metode acth, joshua sinambela
DESCRIPTION
Metode kimia 2TRANSCRIPT
METODE KIMIA KLINIK
TAHAP DASAR I : ORIENTASI
PEMERIKSAAN ADRENOCORTICOTROPIC HORMONE (ACTH)
METODE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
Presentan : Josua Sinambela
Pembimbing : M.I. Diah Pramudianti, dr.,SpPK (K), M.Sc
Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik
Fakultas Kedokteran Universitas Sebelas Maret
Surakarta
2014
1
Lembar Pengesahan
PEMERIKSAAN ADRENOCORTICOTROPIC HORMONE (ACTH)
METODE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
Tinjauan Pustaka
Metode Stase Orientasi Kimia Klinik
Dipersiapkan dan disusun oleh
Josua Sinambela, dr
Dipresentasikan pada tanggal
Telah diperiksa dan disetujui oleh Pembimbing:
M.I. Diah Pramudianti , dr.,SpPK (K), M.Sc
NIK. 19760906 201104 2 008 K
Mengetahui
Kepala Bagian Patologi Klinik/Ketua Program Studi Patologi Klinik
Fakultas Kedokteran UNS
Tahono, dr., Sp . PK (K)
NIP 19491112 197609 1 001
i
DAFTAR ISI
Halaman
Halaman Judul…………………………………..……………….…………....Lembar Pengesahan…………………………………………………………...Daftar Isi …………………………………………………………………..….Daftar Gambar …………………………………………………………..……Daftar Tabel…………………………………………………………………...BAB I. PENDAHULUAN………………………………...............................BAB II. PEMERIKSAAN ADRENOCOTICOTROPIC HORMONE (ACTH)
METODE ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)………...….….......................................................................
A. Pra Analitik………………………………………………………..1. Tujuan…………………………………………………………..2. Alat dan Bahan ..………………………..…………....................3. Persiapan Reagen..……………………………………………..
B. Analitik ……………………………………...…….………………1. Persiapan Sampel…………………………………………….....2. Prosedur Pemeriksaan …………….….………………………..
C. Paska Analitik ………………………......………………...............1. Nilai yang Diharapkan.………………………………….…….2. Presisi..…………………………………………..……………..3. Batasan Deteksi (Sensitifitas Analitik) ……………..…………4. Spesifisitas Analitik (Interferensi)…..………………………...5. High Dose Hook Effect………………………………………..6. Linearitas………………………………………………………
BAB III. SIMPULAN ………………………………………………...............Daftar Pustaka ………………………………………………………...............
iii
iiiiv1
44447889
101011121212121415
ii
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1.Gambar 2.Gambar 3.Gambar 4.Gambar 5.Gambar 6.
Aksis Hypothalamic-Pituitary-Adrenal……….….…………... Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Reader….....
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Washer….....Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Kit…………..Prinsip Pemeriksaan ACTH Metode ELISA…………………Kurva Standar ACTH ELISA ………………………………..
2445
1011
iii
DAFTAR TABEL
Halaman
Tabel 1.Tabel 2.Tabel 3.
Tabel 4.Tabel 5.Tabel 6.Tabel 7.Tabel 8.Tabel 9.Tabel 10.
Penyakit yang Berkaitan dengan Kadar ACTH Abnormal………Perbandingan antara metode RIA dan ELISA…………………Hubungan antara Strip yang Digunakan dan Campuran Antibodi………………………………………………..............Konfigurasi Tes…………………………………..………………Contoh Data Absorbance ELISA ACTH…………………………Presisi Intra Assay ACTH…….………..…………………………..Presisi Inter Assay ACTH……………………………………….Linearitas ACTH………………………………..…………………..Persentase Nilai Recovery ACTH……………………………….Spike dan Recovery ACTH……………………………………………
23
88
111212121313
iv
v
BAB I
PENDAHULUAN
Adrenocorticotropic hormone (ACTH) merupakan hormon polipeptida
yang disekresikan oleh kelenjar pituitary anterior dengan fungsi utama
menstimulasi sintesa dan pelepasan glukokortikoid dari lapisan fasciculata
korteks adrenal. Adrenocorticotropic hormone merupakan komponen penting
dalam aksis hypothalamic-pituitary-adrenal. Bekerja dengan cara berikatan pada
permukaan sel reseptor yang terletak pada sel adrenocortical korteks adrenal
(Kaplan et al., 2010).
