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与 Molecular Probes 一起成为荧光成像艺术家

—免疫荧光实验五大挑战疑难解答

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免疫荧光实验五大挑战疑难解答

引言 ..................................................................................................... 3

五大挑战疑难问题概述 .......................................................................... 3

背景荧光及其解决方案 .......................................................................... 4

背景荧光概述 ................................................................................. 4

背景荧光的来源 ............................................................................. 4

如何减少背景荧光 .......................................................................... 5

荧光成像中的光漂白效应及其消除方法 ................................................ 6

光漂白效应概述 ............................................................................. 6

如何改进光漂白效应 ...................................................................... 7

荧光成像中的光串色效应 ...................................................................... 8

光串色效应介绍 ............................................................................. 8

如何使光串色效应最小化 ............................................................... 9

活细胞成像中的光毒性及其消除方法 .................................................... 9

光毒性现象 ..................................................................................... 9

如何避免光毒性 ........................................................................... 10

荧光成像中的光照度不均匀 ................................................................ 11

光照度不均匀现象 ........................................................................ 11

如何改进光照度不均问题 ............................................................. 11

Molecular Probes® 荧光检测 & 分析课堂 ............................................ 12

细胞成像诊断工具小贴士 .................................................................... 13

目录

目录

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引言

大多数情况下，科学都是 1% 的灵感加 99% 的重复试验，

反复审视那些有瑕疵的结果并找出改进之处是收获科学硕

果的重要一环。通过了解一些可能会遇到的问题，看一些

错误问题的示例，您就可以从中获得一些启发，预防同样

的问题再次发生。

五大挑战疑难问题概述

背景荧光

了解如何降低背景（或噪声）——来自环境光源、显微镜或其他实验组分的非特异性荧光信号。

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光漂白

荧光信号开始很明亮，但随着时间增加会逐渐变暗，这可能是由于荧光基团被光线淬灭（光漂白效

应）所导致的，应了解如何将这一效应控制在最低程度。

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光串色

