Molekularna biologija

PREDMET I ZNAČAJ IZUČAVANJA MOLEKULARNE BIOLOGIJE

 Molekularna biologija (biohemijska genetika) objašnjava osnovne procese života, njihovu prirodu i povezanost. U živim sistemima, prirodu i specifičnost svakog procesa određuju geni, pa je zadatak molekularne biologije da tumačenjem regulacije i aktivnosti gena objasni procese metabolizma. Ova grana biologije treba da utvrdi početne procese razvića osobina na molekularnom nivou, tj. iz čega su geni sastavljeni, kako se reprodukuju i koji su primarni proizvodi funkcije gena.

Danas znamo da su nosioci i realizatori razvića osobina nukleinske kiseline i proteini. Naslednu materiju čini DNK. Ovaj molekul se može nazvati naslednom supstancom zato što ima : 1. sposobnost samoreprodukcije (replikacija); 2. sposobnost da nosi genetičku informaciju (gene); 3. sposobnost promenljivosti strukture i funkcije (mutacije).

BIOMAKROMOLEKULI

Živi sistemi (ćelije, organizmi) su izgrađeni od velikog broja različitih molekula među kojima su zastupljeni : – mali molekuli jednostavne građe (voda, ugljen dioksid,

amonijak), nešto veći i složeniji koji izgrađuju ćeliju(aminokiseline, nukleotidi, masne kiseline, glicerol, monosaharidi) i

– veliki, složeni – biomakromolekuli (polisaharidi, lipidi, proteini, nukleinske kiseline). Među molekulima važnim za održavanje života poseban značaj imaju nukleinske kiseline, kao “čuvari i prenosioci” naslednih informacija i proteini kao realizatori tih informacija.

Наследну материју чини дезоксирибонуклеинска киселина (ДНК).

Овај молекул се може назвати наследном супстанцом зато што има:

1. способност саморепродукције: способност да саму себе ствара

2. способност да носи генетичку информацију: да контролише природу и особеност свих биохемиjских реакција у организму од којих зависи испољавање особина организма;

3. способност промењивости структуре и функције: на основу ове особине може се објаснити разноврсност организама у природи и њихова еволуција.

У периоду од 1940. до 1960. прикупљен је читав низ експерименталних података о генетичким својствима ДНК. Утврђено је да је:

1. садржај DNK у једној хромозомској гарнитури постојан

2. да је састав ДНК у ћелијама организама који припадају једној врсти постојан,

3. дата је претпоставка да је генетичка информација садржана у сложеном распореду 4 типа нуклеотида у полинуклеотидним ланцима ДНК при чему је утврђено да је количина аденина једнака количини тимина, а количина гуанина је једнака количини цитозина.

4. Утврђено је и да ДНК преноси генетичку информацију са родитеља на потомке и то је први пут утврђено код вируса.

Експеримент којим је доказано да се гени састоје од ДНК

1944. Авери, Мак Леод и МекКарти (Avery, Mac Leod, McCarty)-Нобелова награда

a) Живе вирулентне инкапсулиране бактерије – миш умире

b) Живе невирулентне неинкапсулиране бактерије – миш остаје жив

c) Вирулентне инкапсулиране бактерије убијене топлотом – миш остаје жив

d) Помешане живе невирулентне неинкапсулиране бактерије и вирулентне инкапсулиране бактерије убијене топлотом – миш умире

e) живе невирулентне неинкапсулиране бактерије помешане са ДНК изолованом из вирулентних инкапсулираних бактерија убијених топлотом – миш умиреЗакључак: носилац вирулентности бактерија је капсула. Информација за синтезу капсуле налази се на ДНК

NUKLEINSKE KISELINE

 U prirodi postoje dve vrste nukleinskih kiselina – dezoksiribonukleinska kiselina (DNK) i – ribonukleinskakiselina(RNK).

Obe su zastupljene u svim vrstama organizama i veoma su značajne za održavanje života i evoluciju živog sveta.

PRIMARNA STRUKTURA DNK

Osnovna gradivna jedinica DNK je nukleotid.

