第19回日本遺伝子診療学会 遺伝子技術講習会

〜遺伝子診療におけるウェブツールの活用〜

2012.7.28

NCBIでの遺伝子情報検索

「自分が遺伝子診断用のプライマー

を作成するとしたら」

日本大学医学部病態病理学系臨床検査医学分野 中山 智祥

講習の内容

１. NCBIとは？

２. NCBIによる原因遺伝子情報の収集

３.プライマーの設定

４.プライマーの発注

５. まとめ

講習の内容

１. NCBIとは？

２. NCBIによる原因遺伝子情報の収集

３. プライマーの設定

４. プライマーの発注

５. まとめ

NCBIとは？ 1. 米国の国立医学図書館が管理する 国立バイオテクノロジー情報センター National Center of Biotechnology Information 2. 1988年に分子生物学情報のために国家資源として 議会によって作成された。 3. あらゆる生物工学情報がアクセス可能 PubMed、OMIMのほか配列データベースである GenBank 、一塩基

多型 (SNP) のデータベースである dbSNP、ESTのデータベースで ある dbESTなど。

4. 公開されているデータは基本的に無償で利用できる。

講習の内容

１. NCBIとは？

２. NCBIによる原因遺伝子情報の収集

３. プライマーの設定

４. プライマーの発注

５. まとめ

NCBIによる遺伝子情報検索

実際にやってみよう！ NCBIを使って 「ハンチントン病（Huntington病）の遺伝子診断用プライマーを 設定してみよう！

NCBIによる原因遺伝子情報の収集

「ハンチントン病（Huntington病）の原因遺伝子」

ステップ１：NCBIサイトに「Huntington」と入れる。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ２：「Gene」を選ぼう。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ３：「Homo Sapiens (人間)」の遺伝子である「HTT」を選ぼう。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ４：「HTT」の遺伝子情報を閲覧しスクロールダウン。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ４：「HTT」の遺伝子情報を閲覧しスクロールダウン。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ５：「HTT」の遺伝情報を閲覧しスクロールダウン。ずーっと下。 GenomicのGenBankを選ぼう。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ６：「HTT」のGenome (DNA)情報を閲覧しスクロールダウン。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ７：「FASTA」を選ぼう。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ８：「CAGリピート」の周辺のDNA配列をコピーしよう。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ９：WordファイルにDNA配列をペーストしよう。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ１０：CAGリピートに色を付けてみよう。

NCBIによる原因遺伝子情報の収集 ステップ１０：CAGリピートに色を付けてみよう。

講習の内容

１. NCBIとは？

２. NCBIによる原因遺伝子情報の収集

３. プライマーの設定

４. プライマーの発注

５. まとめ

プライマーの設定 ステップ１：遺伝学的検査用PCRプライマー設定のコツ

増幅したい部分（CAGリピート）を含まない。 各プライマーの長さは22から30塩基程度とする。 GC含量は50%-60%程度。 FとRが同じ程度の長さで FとRが同じ程度の50%-60%程度 各プライマーの表記方法は（5’-> 3’）とする。 双方がダイマーを作らないように設定。3’側が結合しないように。 文献に載っているプライマーはまず疑え。 PCRプライマーをシークエンシングプライマーに使えるように考慮。 上記条件で作成することが困難な時はF、Rともに複数発注しPCRしてみる。 CAGリピートを含まざるをえない場合もある。

プライマーの設定 ステップ２：Forwardプライマーを作成し、色を付けるか、アンダーラインをひいてみよう。

プライマーの設定 ステップ３：Reverseプライマーを作成し、二重アンダーラインをひいてみよう。

講習の内容

１. NCBIとは？

２. NCBIによる原因遺伝子情報の収集

３. プライマーの設定

４. プライマーの発注

５. まとめ

プライマーの発注 ステップ１：実際にプライマーを発注する時は5’から記入する。

Sequence Name半角英数字Max20文字空白、カンマ、%、｜(パイプ）は不可

Sequenceスペース不可小文字はS化する場合のみ末端修飾の場合は <Biotin>ACTTGTT等と記入してください。　　　　混合塩基は下記の国際表記を用い、一文字にてご記入ください。B=C+G+T;D=A+G+T; H=A+C+T; I=dI(Inosine); K=G+T; M=A+C;N=A+C+G+T; R=A+G; S=C+G; U=dU(Uracil);

合成スケール0.02/0.03（0.05/0.2/1.0/10.0μ moleスケール は凍結乾燥品出荷）

精製グレードDST:脱塩RP1:逆相ｶｰﾄﾘｯｼﾞｶﾗﾑHPLCPAGE

合成長(単位：mer) G+C G+C% Tm

Example_Primer ACGTACGTAGCT 0.02 DST 12

HTT_F1 ATGAAGGCCTTCGAGTCCCTCAAGTCCTCC 0.02 RP1 30 17 56.7 66.5

HTT_F2 ATGGCGACCCTGGAAAAGCTGATGAA 0.02 RP1 26 13 50 61.2

HTT_R1 GGCGGTGGCGGCTGTTGCTGCTGCTGCTGC 0.02 RP1 30 22 73.3 73.3

HTT_R2 GGCGGCTGAGGAAGCTGAGG 0.02 RP1 20 14 70 63.6

HTT_R3 CAGCAGCGGCTGTGCCTG 0.02 RP1 18 13 72.2 61.7

講習の内容

１. NCBIとは？

２. NCBIによる原因遺伝子情報の収集

３. プライマーの設定

４. プライマーの発注

５. まとめ

まとめ NCBIでの遺伝子情報検索

のウェブツールの活用 1. 遺伝子情報は随時更新する。また情報の入手箇所

は1ヶ所ではない。 2. プライマーを設定するにはソフトを用いることもある

が、最終的には非特異的増幅産物が増幅されていないかを確認することが必要。

3. 文献に記載のあるプライマー配列を参考にすることは有用であるが信用しすぎない。

4. プライマー発注の際、用途によって精製グレードを使い分ける。