Adrenocorticotropic hormone (39 amino acids) berasal dari protein
proopiomelanocortin (POMC) di dalam sel corticotrope. Selain ACTH, POMC
juga menghasilkan beberapa peptida lain termasuk β lipotropin, β endorphin, met-
enkephalin, α melanocyte stimulating hormone (α MSH), dan corticotropin like
intermediate lobe protein (CLIP). Gen POMC distimulasi oleh corticotropin
releasing hormone (CRH), arginine vasopressin (AVP), sitokin pro inflammation
seperti interleukin 6 maupun leukemia inhibitory factor dan diinhibisi oleh
glukokortikoid itu sendiri. Corticotropin releasing hormone (41 amino acid
hypothalamic peptide) yang disintesa di dalam nukleus paraventricular
merupakan stimulator utama sintesa dan pelepasan ACTH. Adrenocorticotropic
hormone memiliki berat molekul 4540 dalton. Sekresi ACTH bersifat pulsatil dan
menunjukkan karakteristik circadian rhythm, mencapai kadar puncak pada pukul
6 pagi dan kadar terendah pada tengah malam. Waktu paruh ACTH di dalam
darah cukup singkat yakni kurang dari 10 menit dan didegradasi di hati dan
diekskresikan melalui ginjal. Konsentrasi ACTH meningkat oleh AVP, stres fisik,
latihan, penyakit akut, dan hipoglikemi yang distimulasi insulin. Hilangnya
umpan balik cortisol seperti pada gagal ginjal primer, tampak pada peningkatan
kadar ACTH yang sangat ekstrim (Larry, 2010).
Steroid ini terlibat dalam pengaturan metabolisme karbohidrat, protein,
dan lemak. Hormon ini penting bagi kehidupan manusia terutama ketika
berhadapan dengan stress biologis seperti tindakan operasi, sakit berat, maupun
1
trauma berat, sekresi cortisol akan meningkat dari 25 mg/hari menjadi 200 sampai
300 mg/hari. Jika cortisol tidak dikeluarkan dalam jumlah yang memadai, pasien
mungkin akan meninggal karena kolapsnya pembuluh darah. Sejumlah besar
glukokortikoid juga memiliki efek anti inflamasi dan imunosupresi (Kaplan et al.,
2010).
Gambar 1. Aksis hypothalamic-pituitary-adrenal (Anonim, 2010)
Beberapa penyakit yang yang berkaitan dengan kadar ACTH yang
abnormal dapat dilihat pada tabel di bawah,
Tabel 1. Penyakit yang berkaitan dengan kadar ACTH abnormal (Kaplan et al., 2010).
Meningkat MenurunAddison’s diseases or primary adrenal
insufficiencyHipopituarism and/or secondary adrenal
insufficiencyCongenital adrenal hyperplasia Adrenal gland tumor
Cushing’s disease Other tumor that produce cortisolMultiple endocrine neoplasia
Gold standard untuk pemeriksaan ACTH adalah dengan menggunakan
metode radio immune assay (RIA). Namun dalam pemeriksaan ACTH ini
menggunakan metode enzime linked immunosorbent assay (ELISA).
2
Perbandingan antara metode RIA dan ELISA dapat dilihat pada tabel di
bawah.
Tabel 2. Perbandingan antara metode RIA dan ELISA dalam mengukur kadar serum ACTH (Unnikrishnan, 2006).
RIA ELISASangat spesifik dan sangat sensitif Sensitif
Menggunakan radio isotop Menggunakan enzimBahan tidak stabil Lebih stabilLebih berbahaya Lebih aman
Lebih mahal Relatif lebih murahMenggunakan alat pemecah radioaktif
gamma (laboratorium lengkap)Dapat dikerjakan di laboratorium kecil
Berisiko tinggi Risiko lebih rendahKalibrasi yang lama (berhari-hari) Kalibrasi dalam waktu lebih singkat
Tidak praktis Lebih praktis
3
BAB II
PEMERIKSAAN ADRENOCORTICOTROPIC HORMONE (ACTH)
METODE ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA)
A. Pra analitik (Anonim, 2011)
1. Tujuan
Pemeriksaan ini bertujuan untuk mengukur secara kuantitatif ACTH
dalam plasma ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA) yang berguna
dalam mendeteksi peningkatan dan penurunan konsentrasi ACTH
dengan metode ELISA (two-site sandwich technique) menggunakan
antibodi spesifik yang berikatan dengan terminal N dan terminal C
epitope ACTH.