Svaki nukleotid se sastoji od tri komponente :– jednog molekula azotne baze, – jednog molekula šećera pentoze (dezoksiriboza)– jedne fosfatne grupe.

Azotne baze mogu biti:– purinske(purini):

adenin(A) i guanin(G)

– pirimidinske(pirimidini):citozin(C) i timin(T).

• Jedinjenje koje nastaje od azotne baze i šećera pentoze naziva se nukleozid. Azotna baza i pentoza su u nukleozidu vezane glikozidnom vezom. Kada se za nukleozid veže fosfatna grupa onda nastaje nukleotid. Nukleotidi su međusobno povezani gradeći polinukleotidni lanac.

• Veze između nukleotida u tom lancu su fosfodiestarske i ostvaruju se tako što se treći C-atom(C3’) pentoze jednog nukleotida veže za peti C-atom(C5’) pentoze narednog nukleotida u lancu.Takvim povezivanjem na jednom kraju lanca ostaje slobodna hidroksilna grupa vezana za C3’ (taj kraj se naziva 3’ kraj), a na drugom fosfatna grupa vezana za C5’ atom (to je 5’ kraj). Početak polinukleotidnog lanca je 5' kraj.

Vrsta i redosled nukleotida DNK predstavlja njenu primarnu strukturu i specifičan je za svaku vrstu. Varijabilnost (promenljivost, različitost) primarne strukture DNK je ogromna. Broj različitih redosleda nukleotida je 4n, gde je n broj nukleotida koji čine lanac DNK. Ako se npr. lanac DNK sastoji od samo 100 nukleotida, bilo bi moguće predvideti postojanje 1056 molekula sa različitim redosledom nukleotida. Prirodni molekuli DNK sastoje se od velikog broja nukleotida(najmanji molekul DNK imaju virusi i on se sastoji od oko 5000 nukleotida) čime se obezbeđuje ogromna raznovrsnost bioloških vrsta.  Linearno raspoređeni delovi DNK su geni.  Struktura gena je tačno određeni redosled nukleotida u delu DNK.

SEKUNDARNA STRUKTURA DNKSekundarnu strukturu DNK uspeli su da odgonetnu Votson i Krik 1953.god. Osnovu te strukture čini dvolančana zavojnica (spirala). Dva polinukleotidna lanca , koja čine ovu zavojnicu, su antiparalelna što znači da se naspram 5’ kraja jednog lanca nalazi 3’ kraj drugog, i obrnuto.Lanci su uvijeni jedan oko drugog tako da se duž dvolančane zavojnice prostiru dva žljeba: veliki i mali.DNK zavojnica ima celom dužinom isti prečnik. Purinske i pirimidinske baze se nalaze u unutrašnjosti zavojnice gusto spakovane jedna nad drugom, a ravni baza su normalne na osu zavojnice. Fosfatne grupe su okrenute prema spoljašnjoj strani i zajedno sa pentozama čine skelet zavojnice

TG

CGAA

TC T

AGT C

A AC

GT

5′

5′

3′

3′

vodonične veze

komplementarne baze

5’3’

3’

5’polinukleotidni lanci su antiparalelni

Потребно је да се наизменично веже по 10 пентоза и 10 фосфатних група да би се формирао спирални навој, односно 11 пентоза се нађе у оси прве.

Кад се вежу једна пуринска и једна пиримидинска, одржава се стално растојање међу скелетним нитима молекула ДНК зато што пар пурин - пиримидин (без обзира да ли је А-Т или G-C) има исту величину 10.9nm, при чему је растојање у пару 0.3nm

У молекулу ДНК, А-Т се вежу са 2 водоничне везе, а G-C са 3 водоничне везе.

Пречник двоспирализованог ланца ДНК је око 20nm.