当实验中要用到两个或多个荧光染料时，其中一个荧光染料所发出的光线可能会“污染” （扩散到）

另一荧光染料的检测通道。了解如何降低光串色。

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光毒性

了解活体细胞成像实验中的光毒性来源、如何鉴别应激细胞以及减少此类损伤的方法。

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光照度不均

观看实例，了解未校准的显微镜光路如何导致染色细胞样本出现亮度差异。

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背景荧光及其解决方案


背景荧光概述

看到了您不希望出现的荧光信号

背景荧光，有时也被称为噪声，是指在图像中观察到、但又不希望它出现的荧光信号。背景荧光有

许多来源，但大体可归为两类。

背景荧光的来源

1. 仪器设置和成像参数导致的背景荧光——如来自激发光源的光线、照像机的噪声和环境光线

2. 样本、器皿、成像介质的自发荧光或没有与特异性靶标相结合的荧光染料所产生的背景荧光

来自仪器和光源的噪声或许难以确定和消除，但这类噪声通常比较恒定，不会随着时间的延长发生

显著变化；而自发荧光和非特异性染色导致的背景荧光则更容易确定和纠正——至少理论上如此！

毕竟实验设计导致背景荧光的形式可谓多种多样，您自然也可以采用多种方法予以抑制。在荧光成

像实验中您可能会遇到的背景荧光光源包括：

• 荧光染料：样本中未结合的染料或非特异性结合的染料

• 样本本身可能具有自发荧光，进而导致背景荧光

• 某些药物和诱导试剂具有（或被激发出）荧光特性

• 用于细胞生长的器皿或基质也可能带来荧光

• 成像过程中使用的培养基也可能成为背景荧光光源

图 1. 实验中的背景荧光可能有多种来源

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如何减少背景荧光

要想从荧光图像中获得最佳数据，您就要尽量扩大靶信号（目标荧光标记信号）与背景噪声（您不

希望看到的荧光标记信号）之间的差异。在报告定量结果时，这一差异有时还会以比值的形式呈现：

∆F/F，其中 ∆F=[ 信号 - 背景 ]，F 为背景。当然谁都希望使用非常明亮的荧光染料，但为了获得最

佳结果，同时还要将背景或脱靶荧光控制在最低水平。降低背景通常有助于获得更高的成像对比度，

从而更易于观察到所需信号。

由样本中未结合染料或非特异性结合染料而产生的背景荧光

• 漂洗：当使用荧光或普通染料标记样本时，可以考虑使用 PBS 或同类缓冲盐溶液漂洗样本 2 到 3

次，这一操作能够去除未结合的荧光染料，从而有助于降低背景。

• 优化荧光染料的浓度：利用荧光染料滴定法标记您的样本（见下图示例）。先分别使用低于、等

于和高于推荐浓度的染料做对比试验，然后针对您的实验条件选择最佳的染料浓度，确保在获得

明亮的特异性信号的同时，又能使多余的背景噪声最小化。

图 2. 同一实验条件下，不同染料浓度可产生截然不同的背景值。

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尝试使用匹配不同检测通道的染料进行标记

如果您的样本存在自发荧光对信号造成干扰，不妨尝试使用匹配另一检测通道的染料进行标记（例

如，从匹配绿色检测通道的染料切换至红色或远红外检测通道的染料）。

检测只含有细胞与药物 / 处理剂的反应孔中的荧光强度

检测只含有细胞与药物 / 处理剂（无荧光标记）的对照反应孔中的荧光强度以确定是否由于您的处

理添加剂而导致活细胞成像过程中出现较高背景。如果真是如此，您便可以从结果中相应扣除此背

景值；或者您也可以采用匹配另一不同（光学）通道的处理剂或染料。

检查使用的培养基

样本的培养基也可能会对您的结果造成影响。无论是固定样本成像还是活细胞成像，这种干扰都可

能会发生。对于固定细胞成像——最常采用的是免疫标记技术——您可能需要检查封片剂；对于活

细胞成像，通过使用光学透明的缓冲盐溶液取代完全培养基（包含蛋白质和维生素等会产生自发荧

光的物质），将会获得更高的信噪比（参见活细胞成像部分）。

检查盛放样本的器皿

成像所使用的器皿也可能产生背景荧光。例如，经常用于细胞培养的塑料底培养皿会产生非常明亮

的荧光，如果您碰到背景荧光过高的情况且当时使用的是塑料底器皿，可尝试换用玻璃底器皿。

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荧光成像中的光漂白效应及其消除方法

光漂白效应概述

信号开始时明亮但随着光照时间延长而衰减

许多荧光染料都可能在成像过程中发生荧光信号的光漂白效应。在成像实验期间，这种荧光基团的

光化学破坏体现为荧光信号的衰减。

当您希望对较弱或丰度较低的靶标进行成像或尝试进行定量分析时，荧光衰减都可能造成不良影响。

无论是何种形式的图像定量操作，都有必要将光漂白效应所造成的荧光衰减纳入考虑，因为它会对

定量数据造成干扰，进而导致生成错误的结果。


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图 3.HeLa 细胞被固定并用 FITC 偶联的鬼笔环肽标记。盖玻片使用 50% 甘油 (PBS) 封固；图 (A) 显示荧光染料的初始荧光，