2. Alat dan Bahan
a. Alat
Gambar 2. ELISA Reader (Anonim, 2010)
Gambar 3. ELISA Washer (Anonim, 2010)
4
Gambar 4. ELISA kit (Anonim, 2011)
b. Bahan (Anonim, 2011)
1) Sampel
Sampel yang digunakan adalah plasma dengan antikoagulan
EDTA. Sampel serum tidak dianjurkan karena ACTH tidak stabil
dalam serum.
2) Kit dan Reagen (Anonim, 2011)
ELISA ACTH reagen kit:
a. Anti ACTH antibody coated microplate
Satu microplate dengan 12 x 8 strips (total 96 sumuran)
yang telah dilapisi dengan antibodi monoclonal antihuman
ACTH. Reagen ini harus disimpan pada suhu 2-8°C dan
stabil sampai tanggal kadaluarsa yang tertera pada ACTH
ELISA assay kit.
b. Horse radish peroxidase (HRP) conjugated anti ACTH
antibody
Setiap vial mengandung 0,25 mL HRP yang telah diberi
label antibodi anti human ACTH dalam matriks protein
stabil.
c. Enzyme linked immunosorbent assay wash concentrate
Setiap botol mengandung 30 mL dari 30 fold concentrate.
Larutan pencuci yang telah diencerkan ini harus disimpan
pada suhu ruangan dan akan stabil sampai masa
kadaluarsanya.
5
d. Enzyme linked immunosorbent assay HRP substrate
Setiap botol mengandung 25 mL tetramethylbenzidine
(TMB) hidrogen peroksida. Reagen ini harus disimpan pada
suhu 2-8°C, dan stabil sampai masa kadaluarsanya.
e. Stop solution ELISA
Setiap botol mengandung 12 mL stop solution. Reagen ini
harus disimpan pada suhu 2-8°C, dan stabil sampai masa
kadaluarsanya.
f. Human ACTH standard
6 vial mengandung ACTH manusia dalam serum lyophilized
bovine based matrix dengan non azide, non mercury
preservative. Standar ini harus disimpan pada suhu 2-8°C,
dan stabil sampai masa kadaluarsanya. Untuk
pengencerannya mengikuti prosedur yang telah ditentukan.
g. Enzyme linked immunosorbent assay controls
2 vial mengandung ACTH manusia dalam lyophilized bovine
serum based matrix non azide preservative. Kontrol ini
harus disimpan pada suhu 2-8°C dan stabil sampai masa
kadaluarsanya. Untuk pengencerannya mengikuti prosedur
yang telah ditentukan.
h. Tracer antibody diluents
Satu vial mengandung 5 mL buffer yang siap digunakan.
Hanya digunakan untuk tracer antibody dilution sesuai
prosedur yang telah ditentukan. Reagen ini harus disimpan
pada suhu 2-8°C, dan stabil sampai masa kadaluarsanya.
Untuk pengencerannya mengikuti prosedur yang telah
ditentukan.
Material lain yang dibutuhkan namun tidak disediakan dalam kit: Precision single channel pipettes capable of delivering
25µL, 200µL, dan seterusnya.
6
Disposable pipette tips suitable for above volume
dispensing.
Aluminum foil.
Deionized or distilled water
Plastic microtiter well cover or polyethylene film.
Enzyme linked immune sorbent assay multi channel washes
bottle atau automatic (semi automatic) washing system.
Spectrophotometric microplate reader capable of reading
absorbance at 450/650 nm. (Anonim, 2011).
