mikromacierze: przykad y zastosowan·aniag/sadm/wyklad2.pdf · p. brown: bada ekspresje 6200 genów...
TRANSCRIPT
Zaawansowane metody biologii obliczeniowejmikromacierze: przykłady zastosowan
Anna Gambin
Wydział Matematyki, Informatyki i Mechaniki UW
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.1
Plan na dzis
pierwsze eksperymenty z macierzami DNA: drózdzjako organizm modelowy.
reakcja genomu na stres (białka ESR).
aneuploidy – jak czesto ?
po co grupowac kolumny macierzy ekspresji ?
historia szczepionki BCG.
testujemy nowe leki na drozdzu.
dobór leków w terapii nowotworów.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.2
schemat eksperymentu
drozdze rosna w dwóch róznych warunkach (np. ztlenem i bez tlenu),
wyciagamy dwie populacje mRNA i ”tłumaczymy” nacDNA.
kazda z populacji cDNA zawiera barwione nukleotydy,czyli jeden transkryptom zielony (odnosnik) a drugiczerwony (eksperymentalny).
czerwone i zielone cDNA mieszamy i zanurzamy w nimpłytke DNA: łancuchy podoczepiaja siekomplementarnie do odpowiednich genów.
zostawiamy na noc, rano płuczemy i suszymy.Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.3
mikromacierze DNA: eksperyment
www.vetmed.iastate.edu/
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.4
czerwono-zielona skala
skanowanie płytki trwa ok 20 min.
porównujemy intensywnosc czerwonego do zielonego.
zamiast ułamków - znów kolory (indukowany =czerwony, represowany = zielony).
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.5
eksperyment deRisi c.d.
głodzimy drozdza bez cukru.
ponad połowa genów zmieniajacych ekspresje madotychczas nieznana funkcje.
odkrywanie nowych sciezek metabolicznych,
wnioskowanie o funkcji genu o ile jego profil ekspresjiprzypomina profil genu o znanej funkcji.
regulacja przez ten sam czynnik transkrypcyjny ? tensam proces komórkowy ?
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.6
wygłodzone drozdze
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.7
DNA chip DeRisi
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.8
regulacja genów
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.9
skoordynowana regulacja enzymów
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.10
eksperyment DeRisi’1997
klasteryzacja wzorców ekspresji =⇒ konserwowaneregiony sekwencji promotorowych ≈ miejsca wiazanczynników transkrypcyjnych (TF).
o ile to TF reguluja ekspresje to jak sie ona zmieni ?
co sie stanie jak wyrzucimy gen kodujacy białko(∆tup1)?
a jesli sztucznie podniesiemy poziom ekspresji (zapomoca plazmida) Y AP1 + ++ ?
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.11
efekty manipulacji
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.12
niezastapiony drózdz
drózdz jako organizm modelowy:
diploid/haploid, metabolizm aerobowy/anaerobowy,
sery, jogurty, alkohol...
mitoza - taka sama u wszystkich organizmów,
mechanizmy odbierania sygałow.
P. Brown: bada ekspresje 6200 genów drozdza w 142stresujacych warunkach.
nowa jakosc: dane z eksperymentów ogólniedostepne.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.13
eksperyment Gash’2000
mierzy czas reakcji na zmiany srodowiska(podgrzewanie, brak aminokwasów, brak azotu,DDT...).
odpowiedz genomu w zaleznosci od nasilenia stresu.
jak reaguje drózdz, który juz przywykł do przykrychwarunków, gdy ponownie narazimy go na stres ?
natezenie stresu: przezywa 80% komórek.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.14
wnioski
mozemy wywnioskowac (pierwotnie nieznana) funkcjegenu poprzez jego klasteryzacje z genami o znanejfunkcji.
zklasteryzowane razem geny czesto maja wspólnekonserwowane motywy w sekwencjachpromotorowych.
zklasteryzowane geny odpowiadaja za wykonaniepojedynczego zadania w komórce (mała podsiecregulacji).
małe podsieci koordynuja swoje działanie w celuwykonania bardziej złozonych zadan.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.15
efekty stresu
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.16
wnioski, c.d.
widoczny trend: 900 genów wspólnie reaguje nawiekszosc (ale nie wszystkie - patrz: czarne kolumny)warunków stresowych: geny ESR (environmentalstress response).
reakcja na stres - gwałtowna na poczatku, upokaja sie;genom przywyka do warunków srodowiska - ciagłaaktywnosc 900 genów ESR jest nieuzasadniona.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.17
do wszystkiego mozna przywyknac
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.18
po co grzybowi izozymy ?
