục sau lọc < 0.1NTU

Loại bỏ tạp chất:100%

10. Sấy thăng hoa

Mục đích:

- Chế biến: quá trình sấy sẽ tách bớt nước ra khỏi bán thành phẩm, chuyển nguyên liệu sang dạng rắn, làm thay đổi sâu sắc các tính chất vất lí và hóa lí của bán thành phẩm.

- Bảo quản: quá trình sấy làm giảm giá trị hoạt độ của nước, ức chế hoạt động của enzyme, chế phẩm enzyme không bị biến đổi trong quá trình bảo quản.


- Vật lí: Nhiệt độ nguyên liệu giảm, các tính chất vật lí của nguyên liệu như hình dạng, kích thước, khối lượng, tỉ trọng, độ giòn,… sẽ thay đổi. Sự khuếch tán ẩm sẽ xảy ra do sự chênh lệch ẩm tại các vùng khác nhau ở bên trong nguyên liệu.

- Hóa học: không có biến đổi đáng kể.

- Hóa lí: biến đổi hóa lí quan trọng nhất là sự chuyển pha của nước từ lỏng thành rắn và từ rắn thành hơi. Ngoài ra, sự giảm nhiệt độ trong quá trình sấy có thể làm biến tính một phần protein (trong đó có enzyme).

- Sinh học: không có biến đổi đáng kể.

- Hóa sinh: không có biến đổi đáng kể.

Thiết bị: thiết bị sấy thăng hoa

Hình 2.9: Thiết bị sấy thăng hoa liên tục

Hình 2.10: Các bộ phận cơ bản của thiết bị sấy thăng hoa

Hình 2.11: Cấu tạo bình ngưng tụ đóng băng

Hình 2.12: nguyên lí cấu tạo và hoạt động của buồng sấy thăng hoa

Thiết bị sấy thăng hoa gồm hai bộ phận chính như sau:

Hệ thống lạnh đông: để chuyển phần ẩm có trong nguyên liệu cần sấy sang trạng thái rắn.

Buồng sấy thăng hoa: để tách ẩm và chuyển ẩm từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi.

Nguyên liệu được lạnh đông thông qua tiếp xúc với khí lạnh. Thực tế cho thấy, trong quá trình lạnh đông nguyên liệu, chúng ta không thể chuyển hóa toàn bộ lượng ẩm trong trong nguyên liệu sang dạng rắn, do đó sẽ còn một phần ẩm ở dạng lỏng trong nguyên liệu sau giai đoạn lạnh đông. Buồng sấy thăng hoa có dạng hình trụ kín, nằm ngang hoặc thẳng đứng. Nguyên liệu sau giai đoạn lạnh đông sẽ được vào buổng sấy thăng hoa. Nguyên liệu được gia nhiệt bằng phương pháp bức xạ.

Ngoài bộ phận gia nhiệt, buồng sấy thăng hoa sẽ được kết nối với hệ thống tạo chân không. Hệ thống này gồm có bộ phận nhưng tụ hơi nước (hơi thoát ra từ nguyên liệu cần sấy) và bơm chân không để tách các cấu tử dễ bay hơi và những khí không ngưng khác.

Quá trình sấy thăng hoa thường gồm ba giai đoạn:

Giai đoạn 1: lạnh đông nguyên liệu để chuyển một phần nước trong nguyên liệu sang dạng rắn. Do nhiệt độ trong bình thăng hoa rất thấp và áp suất chân không rất lớn nên sự truyền nhiệt giữa các thành hộp chứa nước nóng và vật liệu sấy chủ yếu là bức xạ nhiệt

Giai đoạn 2: tạo áp suất chân không rồi gia nhiệt nguyên liệu đã lạnh đông trong buồng sấy để thăng hoa. Hơi nước được làm lạnh và bám vào thành bình, còn không khí khô được thải vào khí quyển.