图 (B) 显示 36 秒持续光照射之后的光漂白效应（光淬灭）。

如何改进光漂白效应

尝试使用不同的染料

一些染料经过特殊调配具有更强的光漂白耐受性。如果您发现所选用的染料发生了很强的光漂白现

象，或许可以在实验设置时尝试一些其他染料或新型染料看看效果是否更好。

尝试使用中性密度的滤光片

您也可尝试使用中性密度的滤镜降低照射样本的光子数量（但您的靶信号也会随之减弱），或改变

显微镜的增益设置以使用更少的光线。唯一需要注意的是，当您需要对样本的成像结果进行对比时，

应确保所有样本都采用了相同的设置。

最小化曝光程度

减少光漂白效应的最简单方法就是减小样本在激发光照下的曝光程度，可通过多种不同的方式实现

这一目的：

• 找到您希望成像的区域，并使用透射光进行对焦，然后使用荧光按需拍摄图像。

• 找到样本目标旁边的一个区域，并使用荧光进行对焦，然后移至邻近目标视野并按需拍摄图像。

• 找到希望成像的样本区域，但使用短于最佳的曝光时间进行对焦，也可结合使用像素组合技术以

减少曝光时间。

建立光漂白曲线

某些荧光基团非常稳定，您无需过分担心光漂白效应；但也有一些荧光基团一点都不稳定；或者您

也可能想专门观察荧光强度的微弱变化。在上述几种情况下，您可能都需要创建光漂白曲线，利用

该曲线，您可以及时修正由光漂白造成的而非实验条件（如药物处理）所致的荧光强度损失。

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使用可提供抗衰减保护的封片剂

如果您要对固定细胞进行成像，并想避免光漂白效应，则可选用一些商业封片剂对样本进行抗衰减

保护，这些封片剂的保护效果主要取决于您使用何种荧光基团，您可能需要尝试不同的配方以找到

最适合的一款，具体请参见封片剂部分。

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荧光成像中的光串色效应

光串色效应介绍

使用了错误的检测通道观察样本

当您在目标通道的临近通道中发现荧光时，即可能发生了光串色现象，这一现象通常发生于使用多

种荧光染料同时进行标记的实验中。

图 4. 如果两个不同荧光基团的激发 / 发射光谱没有准确匹配

到相应检测通道的滤光片组合，则来源于两者的信号就有可

能出现在同一通道中。图中示例显示 TRITC 检测通道中检出

的信号同时也出现在了 FITC 检测通道中。

这些 HUVEC 是通过 ReadyProbes® ActinRed™ 试剂染色的，过氧化物酶体则使用过氧化物酶体的

一抗进行标记，随后通过 Alexa Fluor® 488 荧光二抗检测。在本实验中，肌动蛋白通过 TRITC 检测

通道进行成像，过氧化物酶体则通过 FITC 检测通道进行成像。上图中的结果是通过 FITC 检测通道

获取的，可以很容易地看到过氧化物酶体上预期的荧光信号，但也可观察到来自肌动蛋白荧光标记

的光串色。在这一示例中，肌动蛋白染色的荧光信号串色至 FITC 通道——这两种荧光基团在此实

验中本不应该同时使用。

荧光成像中的光串色效应

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如何使光串色效应最小化

• 合理地选择荧光染料和检测通道的滤光片组合，尽量为每一种您想用于成像的荧光染料选用最合

适的滤光片。

• 使用具有较窄发射光光谱的荧光染料也有助于抑制光串色效应。

• 当设计使用多种荧光染料进行实验时，尽可能选择那些没有光谱重叠的荧光染料。例如，当您想

用三种颜色进行标记时，可尝试使用分别匹配 DAPI、FITC 和 Texas Red® 三个检测通道的染料。

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活细胞成像中的光毒性及其消除方法

光毒性现象

活细胞在延时成像过程中受损而变得不健康

细胞在低波长和高波长的激发光照射（为了激活荧光基团）下均可能受到损伤。研究中所使用的大

多数细胞都不能适应典型成像实验中直接穿过它们机体的大量光子。

在成像过程中，如果观察到细胞从培养器皿上脱离、细胞膜起泡或出现大的液泡，或者发现线粒体

肿大、荧光蛋白聚集等现象，便可以推断细胞存在应激反应并因此变得不健康。

图 5. 图中上方的细胞表现出严重的细胞膜起泡和荧光蛋白聚集，而

其下方相邻的另一细胞则保持着较为健康的状态。

此外，光激活的荧光基团会释放活性氧，而这些活性氧可能会破坏邻近的细胞结构。


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图 6. 上图：转染了 CellLight® H2B-GFP 的活 HeLa 细胞的明场和绿色荧光通道的叠加图。在捕获这张图像之前照射区域中

