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Consiglio per la Ricerca e la Sperimentazione in Agricoltura

MICRORGANISMI ANTAGONISTI DEI FUNGHI MICOTOSSIGENI

Stefania Galletti Centro di Ricerca per le Colture Industriali (CRA-CIN)

Bologna

Roma, 29 ottobre 2013

INTRODUZIONE

-Le malattie delle piante influenzano la quantità e la qualità e delle produzioni agricole.-In particolare le infezioni da parte di funghi micotossigeni rappresentano un rischio per la salute dell’uomo.

Microrganismi antagonisti o Agenti di controllo biologico

(BCA)

Occorre intervenire:Buone pratiche agricole (influenza fattori ambientali)Varietà resistenti (non sempre disponibili)Lotta chimica (non sempre ammessa)

IPM

AGENTI DI CONTROLLO BIOLOGICO (BCA)

BCA: In patologia vegetale il termine si riferisce all’uso di microrganismi residenti o introdotti allo scopo di combattere le malattie delle piante.

• Saprofiti competitivi (viventi su residui vegetali morti);• simbionti facoltativi di piante (viventi su tessuti vegetali);• iperparassiti facoltativi (di patogeni vegetali)

FunghiAmpelomycesConiothyriumGliocladium

TrichodermaMycorrhyzae

BatteriBacillus

BurkholderiaLysobacter

PseudomonasStreptomyces

Trichoderma sono funghi filamentosi comuni nel suolo, considerati simbionti opportunisti avirulenti.

AGENTI DI CONTROLLO BIOLOGICO (BCA)

Formulati commerciali a base di BCA e specialmente di Trichoderma sviluppati per l’uso verso diversi patogeni della rizo- o fillosfera, con varia efficacia

L’uso efficace di BCA dipende dalla conoscenza:

- del pato-sistema;- dei meccanismi d’azione del BCA; - delle interazioni complesse tra BCA, pianta, patogeno e ambiente.

COLLEZIONE CRA-CIN

Al CRA-CIN è mantenuta una collezione di funghi saprofiti, tra cui oltre 300 isolati di Trichoderma spp., utilizzata in diversi settori di studio

Gli isolati differiscono per capacità antagonistiche vs patogeni obenefiche vs pianta:

necessità di selezione per problematiche specifiche

Produzione cellulasi, xilanasi x industria

Pretrattamento biomasse per energia

Biocontrollo

1) Antagonismo

Trichoderma può inibire la crescita del patogeno nella rizo- o fillosfera per mezzo di meccanismi: -diretti (micoparassitismo, produzione di metaboliti tossici, enzimi litici vs la parete cellulare del patogeno);

-indiretti (competizione per spazio e nutrienti, colonizzazione del sito di infezione).

TRICHODERMA - ANTAGONISMO

Colonizzazione di radici di bietola

Inibizione della crescita di F. verticillioides

- promozione crescita- > efficienza d’uso di N - induzione di resistenza sistemica- priming - riduzione tossicità da ROS- riduzione stress abiotici

Trichoderma è considerato un simbionte delle piante, capace di colonizzare e penetrare nelle radici (epibiotic/endophytic) e interagire con la pianta, rilasciando molecole bioattive e inducendo variazioni dell’espressione genica anche nella parte aerea.

TRICHODERMA – AZIONI BENEFICHE

2) Azioni benefiche

fattore chiave nella difesa dalle malattie

TRICHODERMA - INDUZIONE DI RESISTENZA SISTEMICA

Resistenza Sistemica Acquisita Resistenza Sistemica Indotta (SAR) (ISR)

Considerata uno dei meccanismi prevalenti esercitati da Trichoderma.Capacità di indurre una risposta sistemica di difesa dopo applicazione localizzata.

Patogeni necrotroficiVia dell’acido salicilico (SA)Proteine PR (perossidasi, chitinasi, glucanasi)

Rizobatteri promotori crescita(Pseudomonas)Via dell’acido jasmonico (JA)No proteine PR

In base all’elicitore e al percorso metabolico coinvolto:

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Project CANADAIRProject CANADAIR

CRA-CIN: studiare il possibile ruolo del Trichoderma nel contenimento delle infezioni di Fusarium verticillioides in mais attraverso applicazioni al seme.

WP1 - Miglioramento avanzato della resistenza a funghi tossigeni in specie di interesse, diagnosi precoce e controllo delle infezioni

CANADAIR

Gemellaggio Italia – Canada nel settore della ricerca scientifica e innovazione in campo agro-alimentare

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Nell’Italia del Nord le cariossidi di mais sono spesso contaminate da micotossine (fumonisine) prodotte daF. verticillioides, agente del marciume rosa della spiga.

Anche cariossidi apparentemente sane possono ospitare il patogeno endofiticamente e trasmettere l’infezione alla nuova pianta.