3. Persiapan reagen (Anonim, 2011)
a. Sebelum digunakan, semua reagen harus dibiarkan dalam suhu
ruangan. Reagen yang berasal dari nomor lot yang berbeda tidak
dapat digunakan atau dikombinasikan.
b. Konsentrat pencuci ELISA harus dilarutkan dengan 870 mL air
yang telah didemineralisasi, sehingga menghasilkan larutan
pencuci yang mengandung surfaktan dalam phosphate buffer
saline non azide, non mercury preservative.
c. Campurkan standard assay dan kontrol dengan menambahkan
2,0 mL air yang telah didemineralisasi pada tiap botol standar
dan kontrol. Biarkan standar dan kontrol selama 5 menit, lalu
dicampur dengan cara membalikkan atau dengan memutar secara
hati-hati. Harus dipastikan bahwa seluruh serbuk padat telah
larut sebelum digunakan. Standar dan kontrol yang telah
dilarutkan dapat disimpan pada suhu 2-8°C selama 24 jam atau
pada suhu -10°C bila ingin disimpan dalam waktu yang lama.
Hindari lebih dari 3 siklus beku.
d. Siapkan larutan tracer antibody pengenceran 1:21 dengan
menambahkan tracer antibody diluents. Harus dingat agar tracer
antibody disiapkan sesaat sebelum memulai tes.
Berikut adalah tabel hubungan antara strip yang digunakan dan
campuran antibodi yang digunakan.
7
Tabel 3. Hubungan antara strip yang digunakan dengan campuran antibodi (Anonim, 2011).
Dilution Scheme Tracer AntibodyDiluen
t
Tracer Antibody
1 0,4 mL 20 µL2 0,8 mL 40 µL3 1,2 mL 60 µL4 1,6 mL 80 µL5 2,0 mL 100 µL6 2,4 mL 120 µL7 2,8 mL 140 µL8 3,2 mL 160 µL9 3,6 mL 180 µL10 4,0 mL 200 µL11 4,4 mL 220 µL12 4,8 mL 240 µL
e. Persiapkan Anti ACTH antibody coated microplate untuk human
ACTH standard, kontrol dan sampel dengan cara duplikasi.
f. Konfigurasi tes.
Tabel 4. Konfigurasi tes (Anonim, 2011).ROW STRIP 1 STRIP 2 STRIP 3 STRIP 4A STD 1 STD 5 SAMPLE 1 SAMPLE 5B STD 1 STD 5 SAMPLE 1 SAMPLE 5C STD 2 STD 6 SAMPLE 2 SAMPLE 6D STD 2 STD 6 SAMPLE 2 SAMPLE 6E STD 3 C 1 SAMPLE 3F STD 3 C 1 SAMPLE 3G STD 4 C 2 SAMPLE 4H STD 4 C 2 SAMPLE 4
B. Analitik
1. Persiapan sampel (Anonim, 2011)
Sampel yang digunakan adalah plasma dengan antikoagulan EDTA.
Sirkulasi ACTH dipengaruhi oleh circadian rhythm, maka
direkomendasikan untuk mengumpulkan sampel pada pagi hari sebelum
pukul 8 pagi. Pasien tidak diperbolehkan mengkonsumsi steroid sebelum
pemeriksaan darah. Plasma EDTA merupakan sampel yang sesuai untuk
pengukuran kadar ACTH. Sebanyak 0,4 mL plasma EDTA dibutuhkan
8
untuk penentuan kadar ACTH secara duplikasi menggunakan test kit ini.
Plasma EDTA harus dipisahkan dari sel segera setelah pengumpulan
sampel, dengan cara disentrifus selama 15 menit dengan kecepatan 3000
rpm kurang dari 1 jam setelah pengumpulan sampel. Sampel harus
disimpan pada suhu 2-8°C bila akan digunakan kurang dari 8 jam, dan
stabil selama 4 bulan bila disimpan dalam suhu -20°C. Hindari lebih dari
3 kali freeze thaw cycles.