的细胞已经历了长达 10 小时的持续照射；在非照射区域中的细胞则仅在本次采集图像时才受到照射。在持续照射区域的样

本上，我们可以观察到 GFP 信号的削弱和丢失（绿色通道的图像），同时也能观察到明显的细胞损伤，包括细胞皱缩、变

圆和线粒体肿大（明场图像）；下图：针对 CellTracker® Deep Red 试剂染色的 HDFn 细胞培养物开展的划伤实验。光照射

区域的样本经历了 10 小时的持续照射，本区域中的细胞表现出存活力的丧失，因而无法生长进入划伤区域，而非照射区域

中的细胞则仍然具有生长进入划伤区域的活力。

两种过程都可被称为光毒性，而且有时并不会作明确区分。消除光毒性的主要办法是优化显微镜设

置并在实验中使用尽量低强度的光照射。

如何避免光毒性

优化荧光显微镜光路

一种方法是将成像系统设计得非常灵敏，使之能够尽量捕获大多数的发射光，这样一来，便可以使

用更低强度的照射来激发荧光基团，从而使细胞损伤减少到最小。通常做法是将荧光显微镜的光路

设置优化到最高效的程度，具体手段包括使用最灵敏的检测器（通常采用 CCD 摄像机）、使用尽

可能少的激发光和针对所使用的荧光基团选取最佳激发波长。

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尝试使用更低的光照射强度和更短的曝光时间

某些时候您只能利用现有的仪器并尝试做到最好。这需要使用最佳信噪比的光照，同时又保持最低

水平的荧光基团激发，即意味着需要在系统不变的前提下尽可能优化实验方案，以实现最低的光照

射强度和最短的曝光时间。在某些情况下，特别是希望进行长时程的成像时，通过牺牲分辨率来换

取更健康的细胞也是一种适当的做法。具体操作方法包括缩短曝光时间、采用像素组合技术或使用

更低的放大倍数。当然也可以尝试使用红移的荧光基团来帮助保护细胞的健康，具体参见活细胞成

像部分。

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荧光成像中的光照度不均匀

光照度不均匀现象

在整个视野区域中光线未能均匀照射样本，即为光照度不均匀，这将导致在样本上形成暗区和亮区，

如下图所示。

通常您会在图像中看到一些比其他位置更暗的区域（通常在角落处），这使定量工作变得棘手，甚

至无法进行。

图 7. 使用核酸染料染色的细胞如果出现光照度不均，往往是因为显微

镜光路未校对准。

如何改进光照度不均问题

如果发现照度不均的情况，您便需要考虑重新对校准显微镜的光路。

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荧光成像中的光照度不均匀

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Molecular Probes® 荧光检测 & 分析课堂

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Molecular Probes® 荧光检测 & 分析课堂，所有内容均由来自研发一线、经验丰富的科学家们提供，

旨在提供当您使用荧光成像技术时所需要知道的关于荧光的一切！

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Molecular Probes® 荧光检测 & 分析课堂包括以下五大类课程：

荧光显微镜基础知识

样品制备注意事项

标记样品样品拍照及分析

常见实验方案及疑难解答

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细胞成像诊断工具小贴士

实验问题实验问题

可能原因可能原因

小贴士

小贴士

采用基于链霉亲和素的检测方法，线粒体中的背

景较高

结合了内源性生物素

Endogenous Biotin-Blocking Kit【E21390】可以

最大程度地减小内源性生物素的干扰

高背景信号 ( 尤其是细胞核和线粒体中 ) 影响了细

胞结构中超微小细节的观察

染料 – 电荷相互作用引起的非特异性结合

Image-iT® FX Signal Enhancer【R37107】可以阻

断染料 – 电荷相互作用造成的

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实验问题

实验问题

实验问题

实验问题

实验问题

实验问题

可能原因

可能原因

可能原因

可能原因

可能原因

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小贴士

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小贴士

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荧光样品反复成像后，荧光信号逐渐丧失

荧光染料的光漂白作用

ProLong® Diamond 抗淬灭剂【P36961，

P36962】可为荧光染料和荧光蛋白提供出众的抗

荧光衰减保护

细胞结构 ( 尤其是细胞骨架 ) 染色不充分或不均匀

甲醇固定不当可引起肌动蛋白片段化和细胞破坏

Image-iT® Fixation/Permeabilization Kit【R37602】

针对大多数细胞类型提供了最佳固定条件

较低 / 弱信号水平的二级检测要求曝光时间较长，

导致背景增高

低丰度靶点，即细胞中的目标分子过少

酪胺信号放大 (TSA) 技术可以扩增荧光信号，实

现细胞中低水平目标分子的检测，且不会产生高

背景

图像扩散背景高

与蛋白质 ( 而非靶点 ) 的非特异性结合

BlockAid™ Blocking Solution【B10710】是优化

的蛋白质封闭混合组分，可以降低细胞或组织的

背景信号

染色强度较弱或不均匀，尤其是抗体染色

细胞透化处理不当

Image-iT® Fixation/Permeabilization Kit【R37602】

针对大多数细胞类型提供了最佳透化条件

Brdu 检测细胞增殖实验费时，费力，结果不稳定

新一代 Click-iT® Plus EdU 增殖分析试剂盒，操作

简单，2 小时内完成分析，无需抗体，无需 DNA

变性，可以在准确检测细胞增殖的同时，保护

细胞形态、DNA 完整性、抗原结合位点，可与

GFP、mCherry 等荧光蛋白及其他荧光染料做多

色检测。更多信息，请登录 lifetechnologies.com/clickitplus

细胞成像诊断工具小贴士

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