METODO CITOQUIMICOS

• El objetivo de estos metodos es la localizacion e identificacion de las sustancias quimicas constituyentes de las celulas, para lo cual hay dos lineas de investigacion.

• 1.-obtencion de fracciones subcelulares y su posterior analisis bioquimico,

• 2.- determinacion de diferentes compuestos quimicos en el interior de la celula.

¿QUE ES LA CITOQUIMICA?

• La citoquimica estudia la composicion quimica de la celula y permite detectar la localizacion topografica de algunos principios inmeditos,enzimas, metales pesados y otras sustancias. Se considera como un nexo de union entre la morfologia y la bioquimica.

EN UNA REACCION BIOQUIMICA HAY TRES PASOS FUNDAMENTALES:

• 1.-fijacion:para preservar las mestruicturas y reactividad funcional celulares evitando fenomenos nocivos para la misma e impidiendo tambien la difucion de componentes bioquimicas entre los diferentes comportamientos celulares asi como al medio extracelular. Existen diversos fijadores: metanol, etanol, acetona, glutaraidehido, formaldehido, etc.

• 2,. Incubacion en el medio de reaccion: como consecuencia se liberan unos productos que bien por si mismo, o al combinarse con otra sustancia presente, dan lugar a un presipitado visible en lugar de la reaccion.

• 3,. Contraste: para resaltar en lo posible el producto de reacción y permitir una óptima visualización del núcleo y del citoplasma. Las reacciones deben tener 3 características: sensibilidad, especificidad y reproductibilidad. Las muestras a estudiar son extensiones de sangre periférica y de médula ósea, improntas de tejidos y células impactadas mediante cito centrifugación procedentes de diversos líquidos biológicos. Las muestras deben ser recientes y a poder ser sin anticoagulantes.Para la correcta valoración citoquímica hay que intercalar controles positivos y negativos.

LA CROMATOGRAFIA

• permite la separación de biomoléculas basándose en la diferente velocidad de desplazamiento de los componentes de una mezcla a través de un medio determinado.

• La velocidad de desplazamiento dependerá de las características de las biomoléculas. Dentro de esta técnica existen distintas modalidades.

CROMATOGARFIA EN PAPEL

• se aplica una mezcla de biomoléculas sobre una hoja de papel adsorbente. Uno de los extremos se impregna con un disolvente que avanzará por capilaridad a través del papel. Aquellas moléculas que sean solubles en el disolvente serán arrastradas y avanzarán más rápido que las que no lo sean obteniéndose así una separación en función de la solubilidad .

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

• la muestra se pasa por una columna con una resina cargada(positiva o negativamente) de forma que las moléculas de la muestra interaccionarán con la resina en mayor o menor grado en función de su carga y, por tanto, avanzarán a distinta velocidad. Al final podrán recogerse las distintas fracciones

• separadas en función de su carga.

CROMATOGRAFIA DEFILTRACION

• se pasa la muestra por una columna de resina porosa sin cargas. Las moléculas pequeñas avanzarán más despacio pues tienden a entrar en los poros de la resina, mientras lasgrandes irán más rápido. La

• separación se hace, por tanto, en función del tamaño molecular.

ELECTROFORESIS

• es una técnica derivada de la cromatografía que lo que hace es aplicar un campo eléctrico a una muestra colocada en la base de una lámina del gel agarosa.

• La electricidad forzará el desplazamiento delas moléculas en función de su carga, es decir, se moverán al polo positivo o al negativo según cual sea su carga neta y lo harán a una velocidad que dependerá de sumas a y del número de cargas eléctricas.

METODOS DE FRACCIONAMIENTOCELULAR

• En los métodos de fraccionamiento celular lo que se hace es destruir la célula por procedimientos mecánicos o químicos (trituración, vibración ultrasónica, choque osmótico...) y luego se separan los distintos componentes que constituyen la célula.

• El método más usado es la ultra centrifugación diferencial, proceso durante el cual se somete a las células destruidas a una serie de centrifugaciones, con fuerzas centrífugas progresivamente mayores, de forma que las partículas se van separando en función de su tamaño; en cada fase se obtiene un precipitado que se recoge y un sobrenadante que se vuelve a centrifugar.

• Por este método separamos los distintos componentes celulares que podemos estudiar de forma aislada . La última fracción que se obtiene corresponderá a una fase soluble en la que tendremos todo tipo de moléculas. Para estudiar esta fase soluble, es decir, para separar distintas biomoléculas podemos recurrir a otras técnicas como la cromatografía y la electroforesis.