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NDM-1 基因的检测与确认

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中国疾病预防控制中心传染病预防控制所

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NDM-1 简介

一个新发现的耐药基因，全长 826bp

编码 1 型新德里金属 β- 内酰胺酶 造细菌成对碳青酶烯类药物耐药

位于质粒上 最初发现在肺炎克雷伯杆质粒 pKpANDM-1 上 Genbank FN396876 （ 2009.11.24 ）

具有可移动性 可在不同种属细菌间转移 革兰阴性：肠杆菌科、不动杆菌、假单胞菌 革兰阳性：？？ E.coli Genbank AB571289 （ 2010.07.10 ）

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NDM-1 的基因检测

1. PCR 检测2. 序列测定——最终确认

检测对象： 已经过表型筛检的菌株进行 NDM-1 基因确认 对大批菌株直接进行筛检 对标本的检测

高通量、快速、准确

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PCR 检测方法——模板制备

模板制备：菌株、标本1. 菌株（ 1 ） G- 细菌： a. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于 100-200μl 纯水 沸水浴 10min 以上 8000rpm 以上离心 5min

吸取上清， -20 ℃ 保存 b. 试剂盒提取基因组 DNA （说明书）

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PCR 检测方法——模板制备1. 菌株（ 2 ） G+ 细菌： a. 试剂盒提取基因组 DNA （说明书） 溶菌酶充分作用 b. 水煮模板：新鲜培养物悬浊于 100-200 μ l 纯水 低温反复冻融（ -40 ℃ 以下或液氮） 沸水浴 10min 以上 8000rpm 以上离心 5min

吸取上清， -20 ℃ 保存

2. 标本：根据标本类型不同选择相应的试剂盒

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PCR 检测——引物选择1. 引物选择：

扩增片段位于 CDS 正向的 191-482 位置（反向 345-636 位置） 483-769 位置（反向 58-344 位置） 引物特异性较好，理论上无非特异扩增片段

引物 引物序列（ 5 ＇→ 3 ＇） 产物大小（ bp） 退火温度 ( )℃

引物 1

17U-191 CAGCACACTTCCTATCTC 292 55

17L-465 CCGCAACCATCCCCTCTT

引物 2

F-58 GGCGGAATGGCTCATCACGA 286 60

R-344 CGCAACACAGCCTGACTTTC

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PCR 检测—— PCR 体系 引物合成稀释 冻干粉末，开启前 10000rpm 离心 5min

小心开盖，防止粉末喷出 1.0OD+268 μ l 纯水，充分震荡混匀 ，浓

度 20 μ M （ 20 μ mol/L ）

20 μ l 体系（右图） 若使用含有 Mg2+ 的 10×buffer 的加

入量同上表， MgCl2 体积用水补齐 PCR Premix 预混液（根据说明书）

成分 体积（ μl）

10×buffer 2

dNTP （ 10mM each） 1.6

MgCl2 （ 2.5mM） 1.2

Primer-F （ 20μM ） 1

Primei-R （ 20μM ） 1

Taq （ 5U/μl） 0.2

纯水 12

DNA 1ng

总体积 20

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PCR 检测—— PCR 体系

没有阳性对照，如何确保体系正常运转

同批 配置体系时：增加 1 管不使用 NDM-1 引物 加入常用引物及模板，扩增其他已知片段

人工合成长片段 DNA 作为阳性对照？？ 不建议合成：首次发现时如何排除“污染”质疑 如果一定要合成：在中间区域加入若干数量的突变位点 作为区别合成片段与实际阳性片段的标志

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PCR 检测—— PCR 反应条件与电泳

反应条件：（约耗时 1 小时 25 分钟）94 5min℃

94 15sec℃

Tm 30sec 25℃ 个循环72 30sec℃

72 5min℃

电泳： 1.5%琼脂糖电泳 marker ： DL2000

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基因序列测定——最终确认

PCR 阳性结果：携带 NDM-1 基因 非特异扩增 最终确认：序列测定 测序公司，当天得到结果

测序样品： 100 μ l 以上 PCR 产物 引物及其浓度：上下游引物各 10 μ l （ 20uM ） 测序要求：双向、测通，提供拼接好的序列

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基因序列测定——测序结果判读

测序彩图：峰体清晰、无套峰

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基因序列测定——测序结果判读

双向测序结果拼接

起始段结果（ 10-30bp ）、反应结果段结果（ >500bp ）不可用

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基因序列测定——序列比对 下载参考序列： Genbank ： FN396876.1

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/255031061

AB571289 、 HQ171206 、 HM853678

将测度序列与参考序列比对： 常用软件： Clustal 、 DNAstar 、 Mega……

最终确认是否为 NDM-1 基因序列 判定该细菌携带 NDM-1 基因

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NDM-1 基因携带与耐药

抗生素敏感性——细菌表型特征 耐药基因正确表达，表现出细菌的抗生素敏感性 一种细菌可具有多种耐药机制 NDM-1只是其中一种 该细菌表现出的抗生素敏感性是各种耐药机制综合表现的结果

NDM-1 基因的检测与确认——基于基因水平的判断 菌株 A携带 NDM-1 基因 菌株 A 的耐药谱， NDM-1 基因对于这株菌的作用 —— 具体问题具体分析

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