Giai đoạn 3: do trong giai đoạn lạnh đông, chúng ta không thể chuyển toàn bộ lượng nước trong nguyên liệu sang dạng rắn nên sau giai đoạn sấy thăng hoa là giai đoạn sấy chân không để tách thêm một phần ẩm ở dạng lỏng trong nguyên liệu, đảm bảo độ ẩm của nguyên liệu sau quá trình sấy sẽ đạt giá trị yêu cầu.

Ap suất sử dụng trong quá trình sấy thăng hoa thường dao động trong khoảng 27 – 133 Pa.

Ưu điểm lớn của phương pháp sấy thăng hoa là không làm tổn thất các cấu tử mẫn cảm với nhiệt như: vitaimin, các chất có hoạt tính sinh học,…Tuy nhiên, phương pháp sấy thăng hoa tốn kém chi phí đầu tư trang thiết bị và năng lượng. Trong công nghiệp thực phẩm, thiết bị sấy thăng hoa được sử dụng để sấy các chế phẩm vi sinh vật, enzyme hoặc những sản phẩm giàu các hợp chất có hoạt tính sinh học.


Ap suất trong bình thăng hoa : 27-133 Pa

Nhiệt độ: không quá 40-50oC

Độ ẩm nguyên liệu: tùy từng loại nguyên liệu

11. Phối trộn

Mục đích:

Hoàn thiện: giai đoạn này ta trộn các chất bảo quản và chất ổn định hoạt tính enzyme vào để bảo quản và hoàn thiện sản phẩm.


Vật lí: nhiệt độ tăng nhẹ do ma sát.

Hóa học, hóa lí, hóa sinh, sinh học: không có biến đổi đáng kể.

Thiết bị: Thiết bị trộn bột khô hình chữ V.

Hình 2.13: Thiết bị trộn bột khô hình chữ V

Máy bao gồm hai trụ hình V có độ cao khác nhau. Trong suốt quá trình chuyển động của nguyên vật liệu trong ống hình trụ, nguyên liệu được thay đổi và lặp đi lặp lại bằng cách đó sẽ đạt hiệu quả trộn sẽ rất đều nhau.


Nhiệt độ: nhiệt độ thường

Thời gian trộn: 10 – 15 phút

Tốc độ quay: 15 vòng/phút

Tỉ lệ phối trộn

12. Đóng gói

Mục đích: hoàn thiện sản phẩm, dễ dàng trong bảo quản và vận chuyển, thương mại

Các biến đổi của nguyên liệu: hầu như không đáng kể

Thiết bị: thiết bị đóng gói dạng bột, hạt rời.

Hình 2.14: Thiết bị đóng gói dạng bột, hạt rời.

III. Sản phẩm

1. Mô tả sản phẩm và chỉ tiêu chất lượng sản phẩm

Hình 3.1: Chế phẩm glucoamylase dạng rắn

Chế phẩm glucoamylase được phân thành hai loại: dạng lỏng và dạng rắn.

Mô tả chế phẩm enzyme dạng rắn

Chỉ tiêu vật lý:

- Trạng thái vật lý: rắn.

- Nhiệt độ hoạt động tối ưu: 58 – 600C.

Chỉ tiêu hóa học: pH hoạt động tối ưu: 4

Chỉ tiêu hóa sinh: 150,000 U/g.

Các thông tin khác: 20 kg/túi.

Phạm vi sử dụng: là tác nhân đường hóa trong quá trình sản xuất cồn, rượu bia, calci lactate.

2. Các phương pháp bảo quản enzyme glucoamylase

Enzyme có bản chát là protein thường bị biến tính khi ở điều kiện nhiệt độ, pH, nồng độ

dung dịch đệm không thích hợp. Điều kiện bảo quản tối ưu mỗi loại protein là khác nhau. Tuy

nhiên có một vài nguyên tắc để bảo quản protein được tóm tắt và so sánh ở bảng sau

Bảng 3.1: Điều kiện bảo quản enzyme

Nhìn chung các protein được bảo quản tốt nhất ở ≤ 4oC nhưng chỉ giữ được hoạt tính

trong vài ngày hoặc vài tuần. Việc bảo quản ở nhiệt độ phòng sẽ làm giảm hay mất hoạt tính,

thường do bị nhiễm vi khuẩn.