Iz činjenice da je prečnik zavojnice isti celom dužinom, zaključeno je da se naspram purinske baze u jednom lancu nalazi pirimidinska baza u drugom, i to komplementarne – naspram adenina timin, a naspram guanina citozin i obrnuto. Naspramne baze se povezuju vodoničnim vezama :

A i T su međusobno povezani sa dve, a G i C sa tri H-veze (A=T; GC)

Грејањем супстрата у коме се налази изолована ДНК, може доћи до њене денатурације, тј. раздвајања на 2 полинуклеотидна ланца од којих се молекул ДНК састоји.

При томе је утврђено да су на деловање повишене температуре отпорније троструке везе G-C од двоструких веза А-Т.

Овај поступак је повратан и постепеним хлађењем се поново успоставља нормална структура ДНК.

Релативно једноставан поступак денатурације и ренатурације ДНК стоји у основи моћне технике РЕКОМБИНАНТНЕ ДНКПри овом поступку могуће је креирати хибридне молекуле ДНК различитих организамаМетода се користи за утврђивање степена генетичке сличности између појединих таксономских група и процену брзине настанка нових гена у току еволуције

Разлике међу појединим молекулима ДНК заснивају се на разликама у броју и редоследу нуклеотида, којих има укупно четири типа.

Квантитативна заступљеност парова G-C односу на А-Т карактеристична је за сваку групу организама

Пар А-Т је чешће заступљен код организама на вишем ступњу еволуције.

HROMATIN

 Na osnovu molekulske mase DNK i podatka da jedan puni zavoj ima dužinu od 3,4 nm, lako se može izračunati ukupna dužina ispružene dvolančane zavojnice DNK u nekoj ćeliji. Tako, ukupna dužina dvolančene DNK u jednoj jedinoj ćeliji čoveka iznosi oko 2 m. Treba imati u vidu da je prečnik tipične ćelije oko 20 m, a njenog jedra 5-10 m. Navedeni primeri jasno ukazuju da DNK mora biti veoma čvrsto upakovana da bi se uopšte mogla smestiti u ćeliju. To podrazumeva da pored sekundarne strukture, postoje i drugi nivoi organizacije DNK. I zaista, u svim ćelijama DNK je superspiralizovana, što znači da je dvostruka spirala još mnogo puta ispresavijana i čvrsto upakovana. U tom pakovanju učestvuju proteini sa kojima je DNK čvrsto vezana.

U svim ćelijama DNK se nalazi u hromozomima koji se pojavljuju u jedru neposredno pre i za vreme ćelijske deobe. U periodu između dve deobe (u interfazi) hromozomski materijal je raspoređen po celom jedru kao difuzna masa i naziva se hromatin.

Hromatin eukariota se sastoji od DNK, proteina i male količine RNK.

Proteini hromatina se svrstavaju u dve klase: – histone i – nehistonske proteine, pri čemu su histoni važni za

pakovanje DNK.

Hromatin(obrađen nekim enzimima) se pod mikroskopom može videti kao, perlasta struktura, tanka nit na kojoj su nanizane perle.Tanka nit je DNK, a perle su kompleksi DNK i histona nazvani nukleozomi.

Nuklozom

Nukleozom se sastoji od histonskog oktamera oko koga je DNK namotana skoro 2 puta (tačnije 1,8 puta).

Oktamer se sastoji od 8 molekula histona : po dva molekula histona H2A, H2B, H3 i H4.

Histon H1 je vezan za DNK na mestu gde ona ulazi i napušta nukleozom. Između nukleozoma je tzv. vezujuća(linker)

Pakovanjem u nukleozome DNK se prividno skraćuje oko 7 puta, ali to još uvek nije dovoljno za smeštanje DNK u jedro.Ta činjenica ukazuje na postojanje dodatnih nivoa spiralizacije DNK kao što su solenoidne strukture i dr.