2. Prosedur pemeriksaan (Anonim, 2011)
a. Masukkan 200 µL standard, kontrol dan sampel pasien ke dalam
microwells yang telah dilapisi dengan monoclonal antihuman
ACTH.
b. Segera tambahkan 25 µL HRP conjugated anti ACTH antibody ke
tiap-tiap sumuran.
c. Tutup plate wells dengan menggunakan kertas timah atau material
lain untuk melindungi dari cahaya, inkubasi dan putar dengan
menggunakan ELISA plate shaker selama 2 jam pada kecepatan
400 – 450 rpm.
d. Cuci sumuran 5 kali dengan 350 µL larutan pencuci ke dalam tiap
sumuran dan kemudian dibersihkan. Alternatif lain dengan
menggunakan microplate washer automatic.
e. Tambahkan 200 µL ELISA HRP substrate ke dalam tiap sumuran.
f. Tutupi plate wells dengan kertas timah atau material lain untuk
melindunginya dari cahaya. Inkubasi pada suhu ruangan selama 20
menit tanpa diputar.
g. Segera tambahkan 50 µL ELISA stop solution pada tiap sumuran,
campurkan dengan merata.
h. Lakukan pembacaan absorbance pada 450 nm dengan reference
filter 620 atau 650 nm.
9
Gambar 5. Prinsip pemeriksaan ACTH metode ELISA (Anonim, 2012)
C. Paska Analitik
1. Nilai yang diharapkan (expected value)
Nilai normal ACTH yang diharapkan dengan menggunakan ELISA
ini adalah antara 1-72 pg/mL.
Direkomendasikan untuk mengunakan metode titik ke titik
berdasarkan hasil pengukuran nilai standar untuk mendapatkan
kurva standar ACTH.
a. Hitung nilai rerata absorbance tiap pasang hasil tes duplikasi.
b. Kurangi nilai rerata absorbance dari standar level 1 (0 ng/mL)
dari nilai rerata absorbance seluruh hasil pembacaan untuk
menghasilkan absorbance yang benar.
c. Kurva standar dibentuk dengan menggunakan nilai absorbance
yang telah dikoreksi dari seluruh level standar.
d. Konsentrasi ACTH dari kontrol dan sampel dibaca langsung dari
kurva standar menggunakan nilai absorbance masing-masing.
10
Contoh data dan kurva standar
Tabel 5. Contoh data absorbance ELISA ACTH (Anonim, 2011).
Well IDOD 450/650 nm Absorbance
Hasil (pg/mL)Pembacaan Rerata Koreksi
Std 1: 0 pg/mL0,003
0,31 0,0000,028
Std 2: 7,6 pg/mL0,102
0,105 0,0740,109
Std 3: 20 pg/mL0,206
0,215 0,1840,224
Std 4: 51 pg/mL0,562
0,545 0,5140,528
Std 5: 155 pg/mL1,646
1,628 1,5971,610
Std 6: 416 pg/mL3,151
3,373 3,3243,595
Kontrol 10,349
0,390 36,50,364
Kontrol 22,105
1,118 106,01,664
Gambar 6. Kurva standar ACTH ELISA (Anonim, 2011)
2. Presisi
Nilai presisi intra assay divalidasi dengan mengukur 3 sampel
kontrol dengan 16 kali pengulangan.
11
Tabel 6. Nilai presisi intra assay ACTH (Anonim, 2011).Sampel Rerata nilai ACTH (pg/mL) CV (%)
1 36,2 7,62 66,5 8,63 276,9 10,3
Nilai presisi inter assay divalidasi dengan mengukur 2 level kontrol
dengan duplikasi 16 kali dari tes terpisah.
Tabel 7. Nilai presisi inter assay ACTH (Anonim, 2011).Sampel Rerata nilai ACTH (pg/mL) CV (%)
1 32,1 7,12 261,0 5,3
3. Batasan deteksi (sensitifitas analitik)
Sensitifitas analitik dari ACTH ELISA assay kit ini ditentukan
dengan 95% confidence limit pada 8 duplikasi penentuan dari
standar nol adalah mendekati 0,4 pg/mL.
4. Spesifisitas analitik (interferensi)
Air yang dideionisasi dengan polyester resins dapat menginaktifasi
HRP.
5. High dose hook effect
Assay ini tidak menunjukkan adanya high dose hook effect pada
ACTH sampai pada kadar 10.000 pg/mL.
6. Linearitas
Dua level standar ACTH diencerkan dengan assay buffer dan dites.
Persentase nilai recovery ACTH dapat dilihat pada tabel di bawah.
Tabel 8. Linearitas ACTH (Anonim, 2011).