Altre vie di infezione:- Infezione delle radichette da residui infetti nel suolo- Conidi trasportati e inoculati dalla piralide- Conidi trasportati sulle sete dal vento o dalla pioggia

CANADAIR

Ruolo BCA:1) Come antagonisti per ridurre infezioni delle radichette e

diminuire il potenziale d’inoculo dei residui infetti nel suolo; 2) Come induttori di resistenza per contrastare infezioni più tardive

ANTAGONISMO- SCREENING IN VITRO E IN VIVO

Control

• Screening in vitro per antagonismo vs F. verticillioides: su 238 isolati di Trichoderma, 11 sono stati selezionati e utilizzati come sospensione di spore per trattare cariossidi di mais.

• I semi trattati sono stati seminati in terreno inoculato con il patogeno per saggiare la capacità di ridurre infezioni radicali in vivo.

• promozione della crescita !

Culture duali : Fusarium a sinistra, Trichoderma a destra

ControlloEfficace

Le radici sono state espiantate e piastrate

3 degli 11 isolati saggiati hanno ridotto significativamente l’infezione radicale (70%).

20

40

60

80

100

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 ControlloIsolati Trichoderma

Infezione %

Non efficace

ANTAGONISMO - SCREENING IN VIVO

Trattamento al seme: efficacia nel proteggere radichetta da infezioni dal terreno

Al fine di studiare possibili effetti di induzione di resistenza sistemica, semi trattati con la coltura liquida dei 3 isolati di Trichodermasono stati seminati in serra…

INDUZIONE DI RESISTENZA - ESPERIMENTO IN SERRA

…e lo stelo inoculato con il patogeno dopo 15 gg

1) Campioni fogliari sono stati raccolti 24, 48 e 96 h dopo l’inoculazione del patogeno per valutare l’espressione di geni coinvolti in meccanismi di SAR e ISR, tramite analisi del RNA (Real time PCR).

SAR: PAL, PR1, PR5, OPR2.

ISR: HPL, AOS, CTR1, LOX.

INDUZIONE DI RESISTENZA - ESPERIMENTO IN SERRA

2) Campioni di stelo sono stati prelevati 15 gg dopo l’inoculazione per valutare lo sviluppo del patogeno all’interno dei tessuti tramite analisi quantitativa del DNA di F. verticillioides (Real time PCR).

Inoculazione

Analisi DNA

Inoculazione

Analisi RNA

RISULTATI FENOTIPICI

- Uno degli isolati ha promosso significativamente la crescita delle piantine di mais.

NT Trichoderma

- Le radici apparivano ben colonizzate dal Trichoderma (spore verdi).

IIMO5

NT

B75

ANALISI QUANTITATIVA DNA PATOGENO

water

0123456789

NT/FV- NT/FV+ B21/FV+ B75/FV+ IMO5/FV+

pg D

NA

Fv

/12,

5ng

DN

A t

otal

e

Tutti e 3 gli isolati di Trichoderma hanno inibito significativamente lo sviluppo del patogeno all’interno dello stelo rispetto al controllo non trattato (NT).

Trattamento al seme: efficace nel ridurre lo sviluppo endofitico del patogeno.

Prima dell’analisi di espressione genica è stato verificato l’effetto di contenimento del patogeno nello stelo.

ANALISI DI ESPRESSIONE GENICA (RNA) in corso

water

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 24h/FV- 24h/FV+ 48h/FV- 48h/FV+ 96h/FV- 96h/FV+

Qua

ntifi

cazi

one

rela

tiva

NTIMO5

Espressione genica di idroperossido liasi (HPL), marker di ISR, relativo alla produzione di composti volatili (GLV).

Già dopo 24 h dall’inoculazione col patogeno, HPL risulta più indotto nelle piante trattate con Trichoderma, rispetto a NT.

Trattamento al seme: induzione di resistenza sistemica del tipo ISR

NT: grigioTrichoderma: nero

24 h48 h

96 h

CONCLUSIONI

- Il trattamento alle cariossidi di mais con Trichoderma selezionato ad hoc può contrastare le infezioni da F. verticillioides attraverso meccanismi di antagonismo (infezioni da suolo) e di induzione di resistenza sistemica (infezioni aeree).

- Necessario verifica in campo in condizioni reali di infezione.

- L’utilizzo di BCA rappresenta un approccio interessante per la gestione anche integrata di malattie per le quali non è consentita o non esiste un’alternativa chimica, come nel caso del marciume rosa da F. verticillioides.

-La concia del seme può avvenire secondo modalità già in essere presso le aziende sementiere, previa verifica della formulazione e concentrazione più opportuna, già implementata presso il nostro Centro.

- I risultati ottenuti dimostrano che la ricerca è la base per applicazioni efficaci.