Phương pháp đông khô cho phép kéo dài thời gian bảo quản mà gần như không bị biến

tính, nhưng protein có thể bị hư hỏng một phần trong quá trình đông khô. Để giảm khả năng bất

hoạt và mất hoạt tính nêu trên đặc biệt là khi đông khô dịch có nồng độ protein loãng

(< 1mg/ml). Người ta thường bổ sung thêm protein chất mang như huyết thanh bò tinh khiết

(BSA) nồng độ từ 1 – 5mg/ml (0.1 – 0.5%), vào trong dung dịch protein loãng

Ngoài ra còn có rất nhiều chất phụ gia khác cũng được bổ sung vào dịch protein để kéo

dài họat tính bảo quản:

- Glycerol hay ethylene glycol với nồng độ không đổi khoảng 25 – 50% giúp ổn định

protein, ngăn chặn sự tinh thể hóa làm phá hủy cấu trúc protein ở – 20oC

- Chất ức chế protease ngăn chặn sự phân hủy protein

- Tác nhân chống vi khuẩn như sodium azide (NaN3) ở nồng độ 0.02 – 0.05% (w/v) hay

thimerosal.

- Chất tạo phức càng cua như EDTA ở nồng độ 1 – 5 mM, tránh gây ra sự oxi hóa nhóm

S – H giúp protein duy trì trạng thái khử

- Tác nhân khử như dithiothreitol (DTT) và 2 – mercatoethanol (2 – ME) ở nồng độ giúp

ngăn chặn trạng thái oxi hóa của nhóm cysteine, duy trì trạng thái khử của protein.

Tài liệu tham khảo

1. Lê Văn Việt Mẫn, Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất bản đại học quốc gia Tp. Hồ

Chí Minh, 2010.

2. Lê Ngọc Tú và cộng sự, Hóa sinh cộng nghiệp, Nhà xuất bản khoa học kỹ thuật Hà Nội,

2004, 443 trang

3. Nguyễn Đức Lượng, Vi sinh vật học công nghiệp, tập 1, 2, Nhà xuất bản Đại học Quốc

gia thành phố Hồ Chí Minh, 2002.

4. Nguyễn Thị Lệ Ngọc, Nghiên cứu Các điều kiện tối ưu cho hoạt động của enzyme glucoamylase từ một số chủng nấm mốc và ứng dụng, Tp.Hồ Chí Minh, 2010

5. Hoàng Bá Thanh Hải, Nghiên cứu sự tổng hợp các đặc tính và ứng dụng của enzym

glucoamylase ở dạng hòa tan và dạng cố định thu nhận từ canh trường một số chủng nấm

mốc, Tp.Hồ Chí Minh, 2010

6. PGS.TSKH Lê Văn Hoàng, Các Quá Trình Và Thiết Bị Công Nghệ Sinh Học Trong Công Nghiệp, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, 356 trang

http://khotailieu.com/tai-lieu/ky-thuat-cong-nghe/cong-nghe-thuc-pham/nghien-cuu-cac-dieu-kien-toi-uu-cho-hoat-dong-cua-enzyme-glucoamylase-trong-quy-trinh-san-xuat-ruou-nep.html

http://khotailieu.com/tai-lieu/ky-thuat-cong-nghe/cong-nghe-thuc-pham/nghien-cuu-cac-dieu-kien-toi-uu-cho-hoat-dong-cua-enzyme-glucoamylase-trong-quy-trinh-san-xuat-ruou-nep.html

mục lục - tỉnh giấc · web viewhóa học: các phản ứng hóa học xảy ra dưới...

Documents