PengenceranNilai pengamatan
(pg/mL)Persentase nilai perbaikan
Sampel A 416 -1:2 231,4 1111:4 102,1 981:8 52,1 1001:16 26,3 101
Sampel B 155 -1:2 80,3 1041:4 38,6 1001:8 20,5 1061:16 9,3 96
12
Dua sampel plasma EDTA ditambah dengan persediaan konsentrat
ACTH dan dites. Persentase nilai perbaikan ACTH dapat dilihat
pada tabel di bawah.
Tabel 9. Persentase Recovery ACTH (Anonim, 2011).
PengenceranNilai pengamatan
(pg/mL)Persentase nilai perbaikan
Sampel A 184,1 -1:2 105,8 1151:4 58,5 1271:8 22,6 98
Sampel B 33,3 -1:2 17,1 1031:4 9,4 1131:8 5,1 121
Dua sampel plasma EDTA dan tiga standar assay (45, 135 dan 405
pg/mL) dikombinasikan dalam volume yang sama dan dites.
Hasilnya dapat dilihat pada tabel di bawah.
Tabel 10. Spike dan Recovery ACTH (Anonim, 2011).
PengenceranNilai pengamatan
(pg/mL)Nilai diharapkan
(pg/mL)Persentase nilai
perbaikanSampel A 12,5 - -
Std-3 25,1 28,8 87Std-4 73,5 73,8 100Std-5 254,0 208,8 122
Sampel B 21,5 - -Std-3 26,1 33,3 79Std-4 66,8 78,3 85Std-5 208,1 213,3 98
13
BAB III
SIMPULAN
Adrenocorticotropic hormone (ACTH) merupakan hormon polipeptida
yang disekresikan oleh kelenjar pituitary anterior yang fungsi utamanya adalah
menstimulasi sintesa dan pelepasan glukokortikoid terutama kortisol dari korteks
adrenal.
Adrenocorticotropic hormone merupakan komponen penting dalam aksis
hypothalamic-pituitary-adrenal, dan diproduksi sebagai respon terhadap stres
biologis, menstimulasi sekresi hormon steroid glukokortikoid dari sel korteks
adrenal lapisan fasciculata. Konsentrasi ACTH meningkat oleh AVP, stress fisik,
latihan, penyakit akut, dan hipoglikemi yang distimulasi insulin.
Gold standard untuk pemeriksaan ACTH adalah dengan menggunakan
metode radio immune assay (RIA).
14
DAFTAR PUSTAKA
Anonim, 2010. Enzyme linked immuno sorbent assay reader. http://www.biotek.com/products/microplate_detection/elx808_absorbance_microplate_reader.html (diunduh 30 September 2014).
Anonim, 2011. ELISA Kit for adrenocorticotropic hormone (ACTH). http://elisa - antibody.com (diunduh 30 September 2014).
Anonim, 2012. Direct and indirect ELISA protocols http://www.eiaab.com/info/detail/456 (diunduh 30 September 2014).
Boyar RM., Witkin M., Carruth A., Ramsey J. 1979. Circadian cortisol secretory rhythms in Cushing's disease. J Clin Endocrinol Metab. 48(5):760-5.
Kageyama K., Ikeda H., Nigawara T., Sakihara S., Suda T. 2007. Expression of adrenocorticotropic hormone, prolactin and transcriptional factors in clinically nonfunctioning pituitary adenoma. Endocr J. 54(6): 961-8.
Kaplan L. A., and Pesce A. J. 2010. Clinical Chemistry. 5th Edition. USA: Elsevier Saunders Inc, pp: 672-687.
Kreek MJ., Wardlaw SL., Hartman N., Raghunath J., Friedman J., Schneider B., Frantz AG. 1983. Circadian rhythms and levels of beta-endorphin, ACTH, and cortisol during chronic methadone maintenance treatment in humans. Life Sci. 33 Suppl 1:409-11.
Larry J. 2010. Harrison’s endocrinology. 2nd Edition. New York: Mc Graww Hill Medical. Pp: 103-107.
Liddle GW. 1966. An analysis of circadian rhythms in human adrenocortical secretory activity. Trans Am Clin Climatol Assoc. 77:151-60.
Unnikrishnan MK. 2006. Radio immune assay and enzyme linked immune assay. http:// www.pitt.edu/~super7/25011-26001/25011.ppt (diunduh 30 September 2014)
15