izozymy: enzymy (białka) o bardzo podobnychsekwencjach podejrzewane o wykonywanie zupełnieredundantnych funkcji.
mikromacierze DNA wyprowadzaja z błedu: drózdzskrupulatnie odróznia izozymy – dlaczego ?
enzym moze miec inne zadanie w zaleznozci odumiejscowienia w komórce;
izozymy katalizuja te sama reakcje in vitro, ale niein vivo;
w zaleznosci od stresu zadziała inny enzym.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.19
izozymy w akcji
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.20
kontrola ekspresji
ekspresja kontrolowana na poziome transkrypcji.
przebadano gruntownie czyniki transkrypcyjne: Msn2,Msn4, Yap1.
jak delecja Msn2, Msn4, Yap1 wpłynie na ekspresje 15genów, które maja miejsca wiazace te czynniki ?
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.21
zabawa w ciepło-zimno
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.22
DNA chipy maksymalnie uzyteczne
cel: wycisnac jak najwiecej informacji z danych oekspresji.
znamy poziom mRNA, wiemy ile go jest, ale nie wiemydlaczego ?
ilosc informacji przytłaczajaca...
naukowy recycling: nowe wnioski ze starych danych.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.23
co odkryła Rosetta Inpharmatics ?
indukcja kilku genów: nie maja ze soba nicwspólnego....poza połozeniem – blisko telomeruchromosomu 7.
współczynnik korelacji (Pearsona) spada do zera jakwyłaczymy z rozwazan chromosom 7.
klastrujemy kolumny, czyli eksperymenty !
mozliwe wyjasnienie: duplikacja – mamy doczynienia zaneuploidem.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.24
wpółczynnik korelacji
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.25
aneuploid: jak czesto ?
obydwa muntanty drozdza posiadały zduplikowanychromosom 7: jak czesto to sie zdarza ?
przepadano 290 drozdzy mutantów – u 22 cos siezduplikowało: duzo czesciej niz podejrzewanowczesniej.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.26
biomedyczne zastosowania
zmutowane genomy sa niestabilne =⇒ utrata kontrolinad cyklem komórkowym =⇒ zmiany nowotworowe.
diagnostyka medyczna – pierwsze zastosowania:białaczka, rak piersi (trudniej);
klasyfikacja odmian nowotworów =⇒(przeciw)wskazania dotyczace terapii.
jak ewoluowała przez ostatnie 100 lat szczepionka nagruzlice ?
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.27
diagnostyka
badano poziom ekspresji 17856 genów w komórkachlimfocytów.
96 pacjentów porównano z cDNA limfocytówhodowlanych.
wynik: chaos – wiekszosc genów o nieznanychfunkcjach.
ale klasteryzacja hierarchiczna poziomów ekspresjiwyróznia dwie grupy.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.28
ekspresja limfocytów
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.29
ekspresja limfocytów,cd.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.30
ekspresja limfocytów,cd.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.31
ekspresja limfocytów,cd.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.32
szczepionka na gruzlice
Mycobacterium tuberculosis zabija rocznie 2 mln ludzi.
pierwsza szczepionka ok. 1900 w Lille dziekiwspółpracy Albert Calmette i Camille Guérin. BCG(bacille de Calmette et Guérin)
uzyto bakterii M. bovis (atakujacej bydło); testy naswiniach, pierwszy sukces w 1921, kolejne latadowodza skutecznosci szczepionki.
1930: wpadka w Lubece (zakazenie szczepionek),
1960 bakteria BCG zamrozona w instytucie Pasteura(zeby zminimalizowac mutacje).
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.33
szczepionaka BCG
jak genom M. bovisewoluował ?
3902 ORFów na płytce,3756 ulega ekspresji.
13 genomów BCG zcałego swiata porównanedo dzikiego M. bovis.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.34
szczepionka BCG, c.d.
ORF obecny w obydwu genomach, ORF, który uległdelecji w genomie BCG.
namierzono 16 regionów delecji.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.35
szczepionka BCG, c.d.
jak wiele ORFów znikneło ? wyrazny przykładniestabilnosci genomów.