HROMATIN = DNK + 2 KLASE PROTEINA

HISTONI H1; H2A; H2B; H3; H4

-mali proteini (100- 200 aminokiselina)

-20-30% ARGININ+ i LIZIN+

-visoko konzervirana A.K. sekvenca

-važni za strukturnu organizaciju hromatina

-nespecifični inhibitori ekspresije gena

NEHISTONI mala količina – nekoliko klasa

-enzimi replikacije i transkripcije

-modifikatori histona

-regulatorni proteini – specifični aktivatori gena

NUKLEOZOM

DNK H1 histon

nukleozom

jezgro 8 molekula histona: 2xH2A, 2xH2B, 2xH3, 2xH4

nukleozom

DNKH1 histon

oktamerno histonsko jezgro

30 nm

nukleozom

HROMATINSKA NIT

NUKLEOZOMNA NIT

2 nm

11 nm

30 nm

300 nm

700 nm

1400 nm

nukleozomi

30 nm hromatinska

nit

metafazni hromozom

PRIMARNA I SEKUNDARNA STRUKTURA RNK

Osnovna gradivna jedinica RNK je, kao i kod DNK, nukleotid.

Nukleotidi DNK i RNK razlikuju se po pirimidinskim bazama i pentozi : umesto timina RNK ima uracil, a šećer je riboza.

RNK su jednolančani molekuli koji nastaju tako što se nukleotidi povezuju fosfodiestarskim vezama.

Priroda ovih veza je ista kao u DNK, samo što umesto dezoksiriboze učestvuje riboza. Unutar ovih jednolančanih molekula komplementarne baze mogu da nagrade kraće ili duže dvolančane, spiralizovane delove spajajući se vodoničnim vezama (A=U ; GC). Ti dvolančani delovi čine sekundarnu strukturu RNK .

U ćeliji postoje tri vrste RNK : – informaciona RNK (i-RNK), – transportna RNK (t-RNK) i – ribozomska RNK (r-RNK).

 

Sve tri vrste nastaju prepisivanjem određenih delova jednog lanca DNK, odnosno prepisivanjem gena. RNK predstavljaju kopije gena.

Informaciona RNK nastaje prepisivanjem strukturnih gena koji sadrže uputstvo za sintezu proteina. Uloga i-RNK je da to uputstvo (informaciju) za sintezu proteina prenese do ribozoma (mesto sinteze proteina). Sinteza i-RNK počinje onda kada je ćeliji potreban neki protein, a kada se obezbedi dovoljna količina proteina i-RNK biva razgrađena.Transportna RNK nastaje prepisivanjem male grupe specifičnih gena.

 

Transportna RNK ima dvostruku ulogu: prevodi uputstvo za sintezu proteina sa i-RNK u redosled aminokiselina u proteinu i prenosi aminokiseline do ribozoma.

 

Ribozomska RNK nastaje prepisivanjem gena koji se zajednički nazivaju »organizatori jedarceta«.Njena uloga je da zajedno sa određenim proteinima nagradi ribozome.

 

Ćelije jednog organizma se međusobno razlikuju po i-RNK i t-RNK koje sadrže dok su r-RNK i DNK u svim ćelijama jednog organizma iste.

NUKLEINSKE KISELINE - SLIČNOSTI I RAZLIKEDNK RNK

delovi nukleotida

1.dezoksiriboza2.fosfatna grupa3.azotna baza a) purinska -adenin -guanin b) pirimidinska -timin -citozin

1.riboza2.fosfatna grupa3.azotna baza a) purinska -adenin -guanin b) pirimidinska -uracil -citozin

struktura molekula

dvolančana spirala

jednolančan molekul

mesto u ćeliji

jedro jedro,citosol

uloga nosilac gena sinteza proteina

Literatura

http://www.bionet-skola.com/w/Molekularna_biologija

Lazarević, M: Ogledi iz medicinske genetike, Beograd, 1986.

Marinković, D, Tucić, N, Kekić, V: Genetika, Naučna knjiga, Beograd

Matić, Gordana: Osnovi molekularne biologije, Zavet, Beograd, 1997.

Ridli, M: Genom - autobiografija vrste u 23 poglavlja, Plato, Beograd, 2001.

Tatić, S, Kostić, G, Tatić, B: Humani genom, ZUNS, Beograd, 2002.

Tucić, N, Matić, Gordana: O genima i ljudima, Centar za primenjenu psihologiju, Beograd, 2002.