1000 generacji genomu w warunkach laboratoryjnych:selekcja na genomy lubiace ziemniaki z cukrem, a niete, które najlepiej uodparniaja :)
szansa na lepsza szczepionke – odtworzeniepierwotnego genomu.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.36
szczepionka BCG, c.d.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.37
znowu niezastapione drozdze
jak genom in vivo reaguje na podanie leku.
cel: wykorzystac ogromna wiedze o metabolizmiedrozdza.
jest łatwiej jesli znamy sciezke (siec zaleznosci), wktórej uczestniczy białko docelowe (ang. target).
drozdzowe chipy DNA po raz kolejny w uzyciu.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.38
niezastapiony drózdz, c.d.
testujemy działanie dwóch lekówimmunosupresyjnych: CsA i FK506
stosowane w chorobach autoimmunologicznych,
po transplantacji organów,
UWAGA: drózdz nie ma układu immunologicznego !
ale badane leki blokuja białka odpowiedzialne zaprzewodzenie sygnałów w komórce (ich silniezakonserwowane homologi sa tez u człowieka).
Calcineurin ma dwa inhibitory bedace kompleksamibiałko-lek.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.39
działanie leków
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.40
eksperyment
drózdz wt rosnie spokojnie oraz w obecnosci lekuFK506 (obrazek z lewej).
ekspresja drozdza wt porównana z ekspresja drozdzamutanta cna (delecja genu kodujacego Calcineurin) –obrazek z prawej.
teoretycznie efekt powinien byc ten sam (szare kropkina wykresie).
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.41
ekspresja leczonego drozdza
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.42
reakcja na lek, c.d.
indukcja lub represja genów u drozdzy mutantów wporównaniu do dzikiego nieleczonego drozdza (wt -).
druga kolumna = drug signature genes.
cna, fpr1, oraz cna/fpr1 to mutanty, które niereaguja na FK506.
podobnie cph, cna, cna/fpr nie reaguja na CsA,czyli uszkadzaja odpowiednia sciezke.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.43
leczymy drozdze c.d.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.44
wtórny target
dlaczego dziki drózdz po podaniu leków nie reagujedokładnie tak samo jak drózdz mutant, któregopozbawiono białka wiazacego lek ?
mutant jednak produkuje “wyciete” białka,
sa inne białka wiazace lek (alternative targets)
wariancja jest nieunikniona w tej metodzie.
odpowiedz ewidentna po przeanalizowaniu reakcji naduze stezenie leku.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.45
wtórny target
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.46
terapia nowotworów
NCI (National Cancer Institute) uzywa 60 linii komóreknowotworowych przy testowaniu chemioterapii.
zbadac transkryptom i sklasyfikowac te komórki.
pod lupa 8000 genów, jako kontrola mieszankazdrowych komórek ludzkich.
1611 OFRów których ekspresja jest co najmniej 7 razywyzsza lub nizsza u co najmniej 4 sposród 60badanych linii.
klasteryzacja podobnych wzorców ekspresji.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.47
klasteryzacja komórek rakowych
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.48
terapia nowotworów, c.d.
pewne rodzaje łatwiej sie odrózniaja, rak piersiszczególnie trudny w klasyfikacji.
melanoma (czerniak) duzo lepiej “sie klastruje” –wyraznie widac geny które odrózniaja ten rodzajkomórek od innych.
sposób ma trudne komórki: powtórzyc ekspermenttylko dla tych OFRów, które sie eksprymuja.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.49
klasteryzacja komórek rakowych
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.50
terapia nowotworów, c.d.
czy mikromacierze moga pomóc w doborzechemioterapii dla pacjenta ?
integrujemy dwa zbiory danych: dane o profilachekspresji 60 komórek rakowych oraz dane o reakcjachtych komórek na 118 substancji chemicznych.
przeciecie tych eksperymentów zilustrowane jako CIM(ang. clustered image map) os X – geny (1376), os Y –118 leków.
czerwony punkt = wysoka korelacja pomiedzyskutecznoscia leku a indukcja genu, niebieski = lekbardziej skuteczny jesli gen ulega represji.
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.51
clustered image map
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.52
terapia nowotworów, c.d.
przypadek szczególny białaczka:
komórkom nowotworowym brakuje syntetazyasparginy (gen ASNS),
jesli wyeliminujemy dostarczanie tego aminokwasu –zagłodzimy raka,
dostepny na rynku lek L-asparginaza (czyli enzymktóry tnie aspargine).
CIM pokazuje negatywna korelacje pomiedzyskutecznoscia leku a aktywnoscia białka ASNS.
dla komórek białaczki współczynnik korelacji jest−0.98. Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.53
głodzimy raka
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.54
blaski i cienie mikromacierzy
wskazówki dot. funkcji genu,
pewne zwiazki i zaleznosci miedzu genami,
ograniczona rozdzielczosc: ogólny schemat widocznyale zachowanie specyficznego genu ...
pointylizm [wymawiaj puentylizym] :)
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.55
Georges Seurat: Grande Jette
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.56
Georges Seurat: Honfleur
Warszawa, 21 luty 2006 r. – p.57